Stereologiczne oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu frakcjonatora optycznego i standardowego sprzętu mikroskopowego
1 września 2017
Ta praca przedstawia krok po kroku protokół bezstronnego stereologicznego szacowania liczby komórek neuronalnych dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego (tj. mikroskopu świetlnego, zmotoryzowanej tabeli obiektów (płaszczyzna x, y, z) oraz oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu.
Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie opartego na projekcie stereologicznego oszacowania liczby komórek dopaminergicznych w SN myszy przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego. Metoda ta jest przydatna do oszacowania liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy w przedklinicznych badaniach nad chorobą Parkinsona przy użyciu bezstronnej stereologii opartej na projektowaniu. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją osiągnąć za pomocą standardowego sprzętu do mikroskopii bez konieczności posiadania dostępnego na rynku kompletnego zestawu do badań geologicznych.
Procedurę zademonstruje Louisa Friez, technik z mojego laboratorium. Zacznij od umieszczenia mózgu myszy z utrwalonym paraformaldehydem w matrycy mózgowej i wykonania cięcia plus 0,74 milimetra od bregmy. Przenieś ogonową część mózgu, w tym SN, do 4% PFA w 0,1 mola i utrwal przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnego dnia wymień PFA na 30% sacharozę w 0,1 molowym PBS i inkubuj przez kolejne dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zabezpieczyć próbkę przed krioochroną. Po dwóch dniach, gdy mózg zanurzy się w sacharozy, umieść tkankę w Cryomold wypełnionym związkiem o optymalnej temperaturze cięcia i powoli zamrażaj tkankę w płynnym izopentanie chłodzonym suchym lodem. Użyj kriostatu, aby seryjnie przeciąć 30-mikronowe odcinki kriogeniczne w płaszczyźnie koronalnej.
Zaznacz prawą półkulę, przebijając mały otwór w górnej części pnia mózgu. Zbierz cztery serie sekcji, zaczynając od minus 2,46 milimetra od bregmy i kończąc na 4,04 milimetra od bregmy. Przenieś każdą serię odcinków do probówki wypełnionej krioprotektantem i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Przechwytywanie cyfrowych obrazów immunohistochemicznie wybarwionych skrawków SN hydroksylazy tyrozyny za pomocą oprogramowania do obrazowania sprzężonego z mikroskopem. Zacznij od określenia rzeczywistego mocowania i grubości sekcji w trzech losowo wybranych miejscach liczenia na sekcję. Najpierw kliknij odsunięcie górnej części widoku, aby zdefiniować górną część sekcji.
Następnie kliknij zatrzymaj widok u góry. Następnie kliknij przesunięcie dolnego widoku, a następnie kliknij zatrzymaj widok na dole. Zapisz grubość przekroju.
Oblicz strefę ochronną, odejmując trzy mikrony od górnego przesunięcia i wpisz wynik w polu górnego przesunięcia. Następnie odejmij wysokość 13 mikronów dysektora optycznego od górnego numeru przesunięcia i wpisz wynik w polu dolnego przesunięcia. Wybierz następujące parametry, kroki 14, rozmiar 1.00.
Wybierz katalog, w którym chcesz zapisać plik. Kliknij sekwencję, aby rozpocząć akwizycję. Po uzyskaniu obrazów kliknij przetwarzanie i wybierz następujące parametry, wszystkie płaszczyzny z sekwencji, montażu oraz pola szybkiego i zszywania z nakładaniem się obrazów 10%Rozpocznij zszywanie obrazów, klikając start.
Spowoduje to wygenerowanie obrazów stosu do analizy. Aby rozpocząć, otwórz obraz, klikając plik i otwórz. Ustawianie skali obrazu za pomocą polecenia Analizuj i Ustaw skalę.
W tym kroku zmień zdefiniowany rozmiar z pikseli na mikrony. Wybierz wtyczki, a następnie siatkę, a następnie polecenie linii typu grid, aby losowo wstawić siatkę. Zaznacz pole losowego przesunięcia.
Zdefiniuj rozmiar jednego kwadratu w siatce jako 130 mikronów na 130 mikronów, co odpowiada 16 900 mikronom kwadratowym. Zmień typ obrazu z 16-bitowego na kolor RGB, klikając obraz, a następnie wpisz, a następnie kolor RGB. Zlokalizuj substantia nigra pars compacta.
Okrąż obszar za pomocą narzędzia Pędzel za pomocą pędzla o szerokości 11. Cofnij polecenie ustaw skalę, klikając analizuj, a następnie ustaw skalę, a następnie kliknij, aby usunąć skalę, aby obliczać w pikselach, a nie w mikronach. Zrób zrzut ekranu, zapisz plik obrazu i otwórz nowy plik za pomocą ImageJ.
Wybierz pędzel i szerokość pędzla 25. Zaznacz każdy kwadrat siatki, który styka się z SN, w celu umieszczenia dysektora optycznego. Wybierz jeden kwadrat siatki, który zawiera części numeru seryjnego. Zmierz lewy górny róg kwadratu za pomocą kursora w ImageJ, aby zdefiniować początkowe współrzędne x i y.
Wybierz szablon arkusza kalkulacyjnego zatytułowany Pozycja optycznej dyssektora i oblicz pozycję optycznego rozsektorowania. Następnie oszacuj liczbę komórek, korzystając z obliczeń arkusza kalkulacyjnego liczby komórek, jak opisano w pisemnej części protokołu. Ten obraz o niskiej mocy pokazuje fragment mózgu myszy po barwieniu TH dla neuronów dopaminergicznych.
Większe powiększenie przedstawia neurony dopaminergiczne TH dodatnie. Wstawka przedstawia obszar ramki w zwiększonym powiększeniu. Ten obraz przedstawia jedną serię wybarwionych TH odcinków SN obejmujących cały SN myszy od rostralnego do ogonowego.
Każda sekcja jest oddzielona od kolejnej sekcji o 120 mikronów. Liczbę neuronów TH dodatnich w SN prawej i lewej myszy oszacowano przy użyciu metody pokazanej w tym filmie i przy użyciu dostępnego na rynku systemu stereologicznego. Jak widać tutaj, obie metody dały porównywalną liczbę komórek i nie było znaczących różnic między zestawami danych.
Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie środków ochrony osobistej, takich jak rękawice ochronne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić bezstronne stereologiczne oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu metody frakcji optycznej i standardowego sprzętu mikroskopowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół bezstronnej oceny stereologicznej liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy z wykorzystaniem standardowych narzędzi mikroskopowych. Metoda ta ma na celu ułatwienie badań przedklinicznych nad chorobą Parkinsona poprzez zapewnienie niezawodnego podejścia do kwantyfikacji komórek bez konieczności stosowania specjalistycznych systemów stereologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad chorobą Parkinsona
Wprowadzenie
- Neurony dopaminergiczne są kluczowe dla kontroli motorycznej.
- Pręga czarna jest kluczowym obszarem dotkniętym chorobą Parkinsona.
- Obiektywna stereologia zapewnia solidną metodę ilościową.
- Standardowy sprzęt mikroskopowy sprawia, że technika ta jest dostępna.
Cel badania
- Ustalenie protokołu krok po kroku dla kwantyfikacji neuronów.
- Wykorzystanie nieobciążonej stereologii opartej na projektowaniu w żywych modelach myszy.
- Umożliwienie prowadzenia badań przedklinicznych badających utratę neuronów dopaminergicznych.
Zastosowane metody
- Standardowa mikroskopia, w tym mikroskopia świetlna oraz oprogramowanie do cyfrowej analizy obrazu.
- Substantia nigra myszy jako model biologiczny.
- Szczegółowe metody utrwalania, krioprotekcji i sekcjonowania tkanki mózgowej myszy.
- Obrazowanie cyfrowe i specyficzne techniki immunohistochemiczne.
- Precyzyjne pomiary i obliczenia w celu wyznaczenia liczby neuronów.
Główne wyniki
- Wykazano dokładną ocenę liczby neuronów dopaminergicznych w SN.
- Zarówno metody standardowe, jak i zaawansowane pozwoliły uzyskać porównywalną liczbę neuronów.
- Położono istotny nacisk na niezawodność metody z wykorzystaniem standardowych narzędzi.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia wykonalne podejście do ilościowego oznaczania populacji neuronów w badaniach naukowych.
- Pozwala ono na lepsze zrozumienie utraty neuronów w chorobie Parkinsona.
- Wykorzystuje łatwo dostępne narzędzia, co sprzyja szerszemu zastosowaniu w badaniach z zakresu neuronauki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dokładna kwantyfikacja utraty neuronów dopaminergicznych w obrębie istoty czarnej jest kluczowym punktem końcowym w przedklinicznych badaniach nad chorobą Parkinsona, bezpośrednio wpływając na walidację celu oraz redukcję ryzyka mechanistycznego strategii neuroprotekcyjnych. Niniejszy protokół umożliwia wiarygodną i bezstronną ocenę stereologiczną z wykorzystaniem standardowego sprzętu mikroskopowego, co zmniejsza zależność od specjalistycznych systemów stereologicznych i zwiększa dostępność dla procesów badawczych w biologii odkrywczej. Dostarczając ilościowe i powtarzalne dane dotyczące liczby komórek, metoda ta wspiera pewność prognostyczną w testowaniu hipotez dotyczących celów na wczesnym etapie oraz w decyzjach dotyczących priorytetów portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez dostarczenie obiektywnej ilościowej oceny przeżywalności neuronów dopaminergicznych w przedklinicznych modelach choroby Parkinsona.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki zastosowaniu stereologii opartej na projekcie, która minimalizuje błąd obserwatora i zmienność techniczną w badaniach zaangażowania celu.
- Wartość prognostyczna: Generuje ilościowe dane dotyczące liczby neuronów, co pomaga w ocenie skuteczności modulacji celu i dostarcza informacji niezbędnych do podjęcia decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) we wczesnej fazie odkrywania leków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Dostarcza standaryzowane, ilościowe wyniki histologiczne, odpowiednie do walidacji trafień w badaniach przesiewowych mających na celu zachowanie integralności neuronów dopaminergicznych.
- Powtarzalność: Zapewnia spójne pomiary liczby komórek w przekrojach i osobnikach, co wspiera standaryzację testu w celu późniejszej oceny związków.
- Skalowalność: Kompatybilność ze standardową mikroskopią i oprogramowaniem do analizy obrazu umożliwia szersze zastosowanie na platformach badawczych bez konieczności posiadania specjalistycznego sprzętu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Bezpośrednio modeluje utratę neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej, co jest kluczową cechą patologiczną choroby Parkinsona, zwiększając tym samym trafność translacyjną.
- Ciągłość przedkliniczna: Stanowi ilościowy pomost pomiędzy badaniami przesiewowymi a walidacją przedkliniczną, dostarczając danych porównywalnych z komercyjnymi systemami stereologicznymi.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie obiektywnych, opartych na danych decyzji dotyczących rozwoju związków na podstawie statystycznie wiarygodnych wskaźników przeżywalności neuronów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów badawczych, od testowania hipotez dotyczących celów terapeutycznych, przez identyfikację wiodących związków, aż po przedkliniczną ocenę skuteczności, zapewniając ilościowy odczyt histologiczny, który pogłębia zrozumienie mechanizmów działania i zwiększa pewność co do wyboru celu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez ilościowe określanie populacji neuronów dopaminergicznych jako funkcjonalnego odczytu modulacji szlaków w modelach przedklinicznych.
- Przesiewanie: Generuje powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania, które umożliwiają rzetelne porównanie wpływu związków na przeżywalność neuronów.
- Analityka: Dostarcza numerycznych danych o liczbie komórek oraz zapewnia porównywalność statystyczną między grupami eksperymentalnymi, ułatwiając porównania warunków w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Koreluje z patologią choroby Parkinsona poprzez pomiar utraty neuronów w istotnym dla choroby obszarze mózgu, co wspiera przedkliniczną walidację zgodną z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zestandaryzowany, dostępny schemat postępowania w zakresie stereologii, który może być stosowany w wielu programach badawczych w dziedzinie neuronauk bez konieczności zakupu kosztownego sprzętu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki nieobciążonej, opartej na projekcie kwantyfikacji stereologicznej.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację między laboratoriami dzięki wykorzystaniu powszechnie dostępnych narzędzi mikroskopowych i analizy obrazu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wyeliminowanie konieczności stosowania specjalistycznych systemów stereologicznych, przy zachowaniu porównywalności danych z platformami komercyjnymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów przedklinicznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ilościowe, histologicznie zwalidowane dane dotyczące zachowania neuronów dopaminergicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu histologii, immunohistochemii oraz zasad stereologii w celu dokładnego przygotowania tkanek i identyfikacji obszarów.
- Metoda jest zależna od zmotoryzowanego sprzętu mikroskopowego z kontrolą osi z oraz oprogramowania do składania obrazów (stitching) w celu systematycznej analizy przekrojów.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów barwienia, grubości przekrojów i zasad liczenia pomiędzy zespołami, aby zapewnić powtarzalność wyników w różnych ośrodkach.
- Adaptacja metody do innych obszarów mózgu lub typów neuronów może wymagać korekty parametrów barwienia, rozmiaru siatki oraz wymiarów dyssektora optycznego.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od jakości przekrojów oraz konieczność rygorystycznego szkolenia w celu utrzymania dokładności liczenia i uniknięcia błędu próbkowania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
- Wartość naukowa: Powtórzenia w wielu przekrojach i u wielu zwierząt uwzględniają zmienność biologiczną i techniczną, zwiększając pewność, że zaobserwowana liczba neuronów odzwierciedla rzeczywiste efekty eksperymentalne, a nie artefakty związane z próbkowaniem.
- Wartość operacyjna: Spójne protokoły próbkowania ograniczają zmienność międzyoperatorową i wspierają standaryzację w różnych laboratoriach, co jest niezbędne w przypadku wieloośrodkowych projektów badawczych.
