Name: Stereologiczne oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu frakcjonatora optycznego i standardowego sprzętu mikroskopowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Poznaj metodę stereologicznego szacowania neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego. Ta technika umożliwia dokładną kwantyfikację komórek w badaniach nad chorobą Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni Keali Röhm, Louisie Frieß i Heike Menzel za ich fachową pomoc techniczną; Heldze Brünner za opiekę nad zwierzętami; oraz Chistopherowi S. Wardowi za generowanie i dystrybucję wtyczki optycznej siatki disektorowej dla oprogramowania ImageJ.

Przestrzegano wszystkich obowiązujących międzynarodowych, krajowych i/lub instytucjonalnych wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania. Protokół został zatwierdzony przez lokalne organy nadzorcze w Regierung von Unterfranken, Wuerzburg, Niemcy.
1. Obróbka tkanek i immunohistochemia
<ol>
	<li>Uśmiercić myszy za pomocą CO2 lub innej zatwierdzonej metody.</li>
	<li>Przeprowadzić perfuzję transkardialną sześciu 12-tygodniowych samców myszy C56Bl/6N przy użyciu 10 mL 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) z użyciem igły 25-G i pompy infuzyjnej, a następnie 70 mL 4% paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M PBS. 
	OSTROŻNIE: PFA jest toksyczny, alergizujący i rakotwórczy.</li>
	<li>Przeprowadzić sekcję mózgu myszy w płaszczyźnie czołowej za pomocą matrycy do cięcia mózgu w obszarze +0,74 mm od Bregmy (Rycina 25, atlas mózgu myszy Paxinosa i Franklina14).</li>
	<li>Umieścić grzbietową część mózgu, w tym istotę czarną (SN), w 4% PFA w 0,1 M PBS na 1 d w temperaturze 4 °C w celu fiksacji przez imersję.</li>
	<li>Zastąpić PFA 30% roztworem sacharozy/0,1 mol PBS w celu krioprotekcji i inkubować przez kolejne 2 d w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieścić grzbietową część mózgu w formie do kriotomii wypełnionej związkiem OCT (optimal cutting temperature) i powoli zamrozić tkankę w izopentanie chłodzonym suchym lodem. 
	OSTROŻNIE: Suchy lód jest ekstremalnie zimny (-78 °C); podczas pracy z suchym lodem należy używać środków ochrony indywidualnej (PPE), w tym rękawic. Suchy lód odparowuje do CO2, dlatego należy pracować pod wyciągiem.</li>
	<li>Wyciąć seryjnie 30-µm krioprzekroje w płaszczyźnie czołowej i zebrać sekcje, zaczynając od 2,46 mm od Bregmy (Rycina 51, atlas mózgu myszy Paxinosa i Franklina14) i kończąc na 4,04 mm od Bregmy (Rycina 64, atlas mózgu myszy Paxinosa i Franklina14).</li>
	<li>Przechowywać cztery serie w probówkach wypełnionych krioprotektorem (30% glicerolu, 30% etoksyetanolu i 40% PBS) w temperaturze -20 °C. Podczas procedury cięcia oznaczyć prawą półkulę, wykonując niewielkie nakłucie w górnym obszarze pnia mózgu.</li>
	<li>Do barwienia immunohistochemicznego wybrać jedną serię przekrojów na mysz. Preinkubować swobodnie pływające sekcje przez 1 h w 10% normalnym surowicy koziej (NGS)/2% BSA/0,5% detergentu w 0,1 mol PBS na shakerze. Inkubować sekcje z przeciwciałem króliczym przeciwko mysiej tyrozynowej hydroksylazie (TH; rozcieńczenie 1:1 000) rozcieńczonym w 2% NGS/2% BSA/0,5% detergentu w 0,1 mol PBS przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zastosować przeciwciała wtórne przeciwko króliczym immunoglobulinom (Ig) (rozcieńczenie 1:100) przez 2 h w temperaturze pokojowej, a następnie odczyn awidyna/biotyna (rozcieńczenie 1:100). Inkubować i barwić 3,3-diaminobenzydynotetrachlorowodorkiem (DAB) i H2O2. Po zabarwieniu zamontować sekcje na powlekanych szkiełkach przedmiotowych. 
	UWAGA: Dopaminergiczne neurony SN TH+ przedstawiono na Rycynie 1a. Poprzez zabarwienie jednej serii, na każde zwierzę zabarwiane jest średnio 13 sekcji SN, obejmujących od części rostralnej do kaudalnej części zwartej (SNpc) i siatkowatej istoty czarnej (Rycina 1b). Sekcje są oddzielone o 120 µm (1/4 serii) (Rycina 1c). 
	OSTROŻNIE: DAB jest podejrzany o działanie rakotwórcze. Jest toksyczny w przypadku kontaktu i inhalacji. Podczas pracy z DAB należy używać środków ochrony indywidualnej (PPE).</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie obrazów
<ol>
	<li>Wykonaj cyfrową akwizycję obrazów przekrojów SN barwionych immunohistochemicznie na TH, korzystając z oprogramowania obrazowego sprzężonego z mikroskopem. Każdy przekrój z jednej serii analizuj oddzielnie.</li>
	<li>Użyj opcji skanowania preparatu (scan slide) w oprogramowaniu obrazowym. Obrazy zapisz w formacie TIFF, aby zapewnić ich wysoką jakość (Rysunek 2). 
	UWAGA: Rozdzielczość obrazu wynosi 312 pikseli na cm.</li>
	<li>Naciśnij „Acquire”, aby otworzyć okno akwizycji (Rysunek 2a).</li>
	<li>Ustaw binning na „2” dla obrazów w skali szarości. 
	UWAGA: Akwizycja obrazów w skali szarości zamiast zdjęć kolorowych zmniejsza rozmiar końcowego pliku obrazu stosu (Rysunek 2a).</li>
	<li>Kliknij „Show Live” w oknie akwizycji, aby otworzyć nowe okno wyświetlające obraz przekroju na żywo (Rysunek 2a i b).</li>
	<li>Kliknij „Stage” w oknie akwizycji. W menu rozwijanym wybierz „Scan Slide” i zaznacz odpowiednie pole wyboru (Rysunek 2c). 
	UWAGA: Umożliwia to akwizycję i wyrównanie obrazów SN przy dużym powiększeniu (powiększenie 630X) w płaszczyźnie x,y, a także akwizycję obrazów stosu z odległością 1 µm między kolejnymi obrazami w płaszczyźnie z, obejmując całkowity zakres 13 µm.</li>
	<li>Wybierz obiektyw 2,5X, aby zlokalizować SN.</li>
	<li>Zmień obiektyw na 63x.</li>
	<li>Zdefiniuj lewy górny róg (TopLeft) (Rysunek 2c) oraz prawy dolny róg (LowRight) (Rysunek 2d) przekroju, klikając „Set”.</li>
	<li>Kliknij „Z-Series” i zaznacz pole „Z-Plane series” (Rysunek 2e).</li>
	<li>Wyznacz rzeczywistą grubość zamontowanych przekrojów w trzech losowo wybranych miejscach zliczania na każdy przekrój przy użyciu oprogramowania obrazowego. W tym celu kliknij „View Top Offset”, aby zdefiniować górną krawędź przekroju (Rysunek 2e), a następnie kliknij „Stop View Top” (Rysunek 2f). Następnie kliknij „View Bottom Offset” (Rysunek 2f), a potem „Stop View Bottom” (Rysunek 2g). Zapisz grubość przekroju.</li>
	<li>Odejmij 3 µm (strefa ochronna) od górnego offsetu i wpisz wynik w polu górnego offsetu (Rysunek 2h). Odejmij 13 µm (wysokość dysektora optycznego) od wartości górnego offsetu i wpisz wynik w polu dolnego offsetu (Rysunek 2i). Wybierz następujące parametry: steps, 14; size, 1,00 (Rysunek 2i). 
	UWAGA: Odpowiada to grubości 13 µm w płaszczyźnie z, z odległością 1 µm między kolejnymi obrazami.</li>
	<li>Wybierz katalog do zapisu pliku (Rysunek 2j).</li>
	<li>Kliknij „Sequence”, aby rozpocząć akwizycję (Rysunek 2j).</li>
	<li>Kliknij „Processing” i wybierz następujące parametry: „All Planes”, z opcji „Sequence”; „Montage” oraz pola „Fast” i „Stitching”, z nakładaniem obrazów na poziomie 10% (Rysunek 2k). Rozpocznij składanie (stitching) obrazów, klikając „start”. 
	UWAGA: Pozwoli to wygenerować obrazy stosu do analizy (Rysunek 2l, Rysunek 3a-e).</li>
</ol>
3. Kolejność oceny stereologicznej
<ol>
	<li>Przeprowadź analizę obrazów stosu SN przy użyciu oprogramowania NIH ImageJ w wersji 4.7.</li>
	<li>Pobierz z witryny ImageJ.nih.gov dwie wymagane wtyczki: wtyczkę „Grid Overlay”15 oraz wtyczkę „Cell Counter”16. Zainstaluj obie wtyczki zgodnie z opisem.</li>
	<li>W celu bezstronnej oceny stereologicznej zdefiniuj parametry zliczania w następujący sposób: rozmiar siatki 130 x 130 µm, ramka zliczania 50 x 50 µm oraz wysokość disektora optycznego 13 µm.</li>
	<li>Otwórz obraz, klikając „File”&#160;→ „Open” (Rycina 4a). Ustaw skalę obrazu za pomocą polecenia „Analyze”&#160;→ „Set Scale” (Rycina 4b). Na tym etapie zmień zdefiniowany rozmiar z pikseli na µm (Rycina 4c). 
	UWAGA: Dla analizowanych obrazów 425 pikseli odpowiada 100 µm.</li>
	<li>Wybierz polecenie „Plugins”&#160;→ „Grid”&#160;→ „Grid Type: Lines”, aby losowo wstawić siatkę. Zaznacz pole „Random Offset”. Zdefiniuj rozmiar jednego kwadratu wewnątrz siatki (kwadrat siatki) jako 130 µm x 130 µm = 16 900 µm2 (Rycina 3b oraz Rycina 4d i e).</li>
	<li>Zmień typ obrazu z 16-bitowego na RGB Color (kliknij „Image”&#160;→ „Type”&#160;→ „RGB Color”) (Rycina 4f). Zlokalizuj SNpc zgodnie z opisem Baqueta et al.17. Obrysuj SNpc za pomocą narzędzia „Paintbrush Tool” (szerokość pędzla: 11) (Rycina 3c i Rycina 4g-i).</li>
	<li>Cofnij polecenie „Set Scale”, klikając „Analyze” → „Set Scale” → „Click to Remove Scale” (Rycina 4j-l), aby umożliwić wykonywanie obliczeń w pikselach zamiast w µm.</li>
	<li>Zrób zrzut ekranu (Rycina 4m), zapisz plik obrazu i otwórz nowy plik w programie ImageJ (Rycina 4n). Wybierz „Point” (Rycina 4o) i szerokość pędzla 25 (Rycina 4p). Zaznacz każdy kwadrat siatki stykający się z SN w celu umieszczenia disektora optycznego (Rycina 4q). Przeprowadź analizę liczby komórek we wszystkich disektorach optycznych zlokalizowanych w całości lub częściowo w obrysowanym obszarze SN.</li>
	<li>Wybierz jeden kwadrat siatki, który obejmuje części SN. Zmierz górny lewy róg tego kwadratu kursorem w ImageJ, aby zdefiniować początkowe współrzędne x i y (Rycina 4r). 
	UWAGA: Współrzędne zostaną wprowadzone do pozycjonowania disektora optycznego przy użyciu arkusza „optical disector position” (Rycina 4s), zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
	<li>Oblicz pozycję disektora optycznego, korzystając z szablonu arkusza kalkulacyjnego zatytułowanego „Optical disector position”, zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
	<li>Skalibruj disektor optyczny (makro napisane przez Christophera S. Warda, Plik uzupełniający), klikając „Plugins” → „Macros” → „Edit” (Rycina 4t), otwórz plik „opt_dis_grid.txt” (Rycina 4u) i zdefiniuj rozmiar „usergrid” w pikselach, który odpowiada wymiarom x,y disektora optycznego (Rycina 4v). Wybierz rozmiar 50 µm x 50 µm, tak aby rozmiar jednego boku usergrid został zdefiniowany jako 212,5 piksela (50 x 4,25 piksela).</li>
	<li>Wyznacz pozycję disektora optycznego w obrazie stosu, wprowadzając współrzędne ImageX i ImageY definiujące środek disektora optycznego (Rycina 4v). Uruchom makro („Macros” → „Run Macro”) (Rycina 4w). 
	UWAGA: Siatka zniknie z obrazu stosu (Rycina 3d i Rycina 4x). Disektor optyczny będzie widoczny podczas przesuwania się w dół w płaszczyźnie z (Rycina 3e i Rycina 4x).</li>
	<li>Wybierz „Plugins”&#160;→ „Cell Counter”, aby uruchomić wtyczkę Cell Counter (Rycina 4y). Zainicjuj Cell Counter i wybierz typ znacznika (Rycina 4z). Powiększ obraz (kliknij „+”) i przeprowadź stereologiczną ocenę liczby komórek przy powiększeniu 200%.</li>
	<li>Zidentyfikuj perykaria neuronów dopaminergicznych po ich zaokrąglonym lub owalnym kształcie oraz wielkości komórek (Rycina 1a). Ilościowo określ liczbę komórek zgodnie z zasadami stereologii. 
	UWAGA: Ponieważ disektor optyczny jest trójwymiarową sześcianem (Rycina 5a), zdefiniuj ściany wykluczenia jako przednią, lewą i górną ścianę sześcianu (kolor czerwony). W związku z tym nie zliczaj komórek TH+, które stykają się z czerwoną linią (lewą i przednią) lub górną ścianą. Dodaj wyniki zliczania komórek do przygotowanego pliku arkusza kalkulacyjnego zatytułowanego „Calculation of cell count” (krok 5).</li>
	<li>Na podstawie obrazu SN oblicz kolejny kwadrat siatki, w którym należy umieścić disektor optyczny dla następnego zliczania komórek, stosując skoki x,y o rozmiarze nałożonej siatki (Rycina 5b) oraz szablon arkusza „Optical disector position”, zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
	<li>Przeprowadź oszacowanie liczby komórek za pomocą arkusza „Calculation of cell count” (krok 5).</li>
</ol>
4. Obliczanie pozycji optycznego dysektora przy użyciu szablonu arkusza kalkulacyjnego „Optical Disector Position”
<ol>
	<li>Oblicz rozmiar i pozycję każdego dysektora optycznego, który zostanie umieszczony w nakładającej się siatce w obrębie konturu SN (Rysunek 5b), korzystając z pliku arkusza kalkulacyjnego „Optical disector position.xlsx” (Plik uzupełniający).</li>
	<li>Wprowadź przelicznik pikseli na µm, określony przez polecenie „Set Scale”, w zaznaczone na żółto pola w pliku „Optical disector position.xlsx” (Rysunek 6a i Plik uzupełniający).</li>
	<li>Wprowadź planowany rozmiar dysektora optycznego oraz rozmiar pola siatki nakładającej się siatki, określony jako długość jednego boku (w µm), w zaznaczone na pomarańczowo pola. 
	UWAGA: Wyniki są przedstawione w czerwonych polach obok pól pomarańczowych.</li>
	<li>Zacznij od pola siatki w obrębie konturu SN, które zostało wyznaczone jako punkt startowy (wybrano jedno pole siatki na początek, zgodnie z krokiem 3.9 powyżej).</li>
	<li>Wprowadź współrzędne x i y, zmierzone w kroku 3.9, do zielonych pól w pliku (na podstawie tych wartości zostaną obliczone współrzędne x,y środka dysektora optycznego w tym pierwszym polu, a wyniki zostaną przedstawione w niebieskich polach). Uruchom makro opt_dis_grid.txt (Plik uzupełniający).</li>
	<li>Oblicz współrzędne x,y kolejnych dysektorów optycznych, wprowadzając odległość pola siatki (mierzoną w liczbie pól) względem pierwszego pola siatki (brązowe pola). 
	UWAGA: +x: pole siatki znajduje się po prawej stronie; -x: pole siatki znajduje się po lewej stronie; +y: pole siatki znajduje się na dole; -y: pole siatki znajduje się na górze. Wyniki są pokazane w szarych polach.</li>
</ol>
5. Szacowanie liczby komórek przy użyciu arkusza kalkulacyjnego „Obliczanie liczby komórek”
<ol>
	<li>Obliczyć szacowaną liczbę komórek SN TH+ na zwierzę (N), korzystając ze wzoru opublikowanego przez West et al., 19913, gdzie ∑Q- jest definiowane jako całkowita liczba neuronów TH+ policzonych we wszystkich disektorach optycznych jednego przekroju mózgu. 
	UWAGA: W równaniu uwzględniono wysokość disektora optycznego (h) w stosunku do zmierzonej grubości przekroju (t). Ułamek próbkowania powierzchni (asf) definiuje się jako stosunek powierzchni (A) ramki disektora optycznego (A optical disector) do powierzchni kwadratu siatki (A x,y step) (A optical disector/A x,y step) (Rysunek 3b), a ułamek próbkowania przekrojów (ssf) definiuje się jako stosunek liczby wybranych przekrojów do wszystkich seryjnie wyciętych przekrojów mózgu: 
	<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/56103/56103eq1.jpg" /> 
	Aby zapewnić wysoką jakość szacunków ilościowych, współczynnik błędu (CE) powinien być niższy niż 0,10. Wyznaczyć CE, korzystając ze wzoru Keuker et al., 200110: 
	<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/56103/56103eq2.jpg" /></li>
	<li>W celu stereologicznego oszacowania liczby komórek w obrębie SN każdej myszy, wprowadzić do żółtych pól w pliku arkusza kalkulacyjnego „Calculation of cell count.xlsx” (Rysunek 6b i Plik uzupełniający) wskazane informacje dotyczące całkowitej liczby wygenerowanych serii na mysz, wysokości disektora optycznego, powierzchni x,y disektora optycznego (A optical disector, w µm2), powierzchni x,y kwadratu siatki (A x,y step, w µm2) oraz średniej zmierzonej grubości przekroju (w µm).</li>
	<li>Przeanalizować każdy przekrój SN pochodzący od tego samego zwierzęcia, zgodnie z opisem w kroku 5.</li>
	<li>Wprowadzić liczby komórek dla każdego disektora optycznego w szarych polach, gdzie każda linia odnosi się do jednego przekroju SN, korzystając z pliku arkusza kalkulacyjnego „Calculation of cell count.xlsx” (Plik uzupełniający). 
	UWAGA: Szacowana liczba komórek oraz obliczony CE są przedstawione w niebieskich polach (Rysunek 6b).</li>
</ol>
6. Szacowanie liczby komórek przy użyciu dostępnego komercyjnie systemu stereologicznego
<ol>
	<li>Rozpocznij szacowanie liczby komórek dopaminergicznych SNpc, klikając „Probes” → „Optical Fractionator Workflow”, aby otworzyć okno Optical Fractionator Workflow. 
	UWAGA: Pojawi się nowe okno, w którym należy określić, czy będzie liczona nowa seria SN.</li>
	<li>Rozpocznij nową serię przekrojów SN TH+, klikając „Start a new subject” w wyskakującym oknie.</li>
	<li>Przejdź przez poszczególne etapy Optical Fractionator Workflow. W pierwszym kroku skonfiguruj obiekt. W tym celu wprowadź imię badacza, nazwę obiektu (grupa SN) oraz inne przydatne informacje. Wprowadź liczbę przekrojów do policzenia dla tego SN. Wprowadź grubość ciętych przekrojów tkanki. Wprowadź interwał przekrojów, który w tym przypadku wynosi cztery. Wprowadź losowo wyznaczony numer przekroju, od którego należy zacząć.</li>
	<li>W drugim kroku ustaw mikroskop na niskie powiększenie (obiektyw 2X) i wybierz „2X Mag Lens” z menu.</li>
	<li>W kroku 3 obrysuj lewym przyciskiem myszy obszar zainteresowania, którym jest SNpc, zgodnie z opisem Baquet et al., 200917.</li>
	<li>W kroku 4 ustaw mikroskop na wysokie powiększenie. W tym celu zmień obiektyw na 100X i wybierz „100X Mag lens” z menu rozwijanego.</li>
	<li>W kroku 5 zmierz grubość montowania, ustawiając ostrość na górną i dolną powierzchnię przekroju.</li>
	<li>W kroku 6 zdefiniuj rozmiar ramki zliczającej jako 50 x 50 µm; jest to rozmiar dysektora optycznego (x,y).</li>
	<li>W kroku 7 ustaw rozmiar siatki systematycznego losowania (SRS) na 130 x 130 µm.</li>
	<li>W kroku 8 wprowadź 3-µm strefę ochronną (guard zone).</li>
	<li>Zapisz ustawienia w kroku 9.</li>
	<li>Na koniec, w kroku 10 Optical Fractionator Workflow, policz komórki dopaminergiczne TH+ w każdym z dysektorów optycznych w obrębie siatki SRS. W tym celu kliknij przycisk „Counting”.</li>
	<li>Po zakończeniu analizy jednego przekroju kliknij przycisk „Begin Next Section”, aby rozpocząć Optical Fractionator Workflow dla następnego przekroju SN z tej samej serii SN.</li>
	<li>Gdy zostanie ilościowo określony ostatni przekrój SN w jednej serii SN, kliknij „I've Finished Counting”.</li>
	<li>Kliknij przycisk „View Results”, aby wyświetlić wyniki próbkowania stereologicznego.</li>
</ol>

<ol><li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV1%2F2-induced+overexpression+of+A53T-alpha-synuclein+in+the+substantia+nigra+results+in+degeneration+of+the+nigrostriatal+system+with+Lewy-like+pathology+and+motor+impairment%3A+a+new+mouse+model+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11(2017).</li>
<li>Ip, C. W., Beck, S. K., Volkmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+reduce+nigrostriatal+deficits+in+the+6-hydroxydopamine+mouse+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes reduce nigrostriatal deficits in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease.</a> J Neural Transm (Vienna). 122 (12), 1633-1643 (2015).</li>
<li>West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+thesubdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator.</a> Anat Rec. 231 (4), 482-497 (1991).</li>
<li>Schmitz, C., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereology+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Design-based stereology in neuroscience.</a> Neuroscience. 130 (4), 813-831 (2005).</li>
<li>Tieu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+neurotoxic+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">A guide to neurotoxic animal models of Parkinson's disease.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), e009316(2011).</li>
<li>Abercrombie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+nuclear+population+from+microtome+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Estimation of nuclear population from microtome sections.</a> Anat Rec. 94, 239-247 (1946).</li>
<li>Rose, R. D., Rohrlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+sectioned+cells+via+mathematical+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Counting sectioned cells via mathematical reconstruction.</a> J Comp Neurol. 263 (3), 365-386 (1987).</li>
<li>Weibel, E. R., Gomez, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+principle+for+counting+tissue+structures+on+random+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">A principle for counting tissue structures on random sections.</a> J Appl Physiol. 17, 343-348 (1962).</li>
<li>West, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-based+stereological+methods+for+counting+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Design-based stereological methods for counting neurons.</a> Prog Brain Res. 135, 43-51 (2002).</li>
<li>Keuker, J. I., Vollmann-Honsdorf, G. K., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+use+the+optical+fractionator%3A+an+example+based+on+the+estimation+of+neurons+in+the+hippocampal+CA1+and+CA3+regions+of+tree+shrews%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Protoc%22%5BJournal%5D)">How to use the optical fractionator: an example based on the estimation of neurons in the hippocampal CA1 and CA3 regions of tree shrews.</a> Brain Res Brain Res Protoc. 7 (3), 211-221 (2001).</li>
<li>Mouton, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+age+and+lipopolysaccharide+%28LPS%29-mediated+peripheral+inflammation+on+numbers+of+central+catecholaminergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">The effects of age and lipopolysaccharide (LPS)-mediated peripheral inflammation on numbers of central catecholaminergic neurons.</a> Neurobiol Aging. 33 (2), e427-e436 (2012).</li>
<li>Barreto, G. E., Sun, X., Xu, L., Giffard, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+proliferation+following+stroke+in+the+mouse+depends+on+distance+from+the+infarct%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Astrocyte proliferation following stroke in the mouse depends on distance from the infarct.</a> PLoS One. 6 (11), e27881(2011).</li>
<li>Robinson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructural+and+microglial+changes+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Microstructural and microglial changes after repetitive mild traumatic brain injury in mice.</a> J Neurosci Res. 95 (4), 1025-1035 (2017).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Rasband, W. Grid_Overlay.java. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</a> (2010).</li>
<li>De Vos, K. cell_counter.jar. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> (2010).</li>
<li>Baquet, Z. C., Williams, D., Brody, J., Smeyne, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+model-based+%282D%29+and+design-based+%283D%29+stereological+methods+for+estimating+cell+number+in+the+substantia+nigra+pars+compacta+%28SNpc%29+of+the+C57BL%2F6J+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A comparison of model-based (2D) and design-based (3D) stereological methods for estimating cell number in the substantia nigra pars compacta (SNpc) of the C57BL/6J mouse.</a> Neuroscience. 161 (4), 1082-1090 (2009).</li>
<li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoarchitectonic+and+chemoarchitectonic+analysis+of+the+dopamine+cell+groups+in+the+substantia+nigra%2C+ventral+tegmental+area%2C+and+retrorubral+field+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">A cytoarchitectonic and chemoarchitectonic analysis of the dopamine cell groups in the substantia nigra, ventral tegmental area, and retrorubral field in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 217 (2), 591-612 (2012).</li>
<li>German, D. C., Manaye, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midbrain+dopaminergic+neurons+%28nuclei+A8%2C+A9%2C+and+A10%29%3A+three-dimensional+reconstruction+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Midbrain dopaminergic neurons (nuclei A8, A9, and A10): three-dimensional reconstruction in the rat.</a> J Comp Neurol. 331 (3), 297-309 (1993).</li>
<li>Smeyne, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+Effects+of+MPTP+and+Paraquat+on+Dopaminergic+Neurons+and+Microglia+in+the+Substantia+Nigra+Pars+Compacta+of+C57BL%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of the Effects of MPTP and Paraquat on Dopaminergic Neurons and Microglia in the Substantia Nigra Pars Compacta of C57BL/6 Mice.</a> PLoS One. 11 (10), e0164094(2016).</li>
</ol>

C. W. I. zasiadał w radach naukowych Merz Pharmaceuticals, LLC i TEVA; otrzymał dofinansowanie na podróż od firm Ipsen, Merz Pharmaceuticals, LLC i Allergan, Inc.; i otrzymał honoraria mówców od Merz, TEVA i Allergan, Inc. poza zgłoszoną pracą. J. V. pełnił funkcję konsultanta dla Boston Scientific, Medtronic i AbbVie, a poza zgłoszoną pracą otrzymał honoraria od Medtronic, Boston Scientific, AbbVie, Bial, Allergan i GlobalKinetics.

Stereologia zaczyna się od przetwarzania tkanek. Seryjne cięcie tkanki SN musi być wykonywane ostrożnie, aby zapobiec utracie skrawków podczas analizy stereologicznej. Dodatkowo jednym z istotnych kroków jest zaznaczenie jednej półkuli w celu odróżnienia prawej od lewej SN podczas wykonywania stereologii. Umieszczenie maleńkiego otworu w górnej części pnia mózgu przyniosło najlepsze wyniki w prezentowanym badaniu. Ponadto, ponieważ praca z metodą frakcjonowania optycznego wymaga, aby tkanka była cięta na grube odcinki ok...

Kwantyfikacja liczby komórek neuronalnych jest kluczowa w przedklinicznych badaniach nad chorobą Parkinsona, mającej na celu określenie poziomu neurodegeneracji w obrębie istoty czarnej (SN)1,2. Bezstronne stereologiczne oszacowanie liczby komórek w obszarze zainteresowania jest uważane za złoty standard3,4,5.
Przed nadejściem bezstronnej stereologii, liczba neuronów w sekcjach była oceniana poprzez manipulowanie zliczonymi profilami komórek, aby skorygować zmienne prawdopodobieństwa, że neurony pojawią się w zasięgu wzroku w sekcji. Jedną z najczęściej stosowanych metod była korekta ilościowo określonej liczby komórek opisana przez Abercrombie6. W tej metodzie starano się wziąć pod uwagę, że komórki mogą być oznaczane ilościowo więcej niż raz, jeśli fragmenty tej samej komórki zostaną znalezione w sąsiednich cienkich sekcjach. W związku z tym Abercrombie i inni autorzy stworzyli równania, które wymagały założeń dotyczących kształtu, rozmiaru i orientacji zliczanych komórek7,8. Jednak założenia te zwykle nie były realizowane, a zatem prowadziły do błędów systematycznych i rozbieżności z rzeczywistą liczbą komórek (tj. stronniczości). Co więcej, odchylenie nie mogło zostać zmniejszone przez dodatkowe próbkowanie3.
Do stereologicznego szacowania liczby komórek za pomocą optycznego frakcjonatora, stosuje się zasady matematyczne do bezpośredniego szacowania liczby komórek bezpośrednio w określonej, trójwymiarowej objętości. Zaletą tej metody jest to, że nie wiąże się z założeniami dotyczącymi kształtu, rozmiaru i orientacji liczonych komórek. W związku z tym szacowane liczby komórek są bliższe rzeczywistym wartościom i zbliżają się wraz ze wzrostem wielkości próbki (tj. bezstronne)3. Ponieważ podczas korzystania ze stereologii należy przestrzegać wielu zasad, aby metoda była bezstronna, opracowano gotowe do użycia komercyjne systemy stereologii (przegląd patrz Schmitz i Hof, 20054). Wyspecjalizowane systemy stereologiczne wdrażają metody stereologiczne oparte na projektowaniu z a priori zdefiniowanymi sondami i schematami próbkowania do ocen stereologicznych, które prowadzą do niezależności od kształtu, rozmiaru, rozkładu przestrzennego i orientacji analizowanych komórek4,9. Jednak dostępne na rynku systemy stereologiczne są drogie; Może to ograniczyć implementację w nowych badaniach.
Celem tego badania było opracowanie użytecznej techniki do stereologicznego szacowania liczby komórek dopaminergicznych w mysim SN opartej na projektowaniu, wykorzystując metodę optycznego frakcjonowania i używając standardowego sprzętu do mikroskopii (tj. mikroskopu świetlnego, standardowego oprogramowania mikroskopu i zmotoryzowanego stolika x, y, z). W tym celu przedstawiono przewodnik krok po kroku, jak przetwarzać tkankę mózgową myszy i jak oszacować liczbę komórek SN przy użyciu bezstronnej stereologii opartej na projektowaniu. Ponadto dostępne są szablony do obliczania szacowanej liczby komórek i współczynników błędu (CE).
Opisana tutaj metoda nie ogranicza się do analizy SN, ale może być dostosowana do użycia w innych anatomicznie zdefiniowanych regionach mózgu myszy lub szczura. Na przykład, bezstronna stereologia została wykorzystana do oszacowania liczby komórek neuronalnych w hipokampie10 i locus coeruleus11. Dodatkowo można również ocenić typy komórek inne niż neurony, takie jak astrocyty12 i microglia13. Dlatego metoda ta może być przydatna dla naukowców, którzy zamierzają wdrożyć bezstronną stereologię w swoich badaniach, ale nie są skłonni wydawać dużych pieniędzy na zakup systemu stereologicznego.

<table><tbody><tr>Atlas <td></td><td></td><td>myszy Paxinos</td><td>Mózg myszy George Paxinos Keith B.J.FranklinCopyright @2001 by Academic Press CD Rom zaprojektowany i stworzony przez Paula Halasza</td></tr> Mózg <tr><td>Matrix Slicer Mysz</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS 001-1</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza /D(+) Sacharoza</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>izopentan</td><td>Roth</td><td>3927.1</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Merck</td><td>1040931000</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>fosforanowy buforowany sola fizjologiczna Składniki: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sodium chloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>diwodorofosforan potasu</td><td>Merck</td><td>1048731000</td><td></td></tr><tr><td>wodorofosforan disodu dwuwodny</td><td>Merck</td><td>1065801000</td><td></td></tr><tr><td>chlorek potasu</td><td>Merck</td><td>1049360500</td><td></td></tr><tr><td>normalna surowica kozia</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A4503-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100-100ml</td><td>detergent</td></tr><tr><td>3,3-diaminobenzydyna-tetrahydrochlorid/DAB tabletki 10mg pH 7,0</td><td>Kem En Tec</td><td>4170</td><td></td></tr><tr><td>H2O2/ Nadtlenek wodoru 30%</td><td>Merck</td><td>1072090250</td><td></td></tr><tr><td>awidyna/biotyna odczynnik</td><td>Thermo Scientific</td><td>32050</td><td>Standard Ultra Sensitive ABC Staining Kit, 1:100</td></tr><tr><td>królik przeciwciało przeciw mysiej hydroksylazie tyrozynowej</td><td>abcam</td><td>Ab112</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>biotynylowane kozie przeciwciało anty-królikowe IgG H+L</td><td>laboratoria wektorowe</td><td>BA-1000</td><td>1:100</td></tr><tr><td>StereoInvestigator wersja 11.07</td><td>MBF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BX53</td><td>mikroskop Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visiview</td><td>Visitron Systems GmbH</td><td>3.3.0.2</td><td></td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td>Oprogramowanie Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>Wersja 4.7</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-TEK OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr> wtyczka nakładki <tr><td>siatki suchego lodu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Wayne Rasband</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html</td></tr><tr><td>wtyczka licznika komórek</td><td>Kurt de Vos</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).&nbsp;</td></tr><tr><td>disekcja optyczna makro</td><td>Christopher Ward</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6N samce myszy</td><td>Charles River, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka obiektowe z powłoką SuperFrost Plus</td><td>Langenbrinck, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła 25G Microlance 3</td><td>BD</td><td>300400</td><td></td></tr><tr><td>REGLO Analogowa pompa infuzyjna</td><td>System Ismatec</td><td>ISM 829</td><td></td></tr><tr><td>StereoInvestigator</td><td></td><td></td><td>StereoInvestigator wersja 11.07</td></tr><tr>Mikroskop <td></td><td></td><td>BX53</td><td>Mikroskop BX53</td></tr><tr><td>samodzielna stereologia</td><td></td><td></td><td>Visiview</td></tr><tr><td>Axiophot2</td><td></td><td></td><td>Axiophot2</td></tr></tbody></table>

stereologiczne oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu frakcjonatora optycznego i standardowego sprzętu mikroskopowego

Stereological Estimation of Dopaminergic Neuron Number in the Mouse Substantia Nigra Using the Optical Fractionator and Standard Microscopy Equipment

W przedklinicznych badaniach nad chorobą Parkinsona, analiza drogi nigrostriatalnej, w tym kwantyfikacja utraty neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej, jest niezbędna. Aby oszacować całkowitą liczbę neuronów dopaminergicznych, bezstronna stereologia przy użyciu metody frakcjonowania optycznego jest obecnie uważana za złoty standard. Ponieważ teoria stojąca za metodą frakcjonowania optycznego jest złożona, a stereologia jest trudna do osiągnięcia bez specjalistycznego sprzętu, istnieje kilka dostępnych na rynku kompletnych systemów stereologicznych, które zawierają niezbędne oprogramowanie, wyłącznie ze względu na liczenie komórek. Ponieważ zakup specjalistycznego zestawu do badań geologicznych nie zawsze jest wykonalny z wielu powodów, w niniejszym raporcie opisano metodę stereologicznego szacowania liczby dopaminergicznych komórek neuronalnych przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego, w tym mikroskopu świetlnego, zmotoryzowanego stołu obiektów (płaszczyzna x, y, z) z oprogramowaniem do obrazowania oraz komputera do analizy. Podano wyjaśnienie krok po kroku, jak przeprowadzić stereologiczną kwantyfikację przy użyciu metody frakcjonowania optycznego, a także udostępniono wstępnie zaprogramowane pliki do obliczania szacowanej liczby komórek. Aby ocenić dokładność tej metody, przeprowadzono porównanie z danymi uzyskanymi z komercyjnie dostępnego aparatu do badania stereologicznego. Porównywalne liczby komórek znaleziono przy użyciu tego protokołu i urządzenia stereologicznego, demonstrując w ten sposób precyzję tego protokołu dla bezstronnej stereologii.

Stosując przedstawioną metodę, szacowana liczba neuronów dopaminergicznych TH+ w prawej SN mieściła się w zakresie od 7 363 do 7 987 komórek, a w lewej SN od 7 446 do 7 904 komórek. Zatem średnia liczba neuronów dopaminergicznych (± SEM) wynosiła 7 647 ± 83 komórki dla prawej SN i 7 675 ± 66 dla lewej SN. Obliczona wartość CE dla każdego zwierzęcia była niższa niż 0,08 (zakres: 0,073–0,079) (Rycina 7). Aby ocenić porównywalność tej metody z komercyjnie dostęp...

Ta praca przedstawia krok po kroku protokół bezstronnego stereologicznego szacowania liczby komórek neuronalnych dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego (tj. mikroskopu świetlnego, zmotoryzowanej tabeli obiektów (płaszczyzna x, y, z) oraz oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu.

Stereologiczne oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu frakcjonatora optycznego i standardowego sprzętu mikroskopowego

In pre-clinical Parkinson&#39;s disease research, analysis of the nigrostriatal tract, including quantification of dopaminergic neuron loss within the ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opis opartej na projekcie stereologicznej oceny liczby komórek dopaminergicznych w SN myszy przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego. Metoda ta jest przydatna do szacowania liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy w przedklinicznych badaniach nad chorobą Parkinsona z wykorzystaniem nieobciążonej stereologii opartej na projekcie. Główną zaletą tej techniki jest możliwość jej przeprowadzenia przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego, bez konieczności posiadania komercyjnie dostępnego, kompletnego zestawu do stereologii.Procedurę zademonstruje Louisa Friez, technik z mojego laboratorium. Rozpocznij od umieszczenia utrwalonego paraformaldehydem mózgu myszy w matrycy do mózgu i wykonania cięcia 0,74 mm za bregma. Przenieś tylną część mózgu, obejmującą SN, do 4% PFA w 0,1 M i utrwalaj przez noc w temperaturze 4 °C.Następnego dnia należy zastąpić PFA 30% sacharozą w 0,1 M PBS i inkubować przez kolejne dwa dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu krioprotekcji próbki. Po dwóch dniach, gdy mózg opadnie na dno roztworu sacharozy, należy umieścić tkankę w formie do kriomaterialów (Cryomold) wypełnionej związkiem OCT (optimal cutting temperature compound) i powoli zamrozić tkankę w izopentanie chłodzonym suchym lodem. Przy użyciu kriostatu należy wykonać seryjne cięcia kriosekcji o grubości 30 mikronów w płaszczyźnie wieńcowej.Oznacz prawą półkulę, wykonując niewielkie nakłucie w górnym obszarze pnia mózgu. Pobierz cztery serie przekrojów, zaczynając od poziomu -2,46 mm od bregmy i kończąc na 4,04 mm od bregmy. Przenieś każdą serię przekrojów do probówki wypełnionej krioprotektantem i przechowuj w temperaturze -20 °C.Przechwyć cyfrowe obrazy preparatów przekrojów SN barwionych immunohistochemicznie pod kątem hydroksylazy tyrozynowej, korzystając z oprogramowania do obrazowania połączonego z mikroskopem. Rozpocznij od określenia rzeczywistego montażu i grubości przekrojów w trzech losowo wybranych miejscach liczenia na każdy przekrój. Najpierw kliknij „view top offset”, aby zdefiniować górną krawędź przekroju.Następnie kliknij stop view top. Po tym kliknij view bottom offset, a następnie stop view bottom. Zapisz grubość przekroju.Oblicz strefę ochronną, odejmując trzy mikrony od górnego przesunięcia (top offset), a następnie wpisz wynik w polu górnego przesunięcia. Następnie od wartości górnego przesunięcia odejmij wysokość dysekktora optycznego wynoszącą 13 mikronów i wpisz wynik w polu dolnego przesunięcia (bottom offset). Wybierz następujące parametry: krok 14, rozmiar 1,00.Wybierz katalog do zapisania pliku. Kliknij sequence, aby rozpocząć akwizycję. Po pozyskaniu obrazów kliknij processing i wybierz następujące parametry: all planes from sequence, montage oraz zaznacz pola fast i stitching, ustawiając nakładanie się obrazów (image overlap) na 10%. Kliknij start, aby rozpocząć proces zszywania obrazów.Pozwoli to na wygenerowanie stosów obrazów do analizy. Aby zacząć, otwórz obraz, klikając Plik, a następnie Otwórz. Ustaw skalę obrazu, korzystając z polecenia Analizuj i Ustaw skalę.W tym kroku zmień zdefiniowany rozmiar z pikseli na mikrony. Wybierz polecenia plugins, następnie grid, a potem grid type lines, aby losowo wstawić siatkę. Zaznacz pole random offset.Zdefiniuj rozmiar jednego kwadratu w siatce jako 130 µm na 130 µm, co odpowiada 16 900 µm². Zmień typ obrazu z 16-bitowego na kolor RGB, klikając w obraz, następnie w typ, a potem w kolor RGB. Zlokalizuj istotę czarną część zwartą.Obrysuj obszar za pomocą narzędzia pędzla (paintbrush tool), ustawiając szerokość pędzla na 11. Cofnij polecenie ustawienia skali (set scale), klikając Analyze, następnie Set Scale, a następnie klikając Remove Scale, aby obliczenia były wykonywane w pikselach, a nie w mikronach. Wykonaj zrzut ekranu, zapisz plik obrazu i otwórz nowy plik w programie ImageJ.Wybierz pędzel i szerokość pędzla 25. Zaznacz każdy kwadrat siatki, który styka się z SN, w celu rozmieszczenia dyssektora optycznego. Wybierz jeden kwadrat siatki, który obejmuje części SN. Za pomocą kursora w programie ImageJ zmierz górny lewy róg kwadratu, aby zdefiniować początkowe współrzędne x i y.Wybierz szablon arkusza kalkulacyjnego zatytułowany „optical dissector position” i oblicz pozycję dyssektora optycznego. Następnie oszacuj liczbę komórek, korzystając z arkusza obliczeń liczby komórek, zgodnie z opisem zawartym w pisemnej części protokołu. Ten obraz przy małym powiększeniu przedstawia przekrój mózgu myszy po barwieniu TH w celu wykazania neuronów dopaminergicznych.Przy większym powiększeniu przedstawiono neurony dopaminergiczne wykazujące obecność TH. Wstawka pokazuje zaznaczony obszar przy większym powiększeniu. Na tym obrazie widoczna jest seria przekrojów SN barwionych pod kątem obecności TH, obejmująca cały obszar SN myszy od strony rostralnej do kaudalnej.Każdy przekrój jest oddzielony od następnego odległością 120 micronów. Liczbę neuronów wykazujących pozytywną reakcję na TH w prawym i lewym SN myszy oszacowano za pomocą metody przedstawionej w tym filmie oraz przy użyciu dostępnego komercyjnie systemu stereologicznego. Jak widać, obie metody pozwoliły uzyskać porównywalną liczbę komórek i nie stwierdzono istotnych różnic między zestawami danych.Należy pamiętać, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony osobistej, w tym rękawic ochronnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić nieobciążoną stereologiczną szacunkową liczbę neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy, wykorzystując metodę ułamka optycznego oraz standardowy sprzęt mikroskopowy.

stereological-estimation-dopaminergic-neuron-number-mouse-substantia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Dopamina jest w sposób odrębny regulowana w jądrach śródmózgowia, w których znajdują się ciała komórek i dendryty neuronów dopaminergicznych. W niniejszej pracy opisujemy metodę sekcji i obchodzenia się z próbkami, mającą na celu maksymalizację wyników, a tym samym wniosków i spostrzeżeń, dotyczących regulacji dopaminy w jądrach śródmózgowia: w istocie czarnej (SN) oraz polu brzuszno-przyśrodkowym (VTA) u gryzoni.

Kompleksowe profilowanie regulacji dopaminy w istocie czarnej i polu brzuszno-przyponowym

Ten film pokazuje proces ilościowego określania akumulacji alfa-synukleiny w embrionalnych mysich neuronach dopaminowych wstępnie potraktowanych wstępnie uformowanymi włókienkami alfa-synukleiny. Przedstawia etapy utrwalania, barwienia i ilościowego oznaczania neuronów dopaminowych zawierających agregaty alfa-synukleiny za pomocą immunofluorescencji.

Badanie akumulacji alfa-synukleiny w pierwotnych embrionalnych mysich neuronach dopaminowych

Źródło: Olesen, M. V., et al. Technika frakcjonowania optycznego do szacowania liczby komórek w szczurzym modelu terapii elektrowstrząsowej. J. Vis. exp. (2017).  Film demonstruje technikę ilościowego określania nowo wygenerowanych neuronów w tkance mózgowej. Wycinki tkanki hipokampa zawierające neurony znakowane bromodeoksyurydyną (BrdU) wybarwiono za pomocą immunohistochemii, a następnie określono ilościowo na całej grubości tkanki przy użyciu techniki frakcjonowania optycznego.

Kwantyfikacja nowo wygenerowanych neuronów w tkance mózgowej szczura przy użyciu techniki frakcjonowania optycznego

Ten protokół opisuje dwie różne manipulacje środowiskowe oraz równoległy protokół infuzji mózgu do badania wywołanych przez środowisko zmian w mózgu, leżących u podstaw adaptacyjnego zachowania i naprawy mózgu u dorosłych myszy.

Środowiskowe modulacje liczby neuronów dopaminowych śródmózgowia u dorosłych myszy

W chorobie Parkinsona (PD) neurony dopaminergiczne istoty czarnej (SNc) ulegają degeneracji, co prowadzi do dysfunkcji motorycznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli neuronów brzusznej części śródmózgowia od myszy wyrażającej eGFP napędzany sekwencją promotora hydroksylazy tyrozyny (TH), zbierania pojedynczych neuronów fluorescencyjnych z kultur i pomiaru ich transkryptomu za pomocą sekwencji RNA.

Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH

Tutaj prezentujemy metodę stereologiczną, frakcjonator optyczny, używany do ilościowego określenia powstawania nowych neuronów i ich przeżycia w hipokampie szczura po stymulacji elektrowstrząsowej. Przy prawidłowym wdrożeniu, czułość i wydajność metod stereologicznych zapewnia dokładne oszacowania ze stałą i z góry określoną precyzją.

Technika frakcjonowania optycznego do szacowania liczby komórek w szczurzym modelu terapii elektrowstrząsowej

Identyfikacja receptora D1-alfa dopaminy w jądrze półleżącym jest kluczowa dla wyjaśnienia dysfunkcji receptora D1 podczas choroby ośrodkowego układu nerwowego. Przeprowadziliśmy nowatorski test hybrydyzacji RNA in situ, aby uwidocznić pojedyncze cząsteczki RNA w określonym obszarze mózgu.

Identyfikacja receptora dopaminowego D1-alfa w jądrze półleżącym gryzoni za pomocą innowacyjnej technologii wykrywania RNA in situ

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Długość włókien neuronalnych w trójwymiarowej strukturze obszaru mózgu jest wiarygodnym parametrem do ilościowego określenia specyficznej integralności strukturalnej neuronów lub zwyrodnienia. W tym artykule opisano na przykład stereologiczną metodę kwantyfikacji do pomiaru długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta u myszy.

Stereologiczne oszacowanie długości włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym Meynerta mózgu myszy

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

Tutaj prezentujemy zautomatyzowaną metodę półilościowego określania liczby neuronów dopaminergicznych u szczurzej istoty czarnej pars compacta.

Półilościowe oznaczanie gęstości neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej modeli gryzoni przy użyciu automatycznej analizy obrazu

Poznaj metodę stereologicznego szacowania neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu standardowego sprzętu mikroskopowego. Ta technika umożliwia dokładną kwantyfikację komórek w badaniach nad chorobą Parkinsona.

Stereologiczne oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu frakcjonatora optycznego i standardowego sprzętu mikroskopowego (Wideo) | JoVE Journal

Stereologiczne oszacowanie liczby neuronów dopaminergicznych w istocie czarnej myszy przy użyciu frakcjonatora optycznego i standardowego sprzętu mikroskopowego

Przeglądaj więcej filmów