Badanie akumulacji alfa-synukleiny w pierwotnych embrionalnych mysich neuronach dopaminowych

Weźmy na przykład mikro-wyspowe kultury pierwotnych embrionalnych mysich neuronów dopaminowych na wielodołkowej płytce zawierającej pożywkę.

Neurony te są wstępnie traktowane wstępnie uformowanymi włókienkami (PFF) - nieprawidłowo sfałdowanymi i zagregowanymi formami białka alfa-synukleiny.

PFF działają jak nasiona, wywołując dalsze nieprawidłowe fałdowanie i oligomeryzację endogennej alfa-synukleiny, tworząc fosforylowane fibryle alfa-synukleinowe. Włókna te ostatecznie tworzą ciała Lewy'ego.

Zastąp pożywkę utrwalaczem, aby zachować morfologię komórkową.

Umyj komórki buforem.

Wprowadź bufor zawierający detergent, aby przepuszczalnie błony komórkowe.

Dodaj roztwór blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.

Dodaj pierwotne przeciwciała skierowane przeciwko fosforylowanej alfa-synukleiny i białku referencyjnemu ulegającemu wszechobecnej ekspresji w neuronach dopaminowych.

Umyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.

Wprowadzić przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem skierowane przeciwko odpowiednim przeciwciałom pierwszorzędowym.

Umyć ponownie, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.

Dodaj barwnik wiążący DNA, aby zabarwić jądra.

Za pomocą skanera płyte