Badanie akumulacji alfa-synukleiny w pierwotnych embrionalnych mysich neuronach dopaminowych

Weźmy na przykład mikro-wyspowe kultury pierwotnych embrionalnych mysich neuronów dopaminowych na wielodołkowej płytce zawierającej pożywkę.

Neurony te są wstępnie traktowane wstępnie uformowanymi włókienkami (PFF) - nieprawidłowo sfałdowanymi i zagregowanymi formami białka alfa-synukleiny.

PFF działają jak nasiona, wywołując dalsze nieprawidłowe fałdowanie i oligomeryzację endogennej alfa-synukleiny, tworząc fosforylowane fibryle alfa-synukleinowe. Włókna te ostatecznie tworzą ciała Lewy'ego.

Zastąp pożywkę utrwalaczem, aby zachować morfologię komórkową.

Umyj komórki buforem.

Wprowadź bufor zawierający detergent, aby przepuszczalnie błony komórkowe.

Dodaj roztwór blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał.

Dodaj pierwotne przeciwciała skierowane przeciwko fosforylowanej alfa-synukleiny i białku referencyjnemu ulegającemu wszechobecnej ekspresji w neuronach dopaminowych.

Umyć w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał.

Wprowadzić przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem skierowane przeciwko odpowiednim przeciwciałom pierwszorzędowym.

Umyć ponownie, aby usunąć niezwiązane przeciwciała.

Dodaj barwnik wiążący DNA, aby zabarwić jądra.

Za pomocą skanera płytek fluorescencyjnych określ ilościowo neurony dopaminowe zawierające cytoplazmatyczne agregaty alfa-synukleiny.

Dodaj 3,75 mikrolitra po 100 mikrogramów na mililitr wstępnie uformowanych włókien do każdej studzienki doświadczalnej i 3,75 mikrolitra PBS do każdej studzienki kontrolnej.

Podczas pracy z PFF należy uważać na niepożądane zanieczyszczenie białkami, a następnie wyczyścić maskę i wszystkie instrumenty związane z PFF za pomocą 1% SDS i 70% etanolu.

W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym, po wybarwieniu markerów będących przedmiotem zainteresowania, załadować 96-dołkową płytkę hodowlaną do skanera płytek o wysokiej zawartości, wyposażonego w obiektyw o powiększeniu 10x. Dostosuj ustawienia zgodnie ze specyfikacjami płytki 96-dołkowej, takimi jak typ płytki, producent, rozmiar, odległość między dołkami oraz rodzaj i objętość medium.

Wybierz obszar obrazowania studzienek, aby pokryć wszystkie komórki w każdej mikrowyspie, i użyj jednego dołka, aby dostosować autofokus do wyrażenia DAPI. Skalibrować czas akwizycji dla każdego kanału fluorescencyjnego, w oparciu o intensywność barwienia w studzienkach kontrolnych, i dostosować parametry tak, aby komórki dopaminy w wstępnie uformowanych studzienkach kontrolnych traktowanych fibrylami, zawierające agregaty fosfoseryny 129 alfa synukleiny w somie komórki, były wyraźnie rozróżnione, co pozwala na jednoznaczne określenie ilościowe komórek dodatnich i ujemnych fosfoseryny alfa synukleiny.

Następnie zobrazuj wszystkie wybrane studzienki jednocześnie we wszystkich kanałach, używając dokładnie tych samych parametrów dla każdej studni.