Horizontal Whole Mount: nowatorski protokół przetwarzania i obrazowania dla grubych, trójwymiarowych przekrojów tkanek skóry

Ogólnym celem tego protokołu histologicznego i obrazowania jest przedstawienie solidnego systemu, który zachowuje antygenowość epitolu i integralność strukturalną skóry, co pozwala na pełne wykorzystanie metod obrazowania konfokalnego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, w przypadku których istnieje wymóg zbadania natury dowolnego typu komórki w złożonej trójwymiarowej architekturze tkankowej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu ze standardowymi technikami histologicznymi jest to, że jest solidna i łatwa do wykonania.

Dodatkowo protokół doskonale uzupełnia analizę trójwymiarową w mikroskopii konfokalnej. Zacznij od przycięcia skóry pobranej z grzbietowej części przyśrodkowej myszy na prostokątne kawałki. Każdy kawałek powinien być zwymiarowany tak, aby zmieścił się na dnie krioformy.

Pokazano tutaj obszar skóry grzbietowej o wymiarach jednego centymetra kwadratowego, który mieści się w kriomold o wymiarach 22 milimetry na 30 milimetrów na 20 milimetrów. Po zamocowaniu wepchnij umytą skórę na dno formy wypełnionej OCT tak, aby leżała równo z dnem. Zaznacz orientację mieszków włosowych na krioformie, ponieważ określa to orientację cięcia kriometrycznego.

Przenieś kriobloki na metalową płytkę w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni, aby zapobiec unoszeniu się i przemieszczaniu tkanki. Monitoruj proces zamrażania, aby utrzymać orientację skóry na dnie krioformy, ponieważ niewidoczne pęcherzyki powietrza mogą powodować unoszenie się skóry na powierzchnię krioformy. Rozpocznij od zamocowania zamrożonego kriobloku do etapu kriostatu z orientacją mieszków włosowych, jak wskazano na kriofordzie wzdłuż płaszczyzny przekroju.

Prawidłowe ustawienie dokładnej orientacji mieszków włosowych na kriostatu ma kluczowe znaczenie, ponieważ ten krok określa płaszczyznę przekroju, która generuje plastry skóry z nienaruszonymi mieszkami włosowymi na całej długości. Użyj kriostatu, aby wyciąć odcinek o grubości 100 mikronów. Chwyć OCT wokół osadzonego kawałka skóry za pomocą kleszczy i przenieś wycinek z kriostatu do 100-milimetrowej kultury wypełnionej PBS.

W temperaturze pokojowej PBS rozpuści OCT, pozostawiając plastry skóry, które są łatwe do obchodzenia się z kleszczami. Po pocięciu użyj kleszczy, aby przenieść pływające skrawki skóry do dołka 12-dołkowej płytki zawierającej 2,5 mililitra PBS. Znakowanie immunofluorescencyjne należy rozpocząć od dodania 500 mikrolitrów buforu PB do znakowanych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych.

Ostrożnie użyj kleszczyków, aby przenieść plastry skóry z płytki 12-dołkowej do probówek w celu zablokowania. Upewnij się, że wszystkie plasterki skóry są całkowicie zanurzone. Umieść probówki do mikrowirówek na kołysce piły z prędkością 10 oscylacji na minutę lub mniej, przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Oznaczyć oddzielne 1,5 mililitra mikroprobówki wirówkowe dla każdego plastra skóry i dodać 500 mikrolitrów buforu PB zawierającego odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego. Po godzinie blokowania przenieś plastry skóry do świeżo przygotowanych probówek zawierających przeciwciała. Inkubuj plastry w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc na niskich obrotach na bujaku.

Następnego dnia przenieś plastry do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych zawierających 500 mikrolitrów PBS i myj przez godzinę w temperaturze pokojowej na bujaku. Następnie przenieś plastry do oddzielnych 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych zawierających 500 mikrolitrów buforu PB o odpowiednim stężeniu przeciwciał drugorzędowych i DAPI. Inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę z kołysaniem, w razie potrzeby próbki można przechowywać do czterech dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego przetwarzania.

Przed obrazowaniem przenieś plastry skóry do oddzielnych probówek mikrowirówek zawierających 500 mikrolitrów PBS w celu przepłukania przeciwciał drugorzędowych i DAPI. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mililitry na 50 mililitrów na ciemnym tle pod mikroskopem preparacyjnym. Następnie użyj pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów z odciętym końcem końcówki, aby dodać jedną kroplę 100% glicerolu na szkiełko nakrywkowe.

Przenieś plasterek skóry z probówki do mikrowirówki na kroplę glicerolu. Następnie, patrząc przez mikroskop preparacyjny, użyj spiczastych kleszczy, aby ostrożnie rozwinąć zwinięte plastry skóry, nakłaniając je do powrotu do naturalnego kształtu, unosząc się w glicerolu. Nie zmuszaj do nienaturalnego prostowania plastra, ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanki.

Gdy cała długość odcinka jest odpowiednio zorientowana i spłaszczona na szkiełku nakrywkowym. Zamontuj tkankę na zwykłym szkiełku mikroskopowym, ten krok jeszcze bardziej wyprostuje plasterek skóry. Zobrazuj skrawki skóry zamontowane na glicerolu w ciągu najbliższych dwóch dni.

Zdjęcie przedstawia klasycznie uzyskany skriogeniczny wycinek skóry o grubości 10 mikronów oznaczony integryną alfa sześć i integryną alfa osiem, w celu uwidocznienia odpowiednio przedziału naskórka i mięśni kierunkowych pilusów. Ten przekrój poprzeczny tkanki 3D o grubości 100 mikronów został oznaczony w ten sam sposób. Pokazany obraz przedstawia maksymalne rzuty dużego stosu z.

Szczegóły z obu obrazów są porównywane obok siebie, w klasycznych zamrożonych sekcjach większość mieszków włosowych uwidocznionych za pomocą integryny alfa sześć nie została przecięta na całej długości, generując głównie niekompletne mieszki włosowe na sekcję, w porównaniu z poziomymi całymi mocowaniami. Nienaruszone mieszki włosowe i nienaruszone mięśnie arrector pili określono ilościowo zarówno w klasycznej, jak i poziomej sekcji montażu domowego. Określono ilościowo jeden odcinek do replikacji biologicznej, jak widać tutaj, cały odcinek mount ma większy odsetek nienaruszonych mieszków włosowych i mięśni arrector pili.

Po opanowaniu, ta technika kriosekcji może być wykonywana z prędkością ponad 15 sekcji na minutę, przy jednoczesnym uzyskaniu idealnie zorientowanych próbek, jeśli montaż został wykonany prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przetwarzać i analizować przekroje grubych tkanek w środowisku trójwymiarowym.