Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Ogólnym celem tego protokołu jest uzyskanie jednorodnych indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metoda ta może być stosowana do pozyskiwania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wielu celów, w tym do modelowania chorób, badań przesiewowych leków lub do pozyskiwania komórek do przedklinicznych badań klinicznych terapii komórkowej. Zaletą tego protokołu jest to, że jest solidny i generuje jednorodne komórki, które są utrzymywane w przyjaznym dla użytkownika, wolnym od ksenotypów i w pełni zdefiniowanym chemicznie systemie hodowli.

Ponieważ ludzkie komórki iPS rekapitulują tło genetyczne tkanki dawcy i mogą być potencjalnie różnicowane w dowolny typ komórek istotny dla choroby, stanowią doskonałe narzędzia do modelowania prac dyplomowych. Biopsja, sekcja i pobieranie kolonii to skomplikowane procedury. Obserwowanie ich wykonywanych doświadczonymi rękami pomaga w zrozumieniu procedur i ułatwia ich powtarzanie.

Dzisiejszą procedurę zademonstrują Harriet RonnHolm i Kelly Day, dwie bardzo doświadczone techniki laboratoryjne z iPS Core Facility w Karolinska Institutet. Próbki z biopsji skóry mogą być przechowywane w PBS z 1% penicyliną streptomycyną do 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, ale powinny być przetwarzane tak szybko, jak to możliwe po ich uzyskaniu. Przenieś biopsję do 35-milimetrowej naczynia.

Zanurz biopsję skóry w 35-milimetrowym naczyniu z dwoma mililitrami 70% etanolu na 30 sekund. Dodaj jeden mililitr sterylnego roztworu soli Hank's Balanced Salt Solution uzupełnionego 1% streptomycyną penicyliny do nowego 35-milimetrowego naczynia i przenieś biopsję do nowego naczynia. Przenieś biopsję do czterech 35-milimetrowych naczyń wypełnionych jednym mililitrem świeżo przygotowanego 0,1% roztworu dyspazy.

Za pomocą sterylnych skalpeli chirurgicznych i kleszczy pokrój biopsję skóry na jeden do dwóch milimetrowych kawałków. Przenieś fragmenty biopsji z roztworem dyspazy do 15-mililitrowej probówki i dodaj dodatkowe dwa mililitry dypazy. Opłucz 35-milimetrowe naczynie jednym mililitrem roztworu dispazy i przenieś wypłukany roztwór do 15-mililitrowej probówki.

Inkubować biopsję w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka dodaj cztery mililitry 0,1% kolagenazy I do probówki z próbkami do biopsji i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Trzydzieści minut przed wysiewem komórek pokryj jedną studzienkę na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej jednym mililitrem 0,1% żelatyny w DPBS.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po czterech godzinach inkubacji z kolagenazą odwirować strawione komórki 300 razy g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić trawienie w dwóch mililitrach pożywki z fibroblastów.

Usunąć roztwór żelatyny z wcześniej przygotowanej sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej. Przenieść zawiesinę komórkową wraz z pozostałymi fragmentami tkanek na płytkę sześciodołkową. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w wysokiej wilgotności.

Fibroblasty są gotowe do przejścia do kolby do hodowli tkankowej T25, gdy zlewają się w 80%. Fibroblasty w pasażu od drugiego do czwartego są optymalne do przeprogramowania, ponieważ wydajność przeprogramowania jest na ogół wyższa w przypadku fibroblastów o niższym pasażu. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z kolby i przemyć komórki jednym mililitrem DPBS.

Odessać DPBS i dodać jeden mililitr 0,5% trypsyny EDTA. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut lub do momentu odłączenia komórek. Dodaj dwa mililitry pożywki fibroblastowej, ponownie zawieś komórki i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej probówki.

Wirować 300 razy g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach pożywki fibroblastowej. Po zliczeniu fibroblastów za pomocą hemacytometru, wysiewaj pięć razy 10 do czwartej komórki w jednym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia, ze względu na to, że wirus Sendai będzie miał do czynienia, należy kontynuować procedurę w wyznaczonym laboratorium BSL-2, stosując przy tym odpowiednie środki ochrony osobistej. Odessać pożywkę do hodowli komórkowej i dodać 250 mikrolitrów roztworu wirusa Sendai.

Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dzień przed zbiorem kolonii należy przygotować 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowych pokryte LN-521. Odpipetować 250 mikrolitrów roztworu LN-521 do jednego dołka na płytce 24-dołkowej.

Uszczelnić płytkę za pomocą parafilmu i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia odessać roztwór LN-521 z jednego dołka 24-dołkowej płytki i dodać 500 mikrolitrów E8 do studzienki. Podczas pobierania kolonii pod mikroskopem stereoskopowym zaleca się stosowanie siatki na włosy i maski zabiegowej.

Kolonie są gotowe do zbioru, gdy osiągną rozmiar większy niż jeden milimetr średnicy, mają ostre krawędzie i rosną w jednorodnych monowarstwach. Nie wybieraj kolonii z rozmytymi granicami i dużymi, niezwartymi, niejednorodnymi masami komórek. Pokrój każdą kolonię skalpelem na mniejsze kawałki w wzór przypominający siatkę.

Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów mechanicznie zeskrobać arkusze komórek z naczynia, a następnie przenieść arkusz do dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej uprzednio pokrytej LN-521. Wybór kolonii ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego protokołu. Wybranie kilku dodatkowych kolonii zapewni przywiązanie w wystarczającej liczbie.

Pozwól ogniwom przyczepić się bez zmiany pożywki E8 przez 48 godzin. Enzymatycznie przechodź komórki, gdy kolonie osiągną rozmiar większy niż pięć milimetrów. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z komórek i przemyć 250 mikrolitrami DPBS.

Odessać DPBS i dodać 250 mikrolitrów odczynnika dysocjacyjnego. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Zauważ, że komórki zaczęły się zaokrąglać.

Oderwać komórki od płytki, przepłukując je odczynnikiem dysocjacyjnym. Dodaj 500 mikrolitrów pożywki E8 do 15-mililitrowej probówki i przenieś komórki i odczynnik dysocjacyjny do probówki. Wirować 300 razy g przez trzy minuty.

Odessać supernatant z 15-mililitrowej probówki i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 mikrolitrach pożywki E8. Policz komórki za pomocą hememytometru i zasiej 2,5 do pięciu razy 10 do czwartych komórek w innym wcześniej przygotowanym basenie LN-521 zawierającym 500 mikrolitrów pożywki E8 o temperaturze pokojowej. Dodać inhibitor ROCK do końcowego stężenia 10 mikromolowych.

Inkubować komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Korzystając z tego protokołu, indukowane przez człowieka pluripotencjalne kolonie komórek macierzystych wyłaniają się z transdukowanych fibroblastów około 12 dnia po transdukcji. Kolonie były gotowe do zbioru po około trzech do czterech tygodniach od transdukcji.

Preferowane cechy to spłaszczone, zwarte masy komórkowe, wzrost w postaci jednorodnych monowarstw i ostre krawędzie. Te obrazy w jasnym polu pokazują jednorodną, w pełni przeprogramowaną ludzką linię komórkową iPS we wczesnym okresie pasażu w porównaniu z wysoce heterogeniczną linią komórkową. Utrata wektora wirusa Sendai została potwierdzona przez brak markerów specyficznych dla wektora wirusa Sendai w ludzkich komórkach iPS w pasażu 12, w przeciwieństwie do ludzkich komórek iPS w pasażu trzecim.

Barwienie immunocytochemiczne pobranych komórek pod kątem markerów pluripotencji OCT4, SSEA-4 i NANOG dało jednorodnie dodatni wynik. Ekspresję mRNA endogennych genów pluripotencji wykazano za pomocą odwrotnej transkryptazy PCR. Kultury komórkowe zawierające częściowo przeprogramowane komórki, które nie wykazywały ekspresji czynników pluripotencji, zostały odrzucone.

Potencjał różnicowania ludzkich komórek iPS oceniano poprzez tworzenie ciał zarodkowych. PCR w czasie rzeczywistym po 21 dniach różnicowania ciała zarodka wykrył ekspresję mRNA markerów specyficznych dla endodermy, mezodermy i ektodermy, co potwierdziło, że uzyskane ludzkie komórki iPS są zdolne do różnicowania się do trzech listków zarodkowych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać po około 22 godzinach czasu praktycznego w okresie około 16 tygodni.

Pochodzące od człowieka indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste można różnicować w dowolny typ komórek dorosłego człowieka, aby odpowiedzieć na wszelkie pytania związane z twoją dziedziną badań. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze zrozumiesz, jak wykonać kroki niezbędne do uzyskania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z biopsji skóry.