Name: Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Poznaj metodę wyprowadzania homogenicznych hiPSC z fibroblastów skórnych przy użyciu wektorów wirusa Sendai bezintegracyjnego na matrycy Laminin 521. Protokół zapewnia warunki wolne od ksenogennych składników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez agentów finansujących SSF (B13-0074) i VINNOVA (2016-04134).

Zbiór materiału pacjenta i pochodzenie komórek hiPS zostało zatwierdzone przez Komisję Oceny Etyki, Sztokholm, 28 marca 2012, Numer rejestracyjny: 2012/208-31/3. Etapy hodowli komórkowej powinny być wykonywane w komorach bezpieczeństwa biologicznego, chyba że zaznaczono inaczej. Podczas pracy z komórkami należy zawsze stosować techniki sterylnego obchodzenia się z nimi. Przed rozpoczęciem poczekaj, aż pożywka, płytki i odczynniki osiągną temperaturę pokojową. Inkubować komórki w temperaturze 37 oC, 5% CO2 w wysokiej wilgotności.
1. Izolacja ludzkich fibroblastów z biopsji skóry
<ol>
	<li>Preparaty pożywki hodowlanej, enzymów trawiennych, powlekania naczyń i narzędzi preparacyjnych.
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę z fibroblastami: 44,5 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 500 μl penicyliny/streptomycyny (PEST) (patrz Tabela 1), przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotować enzymy trawienne w stężeniu roboczym 1 mg/ml: zważyć porcje 4 mg proszku dispazy i kolagenazy typu I w oddzielnych probówkach o pojemności 15 ml i rozpuścić w 4 ml DMEM/F12 + 1% PEST. Wysterylizuj roztwór enzymatyczny, przepuszczając go przez sitko o wielkości 0,22 μm. Za każdym razem przygotowuj świeże roztwory enzymatyczne.</li>
		<li>Pokryj jedną studzienkę 6-dołkową płytką do hodowli tkankowej (lub 35-milimetrowym naczyniem do hodowli tkankowej) na biopsję, wypreparowaną 1 ml 0,1% żelatyny w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
		<li>Autoklawuj jeden zestaw nożyczek chirurgicznych i kleszczy na biopsję w celu wypreparowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Postępowanie z biopsją 
	UWAGA: Biopsje należy wykonywać tak szybko, jak to możliwe po ich pobraniu. Przechowywać w PBS + 1% PEST do 48 godzin w temperaturze 4 °C. Biopsja powinna mieć średnicę 2 - 4 mm i być zgodna z zezwoleniami etycznymi.
	<ol>
		<li>Przenieś biopsję do naczynia o średnicy 35 mm. Przenieś biopsję do nowej płytki o średnicy 35 mm i zanurz biopsję w 2 ml 70% etanolu na 30 sekund.</li>
		<li>Przenieś biopsję do trzeciego naczynia o średnicy 35 mm i przemyj 1 ml sterylnego roztworu soli Hanka (HBSS) uzupełnionego 1% PEST.</li>
		<li>Przenieść biopsję do czwartego naczynia o średnicy 35 mm, dodać 1 ml świeżo przygotowanego 0,1% roztworu dyspazy.</li>
		<li>Pokrój biopsję skóry na 1 - 2 mm3 kawałki w naczyniu za pomocą nożyczek chirurgicznych i kleszczy, a następnie przenieś kawałki biopsji, w tym roztwór dyspazy, do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj dodatkowe 2 ml dypazy.</li>
		<li>Opłucz naczynie o średnicy 35 mm 1 ml roztworu do dyspazy i przenieś do probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Inkubować biopsję w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Dodać 4 ml 0,1% kolagenazy I do probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
		<li>Odwirować strawione komórki 300 x g przez 3 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić trawienie w 2 ml pożywki fibroblastowej.</li>
		<li>Usunąć roztwór żelatyny z 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Przenieść zawiesinę komórkową wraz z pozostałymi kawałkami na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej (lub 35-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej) wstępnie pokrytą 0,1% żelatyną w DPBS.</li>
		<li>Zmieniaj podłoże co trzeci dzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspansja ludzkich fibroblastów 
	UWAGA: Fibroblasty są gotowe do przejścia do kolby do hodowli tkankowej T25 (25 cm2), gdy zlewają się w 80% (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B). Fibroblasty zazwyczaj osiągają 80% konfluencji w ciągu 7 dni. Jednak wymagany czas może się znacznie różnić, ale nie powinien być dłuższy niż 4 tygodnie.
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę i przemyć raz 2,5 ml DPBS.</li>
		<li>Usunąć DPBS i dodać 1 ml trypsyny-EDTA (0,05%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu, gdy komórki będą miały zaokrąglone krawędzie i zaczną się odrywać.</li>
		<li>Dodać 2 ml pożywki z fibroblastami, w razie potrzeby przepłukać komórki, zapewniając prawidłowe rozłączenie komórek. Przenieść roztwór komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 3 minuty.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki fibroblastowej i płytki fibroblastów w niepowlekanej kolbie T25 do hodowli tkanek komórkowych. Podczas rozszerzania fibroblastów po tym etapie zdysocjuj zgodnie z powyższym opisem i zasiaj 12 x 103 komórek/cm2.</li>
		<li>Gdy zlewające się komórki są gotowe do zamrożenia, rozpręż się lub płytka do przeprogramowania. Zamrozić dwie rundy fibroblastów przed rozpoczęciem jakiegokolwiek przeprogramowania (patrz następna sekcja, aby zapoznać się z procedurą zamrażania). Wydajność przeprogramowania jest na ogół wyższa w przypadku fibroblastów o niższym pasażu, komórki w pasażu 2 - 4 są optymalne. Jednak przy użyciu tego protokołu przeprowadzono udane przeprogramowanie fibroblastów do pasażu 10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamrażanie i rozmrażanie fibroblastów
	<ol>
		<li>Przygotuj świeżą pożywkę do zamrażania fibroblastów: 90% FBS + 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Przechowywać w temperaturze 4 °C (Tabela 1). Po zlewaniu się kolba do hodowli tkankowej T25 może zostać zamrożona w trzech kriowialach. Przygotować 500 μl pożywki do zamrażania fibroblastów na zamrożoną fiolkę.</li>
		<li>Aby zamrozić komórki, należy je zdysocjować zgodnie z opisem w kroku 1.3, policzyć komórki za pomocą hemocytometru i przenieść porcje 3 x 105 komórek do probówek o pojemności 15 ml. Wirować probówki pod ciśnieniem 300 x g przez 3 min. Odsysać supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osady komórkowe w 500 μl pożywki do zamrażania fibroblastów o temperaturze 4 °C i przenieść do kriowali. Umieścić fiolki w pojemniku do zamrażania i inkubować komórki w temperaturze -80 °C przez 24 godziny przed przeniesieniem ich do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Aby rozmrozić komórki, zanurz dolną część kriowialu w wodzie o temperaturze 37 °C. Po upłynnieniu przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i dodaj 5 ml pożywki fibroblastowej. Wiruj komórki 300 x g przez 3 min.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki z fibroblastami. Przenieść komórki do niepowlekanej kolby do hodowli tkankowej T25 i inkubować w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przeprogramowanie wektorów SeV w fibroblastach
<ol>
	<li>Przygotowanie podwielokrotności wektorowych 
	UWAGA: Z SeV należy obchodzić się w warunkach bezpieczeństwa biologicznego na poziomie bezpieczeństwa 2. Zapoznaj się z protokołem producenta i lokalnymi wytycznymi17. Miano wirusa różni się w zależności od partii.
	<ol>
		<li>Przed przygotowaniem porcji należy obliczyć ilość wektora potrzebną dla komórek 5 x 104 zgodnie z protokołem producenta (np. CytoTune 2.0). Miano wirusa na ogół waha się od 8 x 107 - 1,5 x 108. Rozmrozić i połączyć wektory 5:5:3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 i hKlf4 = MOI 3). Porcjować ilość obliczoną na przeprogramowanie 5 x 104 komórek do autoklawowanych probówek o pojemności 1,5 ml. Rozcieńczyć podwielokrotności wirusa pożywką fibroblastów do końcowej objętości 250 μl w celu przeprogramowania. 
		UWAGA: Każda fiolka jest ważna do przeprogramowania jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej z 5 x 104 fibroblastami. Przechowywać porcje wirusa w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transdukcja wektorowa SeV
	<ol>
		<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć 1 ml DPBS. Odessać DPBS i dodać 1 ml trypsyny-EDTA (0,05%). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu oderwania komórek.</li>
		<li>Dodać 2 ml pożywki z fibroblastami, ponownie zawiesić komórki i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Wirować 300 x g przez 3 min.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml pożywki z fibroblastów.</li>
		<li>Policz fibroblasty za pomocą hemocytometru i zasiej 5 x 104 komórek w jednym dołku 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych, dodać 250 μl roztworu SeV i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Codziennie zmieniaj pożywkę na świeżą pożywkę fibroblastów. Pozwól transdukowanym komórkom rosnąć przez 7 dni przed przejściem na płytki pokryte LN-521. Płytki LN-521 należy przygotować na dzień przed przejściem. Patrz 2.3.1 dla procedury powlekania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtarzanie transdukowanych fibroblastów
	<ol>
		<li>Przygotowanie naczyń powlekanych LN-521: Rozcieńczyć LN-521 w DPBS do końcowego stężenia 0,63 μg/cm2. Odpipetować 2 ml roztworu LN-521 na 60-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej. Uszczelnić 60-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej za pomocą parafilmu. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przygotuj podwielokrotności pożywki Essential 8 (E8) dla łatwiejszej obsługi: 48,5 ml pożywki E8, 1 ml suplementu E8 i 500 μl PEST (Tabela 1).</li>
		<li>7 dni po transdukcji należy przenieść komórki do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm pokrytego LN-521. Dodać 250 μl trypsyny-EDTA (0,05%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu oderwania się komórek. Dodać 2 ml pożywki fibroblastowej i odwirowywać komórki przez 3 minuty w 300 x g.</li>
		<li>Odessać supernatant. Zawiesić osad w 2 ml pożywki fibroblastowej i policzyć komórki w hemocytometrze. Odessać roztwór LN-521 z wstępnie powlekanej płytki i zasiać 4 x 104 komórki w 5 ml pożywki fibroblastowej w naczyniu LN-521 o średnicy 60 mm. Dodać inhibitor kinazy Rho Y-27632 (ROCKi) do końcowego stężenia 5 μM. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
		<li>Co ważne, następnego dnia należy zmienić pożywkę na pożywkę E8. Zmieniaj podłoże E8 codziennie. Kolonie komórek hiPS pojawią się w ciągu 2-3 tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wybieranie kolonii i ekspansja komórek hiPS
UWAGA: Następujące kroki są wykonywane poza kabiną bezpieczeństwa biologicznego pod mikroskopem stereoskopowym. Zaleca się stosowanie siatki na włosy i masek zabiegowych. Pracuj ostrożnie, aby nie zanieczyścić kultury komórkowej.
<ol>
	<li>Przygotuj 24-dołkowe płytki z kulturą tkankową powlekaną LN-521 na dzień przed pobraniem. Rozcieńczyć LN-521 w DPBS 0,63 μg/cm2. Odpipetować 250 μl roztworu LN-521 do jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Uszczelnij płyty za pomocą parafilmu. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Kolonie są gotowe do zbioru, gdy osiągną rozmiar > 1 mm średnicy. Kolonie powinny mieć ostre krawędzie i rosnąć w jednorodnych monowarstwach (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Odessać roztwór LN-521 i dodać 500 μl E8 do jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej.</li>
	<li>Pokrój kolonie na mniejsze kawałki za pomocą skalpela w siatkę pod mikroskopem stereoskopowym. Mechanicznie zeskrobać arkusze komórek z naczynia i przenieść arkusze za pomocą pipety 200 μl do przygotowanego dołka (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D-2E). Zbieraj kolonie do oddzielnych studni.</li>
	<li>Pozwól komórkom przyczepić się bez zmiany podłoża przez 48 godzin. Następnie codziennie zmieniaj podłoże E8</li>.
	<li>Gdy kolonie osiągną wielkość > 5 mm, enzymatycznie pasaż komórki jako pojedyncze komórki do nowego dołka płytki pokrytej LN-521.</li>
	<li>Odessać pożywkę do hodowli komórkowych z komórek i przemyć 250 μl DPBS.</li>
	<li>Odessać DPBS. Dodać 250 μl odczynnika dysocjacyjnego i inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zauważ, że komórki zaczęły się zaokrąglać. Oderwij komórki od płytki, kilkakrotnie przepłukując je odczynnikiem dysocjacyjnym.</li>
	<li>Dodaj 500 μl pożywki E8 do probówki o pojemności 15 ml. Przenieść komórki w odczynniku dysocjacyjnym do probówki i wirować przez 3 minuty przy 300 x g.</li>
	<li>Odessać roztwór LN-521 z wstępnie pokrytego LN-521 i dodać 500 μl pożywki E8 o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 500 μl pożywki E8.</li>
	<li>Policzyć komórki za pomocą hemocytometru i zasiać 2,5 x 104 - 5 x 104 komórki w przygotowanym basenie LN-521 (1,25 x 104 - 2,5 x 104 komórek/cm2). Format hodowli komórkowej można łatwo przeskalować, aby dopasować go do zamierzonego celu.</li>
	<li>Dodać ROCKi do końcowego stężenia 10 μM. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże E8 codziennie. Komórki są zwykle gotowe do przejścia po 4 - 6 dniach. Enzymatycznie pasują komórki jako pojedyncze komórki, jak opisano powyżej, gdy około 90% zlewają się. 
	UWAGA: Wektory przeprogramowania są stopniowo rozcieńczane podczas ekspansji komórek hiPS i nie są wykrywalne po przejściu 12. Komórki, które są bezstronnie przeprogramowywane, często przestają się namnażać około pasażu 6 - 10 lub tracą swoją charakterystyczną morfologię pluripotencjalnych komórek macierzystych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B).</li>
	<li>Zamrażanie i rozmrażanie komórek hiPS
	<ol>
		<li>Aby zamrozić komórki, enzymatycznie dysocjuj komórki jako pojedyncze komórki, jak opisano powyżej, policz komórki w hemocytometrze i przenieś 2,5 x 105 komórek do 15-mililitrowej probówki zawierającej 1 ml pożywki E8. Wirować przy 300 x g przez 3 min. Odessać supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 250 μl kriopożywki PSC o temperaturze 4 °C i przenieść do kriowiwalu. Umieścić fiolkę w pojemniku do zamrażania i inkubować komórki w temperaturze -80 °C przez 24 godziny przed przeniesieniem ich do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.</li>
		<li>Aby rozmrozić komórki, należy przygotować wstępnie powleczony dołek LN-521 z 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, zasysając roztwór LN-521 i dodając 250 μl pożywki E8. Zanurz dolną część kriowialu w wodzie o temperaturze 37 °C, aż pozostanie tylko mały sopel lodu.</li>
		<li>Dodać 250 μl pożywki E8 do kriowialu i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i dodać 1 ml pożywki E8. Wiruj komórki 300 x g przez 3 min.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 250 μl pożywki E8 o temperaturze pokojowej. Przenieść zawiesinę komórkową do przygotowanego dołka i dodać 1% suplementu żywotności komórek lub 10 μM ROCKi. Inkubować płytkę do hodowli tkankowej w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration-free+induced+pluripotent+stem+cells+derived+from+retinitis+pigmentosa+patient+for+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling.</a> Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).</li>
<li>Zhou, H., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+induced+pluripotent+stem+cell+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Evolution of induced pluripotent stem cell technology.</a> Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li>
<li>Hovatta, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).</li>
<li>Ludwig, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-independent+culture+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.</a> Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+self-renewal+of+human+pluripotent+stem+cells+on+human+recombinant+laminin-511%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511.</a> Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).</li>
<li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).</li>
<li>Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+culturing+and+cloning+of+human+pluripotent+stem+cells+on+laminin-521-based+matrices+under+xeno-free+and+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions.</a> Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).</li>
<li>Rodin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+culturing+of+human+embryonic+stem+cells+on+laminin-521%2FE-cadherin+matrix+in+defined+and+xeno-free+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment.</a> Nat Commun. 5, 3195(2014).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li>
<li>Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+manufacturing+practice+and+clinical-grade+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines.</a> Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).</li>
<li>Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+express+an+immunogenic+nonhuman+sialic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid.</a> Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).</li>
<li>Kele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+iPS+cell+line+CTL07-II+from+human+fibroblasts%2C+under+defined+and+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions.</a> Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).</li>
<li>Uhlin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+human+iPS+cell+lines+from+monozygotic+twins+in+defined+and+xeno+free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions.</a> Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).</li>
<li>Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf">https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf</a> (2009).</li>
<li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).</li>
<li>Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell+culture%3A+considerations+for+maintenance%2C+expansion%2C+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).</li>
<li>Jacobs, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-Density+Culture+in+Human+Embryonic+Stem+Cells+Results+in+DNA+Damage+and+Genome+Instability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability.</a> Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).</li>
<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).</li>
<li>Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf</a> (2016).</li>
<li>Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+negative+effect+of+donor+age+and+time+in+culture+on+the+reprogramming+efficiency+into+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zgłaszania żadnych konfliktów interesów.

Oczekiwanym rezultatem tego protokołu jest pomyślne wygenerowanie kilku linii komórkowych hiPS pochodzących klonalnie. Co ważne, opisana tutaj metoda utrzymywania i namnażania ustalonych komórek hiPS jest wiarygodna i może być przeprowadzona przy niewielkim wcześniejszym doświadczeniu w hodowli komórek macierzystych. Wiadomo, że enzymatyczne pasażowanie pojedynczych komórek z ROCKi wraz z macierzą LN-521 utrzymuje komórki jako kariotypowo normalne, pluripotencjalne i łatwo zdolne do różnicowania, unikając jednocześnie in...

Od pierwszego wyprowadzenia linii komórkowych hiPS przez Takahashi et al.1,2, komórki hiPS dostarczyły użytecznego narzędzia do modelowania chorób, odkrywania leków oraz jako materiał źródłowy do generowania terapii komórkowych w medycynie regeneracyjnej3. Hodowla komórek hiPS od dawna jest zależna od kohodowli z komórkami odżywiającymi fibroblasty4,5 lub od Matrigel6 oraz z preparatami zawierającymi płodową surowicę bydlęcą (FBS). Różnice między partiami są częstą konsekwencją niezdefiniowanego charakteru tych warunków hodowli, co skutkuje nieprzewidywalnymi zmianami, co jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do zawodności tych protokołów7. Opracowanie zdefiniowanych pożywek, takich jak Essential 8 (E8)8 i zdefiniowanych matryc hodowli komórkowych, na przykład LN-5219, pozwala na ustanowienie wysoce powtarzalnych protokołów i pomoc w solidnym generowaniu i utrzymywaniu jednorodnych komórek hiPS7,8,9,10.
Rozwój technik przeprogramowania bez integracji był krokiem naprzód. Pierwotnie, przeprogramowanie polegało na wektorach retrowirusowych, które losowo integrowały się z genomem, powodując destrukcyjny wpływ na integralność genomu11. Postępy w metodologiach przeprogramowywania obejmują rozwój wektorów opartych na RNA. Wektory RNA mają przewagę nad metodą przeprogramowania opartą na DNA, ponieważ niezamierzona integracja poprzez rekombinację genomową nie jest możliwa12. Wektory SeV zapewniają wysoką i przejściową ekspresję czynników egzogennych poprzez jednoniciowy RNA bez fazy DNA11. Wektory przeprogramowania dostarczane przez SeV są rozcieńczane podczas ekspansji komórki i ostatecznie zrzucane z hodowli, zapewniając sposób przeprogramowania bez odcisków stopy. Następnie utrzymanie pluripotencji zależy od endogennej ekspresji genów pluripotencji2.
Ponieważ pionierskie terapie oparte na komórkach hiPS zaczynają przechodzić do badań klinicznych, wymagania dotyczące standaryzowanych partii, odtwarzalności i bezpieczeństwa są podstawowymi kwestiami do rozwiązania13. Dlatego należy unikać produktów pochodzenia zwierzęcego. Na przykład stosowanie produktów ksenogenicznych wiąże się z ryzykiem zanieczyszczenia patogenami innymi niż ludzie. Wykazano również, że komórki hodowane w obecności składników hodowli pochodzenia zwierzęcego zawierają nieludzkie kwasy krzemiakowe do błon komórkowych, co grozi powstaniem pochodnych komórek immunogennych14. W związku z tym konieczność wyeliminowania produktów ksenogenicznych jest niezbędna dla wszelkich przyszłych badań klinicznych. W protokole tym stosuje się hodowlę wolną od ksenotypów i zdefiniowaną w celu utrzymania komórek hiPS, przybliżając komórki do zgodności klinicznej.
Ten protokół opisuje spójną, wysoce powtarzalną i łatwą w użyciu metodę, która generuje standaryzowane komórki hiPS z fibroblastów. Oferuje również przyjazny dla użytkownika system hodowli do utrzymania ustalonych komórek hiPS. Protokół ten został wykorzystany do wyprowadzenia ponad 300 linii komórkowych hiPS w szwedzkim narodowym ośrodku iPS Core w Karolinska Institutet, z których niektóre linie zostały wcześniej opisane15,16.

<table><tbody><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>171105-041</td><td>Trawienie biopsyjne</td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma</td><td>C0130</td><td>Trawienie biopsyjne</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G1393</td><td>Macierz fibroblastów</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Life Technologies</td><td>21980002-032</td><td>Pożywka fibroblastowa</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td>Podłoże</td></tr> <tr><td>fibroblastowePenicylina/Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td>Podłoże Antybiotyk</td></tr><tr><td>Niezbędny 8</td><td>ThermFisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych iPS</td></tr><tr><td>LN-521</td><td>Biolamina</td><td>LN521-03</td><td>Matryca do hodowli komórkowych iPS</td></tr><tr><td>TrypLE select 1X</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12563011</td><td>Odczynnik dysocjacyjny</td></tr><tr><td>Inhibitor kinazy Rho Y27632</td><td>Millipore</td><td>SCM075</td><td>Inhibitor kinazy Rho (ROCKi)</td></tr><tr><td>CytoTune &ndash; Zestaw do przeprogramowania iPS 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>A1377801</td><td>Wektor przeprogramowania wirusa Sendai</td></tr><tr><td>35 mm naczynie do hodowli tkankowej</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900.300</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>60 mm szalki do hodowli tkankowej</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901.300</td> Płytki do hodowli <td></td></tr><tr><td>tkankowej 24 dołki do hodowli komórkowych</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922.300</td><td>Kolby do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>T25</td> do hodowli komórkowych <td>VWR</td><td>734-2311</td><td>Probówki do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>15 ml</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>Probówki wirówkowe</td></tr><tr><td>Probówka 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030123.301</td><td>Probówka 1,5 ml</td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>Pojemnik do zamrażania</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ml</td><td>Zamrażanie fibroblastów</td></tr><tr><td>Cryovials 1,8 ml</td><td>VWR</td><td>479-6847</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do kriokonserwacji</td> Cryovials PSC <td>Gibco</td><td>A2644601</td><td>PSC CryomediumRevitaCell</td></tr><tr><td>suplement Trypsin-EDTA (0,05%)</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>25300054</td><td>Enzym dysocjacji fibroblastów</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>31331-028</td><td>Rozcieńczalnik</td></tr> <tr>enzymów trawiennych<td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>PBS</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFIsher Scientific</td><td>14025-050</td><td>Przygotowanie do biopsji</td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Sigma</td><td>BRAND, 718920</td><td>Zliczanie komórek</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>291-1213</td><td>Płytki uszczelniające do przechowywania</td></tr></tbody></table>

bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy laminin 521

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Wolne od kseno-ksenów i w pełni zdefiniowane warunki są kluczowymi parametrami dla solidnego i powtarzalnego generowania jednorodnych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS). Utrzymanie komórek hiPS na komórkach zasilających lub niezdefiniowanych matrycach jest podatne na odchylenia partii, zanieczyszczenie patogenne i ryzyko immunogenności. Wykorzystanie zdefiniowanej rekombinowanej ludzkiej matrycy lamininy 521 (LN-521) w połączeniu z preparatami bezksenograficznymi i zdefiniowanymi pożywkami zmniejsza zmienność i pozwala na spójne wytwarzanie komórek hiPS. Wektor wirusa Sendai (SeV) jest nieintegrującym się systemem opartym na RNA, co pozwala uniknąć obaw związanych z potencjalnym destrukcyjnym wpływem, jaki mogą mieć wektory integrujące integralność genomu. Co więcej, wektory te wykazały stosunkowo wysoką skuteczność w przeprogramowywaniu fibroblastów skóry. Ponadto enzymatyczne pasażowanie pojedynczych komórek ułatwia utrzymanie jednorodności komórek hiPS bez znacznego wcześniejszego doświadczenia w hodowli komórek macierzystych. W tym miejscu opisujemy protokół, który został gruntownie przetestowany i opracowany z naciskiem na odtwarzalność i łatwość użycia, zapewniając solidny i praktyczny sposób generowania zdefiniowanych i wolnych od ksenotypów ludzkich komórek hiPS z fibroblastów.

Od biopsji do komórek hiPS
Cały proces od biopsji do uzyskania ustabilizowanych komórek hiPS, pozbawionych wektora reprogramującego i gotowych do charakterystyki, trwa około 16 tygodni (Rysunek 1). Bardziej szczegółowy harmonogram przedstawiono na Rysunku 2A. Ustanowienie i namnożenie kultur fibroblastów zajmuje około 4 tygodni. Pierwsze kolonie komórek hiPS zaczęły pojawi...

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest otrzymanie homogenicznych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Metodę tę można wykorzystać do pozyskiwania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w wielu celach, w tym do modelowania chorób, przesiewania leków lub otrzymywania komórek do przedklinicznych badań nad terapią komórkową. Zaletą tego protokołu jest jego solidność oraz generowanie homogenicznych komórek, które są utrzymywane w przyjaznym dla użytkownika, wolnym od składników pochodzenia zwierzęcego (Xeno-free) i w pełni zdefiniowanym chemicznie systemie hodowlanym.Ponieważ ludzkie komórki iPS odtwarzają tło genetyczne tkanki dawcy i mogą potencjalnie zostać zróżnicowane w każdy rodzaj komórek istotny dla danej choroby, stanowią one doskonałe narzędzia do modelowania procesów chorobowych. Disekcja biopsji oraz wybieranie kolonii są skomplikowanymi procedurami. Obserwacja ich wykonania przez doświadczonego specjalistę pomaga w zrozumieniu tych czynności i ułatwia ich powtórzenie.Procedurę zaprezentują Harriet RonnHolm i Kelly Day, dwie doświadczone techniczki laboratoryjne z iPS Core Facility na Karolinska Institutet. Próbki biopsji skóry można przechowywać w PBS z dodatkiem 1% penicyliny i streptomycyny do 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza, jednak należy je przetworzyć jak najszybciej po pobraniu. Przenieś biopsję do szalki 35 mm.Zanurz biopsjat skóry w 35 mm szalce z 2 mL 70% etanolu na 30 sekund. Do nowej 35 mm szalki dodaj 1 mL sterylnego zrównoważonego roztworu soli Hank'a uzupełnionego o 1% penicyliny i streptomycyny, a następnie przenieś biopsjat do nowej szalki. Przenieś biopsjat do czwartej 35 mm szalki wypełnionej 1 mL świeżo przygotowanego 0,1% roztworu dispazy.Za pomocą sterylnych skalpeli chirurgicznych i pęsety pociąć biopsję skóry na kawałki o wymiarach od jednego do dwóch milimetrów sześciennych. Przenieść fragmenty biopsji wraz z roztworem dyspazy do probówki o pojemności 15 ml i dodać kolejne 2 ml dyspazy. Przepłukać szalkę o średnicy 35 mm jednym mililitrem roztworu dyspazy, a następnie przenieść uzyskany płuczyn do probówki o pojemności 15 ml.Inkubować biopsję w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia rano dodać 4 mL 0,1% kolagenazy I do probówki z fragmentami biopsji i inkubować w temperaturze 37 °C przez cztery godziny. Na trzydzieści minut przed wysiewem komórek pokryć jedno dołkowe w sześciodołkowej płytce do hodowli tkanek 1 mL 0,1% żelatyny w DPBS.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po czterech godzinach inkubacji z kolagenazą, odwirować strawione komórki przy 300 ×g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Odessać nadsącz i zawiesić materiał w dwóch mililitrach pożywki dla fibroblastów.Usunąć roztwór żelatyny z wcześniej przygotowanej płytki hodowlanej z sześcioma dołkami. Przenieść zawiesinę komórkową wraz z wszelkimi pozostałymi fragmentami tkanki do płytki z sześcioma dołkami. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przy wysokiej wilgotności.Fibroblasty są gotowe do pasażowania do kolby hodowlanej T25, gdy osiągną 80% konfluencji. Fibroblasty w drugim do czwartego pasażu są optymalne do przeprogramowania, ponieważ wydajność przeprogramowania jest zazwyczaj wyższa dla fibroblastów o niższym numerze pasażu. Odessać pożywkę z kolby i przemyć komórki jednym mililitrem DPBS.Odssać DPBS i dodać 1 mL 0,5% Trypsyny EDTA. Inkubować w temperaturze 37 °C przez pięć minut lub do czasu odklejenia się komórek. Dodać 2 mL pożywki do fibroblastów, resuspendować komórki, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 mL.Wiruj z prędkością 300 ×g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Odessij nadsącz i resuspenduj osad w dwóch mililitrach medium do fibroblastów. Po policzeniu fibroblastów za pomocą hemacytometru, wysiej 5 × 10⁴ komórek do jednego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej.Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez noc. Następnego dnia, ze względu na pracę z wirusem Sendai, kontynuować procedurę w wyznaczonym laboratorium BSL-2, stosując odpowiednie środki ochrony indywidualnej. Odessać pożywkę hodowlaną i dodać 250 µL roztworu wirusa Sendai.Inkubuj płytkę w temperaturze 37°C. Na jeden dzień przed pobraniem kolonii przygotuj 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowej powlekane LN-521. Pipetuj 250 µL roztworu LN-521 do jednego dołka płytki 24-dołkowej.Uszczelnij płytkę za pomocą parafilmu i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia odessaj roztwór LN-521 z jednej studni płytki 24-dołkowej i dodaj do niej 500 microliters E8. Podczas wybierania kolonii pod mikroskopem stereoskopowym zaleca się stosowanie siatki na włosy i maseczki ochronnej.Kolonie są gotowe do pobrania, gdy osiągną średnicę większą niż 1 mm, mają wyraźne krawędzie i rosną w jednorodnych monowarstwach. Nie należy pobierać kolonii o rozmytych brzegach i dużych, niezbitych, heterogenicznych masach komórkowych. Każdą kolonię należy pociąć skalpelem na mniejsze fragmenty w układzie siatki.Za pomocą pipety 200 µL mechanicznie zeskrob arkusze komórek z szalki, a następnie przenieś arkusz do dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej, uprzednio pokrytej LN-521. Wybór kolonii jest kluczowy dla powodzenia tego protokołu. Pobranie kilku dodatkowych kolonii zapewni przytwierdzenie wystarczającej liczby komórek.Pozostawić komórki do przytwierdzenia bez wymiany medium E8 przez 48 godzin. Przesiać komórki enzymatycznie, gdy kolonie osiągną rozmiar większy niż 5 mm. Odessać medium hodowlane i przemyć komórki 250 µL DPBS.Odssać DPBS i dodać 250 µL odczynnika dysocjującego. Inkubować w temperaturze 37 °C przez trzy minuty. Zaobserwować, że komórki zaczęły przybierać okrągły kształt.Odspój komórki z płytki, płucząc je odczynnikiem dysocjującym. Do probówki o pojemności 15 ml dodaj 500 µL medium E8, a następnie przenieś komórki wraz z odczynnikiem dysocjującym do probówki. Wiruj przy 300 ×g przez trzy minuty.Odssać nadsącz z probówki 15 ml i resuspender osad komórkowy w 500 µL pożywki E8. Policzyć komórki za pomocą hemacytometru i wysiać od 2,5 do 5 × 10⁴ komórek do innej, wcześniej przygotowanej studni pokrytej LN-521 zawierającej 500 µL pożywki E8 o temperaturze pokojowej. Dodać inhibitor ROCK do stężenia końcowego 10 µM.Inkubować komórki w temperaturze 37°C. Stosując ten protokół, kolonie ludzkich indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych pojawiają się z przetransdukowanych fibroblastów około 12. dnia po transdukcji. Kolonie były gotowe do wyselekcjonowania około trzech do czterech tygodni po transdukcji.Preferowane cechy obejmują spłaszczone, zwarte masy komórkowe, wzrost w postaci jednorodnych monowarstw oraz ostre krawędzie. Te obrazy w polu jasnym przedstawiają jednorodną, w pełni przeprogramowaną linię ludzkich komórek iPS z wczesnego pasażu w porównaniu z linią komórkową o wysokim stopniu heterogeniczności. Utratę wektora wirusa Sendai potwierdzono brakiem specyficznych markerów wektora wirusa Sendai w ludzkich komórkach iPS w pasażu 12, w przeciwieństwie do ludzkich komórek iPS w pasażu trzecim.Barwienie immunocytochemiczne pochodnych komórek pod kątem markerów pluripotencji OCT4, SSEA-4 oraz NANOG dało jednorodnie pozytywny wynik. Ekspresję mRNA endogennych genów pluripotencji wykazano za pomocą reakcji RT-PCR. Hodowle komórkowe zawierające komórki częściowo przeprogramowane, które nie wykazywały ekspresji czynników pluripotencji, zostały odrzucone.Potencjał różnicowania ludzkich komórek iPS oceniono poprzez tworzenie ciał embrionalnych. Analiza RT-PCR po 21 dniach różnicowania ciał embrionalnych wykazała ekspresję mRNA markerów specyficznych dla endodermy, mezodermy i ektodermy, co potwierdziło, że otrzymane ludzkie komórki iPS są zdolne do różnicowania się w trzy warstwy zarodkowe. Po opanowaniu, technika ta wymaga około 22 godzin pracy własnej w okresie około 16 tygodni.Otrzymane ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste mogą być różnicowane w dowolny typ komórek dorosłego organizmu człowieka, aby odpowiedzieć na pytania istotne dla Twojej dziedziny badań. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu będziesz mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić kroki niezbędne do uzyskania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z biopsji skóry.

integration-free-derivation-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Przedstawiamy protokół efektywnego przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych w ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) przy użyciu wektorów retrowirusowych kodujących Oct3/4, Sox2, Klf4 i c-myc (OSKM) oraz metodę identyfikacji prawidłowo przeprogramowanych hiPSC poprzez barwienie żywych komórek przeciwciałem Tra-1-81.

Wybór i izolacja kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przeprogramowanych z fibroblastów dorosłych

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), oparte na wzroście pojedynczych komórek bez typu kolonijnego (NCM) zdysocjowanych pojedynczych komórek. Ta nowa metoda, wykorzystująca inhibitory kinaz związane z Rho lub izoformę lamininy 521 (LN-521), jest odpowiednia do wytwarzania dużych ilości jednorodnych hPSC, manipulacji genetycznych i odkrywania leków.

Alternatywne hodowle do produkcji, utrzymania i analizy genetycznej ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisujemy protokół wyprowadzania opartych na lentiwirusach, przeprogramowanych i scharakteryzowanych, bezczynnikowo indukowanych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i przekształcania ich w domniemane warunki kliniczne.

Uzyskanie i charakterystyka wolnej od transgenów indukowanej przez człowieka pluripotencjalnej linii komórek macierzystych i konwersja do określonych stanów klinicznych

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Przedstawiona tutaj metoda opisuje skalowalny i gotowy do stosowania w dobrej praktyce produkcyjnej (GMP) system różnicowania do generowania ludzkich komórek hepatocytowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych. Służy jako opłacalny i ustandaryzowany system do generowania ludzkich komórek podobnych do hepatocytów do podstawowych i stosowanych badań nad ludzką wątrobą.

Zdefiniowane i skalowalne generowanie komórek podobnych do hepatocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Celem protokołu jest porównanie różnych warunków powlekania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), aby ocenić, jak różnicowa powłoka wpływa na tempo wzrostu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). W szczególności dążymy do stworzenia warunków do uzyskania optymalnego wzrostu kultur iPSC.

Pomiar zbiegu iPSC za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania

Celem tego artykułu jest dostarczenie ustandaryzowanego podejścia do indukowania różnicowania ludzkich komórek progenitorowych wątroby od pluripotencjalnych komórek macierzystych. Opracowanie tej procedury z gotowymi do użycia preparatami pożywek oferuje użytkownikowi łatwy system do generowania ludzkich komórek wątroby do badań biomedycznych i translacji.

Specyfikacja progenitorów wątroby z pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu różnicowania

Poznaj metodę wyprowadzania homogenicznych hiPSC z fibroblastów skórnych przy użyciu wektorów wirusa Sendai bezintegracyjnego na matrycy Laminin 521. Protokół zapewnia warunki wolne od ksenogennych składników.

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521 (Wideo) | JoVE Journal

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Przeglądaj więcej filmów