Ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny C po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem

Ten protokół opisuje efektywny i wygodny proces analityczny pobierania próbek i jednoczesnego oznaczania wielu leków, doksorubicyny (DOX), mitomycyny C (MMC) i kardiotoksycznego metabolitu DOX, doksorubicyny (DOXol), w próbkach biologicznych z przedklinicznego modelu guza piersi traktowanego preparatami nanocząsteczkowymi synergicznego połączenia leków.

Ogólnym celem tego protokołu analitycznego jest jednoczesna ekstrakcja i ilościowe określenie dwóch leków przeciwnowotworowych, doksorubicyny i mitomycyny C, dostarczanych jednocześnie przez hybrydowe nanocząstki polimerowo-lipidowe, oraz metabolitu doksorubicyny, doksorubicyny, doksorubicyny, w matrycach biologicznych przy użyciu prostej i niezawodnej metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nanomedycyny, takie jak sposób zaprojektowania skutecznego systemu nanonoszenia, opartego na nanofarmakokinetyce kombinacji leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na jednoczesne oznaczanie ilościowe trzech związków leków w tej samej matrycy biologicznej, bez konieczności zmiany fazy ruchomej HPLC.

Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w biologiczne zachowania doksorubicyny, mitomycyny C i doksorubicyny w pierwotnych nowotworach piersi. Może być również stosowany w przypadku innych typów nowotworów leczonych podobnymi lekami. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ trudno jest nauczyć się skutecznych etapów przygotowania próbki.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać i zamrozić krew pełną, główne narządy i guz piersi, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Szybko zważ zamrożone tkanki i zapisz wagę w notatniku laboratoryjnym. Następnie przenieś je do stożkowej rurki o okrągłym dnie o pojemności 13 mililitrów.

Następnie dodaj od jednego do pięciu mililitrów lodowatego buforu do lizy komórek. Za pomocą elektrycznego homogenizatora ręcznego homogenizuj tkankę ruchem w górę iw dół na lodzie z prędkością 18 000 obr./min. Następnie umyj 10-milimetrową sondę generatora piły homogenizatora destylowaną wodą dejonizowaną.

Umyj sondę 70% etanolem, a następnie ponownie destylowaną wodą dejonizowaną. Przenieś 50 mikrolitrów homogenatu tkankowego lub krwi pełnej do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki z polipropylenu. Następnie nakłuj pięcioma mikrolitrami 2,000 nanogramów na mililitr wewnętrznego wzorca 4-MethylUmbelliferone.

Dodać lodowaty rozpuszczalnik ekstrakcyjny zawierający 150 mikrolitrów acetonitrylu i 100 mikrolitrów pięciomilimolowego octanu amonu. Energicznie mieszaj mieszaninę przez dwie minuty. Wirować w temperaturze 3 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Następnie przenieś 200 mikrolitrów supernatantu do świeżej, wstępnie schłodzonej probówki do mikrowirówki. Użyj powolnego strumienia azotu gazowego, aby odparować supernatant w temperaturze 60 stopni Celsjusza z ochroną przed światłem. Następnie rozpuść wysuszoną pozostałość w 100 mikrolitrach lodowatego metanolu.

Energicznie wiruj przez 30 sekund. Wirować w temperaturze 3 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie przenieść supernatant do wkładki do fiolki HPLC.

Umieścić fiolki z próbkami w tacce automatycznego podajnika próbek w celu wstrzyknięcia. Aby rozpocząć, należy przygotować fazę mobilną HPLC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ustaw warunki początkowe składu fazy ruchomej na 16,5% H2O i 83,5% acetonitrylu.

Ustaw izokratyczne natężenie przepływu na 1.0 mililitrów na minutę. Następnie należy oddzielić leki za pomocą gradientu fazy ruchomej, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie ustaw detektor UV na dwa kanały: jeden na 310 nanometrów dla wewnętrznego wzorca 4-MethylUmbelliferone, a drugi na 360 nanometrów dla Mitomycyny C. Następnie ustaw pierwszy kanał detektora fluorescencji na długość fali wzbudzenia 365 nanometrów i długość fali emisji 445 nanometrów dla 4-MethylUmbelliferone.

Ustaw drugi kanał na długość fali wzbudzenia 480 nanometrów i długość fali emisji 560 nanometrów dla doksorubicyny i doksorubicyny. Aby rozpocząć, użyj automatycznego podajnika próbek do wstrzyknięcia 15 mikrolitrów próbki. Zaprogramowany gradientowy skład fazy ruchomej zmienia się automatycznie poprzez zwiększanie składu acetonitrylu w czasie od zera do 18 minut.

Po 18 minutach stan fazy ruchomej jest przywracany do stanu początkowego i ponownie równoważony do następnego wstrzyknięcia. Po uruchomieniu każdej próbki należy zanotować piki związków leku i ich czasy retencji. Następnie użyj oprogramowania HPLC, aby zintegrować obszar piku pod krzywą dla związków leku.

Obliczyć procent odzysku leku i stosunek pola pod krzywą między każdym związkiem leku a wzorcem wewnętrznym, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tej procedurze dwa leki przeciwnowotworowe, doksorubicyna i mitomycyna C, wraz z metabolitem doksorubicyny, doksorubicyną, są wykrywane bez ingerencji biologicznej. Analiza HPLC pokazuje, że każdy lek jest dobrze oddzielony od pozostałych.

Opracowana metoda HPLC wykazuje mniej niż 15% różnicę w precyzji i dokładności w ciągu i między dniami dla każdego z badanych leków, zarówno w krwi pełnej, jak i różnych matrycach biologicznych, co wskazuje na doskonałą odtwarzalność. Następnie określa się farmakokinetykę i biodystrybucję długotrwałego krążenia lub pegylowanych nanocząstek w oparciu o jednoczesne dostarczanie doksorubicyny i mitomycyny C. Obserwuje się, że stężenia leków we krwi dostarczane przez hybrydowe nanocząstki polimerowo-lipidowe w czasie są co najmniej sześciokrotnie wyższe niż w równoważnych wolnych roztworach leków.

W ortotopowym guzie piersi hybrydowe nanocząstki polimerowo-lipidowe mogą jednocześnie dostarczać doksorubicynę i mitomycynę C w ich synergicznym stosunku leku. W porównaniu z wolnym roztworem leku, nanocząsteczki mają zwiększoną akumulację guza. Wynika to z przedłużonego systematycznego krążenia, które pozwala nanocząstkom wykorzystać zwiększoną przepuszczalność i retencję guza.

Dalsze ilościowo określone tworzenie doksorubicyny w guzie piersi w ciągu 24 godzin, wraz ze zwiększoną apoptozą guza, wskazuje, że biodostępność leku ma kluczowe znaczenie w projektowaniu skutecznego preparatu nanocząstek. Korzystając z tej metody HPLC, udało się wykazać, że hybrydowe nanocząstki polimerowo-lipidowe mogą precyzyjnie dostarczać synergiczną kombinację leków do komórek nowotworowych in vivo, prowadząc do poprawy chemioterapii. Tę technikę można wykonać w około dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Aby zminimalizować potencjalną grabież narkotyków, ważne jest, aby pamiętać o unikaniu bezpośredniego światła słonecznego i trzymaniu próbki na lodzie podczas próby tej procedury. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie nanomedycyny do zbadania nanofarmakokinetyki kombinacji leków i lepszego zaprojektowania skutecznego preparatu nanocząstek do terapii raka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak jednocześnie ekstrahować i wykrywać doksorubicynę, mitomycynę C i metabolit doksorubicyny, doksorubicyn, w szerokim zakresie próbek biologicznych zawierających nanocząstki załadowane kombinacją leków.

Nie zapominaj, że praca z lekami przeciwnowotworowymi i kwasami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tego protokołu należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, okularów i fartuchów laboratoryjnych.