Name: Ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny C po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Odkryj metodę ekstrakcji i jednoczesnej chromatograficznej oceny ilościowej doksorubicyny, mitomycyny C oraz doksorubicynolu w próbkach biologicznych myszy z nowotworem piersi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za dotację na sprzęt od Kanadyjskiej Rady Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych (NSERC) dla HPLC, dotację operacyjną od Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR) i Kanadyjskiego Sojuszu Badań nad Rakiem Piersi (CBCR) dla X.Y. Wu oraz stypendium Uniwersytetu w Toronto dla R.X. Zhanga i T. Zhanga.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami University Health Network w Ontario Cancer Institute i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Canadian Council on Animal Care.
1. Przygotowanie próbek biologicznych
<ol>
	<li>Pobierz krew pełną, główne organy oraz guz piersi w określonych punktach czasowych po dożylnym (i.v.) podaniu formulacji zawierających lek (np. DMPLN, liposomalny DOX)
	<ol>
		<li>Wstrzyknij dożylnie przygotowaną formulację zawierającą lek myszy z przerzutami guza piersi.</li>
		<li>Uśpij mysz w wyznaczonych punktach czasowych (np. 15 min), podając wziewnie 2% izofluran w szczelnej komorze.</li>
		<li>Połóż znieczuloną mysz na plecach i umieść jej nos w adapterze nosowym, który stale dostarcza 2% izofluranu. 
		UWAGA: Aby upewnić się, że mysz znajduje się w głębokiej narkozie, delikatnie uciśnij przednie kończyny myszy i sprawdź, czy nie występują żadne ruchy drgawkowe.</li>
		<li>Dokładnie oczyść okolice klatki piersiowej i brzucha za pomocą 70% etanolu, a następnie wykonaj terminalną procedurę nakłucia serca u głęboko znieczulonych myszy, używając heparynowanej strzykawki 1 mL i igły 23 G.</li>
		<li>Pobierz krew pełną do oznakowanej plastikowej probówki spryskanej heparynem sodu i delikatnie zakręć probówką, aby pobrana krew pełna miała kontakt z powłoką z heparyny na ściance probówki. Pobierz minimum 50 µL krwi pełnej. Próbki zawsze przechowuj w lodzie.</li>
		<li>Przytwierdź taśmą wszystkie cztery kończyny myszy, aby ją unieruchomić, a następnie otwórz jamę brzuszną i klatkę piersiową myszy za pomocą nożyczek i pęsety. Przesuń jelita na bok i odsuń wątrobę do góry, aby dostatecznie odsłonić żyłę wrotną. Przetnij żyłę wrotną w celu odprowadzenia krwi.</li>
		<li>Przepłucz cały organizm myszy 50 mL lodowatej 0,9% soli fizjologicznej poprzez serce, używając strzykawki 10 mL z igłą 25 G. 
		UWAGA: Zegnij igłę pod kątem 90°, aby ułatwić wprowadzenie strzykawki do żyły wrotnej.</li>
		<li>Wypreparuj organy w następującej kolejności: serce, płuca, wątroba, śledziona, nerki. Następnie oddziel guz piersi od otaczających tkanek łącznych za pomocą nożyczek chirurgicznych w obrębie prawego podskórnego płata tłuszczowego piersi myszy. Wszystkie organy umieść indywidualnie w polipropylowych probówkach 1,5 mL i szybko zamroź w ciekłym azocie. 
		​UWAGA: Oddziel pęcherzyk żółciowy od wątroby.</li>
		<li>Przechowuj krew pełną w temperaturze 4 °C, a wypreparowane tkanki w zamrażarce -80 °C do czasu późniejszej analizy HPLC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyekstrahuj DOX, MMC i DOXol z matryc biologicznych.
	<ol>
		<li>Szybko zważ wszystkie zamrożone wypreparowane tkanki i przenieś je do stożkowej probówki 13 mL z zaokrąglonym dnem. Aby uniknąć ewentualnego metabolizmu lub degradacji leku, próbki przechowuj w lodzie.</li>
		<li>Dodaj do probówki 1-5 mL lodowatego buforu do lizy komórek. 
		UWAGA: Objętość stosowanego buforu zależy od masy tkanki, przyjmując stosunek tkanka-bufor 1 g: 5 mL (w/v); dla małych organów, takich jak serce i śledziona, stosunek ten wynosi 1 g: 2 mL.</li>
		<li>Używając elektrycznego homogenizatora ręcznego, homogenizuj próbki tkanek w lodzie, wykonując ruchy góra-dół przy prędkości 18 0 rpm. 
		UWAGA: Pełna homogenizacja wymaga około 3 do 5 iteracji krótkiego procesu homogenizacji trwającego mniej niż 15 s, z chłodzeniem tkanki w lodzie pomiędzy każdym krótkim cyklem.</li>
		<li>Pomiędzy każdą próbką tkanki przemywaj 10 mm ząbkowaną sondę homogenizatora wodą destylowaną i dejonizowaną (DDI) H2O, 70% etanolem, a następnie ponownie DDI H2O, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej.</li>
		<li>Przenieś 50 µL homogenatu tkankowego lub krwi pełnej do polipropylowej probówki do mikrowirówki 1,5 mL i dodaj 5 µL wzorca wewnętrznego (I.S.) 4-metylumbelliferonu (4-MU) (200 ng/mL). 
		UWAGA: Roztwór 4-MU został tutaj przygotowany w metanolu.</li>
		<li>Dodaj 250 µL lodowatego rozpuszczalnika do ekstrakcji do probówki zawierającej krew pełną lub homogenat tkankowy. 
		UWAGA: Rozpuszczalnik do ekstrakcji składa się z 60% acetonitrylu (ACN) i 40% octanu amonu (5 mM) z pH skorygowanym do pH = 3,5 za pomocą 0,05% kwasu mrówkowego. Stosuj stosunek objętości próbka:rozpuszczalnik do ekstrakcji 1:5 (v/v).</li>
		<li>Mocno mieszaj mieszaninę w wirówce vortex przez 2 min, odwiruj przy sile 30 x g w temperaturze 4 oC przez 10 min i pobierz pipetą 20 µL supernatantu do innej, schłodzonej wcześniej, świeżej probówki do mikrowirówki.</li>
		<li>Odparuj supernatant w temperaturze 60 °C pod powolnym strumieniem gazowego azotu, chroniąc go przed światłem.</li>
		<li>Rekonstytuuj wysuszony osad w 10 µL lodowatego metanolu, mocno mieszaj w wirówce vortex przez 30 s i odwiruj przy 30 x g w temperaturze 4 °C przez kolejne 5 min.</li>
		<li>Przenieś supernatant do wkładu do fiolki HPLC i umieść fiolki z próbkami w tackach autosamplera do wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Aparatura HPLC i parametry pracy
<ol>
	<li>Przygotowanie fazy ruchomej do HPLC z zachowaniem powtarzalności
	<ol>
		<li>Odmierz 50 mL wody H2O klasy HPLC za pomocą cylindra miarowego.</li>
		<li>Odmierz 50 mL acetonitrylu (ACN) klasy HPLC za pomocą oddzielnego cylindra miarowego.</li>
		<li>Ostrożnie dodaj 0,5 mL kwasu triflorooctowego (TFA) (OSTROŻNIE) do każdego z 500 mL H2O oraz ACN, aby otrzymać fazę ruchomą H2O oraz ACN zawierającą odpowiednio 0,1% TFA. 
		UWAGA: TFA jest substancją żrącą i toksyczną, dlatego należy z nią pracować pod dygestorium laboratoryjnym. Wszystkie mieszaniny rozpuszczalników przygotowuje się w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przefiltruj fazy ruchome przez nylonowy filtr membranowy o rozmiarze porów 0,45 µm i przelej je do czystych butelek zbiorników HPLC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja aparatury HPLC do jednoczesnego detekcji DOX, MMC, DOXol oraz standardu wewnętrznego (I.S.) 4-MU.
	<ol>
		<li>Włącz pompę gradientową, odgazowywacz, autosampler, detektor z matrycą fotodiod oraz wielodługościowy detektor fluorescencyjny λ.</li>
		<li>Wprowadź początkowe warunki składu fazy ruchomej: 16,5% H2O (0,1% TFA) i 83,5% ACN (0,1% TFA) (v/v).</li>
		<li>Ustaw detektor UV na dwóch kanałach: jeden na 310 nm dla 4-MU (I.S.) i drugi na 360 nm dla MMC.</li>
		<li>Ustaw detektor fluorescencyjny na dwóch kanałach: jeden na λex/λem =365/45 nm dla 4-MU i drugi na λex/ λem=480 nm/560 nm odpowiednio dla DOX i DOXol.</li>
		<li>Ustaw izokratyczną prędkość przepływu na 1,0 mL/min.</li>
		<li>Równoważ wcześniej zainstalowaną kolumnę C18 w fazie odwróconej (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) w temperaturze pokojowej przez 10 min w celu ustalenia linii bazowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozdział leków (DOX, MMC, DOXol i 4-MU) z wykorzystaniem warunków gradientowej fazy ruchomej.
	<ol>
		<li>Wstrzyknij 15 µL wyekstrahowanych i zagęszczonych próbek za pomocą autosamplera.</li>
		<li>Stopniowo zmieniaj początkowe warunki fazy ruchomej (patrz punkt protokołu 2.2.2) do 10% ACN (0,1% TFA) w czasie 18 min przy użyciu automatycznej pompy gradientowej. 
		UWAGA: Podczas procesu rozdziału jednocześnie pojawiają się cztery kanały (dwa absorbujące UV i dwa fluorescencyjne), przy czym każdy kanał wyświetla jeden związek leku (patrz punkty protokołu 2.2.3 i 2.2.4).</li>
		<li>Utrzymaj 10% ACN (0,1% TFA) przez 1 min, a następnie powróć do początkowych warunków fazy ruchomej w ciągu 1 min.</li>
		<li>Ponownie przygotuj kolumnę, stosując początkową fazę ruchomą przy prędkości przepływu 1,5 mL/min przez 4 min przed wstrzyknięciem kolejnej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Walidacja HPLC
<ol>
	<li>Przygotować standardy robocze DOX, MMC i DOXol oraz 4-MU (standard wewnętrzny).
	<ol>
		<li>Odważ oddzielnie 1 mg proszku leków DOX i MMC (OSTROŻNIE) oraz 4-MU na świeżej, małej papierowej szalce wagowej (3 x 3 cale)2). 
		Uwaga: Wszystkie leki przeciwnowotworowe są uznawane za zagrożenie dla zdrowia, które w przypadku inhalacji lub połknięcia mogą wywołać ostrą toksyczność oraz mutagenność komórek linii zarodkowej. Należy z nimi obchodzić się ostrożnie, stosując rękawiczki i maski.</li>
		<li>Przenieś odważone DOX, MMC oraz 4-MU do nowej, oddzielnej polipropylenowej probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 1 ml metanolu i krótko wymieszać wstrząsarce typu vortex, aby uzyskać stężenie DOX i MMC wynoszące 1 mg/ml.</li>
		<li>Do probówki zawierającej wcześniej odważony 1 mg DOXol (ostrożnie) dodać 1 ml metanolu i krótko wymieszać w wirówce typu vortex, aby uzyskać stężenie DOXol wynoszące 1 mg/ml. 
		UWAGA: DOXol jest kardiotoksycznym metabolitem i należy z nim obchodzić się ostrożnie.</li>
		<li>Pipeta 20 µL przygotowanych roztworów zapasowych DOX, MMC, DOXol i 4-MU do nowej, oddzielnej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml z polipropylenu i dodać 980 µL metanolu w celu otrzymania standardu roboczego o stężeniu 20 µg/mL każdego leku.</li>
		<li>Rozcieńczyć 20 µg/mL DOX, MMC i DOXol przy użyciu metanolu w celu otrzymania standardów roboczych o stężeniu 50 ng - 20 µg /mL dla DOX, MMC i DOXol oraz 200 ng/mL dla I.S. 4-MU.</li>
		<li>Zakryć zakrętkę probówki z roztworami roboczymi wąskim paskiem folii parafinowej, aby zapobiec odparowaniu metanolu, owinąć całą probówkę folią aluminiową, aby uniknąć ekspozycji na bezpośrednie światło, i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określenie liniowości, precyzji i dokładności DOX, MMC oraz DOXol w macierzach biologicznych (t. j. całokrwiste oraz homogenat guza).
	<ol>
		<li>Jednoczesne wzbogacenie próbek 5 µL roztworów wzorców roboczych DOX i DOXol (50 ng/ml - 20 µg/mL), MMC (1 0 ng/ml - 16 µg/mL), oraz 4-MU (2 µg/mL) do 50 µL ślepej pełnej krwi lub homogenatu tkankowego w polipropylenowych probówkach do mikrocentryfugi w celu uzyskania standardowej krzywej kalibracyjnej w zakresie od 5 do 200 ng/mL dla związków leku oraz 20 ng/mL dla 4-MU (standardu wewnętrznego).</li>
		<li>Przeprowadź analizę ekstrakcji leku opisaną w protokole 1.2.</li>
		<li>Do oceny precyzji i dokładności wewnątrz- i między-dniowej należy zastosować niskie, średnie i wysokie stężenia DOX i DOXol (50, 50 i 20 ng/ml) oraz MMC (10, 100 i 20 ng/ml). 
		UWAGA: Świeże roztwory standardów o określonych stężeniach należy przygotować w dniu przeprowadzenia analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza próbek
	<ol>
		<li>Wstrzyknąć 15 µL próbki za pomocą autosamplera.</li>
		<li>Stopniowo zmieniaj fazę ruchomą w czasie od 0 do 18 min, zwiększając w tym przedziale zawartość ACN.</li>
		<li>Po 18 min utrzymaj warunki fazy ruchomej przez 1 min.</li>
		<li>Powróć do warunków początkowych w ciągu następnych 2 min, a następnie ponownie wyrównoważ układ przez 4 min przed kolejnym wstrzyknięciem.</li>
		<li>Po każdym przebiegu próbki należy zwrócić uwagę, że piki związków leków wraz z ich czasami retencji są przedstawione w następującej kolejności: MMC, DOXol, 4-MU (S.W.) i DOX.</li>
		<li>Zintegruj pole powierzchni pod krzywą (AUC) dla związków leków, korzystając z oprogramowania do HPLC.</li>
		<li>Obliczyć stosunek AUC pomiędzy poszczególnym związkiem leku a wzorcem wewnętrznym (I.S.) (Równanie 1) i wykorzystać krzywe wzorcowe przygotowane zgodnie z tymi samymi procedurami ekstrakcji, aby oznaczyć stężenia leków DOX, MMC i DOXol w formulacji DMPLN. 
		<img alt="Równanie stosunku powierzchni piku AUC_leku/AUC_IS; formuła chemii analitycznej do analizy danych." src="/files/ftp_upload/56159/56159eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"></li>
		<li>Oblicz procent odzysku leku (Równanie 2), porównując stężenia leku po rekonstytucji przy użyciu metanolu z ekstraktów wzbogaconych próbek biologicznych do stężenia standardowego („czystego”) roztworu leku w metanolu. 
		<img alt="Wzór obliczania odzysku leku, \( \text{Równanie: Odzysk leku \%} = \frac{\text{Stosunek powierzchni piku}_{ekstrahowanego}}{\text{Stosunek powierzchni piku}_{czystego}} \times 10 \)." src="/files/ftp_upload/56159/56159eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"></li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych i konfliktów interesów.

W porównaniu z innymi metodami chromatograficznymi, które umożliwiają wykrywanie pojedynczego gatunku leku na raz, obecny protokół HPLC jest w stanie jednocześnie oznaczać ilościowo trzy związki leków (DOX, MMC i DOXol) w tej samej matrycy biologicznej bez konieczności zmiany fazy ruchomej. Ta metoda przygotowania i analizy została z powodzeniem zastosowana do określenia farmakokinetyki i biodystrybucji dwóch systemów dostarczania leków opartych na nanocząstkach (tj. liposomalnych DOX i DMPLN)2...

Chemioterapia jest podstawową metodą leczenia wielu nowotworów, jednak często wiąże się z poważnymi działaniami niepożądanymi i ograniczoną skutecznością z powodu oporności na leki i innych czynników1,2,3. Aby poprawić wyniki chemioterapii, w klinice zastosowano schematy kombinacji leków w oparciu o takie czynniki, jak nienakładające się na siebie toksyczności, różne mechanizmy działania leków i niekrzyżowa oporność na leki4,5,6. W badaniach klinicznych często obserwowano lepszy wskaźnik odpowiedzi guza przy jednoczesnym podawaniu kombinacji leków w porównaniu ze schematem sekwencyjnego dostarczania leków7,8. Jednak ze względu na nieoptymalną biodystrybucję wolnych form leków, jednoczesne wstrzykiwanie wielu leków może powodować wyraźną normalną toksyczność tkankową, która przeważa nad efektem terapeutycznym9,10,11. Wykazano, że dostarczanie leków oparte na nanonośnikach zmienia farmakokinetykę i biodystrybucję leków w kapsułkach, zwiększając akumulację ukierunkowaną na nowotwór12,13,14. Jak omówiliśmy w naszych ostatnich artykułach, nanocząstki współładowane synergistycznymi kombinacjami leków wykazały zdolność do łagodzenia problemów napotykanych przez wolne kombinacje leków, ze względu na kontrolowane czasowe i przestrzenne jednoczesne dostarczanie wielu leków do tkanki nowotworowej, umożliwiając synergiczne działanie leków przeciwko komórkom nowotworowym4,15,16. W rezultacie, zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych, wykazano wyższą skuteczność terapeutyczną i niską toksyczność4,17,18.
Nasze poprzednie badania in vitro wykazały, że połączenie dwóch leków przeciwnowotworowych, doksorubicyny (DOX) i mitomycyny C (MMC), wywołało efekt synergiczny przeciwko kilku liniom komórek raka piersi, a ponadto, współładowanie DOX i MMC w hybrydowych nanocząstkach polimerowo-lipidowych (DMPLN) pokonało różne wielolekooporne pompy wypływu (np. glikoproteina P i białko odporne na raka piersi)19,20,21. In vivo DMPLN umożliwił przestrzenno-czasowe jednoczesne dostarczanie DOX i MMC do miejsc nowotworowych oraz zwiększył biodostępność leków w komórkach nowotworowych, na co wskazuje moderacja powstawania metabolitu DOX doksorubicynolu (DOXol)22. W rezultacie, DMPLN zwiększył apoptozę komórek nowotworowych, zahamowanie wzrostu guza i wydłużenie przeżycia gospodarza w porównaniu z kombinacją wolnych DOX i MMC lub liposomalnym preparatem DOX22,23,24,25.
Analiza rzeczywistej ilości leków dostarczanych jednocześnie przez nanonośnik jest kluczowa dla projektowania skutecznych preparatów nanocząstek. Opracowano wiele metod analizy poziomu w osoczu pojedynczych dawek DOX lub MMC przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) samodzielnie lub w połączeniu ze spektrometrią mas (MS)26,27,28,29,30,31,32,33,34. Metody te są jednak często czasochłonne i niepraktyczne w przypadku terapii skojarzonej, ponieważ duża liczba próbek biologicznych musi być przygotowywana oddzielnie do analizy wielu leków (czasami zawierających metabolity leków). Oprócz silnego wiązania DOX i MMC z białkami osocza, czerwone krwinki mają również dużą zdolność do wiązania i koncentracji wielu leków przeciwnowotworowych35,36. W związku z tym analiza osocza pod kątem DOX lub MMC może zaciemnić rzeczywiste stężenia leków we krwi. Niniejsza praca (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) opisuje prostą i solidną metodę analizy wielu leków przy użyciu HPLC z odwróconą fazą do jednoczesnej ekstrakcji i ilościowego oznaczania DOX, MMC i metabolitu DOX doksorubicyny (DOXol) z pełnej krwi i różnych tkanek (np. nowotworów). Został on z powodzeniem zastosowany do określenia farmakokinetyki i biodystrybucji DOX i MMC, a także tworzenia DOXolu po podaniu leku za pośrednictwem wolnych roztworów lub form nanocząstek (tj. DMPLN i liposomalnego DOX) w ortotopowo wszczepionym mysim modelu guza piersi po wstrzyknięciu dożylnym (IV)22.

<table><tbody><tr><td>Doksorubicyna&nbsp;</td><td>Polymed Theraeutics</td><td>111023</td><td>Lek przeciwnowotworowy</td></tr><tr><td>Mitomycyna C</td><td>Polymed Theraeutics</td><td>060814</td><td>Lek przeciwnowotworowy</td></tr><tr><td>Doksorubicynol (DOXol)</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>D558020</td><td>Metabolit</td></tr><tr><td>soli sodowej DOX 4-metylumbliferonu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1508</td><td>Wzorzec wewnętrzny</td></tr><tr><td>Kwas mirystynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-63-8&nbsp; &nbsp;</td><td>Materiały na hybrydowe nanocząstki polilipidowe</td></tr><tr><td>Polioksyetylen (100) Stearate</td><td>Spectrum</td><td>M1402</td><td>Materiały na hybrydowe nanocząstki polilipidowe</td></tr><tr><td>Polioksyetylen (40) Stearynian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3440</td><td>Materiały na hybrydowe nanocząstki polilipidowe</td></tr><tr><td>Pluronic F68 (PF68)</td><td>BASF Corp.</td><td>9003-11-6</td><td>Materiały do hybrydowych nanocząstek polilipidowych</td></tr><tr><td>Ultradźwięki (UP100H)</td><td>Hielscher, Technologia ultradźwiękowa</td><td>NA</td><td>Przygotowanie nanocząstek</td></tr><tr><td>Kąpiel wodna (ISOTEMP 3016HS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NA</td><td>Przygotowanie nanocząstek</td></tr><tr><td>Doksorubicyna liposomalna&nbsp; (Caelyx)</td><td>Janssen</td><td>Zakupiony w aptece Princess Margaret</td><td>Hospital Klinicznie zatwierdzona formuła nanocząstek&nbsp;</td></tr><tr><td>Metanol klasy HPLC</td><td>Caledon Chemicals</td><td>6701-7-40</td><td>HPLC kompozycja fazy ruchomej</td></tr><tr><td>Klasa H2O</td><td>Caledon Chemicals</td><td>8801-7-40</td><td>HPLC kompozycja fazy ruchomej</td></tr><tr><td>Acetonitryl klasy HPLC&nbsp;</td><td>Caledon Chemicals</td><td>1401-7-40</td><td>HPLC kompozycja fazy ruchomej</td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td>HPLC skład fazy ruchomej</td></tr><tr><td>0,45 &mu; m Bibuła filtracyjna z membraną nylonową</td><td>Whatman</td><td>WHA7404004</td><td>HPLC Przygotowanie fazy mobilnej</td></tr><tr><td>1cc Plastikowe strzykawki</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>2606-309659</td><td>Wtrysk leczniczy</td></tr><tr><td>5cc Plastikowe strzykawki</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>2608-309646</td><td>Kolekcje tkanek</td></tr><tr><td>Igły 30G 1/2</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305106</td><td>Leczenie iniekcyjne</td></tr><tr><td>Igły 25G 5/8</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td>Kolekcje tkanek</td></tr><tr><td>Sterylne 0,9% soli fizjologicznej</td><td>Uniwersytet w Toronto Marka House</td><td>1011</td><td>Perfuzja tkanek</td></tr><tr><td>13 ml Rurka stożkowa z zaokrąglonym dnem&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>62.515.006</td><td>Prolyprolen, homogenizacja tkankowa</td></tr><tr><td>Alpha Minimum Essential Medium (MEM)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>12571063</td><td>Pożywka komórkowa</td></tr><tr><td>1 x Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Homogenizacja tkanek</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100 ML</td><td>Homogenizacja tkanek</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Caledon Chemicals</td><td>1/5/3840</td><td>Dostosuj pH dla rozpuszczalnika ekstrakcyjnego</td></tr><tr><td>Plastikowe rurki spryskane heparyną sodową</td><td>Becton, Dickinson i spółka</td><td>367878</td><td>Analityczna waga do pobierania krwi</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Sartorius&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CPA225D pH-metry NA&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-637-671</td><td>accumet BASIC</td></tr><tr><td>Vortex Mixter</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-365</td><td>Wirowanie próbek z żądaną prędkością</td></tr><tr><td>1,5 ml&nbsp; Rurka do mikrowirówek</td><td>Fisherbrand</td><td>2043-05408129</td><td>Homogenizator prolyprolenu</td></tr><tr><td>Model 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-672</td><td>Wirówka do homogenizacji tkanek</td></tr><tr><td>5702R</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td>Przygotowanie do ekstrakcji</td></tr><tr><td>Podgrzewany system parownika</td><td>Glas-Col</td><td>NA</td><td>Rekonstytucja próbki</td></tr><tr><td>HPLC Fiolki z gwintem</td><td>śrubowym DIKMA</td><td>5320</td><td>Wtrysk próbki HPLC</td></tr><tr><td>Zakrętki HPLC z białym silikonem PTFE Septa</td><td>DIKMA</td><td>5325</td><td>HPLC wtrysk próbki HPLC</td></tr><tr><td>Wkładka polipropylenowa HPLC&nbsp; &nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0549</td><td>Maksymalna głośność 250 &mu; l, wstrzyknięcie próbki HPLC</td></tr><tr><td>Xbridge C18 Kolumna</td><td>Waters Corporation</td><td>186003117</td><td>Analiza leków</td></tr><tr><td>Pompa gradientowa&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W600</td><td>Analiza narkotyków</td></tr><tr><td>Auto-sampler</td><td>Waters Corporation</td><td>W2707</td><td>Analiza narkotyków</td></tr><tr><td>Detektor matrycy fotodiodowej&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W2998</td><td>Analiza narkotyków</td></tr><tr><td>Detektor fluorescencji Multi &lambda&nbsp;</td><td>Waters Corporation</td><td>W2475</td><td>Analiza leków</td></tr><tr><td>EMPOWER 2</td><td>Waters Corporation</td><td>NA</td><td>Oprogramowanie do analizy danych</td></tr><tr><td>Naukowiec</td><td>Micromath</td><td>NA</td><td>Analiza farmakokinelogiczna</td></tr><tr><td>Samice myszy Balb/c</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>001026</td><td>In vivo</td></tr><tr><td>EMT6 / WT Komórki raka piersi</td><td>dostarczone przez dr Iana Tannocka; Ontario Cancer Institute</td><td>NA</td><td>In vivo</td></tr></tbody></table>

ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny c po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Chemioterapia skojarzona jest często stosowana w klinice w leczeniu raka; jednak związane z nią działania niepożądane na normalną tkankę mogą ograniczyć jej korzyści terapeutyczne. Wykazano, że kombinacja leków oparta na nanocząsteczkach łagodzi problemy napotykane podczas terapii skojarzonej z bezpłatnymi lekami. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że połączenie dwóch leków przeciwnowotworowych, doksorubicyny (DOX) i mitomycyny C (MMC), wywołało efekt synergiczny zarówno przeciwko mysim, jak i ludzkim komórkom raka piersi in vitro. Hybrydowe nanocząstki polimerowo-lipidowe (DMPLN) z jednoczesnym obciążeniem DOX i MMC ominęły różne pompy transportera wypływu, które nadają oporność wielolekową, i wykazały zwiększoną skuteczność w modelach guzów piersi. W porównaniu z konwencjonalnymi formami roztworów, tak wyższą skuteczność DMPLN przypisano zsynchronizowanej farmakokinetyce DOX i MMC oraz zwiększonej wewnątrzkomórkowej biodostępności leku w komórkach nowotworowych, co umożliwił nanonośnik PLN. 
Aby ocenić farmakokinetykę i biodystrybucję jednocześnie podawanych DOX i MMC zarówno w postaci wolnego roztworu, jak i nanocząstek, opracowano prostą i efektywną metodę analizy wielolekowej wykorzystującą wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) z odwróconymi fazami. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych metod, które analizowały DOX lub MMC indywidualnie w osoczu, ta nowa metoda HPLC jest w stanie jednocześnie określić ilościowo DOX, MMC i główny kardiotoksyczny metabolit DOX, doksorubicynol (DOXol), w różnych matrycach biologicznych (np. Krew pełna, guz piersi i serce). Podwójna sonda fluorescencyjna i absorbująca promieniowanie ultrafioletowe, 4-metylolumbelliferon (4-MU), została użyta jako wzorzec wewnętrzny (IS) do jednoetapowego wykrywania wielu analiz leków o różnych długościach fal detekcji. Metoda ta została z powodzeniem zastosowana do określenia stężeń DOX i MMC dostarczanych zarówno przez nanocząstki, jak i roztwory w pełnej krwi i różnych tkankach w ortotopowym mysim modelu guza piersi. Przedstawiona metoda analityczna jest użytecznym narzędziem do analizy przedklinicznej dostarczania kombinacji leków na podstawie nanocząstek.

Dwa leki przeciwnowotworowe, DOX i MMC, a także metabolit DOX, DOXol, zostały jednocześnie wykryte bez żadnych interferencji biologicznych w tych samych warunkach gradientowej HPLC, stosując 4-MU jako standard wewnętrzny (I.S.) zarówno dla detektora fluorescencyjnego, jak i UV. DOX, MMC, DOXol i 4-MU zostały od siebie wyraźnie oddzielone, a czasy retencji wyniosły odpowiednio: 5,7 min dla MMC, 10,4 min dla DOXol, 10,9 min dla 4-MU oraz 1,1 min dla DOX (Rysunek 2</stro...

Ten protokół opisuje efektywny i wygodny proces analityczny pobierania próbek i jednoczesnego oznaczania wielu leków, doksorubicyny (DOX), mitomycyny C (MMC) i kardiotoksycznego metabolitu DOX, doksorubicyny (DOXol), w próbkach biologicznych z przedklinicznego modelu guza piersi traktowanego preparatami nanocząsteczkowymi synergicznego połączenia leków.

Ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny C po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Ogólnym celem tego protokołu analitycznego jest jednoczesna ekstrakcja i ilościowe określenie dwóch leków przeciwnowotworowych, doksorubicyny i mitomycyny C, dostarczanych jednocześnie przez hybrydowe nanocząstki polimerowo-lipidowe, oraz metabolitu doksorubicyny, doksorubicyny, doksorubicyny, w matrycach biologicznych przy użyciu prostej i niezawodnej metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nanomedycyny, takie jak sposób zaprojektowania skutecznego systemu nanonoszenia, opartego na nanofarmakokinetyce kombinacji leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na jednoczesne oznaczanie ilościowe trzech związków leków w tej samej matrycy biologicznej, bez konieczności zmiany fazy ruchomej HPLC.Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w biologiczne zachowania doksorubicyny, mitomycyny C i doksorubicyny w pierwotnych nowotworach piersi. Może być również stosowany w przypadku innych typów nowotworów leczonych podobnymi lekami. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ trudno jest nauczyć się skutecznych etapów przygotowania próbki.Aby rozpocząć tę procedurę, należy pobrać i zamrozić krew pełną, główne narządy i guz piersi, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Szybko zważ zamrożone tkanki i zapisz wagę w notatniku laboratoryjnym. Następnie przenieś je do stożkowej rurki o okrągłym dnie o pojemności 13 mililitrów.Następnie dodaj od jednego do pięciu mililitrów lodowatego buforu do lizy komórek. Za pomocą elektrycznego homogenizatora ręcznego homogenizuj tkankę ruchem w górę iw dół na lodzie z prędkością 18 000 obr./min. Następnie umyj 10-milimetrową sondę generatora piły homogenizatora destylowaną wodą dejonizowaną.Umyj sondę 70% etanolem, a następnie ponownie destylowaną wodą dejonizowaną. Przenieś 50 mikrolitrów homogenatu tkankowego lub krwi pełnej do 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki z polipropylenu. Następnie nakłuj pięcioma mikrolitrami 2,000 nanogramów na mililitr wewnętrznego wzorca 4-MethylUmbelliferone.Dodać lodowaty rozpuszczalnik ekstrakcyjny zawierający 150 mikrolitrów acetonitrylu i 100 mikrolitrów pięciomilimolowego octanu amonu. Energicznie mieszaj mieszaninę przez dwie minuty. Wirować w temperaturze 3 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.Następnie przenieś 200 mikrolitrów supernatantu do świeżej, wstępnie schłodzonej probówki do mikrowirówki. Użyj powolnego strumienia azotu gazowego, aby odparować supernatant w temperaturze 60 stopni Celsjusza z ochroną przed światłem. Następnie rozpuść wysuszoną pozostałość w 100 mikrolitrach lodowatego metanolu.Energicznie wiruj przez 30 sekund. Wirować w temperaturze 3 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie przenieść supernatant do wkładki do fiolki HPLC.Umieścić fiolki z próbkami w tacce automatycznego podajnika próbek w celu wstrzyknięcia. Aby rozpocząć, należy przygotować fazę mobilną HPLC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Ustaw warunki początkowe składu fazy ruchomej na 16,5% H2O i 83,5% acetonitrylu.Ustaw izokratyczne natężenie przepływu na 1.0 mililitrów na minutę. Następnie należy oddzielić leki za pomocą gradientu fazy ruchomej, jak opisano w protokole tekstowym. Następnie ustaw detektor UV na dwa kanały: jeden na 310 nanometrów dla wewnętrznego wzorca 4-MethylUmbelliferone, a drugi na 360 nanometrów dla Mitomycyny C. Następnie ustaw pierwszy kanał detektora fluorescencji na długość fali wzbudzenia 365 nanometrów i długość fali emisji 445 nanometrów dla 4-MethylUmbelliferone.Ustaw drugi kanał na długość fali wzbudzenia 480 nanometrów i długość fali emisji 560 nanometrów dla doksorubicyny i doksorubicyny. Aby rozpocząć, użyj automatycznego podajnika próbek do wstrzyknięcia 15 mikrolitrów próbki. Zaprogramowany gradientowy skład fazy ruchomej zmienia się automatycznie poprzez zwiększanie składu acetonitrylu w czasie od zera do 18 minut.Po 18 minutach stan fazy ruchomej jest przywracany do stanu początkowego i ponownie równoważony do następnego wstrzyknięcia. Po uruchomieniu każdej próbki należy zanotować piki związków leku i ich czasy retencji. Następnie użyj oprogramowania HPLC, aby zintegrować obszar piku pod krzywą dla związków leku.Obliczyć procent odzysku leku i stosunek pola pod krzywą między każdym związkiem leku a wzorcem wewnętrznym, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W tej procedurze dwa leki przeciwnowotworowe, doksorubicyna i mitomycyna C, wraz z metabolitem doksorubicyny, doksorubicyną, są wykrywane bez ingerencji biologicznej. Analiza HPLC pokazuje, że każdy lek jest dobrze oddzielony od pozostałych.Opracowana metoda HPLC wykazuje mniej niż 15% różnicę w precyzji i dokładności w ciągu i między dniami dla każdego z badanych leków, zarówno w krwi pełnej, jak i różnych matrycach biologicznych, co wskazuje na doskonałą odtwarzalność. Następnie określa się farmakokinetykę i biodystrybucję długotrwałego krążenia lub pegylowanych nanocząstek w oparciu o jednoczesne dostarczanie doksorubicyny i mitomycyny C. Obserwuje się, że stężenia leków we krwi dostarczane przez hybrydowe nanocząstki polimerowo-lipidowe w czasie są co najmniej sześciokrotnie wyższe niż w równoważnych wolnych roztworach leków.W ortotopowym guzie piersi hybrydowe nanocząstki polimerowo-lipidowe mogą jednocześnie dostarczać doksorubicynę i mitomycynę C w ich synergicznym stosunku leku. W porównaniu z wolnym roztworem leku, nanocząsteczki mają zwiększoną akumulację guza. Wynika to z przedłużonego systematycznego krążenia, które pozwala nanocząstkom wykorzystać zwiększoną przepuszczalność i retencję guza.Dalsze ilościowo określone tworzenie doksorubicyny w guzie piersi w ciągu 24 godzin, wraz ze zwiększoną apoptozą guza, wskazuje, że biodostępność leku ma kluczowe znaczenie w projektowaniu skutecznego preparatu nanocząstek. Korzystając z tej metody HPLC, udało się wykazać, że hybrydowe nanocząstki polimerowo-lipidowe mogą precyzyjnie dostarczać synergiczną kombinację leków do komórek nowotworowych in vivo, prowadząc do poprawy chemioterapii. Tę technikę można wykonać w około dwie godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Aby zminimalizować potencjalną grabież narkotyków, ważne jest, aby pamiętać o unikaniu bezpośredniego światła słonecznego i trzymaniu próbki na lodzie podczas próby tej procedury. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie nanomedycyny do zbadania nanofarmakokinetyki kombinacji leków i lepszego zaprojektowania skutecznego preparatu nanocząstek do terapii raka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś zrozumieć, jak jednocześnie ekstrahować i wykrywać doksorubicynę, mitomycynę C i metabolit doksorubicyny, doksorubicyn, w szerokim zakresie próbek biologicznych zawierających nanocząstki załadowane kombinacją leków.Nie zapominaj, że praca z lekami przeciwnowotworowymi i kwasami może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tego protokołu należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek, okularów i fartuchów laboratoryjnych.

sample-extraction-simultaneous-chromatographic-quantitation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Insonacja mikropęcherzyków jest obiecującą strategią ablacji guzów przy zredukowanej średniej mocy akustycznej, a także ukierunkowanego dostarczania leków. Celem niniejszego badania jest opracowanie strategii impulsowania ultradźwiękami o niskim cyklu pracy oraz nanonośników w celu maksymalizacji nietermicznej ablacji mikro naczyniowej i dostarczania ładunku do podskórnych glejaków C6.

Porównanie ukierunkowanego leczenia glejaków u myszy z wykorzystaniem ultradźwięków poprzez dostarczanie nanocząsteczek z lekiem oraz ablację mikro naczyniową

Opisujemy metodę obrazowania odpowiedzi na leczenie przeciwnowotworowe in vivo i w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Obrazowanie na żywo odpowiedzi na leki w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi

Ten artykuł szczegółowo opisuje procedury analizy obrazowania optycznego nanocząsteczki HerDox, ukierunkowanej na nowotwór.  W szczególności opisano tutaj szczegółowe zastosowanie wielomodowego urządzenia do obrazowania do wykrywania celowania w guz i oceny penetracji guza.

Analiza celowanych nanocząstek białek wirusowych dostarczanych do guzów HER2+

Przedstawiono przykład nanoleku opartego na kwasie polimalowym w kierunku racjonalnego projektowania medycyny spersonalizowanej, która ma zastosowanie w leczeniu raka. Opisuje syntezę nanoleku do leczenia Her2-dodatniego ludzkiego raka piersi u nagiej myszy.

Nanobiopolimery na bazie kwasu polimalowego do celowania w wiele markerów nowotworowych: szansa dla medycyny spersonalizowanej?

Opisujemy tutaj metodę obrazowania opartego na światłowodowej konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (FCFM), która zapewnia innowacyjny sposób zrozumienia zjawisk fizjologicznych na poziomie komórkowym i subkomórkowym u zwierząt.

Toksyczność naczyniowa wywołana chemioterapią - obrazowanie in vivo w czasie rzeczywistym upośledzenia naczyń krwionośnych

Heterogeniczne nagromadzenie liposomów wewnątrz guza zostało powiązane z nieprawidłowym mikrośrodowiskiem guza. W niniejszej pracy przedstawiono metody pomiaru mikrokrążenia guza za pomocą obrazowania perfuzyjnego i podwyższonego ciśnienia płynu śródmiąższowego (IFP) przy użyciu systemu robotycznego sterowanego obrazem. Pomiary są porównywane z wewnątrznowotworową akumulacją liposomów, oznaczoną za pomocą wolumetrycznego obrazowania mikro-CT.

Pomiary przestrzenne perfuzji, ciśnienia płynu śródmiąższowego i akumulacji liposomów w guzach litych

Opisano protokół przygotowania i charakterystyki lipofilowych miceli 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[amino(glikol polietylenowy)-2000] (DSPE-PEG).

Przygotowanie i charakterystyka lipofilowych miceli prolekowych doksorubicyny

Nanocząsteczki stają się obiecującymi systemami dostarczania leków dla szerokiego zakresu wskazań. Tutaj opisujemy prostą, ale potężną metodę wytwarzania nanocząstek jedwabiu przy użyciu odwróconego jedwabiu Bombyx mori. Te nanocząstki jedwabiu można łatwo załadować ładunkiem terapeutycznym, a następnie zbadać pod kątem zastosowań związanych z dostarczaniem leków.

Produkcja i dostarczanie leków Zastosowania nanocząstek jedwabiu

Słabe zrozumienie skuteczności nanoleków in vivo utrudnia ich kliniczne tłumaczenie. Opisano tutaj procedury oceny zachowania in vivo nanoleków przeciwnowotworowych na poziomie ogólnoustrojowym, tkankowym, jednokomórkowym i subkomórkowym u myszy immunokompetentnych z nowotworem. Podejście to może pomóc naukowcom w zidentyfikowaniu obiecujących nanoleków przeciwnowotworowych do zastosowania klinicznego.

Kompleksowa procedura oceny skuteczności in vivo nanoleków przeciwnowotworowych

W tym protokole, nanocząstki złota modyfikowane doksorubicyną AS1411-g-PEI-g-PEG są syntetyzowane w trzyetapowych reakcjach amidowych. Następnie doksorubicyna jest ładowana i dostarczana do docelowych komórek rakowych w celu terapii przeciwnowotworowej.

Synteza nanocząstek złota modyfikowanych aptamerem-PEI-g-PEG obciążonych doksorubicyną w celu celowanego dostarczania leków

Tutaj opisujemy protokół dostarczania in vivo magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przenoszących oligomery RNA do przerzutowego raka piersi w modelach zwierzęcych, zapewniając klinicznie realne podejście do terapeutycznego wyciszania onkogennych kwasów nukleinowych.

Monitorowanie akumulacji nanoleków w przerzutach mysiego raka piersi

Odkryj metodę ekstrakcji i jednoczesnej chromatograficznej oceny ilościowej doksorubicyny, mitomycyny C oraz doksorubicynolu w próbkach biologicznych myszy z nowotworem piersi.

Ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny C po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem (Wideo) | JoVE Journal

Ekstrakcja próbki i jednoczesna chromatograficzna ocena ilościowa doksorubicyny i mitomycyny C po dostarczeniu kombinacji leków w nanocząstkach myszom z nowotworem

Przeglądaj więcej filmów