Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie bezkomórkowego systemu ekspresji opartego na E. coli, zwanego translacją transkrypcji lub TX tl. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw trzech początkowych składników do ekstraktu z surowych komórek TX TL, roztworu aminokwasów i roztworu energetycznego. Roztwór aminokwasowy i roztwór energetyczny zostaną później połączone w celu utworzenia bufora TX TL.

Drugim krokiem jest kalibracja surowego ekstraktu komórkowego w celu określenia optymalnych stężeń magnezu, potasu i naziemnej telewizji cyfrowej w celu wytworzenia reakcji TX TL o maksymalnych poziomach ekspresji. Następnie wyniki kalibracji są wykorzystywane do wykonania trzyprobówkowego systemu TX TL wykonanego z buforowego ekstraktu z surowych komórek i DNA. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie reakcji TX TL przy użyciu właśnie wytworzonych odczynników.

Ostatecznie TX TL służy do demonstrowania obwodów biologii syntetycznej, a także tradycyjnych zastosowań ekspresji bezkomórkowej. Metoda ta może pomóc w testowaniu obwodów w dziedzinie biologii syntetycznej, zapewniając równe środowisko in vitro, które naśladuje to in vivo. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zwiększenia szybkości projektowania syntetycznej biologii poprzez wyeliminowanie konieczności przeprowadzania wszystkich etapów prototypowania in vivo.

Asystować przy zabiegu będzie Claire Hayes, asystentka naukowa w naszej grupie. Należy pamiętać, że ten film przejdzie tylko przez wybrane sekcje protokołu krytyczne dla filmowania. Pełny protokół jest dostępny wraz z artykułem tekstowym.

Wcześniej w tym protokole komórki bakteryjne były hodowane i granulowane. Teraz komórki bakteryjne zostaną poddane lizie za pomocą ubijaka do kulek. Przechowuj wszystkie 50-mililitrowe probówki sokoła zawierające zawiesinę komórek na lodzie.

Na potrzeby tego filmu koraliki zostaną zademonstrowane tylko dla jednej rurki. Koraliki muszą być dodawane z przerwami do probówki Falcon w trzech porcjach, z których każda wykorzystuje jedną trzecią wszystkich kulek. Dodaj pierwszą porcję koralików do wiru rurki na 30 sekund i umieść na lodzie.

W ten sam sposób dodaj drugą porcję koralików, wiruj i umieść na lodzie. Po dodaniu ostatniej porcji i wirowaniu upewnij się, że kulki są równomiernie rozłożone, po trzecim etapie wirowania należy uformować gęstą pastę. Umieść rurkę na lodzie.

Przygotuj końcówkę pipety o objętości pięciu mililitrów, używając sterylnych nożyczek, aby odciąć koniec. Aby utworzyć otwór o średnicy od trzech do czterech milimetrów, ustaw pipetę na dwa mililitry. Umieść 20 sterylnych probówek do koralików na lodzie.

Użyj zmodyfikowanej pipety, aby sprawdzić wysoką lepkość roztworu kukiełków. Powinna być lepka do tego stopnia, że ledwo wychodzi z końcówki pipety. Podczas wyrzucania wyjmij roztwór komórek perełkowych z rurki Falcon i przenieś do rurki z kulkami.

Napełniając go do trzech czwartych pełnego wirowania, bardzo krótko w mini wirówce. Aby usunąć pęcherzyki powietrza bez redystrybucji kulek, zakończ dodawanie roztworu komórek kulek do probówki, aby utworzyć wklęsły menisk. Następnie dodaj bardzo małą kroplę roztworu komórek koralików na wewnętrzną stronę nasadki rurki do koralików.

Uważając, aby nie wlać roztworu do zewnętrznej krawędzi nasadki. W przeciwnym razie rurka do koralików nie zamknie się wystarczająco. Postukaj nakrętką o płaską powierzchnię i sprawdź, czy na spodzie nasadki nie ma pęcherzyków powietrza.

Zakryj rurkę do ubijania koralików. Jeśli zrobisz to poprawnie, nasadka powinna być szczelnie zamknięta. Żadne pęcherzyki powietrza nie powinny być widoczne i niewiele, jeśli w ogóle, roztwór komórek koralików powinien się przelać od tego momentu, do wydajnego wykonania koralików potrzebne są dwie osoby.

Przekaż napełnioną rurkę asystentowi w celu perlania koralików, podczas gdy pierwszy demonstrator kontynuuje napełnianie kolejnych rurek do koralików pozostałym roztworem komórek koralików. Weź wypełnioną rurkę do koralików i umieść ją na lodzie. Po zebraniu dwóch napełnionych rurek do perełkowania koralików i przebywaniu na lodzie przez co najmniej minutę.

Rozpocznij koraliki koralikowe jedną rurkę przez 30 sekund przy 46 obr./min. Połóż do góry nogami na lodzie na 30 sekund, ubijając drugą rurkę. Powtórz nawlekanie i lukier tak, aby każda wypełniona rurka do perełek była ubijana przez łącznie jedną minutę.

Po przetworzeniu wszystkich wypełnionych rurek do perełek skonstruuj aparat filtrujący z 15-mililitrowej rurki sokoła. Najpierw dodaj nową nasadkę do koralików płaską częścią skierowaną do dołu rurki. Następnie zdejmij nasadkę z przetworzonej rurki do perełkowania koralików i mocno dociśnij kolumnę mikrochromatograficzną do końca przetworzonej rurki do perełkowania koralików, aż do całkowitego uszczelnienia.

Oderwij eluciański koniec kolumny mikrochromatograficznej i umieść ją elucian. Zakończ w dół do pustej rurki do koralików. Umieść ten kompleks w 15-mililitrowej tubie sokoła.

Zbuduj aparaty filtrujące dla wszystkich napełnionych rurek do ubijania kulek i utrzymuj je na lodzie. Po całkowitym odwirowaniu aparaty filtrujące Probówka Falcona odkorkowana przy 6 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu oddzielenia ekstraktu i osadu od kulek. Po odwirowaniu sprawdź, czy każda rurka z kulkami wytworzyła żywy ekstrakt.

Prawidłowo ubity ekstrakt nie będzie mętny, a granulka będzie miała dwie wyraźne warstwy, jak pokazuje tubka po lewej stronie. Zmętniałe rurki, jak pokazano w przykładzie po prawej stronie, należy wyrzucić. Przenieś supernatant z nietwardych probówek do pojedynczych mikroprobówek wirówek o pojemności 1,75 mililitra, pobierając jak najmniej granulek.

Trzymaj na lodzie, aż wszystkie rurki do koralików zostaną przetworzone. Następnie odwiruj mikroprobówki wirówkowe i zbierz supernatant. Po zagęszczeniu 500 mikrolitrów supernatantu bez granulek w nowej probówce do perełek perełkowych.

Inkubować probówki ze zdjętymi nakrętkami przy 220 obr./min i 37 stopniach Celsjusza przez 80 minut. Spowoduje to strawienie pozostałych kwasów nukleinowych za pomocą endogennej egzonukleazy uwalnianej podczas procesu perełkowania. Po zakończeniu inkubacji ekstrakt powinien wyglądać na mętny.

Skonsoliduj ekstrakt w mikroprobówkach wirówkowych o pojemności 1,75 mililitra do 1,5 mililitra na probówkę w temperaturze 12 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipety skonsoliduj supernatant bez granulek w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,75 mililitra w celu uzyskania mniejszych plonów lub w 15-mililitrowej probówce Falcon w celu uzyskania większej wydajności na lodzie. Zakryj probówkę i dobrze wymieszaj, odwracając.

Zaoszczędź 10 mikrolitrów supernatantu na lodzie do późniejszego pomiaru stężenia białka. Określić całkowitą ilość wyprodukowanego ekstraktu i uwodnić niezbędną liczbę 10 kaset dializacyjnych o odciętej masie cząsteczkowej, zanurzając w buforze S 30 B na dwie minuty. Załaduj kasety z maksymalnie 2,5 mililitra ekstraktu.

Każda zlewka może pomieścić do dwóch kaset dializowanych, mieszając w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Zapoznaj się z artykułem pisemnym, aby zapoznać się z etapami przetwarzania po dializie. Podstawowa reakcja translacji transkrypcji składa się z trzech części: surowego ekstraktu komórkowego, buforu i DNA.

Chociaż reakcje mogą różnić się objętością, protokół ten wykorzystuje wcześniej napisany szablon do przeprowadzenia reakcji o objętości 10 mikrolitrów. Tu. Pozycje w kolorze fioletowym wskazują wartości wprowadzone przez użytkownika, a pozycje w kolorze niebieskim wskazują dodatkowe odczynniki, które należy dodać do projektu reakcji w postaci eksperymentu in sili przy użyciu sekcji przygotowania mieszanki głównej i sekcji przygotowania DNA. Ogólnie rzecz biorąc, stałe można umieścić w sekcji przygotowania mieszanki głównej, podczas gdy zmienne można umieścić w sekcji przygotowania DNA.

Zminimalizuj próbki na eksperyment, aby uniknąć parowania próbki i odchylenia czasu rozpoczęcia eksperymentu. Przykładowa konfiguracja jest pokazana w tej tabeli. Aby przygotować próbki DNA dla każdej próbki, ID podwielokrotnia wskazanej wody DNA i przedmiotów dostarczonych przez użytkownika do mikroprobówki wirówkowej.

W temperaturze pokojowej przygotuj mieszankę wzorcową składającą się z ekstraktu buforowego i wszelkich elementów dostarczonych przez użytkownika z całego świata, utrzymywanych na lodzie i wirujących. Po dodaniu każdej pozycji dodaj odpowiednią ilość mieszanki wzorcowej do każdej próbki DNA i utrzymuj w temperaturze pokojowej. Potraktuj to jako czas rozpoczęcia reakcji.

Każdą próbkę należy wirować i odwirowywać przy sile 10 000 G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej, aby usunąć pozostałą próbkę i zredukować pęcherzyki. Przeprowadź reakcję w płytce 384-dołkowej w temperaturze 29 stopni Celsjusza. Czas wykonywania będzie się różnić w zależności od eksperymentu, ale zwykle trwa poniżej ośmiu godzin.

Po zakończeniu cyklu dane można odczytać z czytnika płytek. W artykule przedstawiono pięciodniowy protokół przygotowania endogennej translacji transkrypcyjnej opartej na E. coli lub bezkomórkowego systemu ekspresji TXTL. Warunki ekspresji tego systemu zostały zoptymalizowane poprzez testowanie efektów różnych metod przetwarzania plazmidu i buforu elucijanowego.

Niektóre zmienne wprowadzone do systemu TXTL powinny być wcześniej skalibrowane pod kątem toksyczności, na przykład w porównaniu metod oczyszczania plazmidów używa się tylko zestawu Kaya Prep Spin Mini Prep Prep, podczas gdy w drugiej metodzie oczyszczania plazmid jest przygotowywany przy użyciu tego samego mini zestawu przygotowawczego, a następnie przetwarzany za pomocą kajaka. Zestaw do szybkiego oczyszczania PCR. Ten wykres pokazuje fluorescencję punktu końcowego po ośmiu godzinach, a także maksymalne tempo produkcji białka w oparciu o 12-minutowe słupki błędu średniej ruchomej to jedno odchylenie standardowe od czterech niezależnych przebiegów w różnych dniach.

Zaobserwowana różnica w ekspresji wynika z różnicy w zawartości soli. Jednak inne elementy mogą nie mieć wpływu na TXTL, takie jak bufor eluciański. Porównano różne stężenia chlorku TS w bezkomórkowej reakcji ekspresji opartej na ekspresji jednego anomolowca plazmidu.

Podane stężenia są końcowymi stężeniami trichlorku. W reakcji zastosowany bufor eluciański to 10 milimolowe słupki błędu chlorku trisu to jedno odchylenie standardowe od trzech niezależnych przebiegów w różnych dniach. Ten rysunek przedstawia typowe wykresy kalibracyjne dla surowego ekstraktu komórkowego, skalibrowane pod kątem dodatkowych poziomów glutaminianu magnezu, glutaminianu potasu i DTT.

Pokazano fluorescencję punktu końcowego po ośmiu godzinach, a także maksymalną szybkość produkcji białka w oparciu o 12-minutową średnią ruchomą. Należy pamiętać, że każdy surowy ekstrakt komórkowy musi być skalibrowany niezależnie dla tych trzech zmiennych. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki wskazują, że surowy ekstrakt komórkowy jest najbardziej wrażliwy na poziom glutaminianu magnezu, a następnie poziom glutaminianu potasu.

Na podstawie tych wykresów dopuszczalny zakres dodatkowego glutaminianu magnezu wynosi cztery milimolowe dawki glutaminianu potasu od 60 do 80 milimolowych, a DTT wynosi od zera do trzech milimolowych napowietrzania po dolnej stronie. Końcowa skuteczność każdego surowego ekstraktu komórkowego może się różnić w zależności od biegłości użytkownika i warunków środowiskowych. Chociaż typowa różnica w wydajności wynosi od pięciu do 10%, fluorescencja punktów końcowych dwóch surowych ekstraktów przygotowanych w różnych terminach jest pokazana tutaj.

Słupki błędów to jedno odchylenie standardowe z trzech niezależnych przebiegów w różnych dniach. Aby zademonstrować bezkomórkowy system ekspresji, skonstruowano pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego opartą na represji Tet i przetestowano ten sam obwód uruchomiony z TC i bez niego, który wykazał siedmiokrotną ekspresję końcową. Zmiana reportera D-E-G-F-P po ośmiu godzinach wyrażania Słupki błędów to jedno odchylenie standardowe z trzech niezależnych przebiegów w różnych dniach.

Obwód genetyczny jest pokazany we wstawce. Ten ostatni rysunek przedstawia analizę kosztów i ekspresji konkurencyjnych surowych ekstraktów komórkowych. Wykres kołowy w kształcie litery A przedstawia koszty robocizny i materiałów bezkomórkowego systemu ekspresji TX TL w oparciu o koszty odczynników z grudnia 2012 r. i koszty pracy w wysokości 14 za godzinę.

Panel B porównuje koszty bezkomórkowego systemu ekspresji TX z innymi systemami komercyjnymi. Koszty są podzielone na mikrolitr, chociaż objętości reakcji mogą się różnić w zależności od zestawu. Koszty materiałów dla tego systemu wynoszą około 3 centów za reakcję mikrolitrową, co stanowi 98% redukcję kosztów w porównaniu z porównywalnymi komercyjnymi systemami bezkomórkowymi.

Panel C przedstawia porównanie wydajności bezkomórkowego systemu ekspresji TX TL z innymi systemami komercyjnymi. System ten może wytwarzać do 0,75 miligrama na mililitr białka reporterowego przy użyciu promotora opartego na Sigma 70 z operatorami fagów Lambda lub promotora sterowanego T siedmioma. Porównania te wskazują, że bezkomórkowy system ekspresji TX TL może wytwarzać równoważne ilości białka, co systemy oparte na T siódemce, co znacznie obniża koszty w porównaniu z podobnymi systemami komercyjnymi.

Mamy nadzieję, że ta technika utoruje drogę do uproszczenia procesu inżynieryjnego w biologii syntetycznej.