Name: Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Poznaj protokół wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej. Ta metoda umożliwia szybkie testowanie obwodów genetycznych in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jongminowi Kimowi, Danowi Siegal-Gaskinsowi, Anu Thubagere i Enochowi Yeungowi za pomoc w usprawnieniu protokołu, a Clare Chen i Barclayowi Lee za pomoc we wczesnych etapach projektu. Niniejszy materiał opiera się na pracach wspieranych częściowo przez program Living Foundries Agencji Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obszarze Obronności (DARPA/MTO), numer umowy HR0011-12-C-0065 (DARPA/CMO.Z.Z.S. jest również wspierany przez stypendium UCLA/Caltech Medical Scientist Training Program oraz przez DoD, Biuro Badań Naukowych Sił Powietrznych, stypendium National Defense Science and Engineering Graduate (NDSEG), 32 CFR 168a. Poglądy i wnioski zawarte w tym dokumencie są poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące oficjalną politykę, wyraźną lub dorozumianą, Agencji Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obszarze Obronności (Defense Advanced Research Projects Agency) lub rządu Stanów Zjednoczonych.

<ol><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li>
<li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+DNA+to+protein%3A+No+living+cells+required%5BTitle%5D)+AND+%22Process+Biochem%22%5BJournal%5D)">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li>
<li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+projects+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology projects in vitro.</a> Genome Res. 17, 1-6 (1101).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8(2010).</li>
<li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox%3A+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9(2010).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Replication%2C+Synthesis%2C+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li>
<li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M. Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits. Pao, L., Abramovitch, D. American Control Conference, Jun 17-19, Washington, DC, , AACC. 1531-1536 (2013).</li>
<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104(2011).</li>
<li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li>
<li>Wood, W. B., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Enzymatically+Synthesized+Ribonucleic+Acid+on+Amino+Acid+Incorporation+by+a+Soluble+Protein-Ribosome+System+from+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Effect of Enzymatically Synthesized Ribonucleic Acid on Amino Acid Incorporation by a Soluble Protein-Ribosome System from Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 48, 94(1962).</li>
<li>Zubay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Vitro+Synthesis+of+Protein+in+Microbial+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems.</a> Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).</li>
<li>Pratt, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPratt%2C+JM+%22Transcription+and+Translation%3A+A+Practical+Approach%22">Transcription and Translation: A Practical Approach</a>. Hames, B. D., Higgins, S. J. , IRL Press. 179-209 (1984).</li>
<li>Kim, H. C., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+energizing+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bioscience+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Methods for energizing cell-free protein synthesis.</a> Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).</li>
<li>Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+stabilization+for+cell-free+protein+synthesis+by+modification+of+the+Escherichia+coli+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+engineering%22%5BJournal%5D)">Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome.</a> Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).</li>
<li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li>
<li>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. K., Weiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+new+engineering+rules+for+an+emerging+discipline%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: new engineering rules for an emerging discipline.</a> Molecular systems biology. 2, 2006.0028(2006).</li>
<li>Kwok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+hard+truths+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Five hard truths for synthetic biology.</a> Nature. 463, 288-290 (2010).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%2Fpromoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li>
<li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li>
<li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells%3A+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135(2006).</li>
<li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+structural+and%22%5BJournal%5D)">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li>
<li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular.+NMR%22%5BJournal%5D)">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li>
<li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li>
<li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li>
<li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits%3A+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li>
<li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coping+with+complexity%3A+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li>
<li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology%3A+thinking+outside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+engineering%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li>
<li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li>
<li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+production+of+amorpha-4%2C11-diene%2C+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin%2C+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489(2009).</li>
<li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li>
<li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+designing+and+building+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany tutaj endogenny bezkomórkowy system ekspresji TX-TL oparty na Escherichia coli jest łatwą do przeprowadzenia reakcją trójprobówkową, która może zająć mniej niż osiem godzin od konfiguracji do zebrania danych. Proces tworzenia wszystkich odczynników wymaga łącznie pięciu dni (przy znacznym nakładzie pracy tylko w jednym dniu), ale daje surowy ekstrakt na 3 000 reakcji i odczynniki buforowe na 10 000 reakcji (rysunek 1). Ponadto odczynniki do sporządzania ekstraktu surowego i buforu są stabilne przez co najmniej 1 rok w temperaturze -80 °C, co pozwala na wielokrotne stosowanie jednego preparatu. 4 Przy 0,11 USD za 10 μl reakcji (0,26 USD z robocizną) koszty są o 98% niższe niż w przypadku porównywalnych systemów komercyjnych (ilustracja 2). 
Istnieją jednak pewne nierozwiązane ograniczenia systemu. Wydajność końcowa każdego preparatu z ekstraktu z komórek surowych może się różnić w zależności od biegłości użytkownika i warunków środowiskowych, chociaż typowa różnica w wydajności wynosi od 5 do 10% (rysunek 4b). W związku z tym należy spodziewać się zmienności między partiami zarówno w wyrażeniu punktu końcowego, jak i w dynamice wyrażenia. Różnice te prawdopodobnie utrzymają się, dopóki ekstrakt nie zostanie w pełni scharakteryzowany lub dopóki tworzenie ekstraktu nie zostanie w pełni zautomatyzowane. Jeśli bezkomórkowy system ekspresji jest używany do przeprowadzania czułych eksperymentów ilościowych, zaleca się przeprowadzenie wszystkich eksperymentów z tą samą partią surowego ekstraktu komórkowego. Wydajność z pojedynczej partii surowego ekstraktu komórkowego, około 3000 reakcji, powinna być wystarczająca dla typowych kursów eksperymentalnych. Chociaż podejrzewamy, że zmienność można usunąć poprzez zwiększenie skali i automatyzację procedury, takie próby wymagałyby znacznych inwestycji w zasoby. 
Ponadto, chociaż poziomy ekspresji w punkcie końcowym są dość łatwe do określenia, należy wykonać więcej pracy w celu zrozumienia dynamiki nieodłącznie związanej z systemem bezkomórkowym. Wiadomo, że zarówno konkurencja o zasoby, jak i ograniczenie zasobów mogą wpływać na dynamikę wyrażeń. Na przykład ograniczona endogenna sigma 70 może powodować reżim nasycenia zwiększoną matrycą DNA, wytwarzając profil ekspresji analogiczny do profilu nukleotydu lub niedoboru aminokwasów. 9,27 Jednak dynamika nie musi być w pełni zrozumiała, aby można było korzystać z systemu. W celu czystego wzrostu plonów optymalizację można przeprowadzić za pomocą podejść opartych na uczeniu maszynowym. 28 Kwestie konkurencji i ograniczeń zasobów można rozwiązać za pomocą modeli matematycznych zweryfikowanych na podstawie danych eksperymentalnych.
Przedstawiony tutaj protokół jest zoptymalizowany dla szczepu BL21-Rosetta2, ale można go uogólnić na inne szczepy E. coli . Modyfikacje w BL21-Rosetta2, takie jak usunięcie genu kodującego proteazę lon i dodanie genów kodujących rzadkie tRNA, pozwalają na maksymalną produkcję białka. Próbowaliśmy zastosować protokół z dwoma innymi szczepami ekstraktu - tylko BL21 i nokautem BL21 trxA - i znaleźliśmy o 50% mniejszą wydajność białka. Przypuszczamy, że plony podobnie spadają w przypadku stosowania innych szczepów. Inne zmiany parametrów, takie jak zamiana pożywki 2xYT na LB i inne bogate buliony, spowodowały zmniejszenie wydajności białka. 
Bezkomórkowe systemy ekspresji, wykorzystujące zarówno endogenne, jak i egzogenne mechanizmy transkrypcyjno-translacyjne i mechanizmy regulacji, mają szerokie zastosowanie zarówno w ekspresji białek i metabolitów, jak i w biologii syntetycznej. Zamiast ograniczać się do obwodów regulowanych przez T7, można sobie wyobrazić wytwarzanie złożonych biomolekuł w warunkach kontrolowanych przez użytkownika przy użyciu mieszanki natywnych promotorów E. coli i egzogennych mechanizmów transkrypcji i regulacji. Bez ograniczeń podziału komórek i metabolizmu, zmienność w obwodach syntetycznych, takich jak represylator, lub w szlakach metabolicznych, takich jak te wytwarzające artemizyninę, może być zmniejszona lub lepiej poznana. 30,31 Wykorzystaliśmy te zalety do wdrożenia przełączników genetycznych, a także do zrozumienia sekwestracji czynnika sigma. 9,32 Taka technologia może również stanowić szkielet "minimalnych" lub "sztucznych" komórek - małych, dobrze scharakteryzowanych i samowystarczalnych ucieleśnionych jednostek ekstraktu. 33,34 pkt. 
Docelowo przewidujemy natychmiastowe zastosowanie tego endogennego, bezkomórkowego systemu ekspresji jako środowiska prototypowego dla biologii syntetycznej. Nazywany "biomolekularną płytką prototypową TX-TL", bezkomórkowy system ekspresji zapewnia kontrolowane środowisko, w którym syntetyczne obwody ostatecznie przeznaczone do ekspresji in vivo mogą przejść rundy prototypowania - cykle testowania na podstawowym plazmidzie, liniowym lub chemicznie syntetyzowanym DNA, po których następuje analiza i szybka modyfikacja. Rundy prototypowania mogą być wspomagane przez predykcyjne modele matematyczne, które są obecnie opracowywane. Usuwając klonowanie i manipulację in vivo dla obwodów niekońcowych, przewidujemy, że czas cyklu inżynieryjnego zostanie skrócony do 1-3 dni zamiast standardu z obecnych tygodni.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Technologia ekspresji bezkomórkowej rozpoczęła się w latach 50. jako czysto translacyjna, rozwijając się lata później, aby objąć sprzężone mechanizmy transkrypcji-translacji za pomocą DNA bakteriofaga T7. 11,12 Od tego czasu podjęto liczne wysiłki w celu optymalizacji tworzenia surowego ekstraktu komórkowego (lub ekstraktu z E. coli S30). 13,14 Optymalizacje te obejmują wydłużenie bezkomórkowej syntezy białek poprzez regenerację ATP lub modyfikacje szczepów oraz skrócenie czasu i kosztów protokołu. 15-17 Istnieją alternatywne, bezkomórkowe systemy ekspresji, które wykorzystują do ekspresji odtworzone składniki zamiast surowego ekstraktu komórkowego. 5 Zarówno metody ekstrakcji z komórek surowych, jak i rekonstytucji zostały opracowane do użytku komercyjnego.
Wraz z pojawieniem się biologii syntetycznej, wzrasta zapotrzebowanie na dobrze scharakteryzowaną platformę do testowania i wyrażania zaprojektowanych modułów i obwodów biologicznych. 18,19 Platforma ta musi być wszechstronna, dobrze scharakteryzowana, łatwa w obsłudze i skoncentrowana na komponentach dostarczanych przez użytkownika. Pomimo tego, że zostały opracowane pół wieku wcześniej, systemy bezkomórkowe oparte na E. coli z natury mają te same wymagania, ponieważ są uproszczoną reprezentacją procesów komórkowych in vitro bez złożoności wzrostu i metabolizmu. Ponadto cała podstawowa wiedza z badań in vivo nad E. coli ma zastosowanie do systemów bezkomórkowych E. coli.
Chociaż bezkomórkowe systemy ekspresji mogą mieć zastosowanie w biologii syntetycznej, do tej pory celem większości bezkomórkowych systemów ekspresji była maksymalizacja wydajności białek i metabolitów. Osiąga się to za pomocą transkrypcji bakteriofagów T7 sekwencji sterowanych przez promotory T7. 20 Chociaż systemy te są skuteczne i solidne, służą one ściśle wyspecjalizowanym celom. Metody regulacji komórek są ograniczone, docelowe matryce DNA muszą zostać przeprojektowane tak, aby zawierały promotory T7, a niektóre sekwencje, takie jak kompleksy rybosomalne, nie mogą być transkrybowane i składane. 21,22 Istniejące bezkomórkowe systemy ekspresji nie są w stanie utrzymać wysokiej wydajności przy jednoczesnym zachowaniu endogennych mechanizmów regulacyjnych, co jest uniwersalnością niezbędną w biologii syntetycznej.
 Opracowaliśmy endogenny system ekspresji E. coli, który zachowuje skuteczność ekspresji białek wykazywaną przez poprzednie systemy, ale dodaje dodatkową wszechstronność, umożliwiając ekspresję i regulację opartą zarówno na endogennych, jak i egzogennych (T7 lub inne) mechanizmach. Opisany tutaj protokół jest pierwotnie oparty na Kigawa et al. (2004) i Liu et al. (2005), ale ma znaczące modyfikacje. Wykorzystuje glutaminian Mg i K zamiast octanu Mg i K w celu zwiększenia wydajności, usuwa 2-merkaptoetanol i lizuje komórki za pomocą ubijaka do kulek. 17,23,24 Bicie koralików jest wybierane zamiast homogenizacji, metod opartych na ciśnieniu lub sonikacji ze względu na niższy koszt i porównywalną wydajność z konkurencyjnymi systemami. 23 Kwas 3-fosfoglicerynowy (3-PGA) jest używany jako źródło energii, ponieważ stwierdzono, że daje wyższą wydajność białka w porównaniu z fosforanem kreatyny i fosfoenolopirogronianem. 4,25 Nasz system może wyprodukować do 0,75 mg/ml białka reporterowego przy użyciu promotora opartego na sigma70 z operatorami lambda-fagowymi lub promotora sterowanego T7, podobnie jak w przypadku innych systemów komercyjnych. 4,6 Do wyprodukowania wszystkich niezbędnych odczynników potrzeba pięciu dni (rysunek 1). Co więcej, zapewnia 98% redukcję kosztów w porównaniu z porównywalnymi komercyjnymi systemami bezkomórkowymi - koszty materiałów wynoszą 0,11 USD za 10 μl reakcji, które wzrastają do 0,26 USD z uwzględnieniem robocizny (ilustracja 2).

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedyczne</td><td>3012-032</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>BD Diagnostyka</td><td>214010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubki do ubijania koralików (mikrofiolki polipropylenowe)</td><td>BioSpec</td><td>522S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Koraliki, średnica 0,1 mm.</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli szczep</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Bradford BSA</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Złącze CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kuwety, 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cyfrowa Umowa</td><td>Telekomunikacyjna Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwas folinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>K-glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mg-glutaminian</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kolumny do chromatografii mikro biospinowej</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Denne płyty optyczne Nunc 384-well</td><td>Thermo-Scientific</td><td>142761</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca Nunc</td><td>Thermo-Scientific</td><td>232701</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosforan potasu roztwór jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Próbnik aminokwasów RTS</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (zestaw)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Spermidyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Podstawa Tris</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>tRNA (z E. coli)</td><td>Roche Applied Science</td><td>MRE600</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Skrętka UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Butelka wirówki 1L</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A98813</td><td>Jest to specyficzne dla serii Avanti J; Uzyskaj równoważny rozmiar dla wirówki w użyciu.</td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera</td><td>4L Kimble Chase</td><td>26500-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówka Avanti J-26XP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>393127</td><td>odpowiednik wirówki o pojemności 1L.</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna Forma 480</td><td>Thermo Scientific</td><td>480</td><td>Lub odpowiednik shakera 6x4L wielkości klatki piersiowej.</td></tr><tr><td>JLA-8.1000 Rotor</td><td>Beckman-Coulter</td><td>363688</td><td>Lub 1L, odpowiednik wirnika 5000 x g do wirówki.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>BioSpec</td><td>3110BX</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Materiał uzupełniający 1. Przepisy na Items. 
Chloramfenikol, 34 mg/ml: Przygotować 0,51 g chloramfenikolu i dodać etanol do 15 ml. Sterylizacja filtra (0,22 &mu; M), podwielokrotność do 1 ml probówek, przechowywać w temperaturze -20 °; C do późniejszego wykorzystania. 
2xYT+P+Cm płytka agarowa: Przygotuj 1,24 g 2xYT, 1,6 ml dwuzasadowego roztworu fosforanu potasu @ 1 M, 0,88 ml jednozasadowego roztworu fosforanu potasu @ 1 M, 0,6 g agaru i wodę do 40 ml. Autoklaw. Ostudzić do 50 stopni; C i dodać 40 &mu; l Cm. Podwielokrotność 25 ml na szalkę Petriego o wymiarach 100x15 mm i pozostawić do ostygnięcia na godzinę. 
2xYT+P podłoża: Przygotować 124 g 2xYT, 160 ml dwuzasadowego roztworu fosforanu potasu @1 M, 88 ml jednozasadowego roztworu fosforanu potasu @ 1 M i wodę do 4 l. Podwielokrotność rozdzielić na 2x1,88 l i 0,24 l. Autoklaw. 
Baza Tris, 2 M: Przygotuj 60,57 g bazy Tris i wodę do 250 ml. Wysterylizować, przechowywać w temperaturze RT do późniejszego wykorzystania. 
DTT, 1 M: Przygotuj 2,31 g naziemnej telewizji cyfrowej i wodę do 15 ml. Sterylizacja filtra (0,22 &mu; M), podwielokrotność do 1 ml probówek, przechowywać w temperaturze -20 °; C do późniejszego wykorzystania. 
Bufor S30A: Przygotować 10,88 g Mg-glutaminianu i 24,39 g K-glutaminianu, 50 ml Tris w 2M, kwasu octowego (do pH 7,7) i wody do 2 l. Autoklaw, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, przed użyciem dodać 4 ml 1 M DTT. 
Bufor S30B: Przygotować 10,88 g Mg-glutaminianu i 24,39 g K-glutaminianu, Tris w 2 M (do pH 8,2) i wodę do 2 l. Autoklaw, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, dodać 2 ml 1 M DTT przed użyciem. 
HEPES: Przygotować 1,91 g HEPESU (MW 238,21), KOH (do pH 8) i wody do 4 ml. 
tRNA: Przygotuj 30 mg tRNA i wodę do 600 &mu;l. 
CoA: Przygotować 30 mg CoA (MW 767.53) i wodę do 600 &mu;l. 
NAD: Dodaj 34,83 mg NAD (MW 663,43), Tris w 2 M (do pH 7,5-8) i wodę do 300 &mu;l. (Dodaj 27 &mu; l Tris w 2 M, aby doprowadzić roztwór do pH 7,5-8). 
cAMP: Dodać 42,80 mg cAMP (MW 329,22), Tris w 2 M (do pH 8) i wodę do 200 &mu;l. (Dodać 73 &mu; l Tris w 2 M, aby doprowadzić roztwór do pH 8). 
Kwas folinowy (33,9 mM): Do 20 mg stałej soli wapniowej kwasu folinowego (MW 511,5) dodać 1,15 ml wody. 
Spermidyna: Przygotuj 23,55 &mu; l spermidyny (MW 145,25) i wody do 150 &mu;l. Przygotować w temperaturze pokojowej po krótkim stopieniu w temperaturze 37 °C. 
3-PGA: Dodać 1,03 g 3-PGA (MW 230,02), Tris w 2 M (do pH 7,5) i wody do 3,2 ml. (Dodać 1,73 ml Tris w 2 M, aby doprowadzić roztwór do pH 7,5). 
Mieszanka nukleotydów: Dodać 145 mg dwuwodnej soli dipotasowej ATP (MW 619,4), 133 mg soli disodowej GTP (MW 567,14), 79,4 mg dwuwodnej soli disodowej CTP (MW 563,16), 82,6 mg dwuwodnej soli trisodowej UTP (MW 586,12), KOH w 15% rozcieńczeniu (do pH 7,5) i wodę do 1,5 ml. (Dodać 353 &mu; l KOH w 15% rozcieńczeniu, aby doprowadzić roztwór do pH 7,5). 
Materiał uzupełniający 2. Test Bradforda.
<ol>
	<li>Usuń agenta Bradforda z 4 &deg; C i ustawić w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotuj 50 &mu; l Wzorzec BSA przy stężeniu 1 mg/ml i 0,1 mg/ml.</li>
	<li>Przygotuj 40 &mu; l 20-krotne rozcieńczenie ekstraktu z etapu 1.47.</li>
	<li>Dodać 800 &mu; l woda do 7 kuwet. </li>
	<li>Przygotować kuwety wzorcowe na 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu; l 0,1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu; l 0,1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu; l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu; l 1 mg/ml BSA).</li>
	<li>Przygotuj eksperymentalne kuwety dla 2 i mu; l próbki i 4 &mu; l próbki.</li>
	<li>Dodaj 200 &mu; Do każdej kuwety i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut</li>
	<li>Wytwórz standardową krzywą przy średnicy zewnętrznej 595 nm za pomocą kuwet z kroku 6.5. Odrzucić krzywą standardową, jeśli r2 < 0,95,</li>
	<li> Określić stężenie ekstraktu przy OD 595nm za pomocą kuwet z tep 6.6.</li>
</ol>
<mocny>Materiał uzupełniający 3. Arkusz kalkulacyjny kalibracji bufora. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank"> Zobacz TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>. 
Materiał uzupełniający 4. Arkusz kalkulacyjny z wyrażeniem bez komórek. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Patrz TXTL _JoVE.xlsx</a>.</td></tr></tbody></table>

protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji tx-tl opartego na escherichia coli w biologii syntetycznej

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Idealne systemy ekspresji bezkomórkowej mogą teoretycznie emulować środowisko komórkowe in vivo na kontrolowanej platformie in vitro. 1 Jest to przydatne do kontrolowanej ekspresji białek i obwodów genetycznych, a także do zapewnienia środowiska prototypowania biologii syntetycznej. 2,3 Aby osiągnąć ten ostatni cel, bezkomórkowe systemy ekspresji, które zachowują endogenne mechanizmy transkrypcji-translacji Escherichia coli, są w stanie dokładniej odzwierciedlić dynamikę komórkową in vivo niż te oparte na transkrypcji polimerazy T7 RNA. Opisujemy przygotowanie i wykonanie wydajnego endogennego systemu ekspresji bezkomórkowego opartego na transkrypcji i translacji (TX-TL) opartym na E. coli, który może wytwarzać równoważne ilości białka jak systemy oparte na T7 przy 98% redukcji kosztów w porównaniu z podobnymi systemami komercyjnymi. 4,5 Opisano przygotowanie i surowego ekstraktu komórkowego, jak również przeprowadzenie trzyprobówkowej reakcji TX-TL. Przygotowanie całego protokołu trwa pięć dni i daje wystarczającą ilość materiału do przeprowadzenia do 3000 pojedynczych reakcji w jednym preparacie. Po przygotowaniu każda reakcja trwa mniej niż 8 godzin od konfiguracji do zebrania i analizy danych. Mechanizmy regulacji i transkrypcji egzogenne dla E. coli, takie jak represory lak/tet i polimeraza RNA T7, mogą być uzupełniane. 6 Właściwości endogenne, takie jak tempo degradacji mRNA i DNA, można również dostosować. 7 Wykazano, że bezkomórkowy system ekspresji TX-TL umożliwia składanie obwodów na dużą skalę, badanie zjawisk biologicznych i ekspresję białek zarówno pod promotorami T7, jak i endogennymi. 6,8 Dostępne są towarzyszące modele matematyczne. 9,10 Powstały w ten sposób system ma unikalne zastosowania w biologii syntetycznej jako środowisko prototypowe lub "biomolekularna płytka prototypowa TX-TL".

Przedstawiliśmy pięciodniowy protokół przygotowania endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. Przykładowy harmonogram tworzenia odczynników - surowego ekstraktu komórkowego i buforu - można znaleźć na rysunku 1. Po utworzeniu można je przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do jednego roku. Po utworzeniu odczynników konfiguracja i wykonanie eksperymentu mogą zostać wykonane w czasie krótszym niż 8 godzin.
Dodatkowo, zoptymalizowaliśmy warunki ekspresji systemu ekspresji TX-TL bez komórek. Inne dodatki dostarczone przez użytkownika, takie jak lub roztwory DNA, powinny być wcześniej skalibrowane pod kątem toksyczności. Na przykład różne metody przetwarzania plazmidów powodują różną ekspresję ze względu na zawartość soli. Przetestowaliśmy również wpływ buforu elucyjnego Tris-Cl na wydajność reakcji (ryc. 5).
Przykład kalibracji surowego ekstraktu komórkowego, odnoszący się do kroku 4.1 do 4.9, jest pokazany na rysunku 4a. Ogólnie rzecz biorąc, nasze eksperymenty pokazują, że surowy ekstrakt komórkowy jest najbardziej wrażliwy na poziom Mg-glutaminianu, a następnie na poziom K-glutaminianu. Aby zademonstrować bezkomórkowy system ekspresji, skonstruowaliśmy i przetestowaliśmy pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego opartą na represji tet. 26 (Rysunek 6). W bezkomórkowym systemie ekspresji ten sam obwód przebiegający z aTc i bez niego wykazuje 7-krotną zmianę ekspresji w punkcie końcowym reportera deGFP po ośmiu godzinach ekspresji. Chociaż ten eksperyment nie wymaga globalnych induktorów ani represorów, w razie potrzeby można je dodać w sekcji "Przygotowanie mieszanki głównej".
<img alt="Rysunek 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg"> 
Rysunek 1. Oś czasu dla surowego ekstraktu komórkowego, roztworu aminokwasów i przygotowania roztworu energetycznego. Pięciodniowy harmonogram typowego wykonania protokołu podano powyżej, zoptymalizowany pod kątem inkubacji w nocy i etapów pracy w ciągu dnia.
<img alt="Rysunek 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg"> 
Rysunek 2. Analiza kosztów i ekspresji konkurencyjnych surowych ekstraktów komórkowych. a) Zestawienie kosztów robocizny i materiałów bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL. Na podstawie kosztów odczynników z grudnia 2012 r. i kosztów pracy w wysokości 14 USD za godzinę. b) Porównanie kosztów bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL z innymi systemami komercyjnymi. Koszty są podzielone na μl, chociaż objętości reakcji mogą się różnić w zależności od zestawu. c) Porównanie wydajności bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL z innymi systemami komercyjnymi. Wydajność ekspresji białka określona przez normy producenta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać</a>.
<img alt="Rysunek 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg"> 
Rysunek 3. Załadunek i obróbka rurki do ubijania koralików. a) Wykazanie prawidłowej lepkości roztworu kulki komórkowej. Roztwór kulki komórkowej będzie miał lepkość zależną od wielu czynników, w tym ilości dodanego bufora S30A, ilości dodanych kulek i czasu spędzonego na lodzie. b) Załadunek rurki do ubijania koralików przed szybkim odwirowaniem na stole. Wirowanie usuwa pęcherzyki nagromadzone podczas załadunku. c) Pęcherzyki wynurzające się po odwirowaniu na stole. Wielkość bąbelków będzie się różnić; Można je przebić lub usunąć za pomocą końcówki do pipety. d) Całkowicie wypełniona rurka do ubijania koralików przed zamknięciem. W rurce do ubijania koralików tworzy się menisk, a nasadka ma wystarczająco dużo, aby zakryć i spowodować przepełnienie niewielkich ilości. e) Prawidłowo załadowana aparatura filtrująca. Można je ponownie wykorzystać. f) Porównanie prawidłowo i nieprawidłowo przetworzonej rurki do bicia koralików. Rurka po lewej stronie to dobrze bita rurka - ma małą i dobrze zarysowaną górną warstwę oraz bardzo wyraźny supernatant. Rurka po prawej stronie jest nieoptymalna, oparta na większej, zamglonej drugiej warstwie i zamglonym supernatantze. Rury, które są nieoptymalne, nie powinny być poddawane dodatkowej obróbce.
<img alt="Rysunek 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg"> 
Rysunek 4. Właściwości surowych preparatów ekstraktowych. a) Typowe wykresy kalibracyjne dla surowego ekstraktu komórkowego. Surowy ekstrakt jest kalibrowany pod kątem dodatkowych poziomów Mg-glutaminianu, K-glutaminianu i DTT, w tej kolejności. Pokazano fluorescencję punktu końcowego po 8 godzinach, a także maksymalne tempo produkcji białka w oparciu o 12-minutową średnią kroczącą. Na podstawie tych wykresów dopuszczalny zakres dodatkowego Mg-glutaminianu wynosi 4 mM, K-glutaminianu wynosi 60-80 mM, a DTT wynosi 0-3 mM. Należy pamiętać, że każdy surowy ekstrakt musi być kalibrowany niezależnie dla tych trzech zmiennych. b) Odchylenie od preparatów ekstraktowych. Pokazano fluorescencję końcową dwóch surowych ekstraktów przygotowanych w różnych terminach; Słupki błędów to 1 odchylenie standardowe od trzech niezależnych przebiegów w różnych dniach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać</a>.
<img alt="Rysunek 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg"> 
Rysunek 5. Wpływ roztworu DNA na wydajność ekspresji. a) Porównanie dwóch różnych metod oczyszczania plazmidów. 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 przygotowuje się wyłącznie przy użyciu zestawu QiaPrep Spin Miniprep Kit (metoda oczyszczania 1) lub poddaje się obróbce końcowej za pomocą zestawu do oczyszczania QiaQuick PCR (metoda oczyszczania 2). Pokazano fluorescencję punktu końcowego po 8 godzinach, a także maksymalne tempo produkcji białka w oparciu o 12-minutową średnią kroczącą. Słupki błędów to 1 odchylenie standardowe od czterech niezależnych przebiegów w różnych dniach. b) Wpływ buforu elucyjnego (Tris-Cl). Różne stężenia Tris-Cl porównuje się w bezkomórkowej reakcji ekspresji opartej na ekspresji 1 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Podane stężenia są końcowymi stężeniami Tris-Cl w reakcji; zastosowany bufor elucyjny to 10 mM Tris-Cl. Słupki błędów to 1 odchylenie standardowe od trzech niezależnych przebiegów w różnych dniach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać</a>.
<img alt="Rysunek 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg"> 
Rysunek 6. Przykładowy przebieg TX-TL pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego. a) Przykładowy układ reakcji wykonawczej bez komórki. Testuje stan "włączony" i "wyłączony" pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego, z kontrolą dodatnią i ujemną. b) Mapa plazmidowa pętli ujemnego sprzężenia zwrotnego. c) Reprezentatywne wyniki. Dane odzwierciedlają eksperyment w a) i b), z kontrolą ujemną odjętą od sygnału. Obwód genetyczny pokazany we wstawce. Słupki błędów to 1 odchylenie standardowe od trzech niezależnych przebiegów w różnych dniach. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą postać</a>.
<obramowanie tabeli="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>nazwa</td>
 <td>koncentracja</td>
 <td>kwota</td>
 <td>sterylizacja</td>
 <td>Notatki</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramfenikol (cm)</td>
 <td>34 mg/ml w etanolu</td>
 <td>Pojemność 1 ml</td>
 <td>Sterylizacja filtra (0,22 μM)</td>
 <td>Może być wytwarzany w większych ilościach przechowywany w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Płytka agarowa 2xYT+P+Cm</td>
 <td>31 g/L 2xYT, 40 mM fosforan potasu dwuzasadowy, 22 mM fosforan potasu jednozasadowy, 34 μg/ml chloramfenikolu</td>
 <td>1 talerz</td>
 <td>autoklaw</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nośniki 2xYT+P</td>
 <td>31 g/L 2xYT, 40 mM fosforan potasu dwuzasadowy, 22 mM fosforan potasu jednozasadowy </td>
 <td>4 L</td>
 <td>autoklaw</td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>

Tabela 1. Odczynniki do dnia 1 protokołu Crude Cell Extract.
<obramowanie tabeli="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>nazwa</td>
 <td>koncentracja</td>
 <td>kwota</td>
 <td>sterylizacja</td>
 <td>Notatki</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Baza Tris</td>
 <td>2 mln</td>
 <td>Pojemność 250 ml</td>
 <td>Filtracja, sterylizacja (0,22 μM) lub autoklaw</td>
 <td>Może być przechowywany w temperaturze pokojowej.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Naziemna telewizja</td> cyfrowa
 <td>1 mln</td>
 <td>Pojemność 6 ml</td>
 <td>Sterylizacja filtra (0,22 μM)</td>
 <td>Może być wytwarzany w większych ilościach i przechowywany w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor S30A</td>
 <td>14 mM Mg-glutaminian, 60 mM K-glutaminian, 50 mM Tris, pH 7,7</td>
 <td>2 L</td>
 <td>autoklaw</td>
 <td>Aby osiągnąć pH 7,7, miareczkować kwasem octowym. Dodaj DTT do 2 mM końcowego stężenia tuż przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bufor S30B</td>
 <td>14 mM Mg-glutaminian, 60 mM K-glutaminian, ~5 mM Tris, pH 8,2</td>
 <td>2 L</td>
 <td>autoklaw</td>
 <td>Aby osiągnąć pH 8,2, miareczkować za pomocą 2M Tris. Dodaj DTT do 1 mM końcowego stężenia tuż przed użyciem. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</td>
 </tr>
</tbody>

Tabela 2. Odczynniki do dnia 2 protokołu Crude Cell Extract.
<obramowanie tabeli="1">
<tbody>
 <tr>
 <td></td>
 <td colspan="4">Sokół</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td>1</td>
 <td>cyfra arabska</td>
 <td>3</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pusty 50 ml Sokół (g)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml Sokół z granulką (g)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Masa osadowa (50 ml Falcon z osadem - pusta 50 ml Falcon) (g)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Objętość buforu S30A do dodania (masa osadu* 0,9) (ml)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Całkowita masa kulek do dodania (masa granulki * 5,0) (g)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
</tbody>

Tabela 3. Kalkulator masy buforu i kulki S30A dla 3 dnia protokołu Crude Cell Extract.
<obramowanie tabeli="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>nazwa</td>
 <td>koncentracja</td>
 <td>kwota</td>
 <td>sterylizacja</td>
 <td>Notatki</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPESY</td>
 <td>2 M, pH 8</td>
 <td>Pojemność 4 ml</td>
 <td>żaden</td>
 <td>Aby osiągnąć pH 8, miareczkować za pomocą KOH.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mieszanka nukleotydów</td>
 <td>156 mM ATP i GTP, 94 mM CTP i UTP, pH 7,5</td>
 <td>Pojemność 1,5 ml</td>
 <td>żaden</td>
 <td>Aby osiągnąć pH 7,5, miareczkować za pomocą KOH. </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 <td>600 μl</td>
 <td>żaden</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Certyfikat Autentyczności</td>
 <td>65 mM</td>
 <td>600 μl</td>
 <td>żaden</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>175 mM, pH 7,5-8</td>
 <td>300 μl</td>
 <td>żaden</td>
 <td>Aby osiągnąć pH 7,5-8, miareczkować za pomocą Tris w odległości 2 M.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>obóz</td>
 <td>650 mM, pH 8</td>
 <td>200 μl</td>
 <td>żaden</td>
 <td>Aby osiągnąć pH 8, miareczkować za pomocą Tris w odległości 2 M.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kwas folinowy</td>
 <td>33,9 mM</td>
 <td>300 μl</td>
 <td>żaden</td>
 <td>Chociaż potrzebne jest tylko 300 μl, przepis w uzupełnieniu jest na 1,15 ml.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>spermidyna</td>
 <td>1 mln</td>
 <td>150 μl</td>
 <td>żaden</td>
 <td>Przechowywać w temperaturze 4 °C, podgrzać do 37 °C do stopienia.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA (pol.</td>
 <td>1,4 m, pH 7,5</td>
 <td>3,2 ml</td>
 <td>żaden</td>
 <td>Aby osiągnąć pH 7,5, miareczkować za pomocą Tris w odległości 2 M.</td>
 </tr>
</tbody>

Tabela 4. Odczynniki do przygotowania do protokołu Rozwiązania Energetycznego.
 Materiały uzupełniające 1. Przepisy na przedmioty. 
Chloramfenikol, 34 mg/ml: Przygotuj 0,51 g chloramfenikolu i dodaj etanol do 15 ml. Filtruj sterylizuj (0,22 μM), podwielokrotność do 1 ml probówek, przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
 2xYT+P+Cm płytka agarowa: Przygotuj 1,24 g 2xYT, 1,6 ml dwuzasadowego roztworu fosforanu potasu @ 1 M, 0,88 ml jednozasadowego roztworu fosforanu potasu @ 1 M, 0,6 g agaru i wodę do 40 ml. Autoklaw. Ostudzić do temperatury 50 °C i dodać 40 μl cm. Porcję porcji 25 ml do szalki Petriego o wymiarach 100 x 15 mm i pozostawić do ostygnięcia na godzinę.
 2xYT+P podłoża: Przygotuj 124 g 2xYT, 160 ml dwuzasadowego roztworu fosforanu potasu @1 M, 88 ml jednozasadowego roztworu fosforanu potasu @ 1 M, i wodę do 4 L. Podziel na 2 x 1,88 l i 0,24 l Autoklawu.
 Tris base, 2 M: Przygotuj 60.57 g Tris base i wodę do 250 ml. Sterylizuj, przechowuj w RT do późniejszego wykorzystania.
 DTT, 1 M: Przygotuj 2,31 g DTT i wodę do 15 ml. Sterylizuj filtrem (0,22 μM), podwielokrotność do 1 ml probówek, przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
 Bufor S30A: Przygotuj 10,88 g Mg-glutaminianu i 24,39 g K-glutaminianu, 50 ml Tris w 2M, kwas octowy (do pH 7,7) i wodę do 2 L. Autoklaw, przechowywać w temperaturze 4 °C, dodać 4 ml 1 M DTT przed użyciem.
 Bufor S30B: Przygotuj 10,88 g Mg-glutaminianu i 24,39 g K-glutaminianu, Tris w 2 M (do pH 8,2) i wodę do 2 L. Autoklaw, przechowywać w temperaturze 4 °C, dodać 2 ml 1 M DTT przed użyciem.
 HEPES: Przygotuj 1,91 g HEPES (MW 238,21), KOH (do pH 8) i wodę do 4 ml.
 tRNA: Przygotuj 30 mg tRNA i wodę do 600 μl.
 CoA: Przygotuj 30 mg CoA (MW 767.53) i wodę do 600 μl.
 NAD: Dodaj 34.83 mg NAD (MW 663.43), Tris na 2 M (do pH 7.5-8) i wodę do 300 μl. (Dodaj 27 μl Tris na 2 M, aby doprowadzić roztwór do pH 7.5-8).
 cAMP: Dodaj 42,80 mg cAMP (MW 329,22), Tris w 2 M (do pH 8) i wodę do 200 μl. (Dodaj 73 μl Tris w 2 M, aby doprowadzić roztwór do pH 8).
 Kwas folinowy (33,9 mM): Do 20 mg stałej soli wapniowej kwasu folinowego (MW 511,5), dodaj 1,15 ml wody.
 Spermidyna: Przygotuj 23,55 μl spermidyny (MW 145,25) i wodę do 150 μl. Przygotuj w temperaturze pokojowej po krótkim stopieniu w temperaturze 37 °C. 
 3-PGA: Dodać 1,03 g 3-PGA (MW 230.02), Tris w 2 M (do pH 7,5) i wodę do 3,2 ml. (Dodać 1,73 ml Tris w 2 M, aby doprowadzić roztwór do pH 7,5).
Mieszanka nukleotydów: Dodaj 145 mg dwuwodnej soli dipotasowej ATP (MW 619.4), 133 mg soli disodowej GTP (MW 567.14), 79.4 mg soli disodowej CTP dwuwodnej (MW 563.16), 82.6 mg dwuwodnej soli trisodowej UTP (MW 586.12), KOH w 15% rozcieńczeniu (do pH 7.5) i wodę do 1.5 ml. (Dodaj 353 μl KOH w 15% rozcieńczeniu, aby doprowadzić roztwór do pH 7.5).
Materiały uzupełniające 2. Test Bradforda.
<ol>
<li>Usunąć środek Bradford z 4 °C i ustawić w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przygotować 50 μl wzorca BSA w stężeniach 1 mg/ml i 0,1 mg/ml.</li>
<li>Przygotować 40 μl 20x rozcieńczenia ekstraktu z kroku 1.47.</li>
<li>Dodaj 800 μl wody do 7 kuwet. </li>
<li>Przygotować kuwety wzorcowe na 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 μl 0,1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 μl 0,1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 μl 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 μl 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Przygotować kuwety doświadczalne na 2 μl próbki i 4 μl próbki.</li>
<li>Dodać 200 μl środka Bradford do każdej kuwety i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 10 minut.</li>
<li>Uzyskać krzywą wzorcową przy średnicy zewnętrznej 595 nm za pomocą kuwet z kroku 6.5. Odrzucić krzywą wzorcową, jeżeli r2 &lt; 0,95.</li>
<li> Oznaczyć stężenie ekstraktu przy OD 595 nm za pomocą kuwet z kroku 6.6.</li>
</ol>
Materiał uzupełniający 3. Arkusz kalkulacyjny kalibracji bufora.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank"> Zobacz TXTL_e(szablon)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
Materiały uzupełniające 4. Arkusz kalkulacyjny uruchamiania wyrażeń bez komórek.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Zobacz _JoVE.xlsx TXTL</a>.</obramowanie></obramowanie></obramowanie></obramowanie>

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie bezkomórkowego systemu ekspresji opartego na E. coli, zwanego translacją transkrypcji lub TX tl. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw trzech początkowych składników do ekstraktu z surowych komórek TX TL, roztworu aminokwasów i roztworu energetycznego. Roztwór aminokwasowy i roztwór energetyczny zostaną później połączone w celu utworzenia bufora TX TL.Drugim krokiem jest kalibracja surowego ekstraktu komórkowego w celu określenia optymalnych stężeń magnezu, potasu i naziemnej telewizji cyfrowej w celu wytworzenia reakcji TX TL o maksymalnych poziomach ekspresji. Następnie wyniki kalibracji są wykorzystywane do wykonania trzyprobówkowego systemu TX TL wykonanego z buforowego ekstraktu z surowych komórek i DNA. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie reakcji TX TL przy użyciu właśnie wytworzonych odczynników.Ostatecznie TX TL służy do demonstrowania obwodów biologii syntetycznej, a także tradycyjnych zastosowań ekspresji bezkomórkowej. Metoda ta może pomóc w testowaniu obwodów w dziedzinie biologii syntetycznej, zapewniając równe środowisko in vitro, które naśladuje to in vivo. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku zwiększenia szybkości projektowania syntetycznej biologii poprzez wyeliminowanie konieczności przeprowadzania wszystkich etapów prototypowania in vivo.Asystować przy zabiegu będzie Claire Hayes, asystentka naukowa w naszej grupie. Należy pamiętać, że ten film przejdzie tylko przez wybrane sekcje protokołu krytyczne dla filmowania. Pełny protokół jest dostępny wraz z artykułem tekstowym.Wcześniej w tym protokole komórki bakteryjne były hodowane i granulowane. Teraz komórki bakteryjne zostaną poddane lizie za pomocą ubijaka do kulek. Przechowuj wszystkie 50-mililitrowe probówki sokoła zawierające zawiesinę komórek na lodzie.Na potrzeby tego filmu koraliki zostaną zademonstrowane tylko dla jednej rurki. Koraliki muszą być dodawane z przerwami do probówki Falcon w trzech porcjach, z których każda wykorzystuje jedną trzecią wszystkich kulek. Dodaj pierwszą porcję koralików do wiru rurki na 30 sekund i umieść na lodzie.W ten sam sposób dodaj drugą porcję koralików, wiruj i umieść na lodzie. Po dodaniu ostatniej porcji i wirowaniu upewnij się, że kulki są równomiernie rozłożone, po trzecim etapie wirowania należy uformować gęstą pastę. Umieść rurkę na lodzie.Przygotuj końcówkę pipety o objętości pięciu mililitrów, używając sterylnych nożyczek, aby odciąć koniec. Aby utworzyć otwór o średnicy od trzech do czterech milimetrów, ustaw pipetę na dwa mililitry. Umieść 20 sterylnych probówek do koralików na lodzie.Użyj zmodyfikowanej pipety, aby sprawdzić wysoką lepkość roztworu kukiełków. Powinna być lepka do tego stopnia, że ledwo wychodzi z końcówki pipety. Podczas wyrzucania wyjmij roztwór komórek perełkowych z rurki Falcon i przenieś do rurki z kulkami.Napełniając go do trzech czwartych pełnego wirowania, bardzo krótko w mini wirówce. Aby usunąć pęcherzyki powietrza bez redystrybucji kulek, zakończ dodawanie roztworu komórek kulek do probówki, aby utworzyć wklęsły menisk. Następnie dodaj bardzo małą kroplę roztworu komórek koralików na wewnętrzną stronę nasadki rurki do koralików.Uważając, aby nie wlać roztworu do zewnętrznej krawędzi nasadki. W przeciwnym razie rurka do koralików nie zamknie się wystarczająco. Postukaj nakrętką o płaską powierzchnię i sprawdź, czy na spodzie nasadki nie ma pęcherzyków powietrza.Zakryj rurkę do ubijania koralików. Jeśli zrobisz to poprawnie, nasadka powinna być szczelnie zamknięta. Żadne pęcherzyki powietrza nie powinny być widoczne i niewiele, jeśli w ogóle, roztwór komórek koralików powinien się przelać od tego momentu, do wydajnego wykonania koralików potrzebne są dwie osoby.Przekaż napełnioną rurkę asystentowi w celu perlania koralików, podczas gdy pierwszy demonstrator kontynuuje napełnianie kolejnych rurek do koralików pozostałym roztworem komórek koralików. Weź wypełnioną rurkę do koralików i umieść ją na lodzie. Po zebraniu dwóch napełnionych rurek do perełkowania koralików i przebywaniu na lodzie przez co najmniej minutę.Rozpocznij koraliki koralikowe jedną rurkę przez 30 sekund przy 46 obr./min. Połóż do góry nogami na lodzie na 30 sekund, ubijając drugą rurkę. Powtórz nawlekanie i lukier tak, aby każda wypełniona rurka do perełek była ubijana przez łącznie jedną minutę.Po przetworzeniu wszystkich wypełnionych rurek do perełek skonstruuj aparat filtrujący z 15-mililitrowej rurki sokoła. Najpierw dodaj nową nasadkę do koralików płaską częścią skierowaną do dołu rurki. Następnie zdejmij nasadkę z przetworzonej rurki do perełkowania koralików i mocno dociśnij kolumnę mikrochromatograficzną do końca przetworzonej rurki do perełkowania koralików, aż do całkowitego uszczelnienia.Oderwij eluciański koniec kolumny mikrochromatograficznej i umieść ją elucian. Zakończ w dół do pustej rurki do koralików. Umieść ten kompleks w 15-mililitrowej tubie sokoła.Zbuduj aparaty filtrujące dla wszystkich napełnionych rurek do ubijania kulek i utrzymuj je na lodzie. Po całkowitym odwirowaniu aparaty filtrujące Probówka Falcona odkorkowana przy 6 000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu oddzielenia ekstraktu i osadu od kulek. Po odwirowaniu sprawdź, czy każda rurka z kulkami wytworzyła żywy ekstrakt.Prawidłowo ubity ekstrakt nie będzie mętny, a granulka będzie miała dwie wyraźne warstwy, jak pokazuje tubka po lewej stronie. Zmętniałe rurki, jak pokazano w przykładzie po prawej stronie, należy wyrzucić. Przenieś supernatant z nietwardych probówek do pojedynczych mikroprobówek wirówek o pojemności 1,75 mililitra, pobierając jak najmniej granulek.Trzymaj na lodzie, aż wszystkie rurki do koralików zostaną przetworzone. Następnie odwiruj mikroprobówki wirówkowe i zbierz supernatant. Po zagęszczeniu 500 mikrolitrów supernatantu bez granulek w nowej probówce do perełek perełkowych.Inkubować probówki ze zdjętymi nakrętkami przy 220 obr./min i 37 stopniach Celsjusza przez 80 minut. Spowoduje to strawienie pozostałych kwasów nukleinowych za pomocą endogennej egzonukleazy uwalnianej podczas procesu perełkowania. Po zakończeniu inkubacji ekstrakt powinien wyglądać na mętny.Skonsoliduj ekstrakt w mikroprobówkach wirówkowych o pojemności 1,75 mililitra do 1,5 mililitra na probówkę w temperaturze 12 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Za pomocą pipety skonsoliduj supernatant bez granulek w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 1,75 mililitra w celu uzyskania mniejszych plonów lub w 15-mililitrowej probówce Falcon w celu uzyskania większej wydajności na lodzie. Zakryj probówkę i dobrze wymieszaj, odwracając.Zaoszczędź 10 mikrolitrów supernatantu na lodzie do późniejszego pomiaru stężenia białka. Określić całkowitą ilość wyprodukowanego ekstraktu i uwodnić niezbędną liczbę 10 kaset dializacyjnych o odciętej masie cząsteczkowej, zanurzając w buforze S 30 B na dwie minuty. Załaduj kasety z maksymalnie 2,5 mililitra ekstraktu.Każda zlewka może pomieścić do dwóch kaset dializowanych, mieszając w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Zapoznaj się z artykułem pisemnym, aby zapoznać się z etapami przetwarzania po dializie. Podstawowa reakcja translacji transkrypcji składa się z trzech części: surowego ekstraktu komórkowego, buforu i DNA.Chociaż reakcje mogą różnić się objętością, protokół ten wykorzystuje wcześniej napisany szablon do przeprowadzenia reakcji o objętości 10 mikrolitrów. Tu. Pozycje w kolorze fioletowym wskazują wartości wprowadzone przez użytkownika, a pozycje w kolorze niebieskim wskazują dodatkowe odczynniki, które należy dodać do projektu reakcji w postaci eksperymentu in sili przy użyciu sekcji przygotowania mieszanki głównej i sekcji przygotowania DNA. Ogólnie rzecz biorąc, stałe można umieścić w sekcji przygotowania mieszanki głównej, podczas gdy zmienne można umieścić w sekcji przygotowania DNA.Zminimalizuj próbki na eksperyment, aby uniknąć parowania próbki i odchylenia czasu rozpoczęcia eksperymentu. Przykładowa konfiguracja jest pokazana w tej tabeli. Aby przygotować próbki DNA dla każdej próbki, ID podwielokrotnia wskazanej wody DNA i przedmiotów dostarczonych przez użytkownika do mikroprobówki wirówkowej.W temperaturze pokojowej przygotuj mieszankę wzorcową składającą się z ekstraktu buforowego i wszelkich elementów dostarczonych przez użytkownika z całego świata, utrzymywanych na lodzie i wirujących. Po dodaniu każdej pozycji dodaj odpowiednią ilość mieszanki wzorcowej do każdej próbki DNA i utrzymuj w temperaturze pokojowej. Potraktuj to jako czas rozpoczęcia reakcji.Każdą próbkę należy wirować i odwirowywać przy sile 10 000 G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej, aby usunąć pozostałą próbkę i zredukować pęcherzyki. Przeprowadź reakcję w płytce 384-dołkowej w temperaturze 29 stopni Celsjusza. Czas wykonywania będzie się różnić w zależności od eksperymentu, ale zwykle trwa poniżej ośmiu godzin.Po zakończeniu cyklu dane można odczytać z czytnika płytek. W artykule przedstawiono pięciodniowy protokół przygotowania endogennej translacji transkrypcyjnej opartej na E. coli lub bezkomórkowego systemu ekspresji TXTL. Warunki ekspresji tego systemu zostały zoptymalizowane poprzez testowanie efektów różnych metod przetwarzania plazmidu i buforu elucijanowego.Niektóre zmienne wprowadzone do systemu TXTL powinny być wcześniej skalibrowane pod kątem toksyczności, na przykład w porównaniu metod oczyszczania plazmidów używa się tylko zestawu Kaya Prep Spin Mini Prep Prep, podczas gdy w drugiej metodzie oczyszczania plazmid jest przygotowywany przy użyciu tego samego mini zestawu przygotowawczego, a następnie przetwarzany za pomocą kajaka. Zestaw do szybkiego oczyszczania PCR. Ten wykres pokazuje fluorescencję punktu końcowego po ośmiu godzinach, a także maksymalne tempo produkcji białka w oparciu o 12-minutowe słupki błędu średniej ruchomej to jedno odchylenie standardowe od czterech niezależnych przebiegów w różnych dniach.Zaobserwowana różnica w ekspresji wynika z różnicy w zawartości soli. Jednak inne elementy mogą nie mieć wpływu na TXTL, takie jak bufor eluciański. Porównano różne stężenia chlorku TS w bezkomórkowej reakcji ekspresji opartej na ekspresji jednego anomolowca plazmidu.Podane stężenia są końcowymi stężeniami trichlorku. W reakcji zastosowany bufor eluciański to 10 milimolowe słupki błędu chlorku trisu to jedno odchylenie standardowe od trzech niezależnych przebiegów w różnych dniach. Ten rysunek przedstawia typowe wykresy kalibracyjne dla surowego ekstraktu komórkowego, skalibrowane pod kątem dodatkowych poziomów glutaminianu magnezu, glutaminianu potasu i DTT.Pokazano fluorescencję punktu końcowego po ośmiu godzinach, a także maksymalną szybkość produkcji białka w oparciu o 12-minutową średnią ruchomą. Należy pamiętać, że każdy surowy ekstrakt komórkowy musi być skalibrowany niezależnie dla tych trzech zmiennych. Ogólnie rzecz biorąc, wyniki wskazują, że surowy ekstrakt komórkowy jest najbardziej wrażliwy na poziom glutaminianu magnezu, a następnie poziom glutaminianu potasu.Na podstawie tych wykresów dopuszczalny zakres dodatkowego glutaminianu magnezu wynosi cztery milimolowe dawki glutaminianu potasu od 60 do 80 milimolowych, a DTT wynosi od zera do trzech milimolowych napowietrzania po dolnej stronie. Końcowa skuteczność każdego surowego ekstraktu komórkowego może się różnić w zależności od biegłości użytkownika i warunków środowiskowych. Chociaż typowa różnica w wydajności wynosi od pięciu do 10%, fluorescencja punktów końcowych dwóch surowych ekstraktów przygotowanych w różnych terminach jest pokazana tutaj.Słupki błędów to jedno odchylenie standardowe z trzech niezależnych przebiegów w różnych dniach. Aby zademonstrować bezkomórkowy system ekspresji, skonstruowano pętlę ujemnego sprzężenia zwrotnego opartą na represji Tet i przetestowano ten sam obwód uruchomiony z TC i bez niego, który wykazał siedmiokrotną ekspresję końcową. Zmiana reportera D-E-G-F-P po ośmiu godzinach wyrażania Słupki błędów to jedno odchylenie standardowe z trzech niezależnych przebiegów w różnych dniach.Obwód genetyczny jest pokazany we wstawce. Ten ostatni rysunek przedstawia analizę kosztów i ekspresji konkurencyjnych surowych ekstraktów komórkowych. Wykres kołowy w kształcie litery A przedstawia koszty robocizny i materiałów bezkomórkowego systemu ekspresji TX TL w oparciu o koszty odczynników z grudnia 2012 r. i koszty pracy w wysokości 14 za godzinę.Panel B porównuje koszty bezkomórkowego systemu ekspresji TX z innymi systemami komercyjnymi. Koszty są podzielone na mikrolitr, chociaż objętości reakcji mogą się różnić w zależności od zestawu. Koszty materiałów dla tego systemu wynoszą około 3 centów za reakcję mikrolitrową, co stanowi 98% redukcję kosztów w porównaniu z porównywalnymi komercyjnymi systemami bezkomórkowymi.Panel C przedstawia porównanie wydajności bezkomórkowego systemu ekspresji TX TL z innymi systemami komercyjnymi. System ten może wytwarzać do 0,75 miligrama na mililitr białka reporterowego przy użyciu promotora opartego na Sigma 70 z operatorami fagów Lambda lub promotora sterowanego T siedmioma. Porównania te wskazują, że bezkomórkowy system ekspresji TX TL może wytwarzać równoważne ilości białka, co systemy oparte na T siódemce, co znacznie obniża koszty w porównaniu z podobnymi systemami komercyjnymi.Mamy nadzieję, że ta technika utoruje drogę do uproszczenia procesu inżynieryjnego w biologii syntetycznej.

protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Nowa generacja bezkomórkowych platform transkrypcyjno-translacyjnych została zaprojektowana do budowy systemów biochemicznych in vitro poprzez wykonywanie obwodów genowych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób bakteriofagi, takie jak MS2, ΦΧ174 i T7, są syntetyzowane z ich genomu przy użyciu systemu TXTL wolnego od komórek E. coli.

Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Ten protokół opisuje szybką i prostą metodę produkcji lizatu bakteryjnego do ekspresji genów bez komórek, przy użyciu zmodyfikowanego szczepu Escherichia coli i wymagającego jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Szybka, niedroga i nieskomplikowana produkcja lizatu bezkomórkowego

Ta praca opisuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Escherichia coli (E. coli), po którym następują reakcje syntezy białek bez komórek (CFPS) w czasie krótszym niż 24 godziny. Wyjaśnienie protokołu autoindukcji bezkomórkowej (CFAI) zawiera szczegółowe informacje o ulepszeniach wprowadzonych w celu zmniejszenia nadzoru badaczy i zwiększenia ilości uzyskiwanego ekstraktu komórkowego.

Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

Ten protokół szczegółowo opisuje ulepszoną metodę syntezy wysokiej wydajności białek rekombinowanych z systemu transkrypcyjno-translacyjnego bezkomórkowego Streptomyces (TX-TL).

Wysokowydajny zestaw narzędzi do transkrypcji i translacji Streptomyces do zastosowań w biologii syntetycznej i produktach naturalnych

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania i kalibracji buforu ekstraktów komórkowych z egzonukleazy V nokautujących szczepów Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD i ΔrecB). Jest to szybkie, łatwe i bezpośrednie podejście do ekspresji w bezkomórkowych systemach syntezy białek przy użyciu liniowych matryc DNA.

Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Poznaj protokół wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej. Ta metoda umożliwia szybkie testowanie obwodów genetycznych in vitro.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Przeglądaj więcej filmów