Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Ogólnym celem tego protokołu jest oczyszczenie i wyizolowanie pierwotnych komórek śródbłonka mózgu świni w celu stworzenia ścisłego modelu bariery krew-mózg in vitro. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bariery krew-mózg, takie jak dostarczanie leków, przepuszczalność, transport receptorów, a także szczelność i polaryzacja kulki. Główną zaletą tego modelu jest wysoka wydajność pierwotnych komórek śródbłonka mózgu, które można wykorzystać do stworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro, który ma wysoki TEER i niską przepuszczalność. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść mózgi w sterylnej ławce przepływowej i delikatnie umyj je jednym litrem PBS w zlewce umieszczonej na lodzie.

Następnie ostrożnie usuń opony mózgowe z każdego mózgu za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Za pomocą skalpela zeskrob szarą istotę z mózgów pojedynczo i przenieś wyizolowany materiał na szalki Petriego zawierające 20 mililitrów DMEM/F-12 umieszczonych na lodzie. W celu wstępnej fragmentacji przepuść materiał istoty szarej przez 50-mililitrową strzykawkę bez igły.

Powtórz procedurę dla wszystkich mózgów i połącz ze sobą zebrany materiał istoty szarej. Przenieś wyizolowany materiał istoty szarej z podłożem DMEM/F-12 do probówki młynka ręcznego homogenizatora tkankowego. Ujednolicić materiał, wykonując osiem ruchów w górę iw dół luźnym tłuczkiem, a następnie osiem ruchów w górę iw dół ciasnym tłuczkiem.

Następnie odizoluj naczynia włosowate, filtrując homogenat za pomocą 500-mililitrowej niebieskiej butelki z nakrętką z uchwytem filtra i siatką filtracyjną o średnicy 140 mikronów. Umieść filtry kapilarne na szalkach Petriego z roztworem wytrawiającym. Następnie inkubuj szalki Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min lub delikatnie mieszaj je co 10 minut.

Po godzinie zmyć naczynia włosowate z filtrów zawiesiną z szalki Petriego. Następnie podziel zawiesinę z trzech szalek na dwie 50-mililitrowe probówki i zatrzymaj trawienie, dodając 10 mililitrów DMEM / F-12 do każdej 50-mililitrowej probówki. Odwirować zawiesiny komórek w temperaturze 250 razy g, cztery stopnie Celsjusza przez pięć minut.

Następnie odessać supernatanty i ponownie zawiesić każdą osadkę w 10 mililitrach DMEM/F-12. Następnie dodaj kolejne 20 mililitrów DMEM/F-12 do każdej probówki. Aby zoptymalizować warunki przyłączania PBEC, dodaj roztwór powlekający do kolby T-75, uzyskując końcowe stężenie kolagenu cztery na poziomie 150 mikrogramów na mililitr i fibronektyny na poziomie 50 mikrogramów na mililitr oraz za pomocą wody destylowanej, upewniając się, że roztwór pokrywa całą powierzchnię.

Następnie rozmrozić naczynia włosowate w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby usunąć pożywkę zamrażającą, odwiruj naczynia włosowate z prędkością 250 razy g, cztery stopnie Celsjusza, przez siedem minut. Następnie ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym do dwóch mililitrów 10-mililitrowej porcji.

Następnie przenieść zawiesinę kapilarną do powlekanej kolby T-75 i delikatnie przechylić kolbę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na powierzchni. Umieścić kolbę T-75 w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po całonocnej inkubacji przygotować 10 mililitrów pożywki wzrostowej PBEC, uzupełnionej puromycyną w dawce czterech mikrogramów na mililitr na jedną kolbę T-75 i wykonać zmianę pożywki.

Następnie przygotuj przepuszczalne wkładki membranowe do wysiewu PBEC, pokrywając je kolagenem IV w ilości 500 mikrogramów na mililitr i fibronektyną w ilości 100 mikrogramów na mililitr oraz wodą destylowaną. Trypsyna komórek przez dodanie dwóch mililitrów roztworu trypsyny-EDTA do kolby T-75 i umieszczenie jej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, na pięć do siedmiu minut. Aby odłączyć komórki śródbłonka mózgu, delikatnie postukaj opuszkami palców w bok kolby T-75.

Następnie przenieś roztwór komórkowy do 15-mililitrowej probówki i wiruj komórki śródbłonka mózgu przez odwirowanie w temperaturze 250 razy g, cztery stopnie Celsjusza, przez siedem minut. Następnie ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze podłoża. Następnie dodaj kolejne dwa mililitry pożywki, aby zwiększyć całkowitą objętość do trzech mililitrów.

Policz liczbę komórek ręcznie za pomocą komory do liczenia komórek lub automatycznego systemu zliczania komórek. W przypadku kokultury bezkontaktowej przenieś wkładki do studzienek, w których znajdują się astrocyty, które dzień wcześniej zostały odświeżone pożywką dla wzrostu astrocytów. Następnego dnia należy wymienić podłoże na przepuszczalne wkłady membranowe zawierające PBEC.

Następnie ostrożnie odessać pożywkę z dołków i dodać 750 mikrolitrów pożywki różnicującej do każdej studzienki. Następnie ostrożnie odessać pożywkę z wkładek i dodać 500 mikrolitrów pożywki różnicującej na wkładkę. Następnie dodaj pozostałe 750 mikrolitrów pożywki różnicującej do każdego studzienki astrocytu.

Następnie inkubuj komórki z pożywką różnicującą w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, do następnego dnia. Następnego dnia po stymulacji komórek pożywką różnicującą należy przygotować system komory do pomiaru oporu tkanek do pomiarów TEER, przepłukując komorę dwa razy wodą dwudestylowaną, raz 70% etanolem przez pięć minut i jeszcze dwa razy wodą dwudestylowaną. Następnie podłącz komorę do systemu, dodaj cztery mililitry DMEM/F-12 do komory pomiaru oporu tkanek i pozostaw w temperaturze pokojowej przez około 30 minut.

Następnie należy wykonać pomiary TEER, ostrożnie umieszczając wkładki w komorze pomiaru oporu tkanek. Oto obrazy z mikroskopii fazowej z kontrastem fazowym PBEC, kultur i astrocytów oglądane przez pięć dni. Oczyszczone fragmenty naczyń włosowatych w pierwszym dniu początkowej hodowli wykazały obecność zarówno naczyń włosowatych, jak i komórek zanieczyszczających, które po zmianie pożywki w drugim dniu i dodatkowym dniu wzrostu wykazywały selekcję na PBEC, rozpoczynając swój wzrost od fragmentów naczyń włosowatych.

Zlewające się monowarstwy PBEC były zwykle osiągane w dniach od czwartego do szóstego, w którym to czasie PBEC wykazywały morfologię w kształcie wrzeciona i były wyrównane wzdłużnie. Astrocyty szczurów wysiane w studzienkach dennych zwykle rozmnażały się do zlewających się warstw w ciągu pięciu dni i były wykorzystywane do bezkontaktowych modeli kokultury po dwóch tygodniach wzrostu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu godzin.

Po jej opracowaniu, technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania dostarczania leków i transportu receptorów w ciasnych i spolaryzowanych komórkach śródbłonka mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć model bariery krew-mózg in vitro, który można wykorzystać do nowych badań, których nie można przeprowadzić in vivo.