Name: Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro z użyciem pierwotnych komórek śródbłonka mózgu świni. Protokół zapewnia wysoką powtarzalność i szczelność barierę z wysokim TEER.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Elisabeth Helenie Bruun, Sarah Christine Christensen i Nielsowi M. Kristiansensenowi za pomoc techniczną oraz grant Fundacji Lundbeck o numerze R155-2013-14113.

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.

Oczyszczanie i proliferacja pBEC
Podczas procedury oczyszczania krytyczne etapy obejmują szybkie i skuteczne usunięcie opon mózgowych oraz oddzielenie istoty białej i szarej, co jest ważne dla wydajności i czystości oczyszczania oraz dla prawidłowego ustalenia modelu. Dla przedstawionego modelu BBB in vitro z wykorzystaniem pBEC udoskonaliliśmy i uprościliśmy procedurę oczyszczania opartą na mechanicznej homogenizacji wyizolowanej istoty szarej, filtracji selektywnej pod kątem izolacji m...

Struktura komórkowa i funkcja bariery krew-mózg
Na styku układu krążenia i ośrodkowego układu nerwowego (OUN), BBB działa jako kluczowe miejsce regulacyjne dla homeostatycznej kontroli mikrośrodowiska OUN, co jest niezbędne dla prawidłowego funkcjonowania i ochrony układu nerwowego. Miejscem bariery krew-mózg są komórki śródbłonka wyściełające światło naczynia krwionośnego. W naczyniach włosowatych mózgu komórki śródbłonka tworzą złożone ścisłe połączenia międzykomórkowe, a silnie spolaryzowane wzorce ekspresji poszczególnych transporterów napływu i odpływu zapewniają wysoce specyficzny transport molekularny między krwią a mózgiem 1. Składniki strukturalne kompleksów połączeń ścisłych obejmują białka z rodziny okludyny i klaudyny, białka zonula occludens (ZO), cingulinę i związane z nią cząsteczki adhezji złącznej (JAM). Klaudyna 5 jest szczególnie ważna w ograniczeniu połączeń przykomórkowych. Indukcja i utrzymanie tego charakterystycznego fenotypu śródbłonka BBB obejmuje dynamiczne interakcje z otaczającymi komórkami, w tym perycytami, astrocytami, neuronami i błonami podstawnymi, które wraz z komórkami śródbłonka mózgu tworzą jednostkę nerwowo-naczyniową (NVU)2,3. Mechanizmy związane z tymi interakcjami nie są jeszcze w pełni poznane, ale obejmują wymianę sygnałów chemicznych między komórkami, co pozwala na modulację przepuszczalności BBB w krótkim okresie i indukuje długoterminowe cechy BBB4. Astrocyty są szczególnie znane z tego, że przyczyniają się do fenotypu komórek śródbłonka mózgu i są źródłem czynników regulacyjnych, takich jak czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego (wpływający na wewnątrzkomórkowy cAMP)5, podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów6, hydrokortyzon7 i transformujący czynnik wzrostu β (TGF-β)8. Wpływ TGF-β był jednak przedmiotem dyskusji9.
Od In Vivo do In Vitro BBB
Badania in vivo nadal dostarczają cennych informacji na temat biologii BBB. Jednak modele hodowli komórkowych mogą dostarczyć dodatkowych informacji i stanowić użyteczne narzędzia do zrozumienia szczegółowych molekularnych i funkcjonalnych aspektów bariery krew-mózg zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Chociaż złożone interakcje między typami komórek i składnikami BBB są trudne do pełnego osiągnięcia w modelach in vitro, od czasu pierwszego oczyszczenia komórek śródbłonka mózgu i zastosowania ich w monokulturach zaszły takie przypadki10,11,12, szeroko zakrojony rozwój procedur oczyszczania i warunków wzrostu modeli hodowli komórkowych BBB, co skutkuje większym podobieństwem do bariery in vivo. Powszechnie stosowane modele BBB in vitro oparte są na pierwotnych komórkach pochodzących od gryzoni, świń i bydła oraz na unieśmiertelnionych liniach komórkowych. Każdy model ma inne zalety i wady. Do porównania i wyboru modelu wykorzystywane są markery walidacyjne, takie jak ekspresja enzymów BBB, transporterów, receptorów i białek strukturalnych, do tworzenia przeglądów aktualnie ustalonych modeli1.
Cel protokołu
Jedną z ważnych cech BBB jest szczelność bariery i wysoki TEER, jednak duża liczba dostępnych modeli nie odzwierciedla dobrze poziomów in vivo. Uwzględniając wkład rozwojowy i optymalizacyjny z kilku laboratoriów, celem niniejszego protokołu jest przedstawienie metody ustanawiania modelu BBB o wysokim TEER in vitro w oparciu o pierwotne pBEC w MC z ACM lub bez ACM lub w NCC z pierwotnymi astrocytami pochodzenia szczurzego lub wieprzowego. Zastosowane procedury i ustanowienie modelu obejmują wysiłki mające na celu wyeliminowanie zanieczyszczających komórek i poprawę różnicowania pBEC w fenotyp BBB. Prace te zaowocowały stworzeniem niezawodnych modeli o wysokim TEER o niskiej przepuszczalności parakomórkowej i dobrej ekspresji funkcjonalnej kluczowych białek połączeń ścisłych, transporterów i receptorów. Ponieważ jednak astrocyty są czynnikiem przyczyniającym się do fenotypu komórek śródbłonka mózgu, trzy różne warunki hodowli reprezentują trzy różne fenotypy komórek śródbłonka mózgu. Model NCC jest szczególnie przydatny do badań nad pewnymi wyspecjalizowanymi mechanizmami związanymi z odkrywaniem leków, badaniami transportu i transportem wewnątrzkomórkowym, a także do badania interakcji komórka-komórka, w których maksymalna ekspresja cech BBB jest korzystna.
Pochodzenie i historia protokołu
Opisany tutaj model pBEC jest w dużej mierze oparty na modelu świńskim opracowanym w Eisai Laboratories (Londyn) przez dr Louise Morgan i współpracowników, który jest oparty na udanym wcześniejszym modelu komórek śródbłonka mózgu bydlęcego13. Pierwotna metoda przygotowania komórek polegała na dwuetapowej filtracji przy użyciu siatek nylonowych do wyłapywania mikronaczyń, a następnie etapie subkulturacji w celu poprawy czystości. We wcześniejszym opracowaniu metody optymalny fenotyp BBB i szczelność bariery uzyskano poprzez wzrost w pożywce suplementowanej, w tym ACM. Dalsze modyfikacje metody zostały wprowadzone przez R. Skinnera w laboratorium prof. N. Rothwella w Manchesterze w Wielkiej Brytanii14,15. Metoda została przyjęta przez laboratorium Abbott, KCL London, gdzie Patabendige znacznie uprości przygotowanie, unikając użycia astrocytów lub ACM i eliminując puromycyną zanieczyszczające komórki, takie jak perycyty. Pierwsze prace potwierdziły, że model MC zachował kilka ważnych cech BBB in vivo, w tym skuteczne połączenia ścisłe, systemy transportu błonowego i transcytozę za pośrednictwem receptora16,17,18,19,20. Później S. Yusof ponownie przetestował kohodowlę astrocytów i stwierdził, że znacznie poprawiła TEER, więc jest to preferowany wariant obecnie używany w Abbott lab21. Model został teraz pomyślnie przeniesiony do laboratorium M. Nielsen w Aarhus, gdzie wprowadzono dalsze modyfikacje (ten protokół), w tym uproszczenie ekstrakcji istoty szarej, przy użyciu tylko jednego etapu filtracji siatkowej oraz pojedynczego etapu powlekania filtra łączącego kolagen i fibronektynę. Zastosowana procedura izolacji astrocytów świń (ten protokół) została oparta na protokołach opracowanych przez laboratorium T. Moos w Aalborgu, opisanych przez Thomsen et al22. TEER i inne właściwości modelu wygenerowanego w Londynie i Aarhus są podobne, co daje pewność poglądowi, że model jest łatwo przenoszony między laboratoriami i dobrze reaguje na uważną obserwację i racjonalizację etapów metody. Rzeczywiście, S. Yusof ustalił model MC w kraju tropikalnym (Malezja)23, co wymagało dalszego dostosowania do lokalnych warunków i źródeł tkankowych.
Zalety w porównaniu z alternatywnymi metodami i obecnie istniejącymi modelami
W porównaniu do komórek śródbłonka mózgu pochodzenia bydlęcego i gryzońskiego, pBECs mają tę zaletę, że mają niższy wskaźnik utraty fenotypu BBB in vivo po izolacji24. Co więcej, pBEC są zdolne do tworzenia stosunkowo szczelnych barier śródbłonkowych, nawet gdy są uprawiane w MC (800 Ω cm2)16 w porównaniu z powszechnie zgłaszanymi poziomami dla monowarstw linii komórkowych, takich jak bEND.5 i bEND.3 (50 Ω cm2)25,26,27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30 i cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32, oraz pierwotne komórki śródbłonka mózgu myszy (100-300 Ω cm2)33,34,35,36 i szczur (100-300 Ω cm2)37, 38. Wykazano jednak, że TEER jest zależny od procedur oczyszczania i hodowli. W większości przypadków dodanie ACM lub kohodowli z astrocytami wykazuje różnicujący wpływ na komórki śródbłonka i wzrost szczelności warstw śródbłonka1. Niemniej jednak, dzięki wysiłkom na rzecz optymalizacji warunków hodowli, tylko modele oparte na bydle wykazały wartości TEER porównywalne z modelami opartymi na świniach (średnie 800 Ω cm2 w MC, do 2500 Ω cm2 w kohodowli astrocytów)13,39,40,41,42,43,44,45. Ponieważ modele oparte na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu bydlęcego wykazały duże różnice, zarówno między laboratoriami, jak i w ich obrębie14,45,46,47,48, odtwarzalność może stanowić problem. W przedstawionym tutaj modelu pBEC laboratoria biorące udział w projekcie osiągnęły bardzo podobne wartości TEER i przepuszczalności parakomórkowej przy niskiej zmienności, zarówno w laboratoriach, jak i między nimi. W związku z tym inne laboratoria powinny być w stanie ustanowić solidny model o niskiej zmienności przy użyciu przedstawionej tutaj metody. Oprócz tworzenia ścisłych warstw śródbłonka, modele z pBEC zostały wcześniej zweryfikowane pod kątem ekspresji białek połączeń ścisłych, funkcjonalnych transporterów BBB, receptorów i enzymów oraz wykazały przydatność w szeregu badań15,16,17,19,20,22,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. Ponadto niepublikowane dane transkryptomiczne dotyczące kokultur pBEC pokazują oczekiwany profil transporterów i receptorów BBB (niepublikowane wyniki, Nielsen i wsp.).
Model BBB oparty na świniach ma dodatkową zaletę, ponieważ genom, anatomia, fizjologia i postęp choroby świni odzwierciedlają biologię człowieka w wyższym stopniu niż inne uznane modele60, które są korzystnymi cechami dla przemysłu farmaceutycznego. Ponieważ mózgi świń są powszechnym produktem ubocznym przemysłu mięsnego, stanowią one łatwo dostępne źródło komórek śródbłonka mózgu, minimalizując liczbę zwierząt potrzebnych do eksperymentów i zapewniając wysoką wydajność oczyszczania z jednego mózgu świni. Chociaż oczyszczanie i hodowla komórek pierwotnych jest nieco czasochłonna i wymaga specjalistycznej wiedzy w zakresie standaryzacji podczas tworzenia modelu, komórki pierwotne generują najbardziej wiarygodne modele BBB. Unieśmiertelnione linie komórkowe nie mogą być substytutem, ponieważ ważne właściwości, takie jak szczelność bariery, profile ekspresji transportera i regulacja mikrośrodowiska, nie odzwierciedlają wyników eksperymentu in vivo61,62. Modele in vitro zapewniają przewagę obrazowania żywych komórek o wyższej rozdzielczości, umożliwiając wizualizację procesów wewnątrzkomórkowych poprzez umożliwienie zbliżenia się do próbkowanych lub obserwowanych komórek, przy użyciu obiektywów o większym powiększeniu i lepszej jakości optycznej63. Inaczej jest w przypadku stosowania mikroskopii dwufotonowej u żywych zwierząt. Co więcej, modele in vitro zapewniają możliwość transfekcji komórek, umożliwiając wizualizację znakowanych białek i badanie ich transportu.
Zastosowania modelu
Funkcja BBB nie jest stała i może być dynamicznie modulowana zarówno w fizjologii, jak i patologii. W wielu chorobach neurologicznych, w tym chorobach neurodegeneracyjnych, zapalnych i zakaźnych, obserwuje się zakłócenie i zwiększoną przepuszczalność bariery krew-mózg64,65,66,67. W celu zmniejszenia i zapobieżenia postępowi choroby i późniejszym uszkodzeniom, identyfikacja i charakterystyka mechanizmów molekularnych leżących u podstaw modulacji BBB ma ogromne znaczenie. W tym kontekście przemysł farmaceutyczny bardzo poszukuje wiarygodnych modeli in vitro, które odgrywają również ważną rolę w przewidywaniu przepuszczalności krwi (BBB) leków do OUN. Każdy model in vitro służący jako ekran przepuszczalności powinien wyświetlać restrykcyjny szlak parakomórkowy, fizjologicznie realistyczną architekturę komórki i funkcjonalną ekspresję mechanizmów transportera68. Wykazany w poprzednich badaniach16,17,57, oraz przez przepuszczalność parakomórkową i ekspresję białek TJ i AJ tutaj, prezentowany model spełnia wszystkie te kryteria i nadaje się do szeregu badań BBB zarówno w normalnej fizjologii, jak i patologii. Do mocnych stron przedstawionej metody oczyszczania i hodowli należy połączenie prostoty i powtarzalności oraz możliwość uwzględnienia wpływu astrocytarnego z uzyskanym solidnym i wiarygodnym modelem BBB o wysokim współczynniku TEER in vitro. W tym celu wykazano, że astrocyty pochodzenia świńskiego i szczurzego zwiększają fenotyp BBB pBEC w podobny sposób22.

<table><tbody><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Lonza</td><td>BE12-719F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Niski poziom glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Surowica pochodząca z osocza (PDS)</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-89</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10-270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>8-CPT-cAMP</td><td>Biolog</td><td>C010</td><td></td></tr><tr><td>RO 20-1724</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8279</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34896</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>VWR</td><td>20,824,296</td><td>Wymieszaj 70% roztwór z 96</td></tr>% <tr><td>DNAzy EtOH 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza CLS2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Wykonane z kolb Elga System</td></tr><tr><td>T75</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Wkładki Costar Transwell (wkładki membranowe przepuszczalne dla komórek)</td><td>Costar</td><td>CLS3401</td><td>12-dołkowa płytka, średnica 12 mm, 0,4 &mu; m Membrana poliwęglanowa</td></tr><tr><td>15 ml probówki wirówkowe</td><td>Cellstar</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki wirówkowe</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Petriego</td><td>Thermo Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>Thermo Scientific</td><td>377224</td><td></td></tr><tr><td>butelka 500 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>159910/159920</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele</td><td>Swann-Morten</td><td>REF0211</td><td>Typ 24</td></tr><tr><td>Homogenizator tkankowy</td><td>Sigma</td><td>D9188</td><td></td></tr><tr><td>140 &mu; m filtry</td><td>MERCK</td><td>NY4H04700</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m filtry</td> System komór <td>Corning</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>EndOhm</td><td>World Precision Instruments</td><td>ENDOHM-12</td><td>Komora EndOhm do kubków hodowlanych 12 mm</td></tr><tr><td>System elektrod EVOM2 System pomiarowy</td><td>TEER World Precision Instruments</td><td>300523+STX100C</td> ze <td>sztywną parą elektrod STX-100C</td></tr><tr><td>Długa igła</td><td>Sigma</td><td></td><td>Podłącz do strzykawki</td></tr><tr><td>Kleszczyki zakrzywione z cienką końcówką</td><td>KLS Martin</td><td>12-409-12-07</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze z szeroką końcówką</td><td>VWR</td><td>82027-390</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt filtra</td><td>MERCK Milipore</td><td>Swinnex-47</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 50 ml</td><td>Braun</td><td>4617509F</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Przeciwciało</td> antyokludynowe <td>Terumo</td><td>SSt20ESI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab31721</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Anty-p120 Przeciwciało kateniny</td><td>Laboratoria transdukcji BD</td><td>610133</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>61-7300</td><td>1:200</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Claudin 5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4502981</td><td>1:100</td></tr><tr><td>IgG przeciwko osiołkowi przeciw królikowi skoniugowane z mąką Alexa 568</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10042</td><td>1:500</td></tr><tr><td>IgG przeciwko myszom osła skoniugowane z mąką Alexa 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEC100X250UC</td><td>0,15&mikro; l/ml końcowy składnik roboczy</td></tr><tr><td>Lucifer Yellow</td><td>Sigma</td><td>L0144</td><td>10 &micro; g/ml końcowe stężenie robocze</td></tr></tbody></table>

ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Celem tego protokołu jest zoptymalizowana procedura oczyszczania i hodowli pBECs oraz ustanowienie in vitro modeli bariery krew-mózg (BBB) opartych na pBECs w monokulturze (MC), MC z pożywką kondycjonowaną przez astrocyty (ACM) i bezkontaktowej kokulturze (NCC) z astrocytami pochodzenia wieprzowego lub szczurzego. pBECs zostały wyizolowane i wyhodowane z fragmentów naczyń włosowatych z kory mózgowej świń domowych w wieku 5-6 miesięcy. Fragmenty te oczyszczono poprzez staranne usunięcie opon mózgowych, izolację i homogenizację istoty szarej, filtrację, trawienie enzymatyczne i odwirowanie. Aby jeszcze bardziej wyeliminować zanieczyszczające komórki, fragmenty naczyń włosowatych hodowano z pożywką zawierającą puromycynę. Gdy 60-95% zlewają się, pBEC wyrastające z fragmentów kapilarnych zostały przepuszczone do przepuszczalnych wkładów filtracyjnych membranowych i ustalone w modelach. W celu zwiększenia szczelności bariery i charakterystycznego dla BBB fenotypu pBEC, komórki potraktowano następującymi czynnikami różnicującymi: przepuszczalnym przez błonę 8-CPT-cAMP (tutaj w skrócie cAMP), hydrokortyzonem i inhibitorem fosfodiesterazy RO-20-1724 (RO). Zabieg przeprowadzano przez okres 9-11 dni, a przy ustalaniu modelu NCC astrocyty hodowano z 2-8 tygodniowym wyprzedzeniem. Przestrzeganie procedur opisanych w protokole pozwoliło na ustanowienie warstw śródbłonka o bardzo ograniczonej przepuszczalności parakomórkowej, przy czym model NCC wykazuje średni transśródbłonkowy opór elektryczny (TEER) wynoszący 1249 ± 80 Ω cm2 i przepuszczalność parakomórkową (P app) dla Lucyfera Yellow wynoszącą 0,90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sec-1 (średnia ± SEM, n=55). Dalsza ocena tego fenotypu pBEC wykazała dobrą ekspresję białek ściśle połączeniowych klaudyny 5, ZO-1, okludyny i kateniny białka połączeniowego p120 adherenów. Przedstawiony model może być wykorzystany do szeregu badań nad barierą krew-mózg w zdrowiu i chorobie, a dzięki wysoce restrykcyjnej przepuszczalności parakomórkowej model ten nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym.

Tworzenie modeli bariery krew-mózg in vitro
W przedstawionej, zoptymalizowanej metodzie hodowla pBEC oraz ustanowienie systemu wkładów z przepuszczalną membraną z MC lub bez ACM lub NCC z astrocytami (Rysunek 1) była prowadzona przez okres od 9 do 11 dni (Rysunek 2). W celu selekcji komórek śródbłonka wstępną hodowlę oczyszczonych fragmentów naczyń włosowatych poł...

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Ogólnym celem tego protokołu jest oczyszczenie i wyizolowanie pierwotnych komórek śródbłonka mózgu świni w celu stworzenia ścisłego modelu bariery krew-mózg in vitro. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bariery krew-mózg, takie jak dostarczanie leków, przepuszczalność, transport receptorów, a także szczelność i polaryzacja kulki. Główną zaletą tego modelu jest wysoka wydajność pierwotnych komórek śródbłonka mózgu, które można wykorzystać do stworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro, który ma wysoki TEER i niską przepuszczalność. Aby rozpocząć tę procedurę, umieść mózgi w sterylnej ławce przepływowej i delikatnie umyj je jednym litrem PBS w zlewce umieszczonej na lodzie.Następnie ostrożnie usuń opony mózgowe z każdego mózgu za pomocą kleszczy z cienką końcówką. Za pomocą skalpela zeskrob szarą istotę z mózgów pojedynczo i przenieś wyizolowany materiał na szalki Petriego zawierające 20 mililitrów DMEM/F-12 umieszczonych na lodzie. W celu wstępnej fragmentacji przepuść materiał istoty szarej przez 50-mililitrową strzykawkę bez igły.Powtórz procedurę dla wszystkich mózgów i połącz ze sobą zebrany materiał istoty szarej. Przenieś wyizolowany materiał istoty szarej z podłożem DMEM/F-12 do probówki młynka ręcznego homogenizatora tkankowego. Ujednolicić materiał, wykonując osiem ruchów w górę iw dół luźnym tłuczkiem, a następnie osiem ruchów w górę iw dół ciasnym tłuczkiem.Następnie odizoluj naczynia włosowate, filtrując homogenat za pomocą 500-mililitrowej niebieskiej butelki z nakrętką z uchwytem filtra i siatką filtracyjną o średnicy 140 mikronów. Umieść filtry kapilarne na szalkach Petriego z roztworem wytrawiającym. Następnie inkubuj szalki Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min lub delikatnie mieszaj je co 10 minut.Po godzinie zmyć naczynia włosowate z filtrów zawiesiną z szalki Petriego. Następnie podziel zawiesinę z trzech szalek na dwie 50-mililitrowe probówki i zatrzymaj trawienie, dodając 10 mililitrów DMEM / F-12 do każdej 50-mililitrowej probówki. Odwirować zawiesiny komórek w temperaturze 250 razy g, cztery stopnie Celsjusza przez pięć minut.Następnie odessać supernatanty i ponownie zawiesić każdą osadkę w 10 mililitrach DMEM/F-12. Następnie dodaj kolejne 20 mililitrów DMEM/F-12 do każdej probówki. Aby zoptymalizować warunki przyłączania PBEC, dodaj roztwór powlekający do kolby T-75, uzyskując końcowe stężenie kolagenu cztery na poziomie 150 mikrogramów na mililitr i fibronektyny na poziomie 50 mikrogramów na mililitr oraz za pomocą wody destylowanej, upewniając się, że roztwór pokrywa całą powierzchnię.Następnie rozmrozić naczynia włosowate w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby usunąć pożywkę zamrażającą, odwiruj naczynia włosowate z prędkością 250 razy g, cztery stopnie Celsjusza, przez siedem minut. Następnie ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym do dwóch mililitrów 10-mililitrowej porcji.Następnie przenieść zawiesinę kapilarną do powlekanej kolby T-75 i delikatnie przechylić kolbę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie na powierzchni. Umieścić kolbę T-75 w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Po całonocnej inkubacji przygotować 10 mililitrów pożywki wzrostowej PBEC, uzupełnionej puromycyną w dawce czterech mikrogramów na mililitr na jedną kolbę T-75 i wykonać zmianę pożywki.Następnie przygotuj przepuszczalne wkładki membranowe do wysiewu PBEC, pokrywając je kolagenem IV w ilości 500 mikrogramów na mililitr i fibronektyną w ilości 100 mikrogramów na mililitr oraz wodą destylowaną. Trypsyna komórek przez dodanie dwóch mililitrów roztworu trypsyny-EDTA do kolby T-75 i umieszczenie jej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, na pięć do siedmiu minut. Aby odłączyć komórki śródbłonka mózgu, delikatnie postukaj opuszkami palców w bok kolby T-75.Następnie przenieś roztwór komórkowy do 15-mililitrowej probówki i wiruj komórki śródbłonka mózgu przez odwirowanie w temperaturze 250 razy g, cztery stopnie Celsjusza, przez siedem minut. Następnie ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze podłoża. Następnie dodaj kolejne dwa mililitry pożywki, aby zwiększyć całkowitą objętość do trzech mililitrów.Policz liczbę komórek ręcznie za pomocą komory do liczenia komórek lub automatycznego systemu zliczania komórek. W przypadku kokultury bezkontaktowej przenieś wkładki do studzienek, w których znajdują się astrocyty, które dzień wcześniej zostały odświeżone pożywką dla wzrostu astrocytów. Następnego dnia należy wymienić podłoże na przepuszczalne wkłady membranowe zawierające PBEC.Następnie ostrożnie odessać pożywkę z dołków i dodać 750 mikrolitrów pożywki różnicującej do każdej studzienki. Następnie ostrożnie odessać pożywkę z wkładek i dodać 500 mikrolitrów pożywki różnicującej na wkładkę. Następnie dodaj pozostałe 750 mikrolitrów pożywki różnicującej do każdego studzienki astrocytu.Następnie inkubuj komórki z pożywką różnicującą w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, do następnego dnia. Następnego dnia po stymulacji komórek pożywką różnicującą należy przygotować system komory do pomiaru oporu tkanek do pomiarów TEER, przepłukując komorę dwa razy wodą dwudestylowaną, raz 70% etanolem przez pięć minut i jeszcze dwa razy wodą dwudestylowaną. Następnie podłącz komorę do systemu, dodaj cztery mililitry DMEM/F-12 do komory pomiaru oporu tkanek i pozostaw w temperaturze pokojowej przez około 30 minut.Następnie należy wykonać pomiary TEER, ostrożnie umieszczając wkładki w komorze pomiaru oporu tkanek. Oto obrazy z mikroskopii fazowej z kontrastem fazowym PBEC, kultur i astrocytów oglądane przez pięć dni. Oczyszczone fragmenty naczyń włosowatych w pierwszym dniu początkowej hodowli wykazały obecność zarówno naczyń włosowatych, jak i komórek zanieczyszczających, które po zmianie pożywki w drugim dniu i dodatkowym dniu wzrostu wykazywały selekcję na PBEC, rozpoczynając swój wzrost od fragmentów naczyń włosowatych.Zlewające się monowarstwy PBEC były zwykle osiągane w dniach od czwartego do szóstego, w którym to czasie PBEC wykazywały morfologię w kształcie wrzeciona i były wyrównane wzdłużnie. Astrocyty szczurów wysiane w studzienkach dennych zwykle rozmnażały się do zlewających się warstw w ciągu pięciu dni i były wykorzystywane do bezkontaktowych modeli kokultury po dwóch tygodniach wzrostu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu godzin.Po jej opracowaniu, technika ta utorowała naukowcom drogę do zbadania dostarczania leków i transportu receptorów w ciasnych i spolaryzowanych komórkach śródbłonka mózgu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stworzyć model bariery krew-mózg in vitro, który można wykorzystać do nowych badań, których nie można przeprowadzić in vivo.

improved-method-for-establishment-an-vitro-blood-brain-barrier-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejsza metoda opisuje sposób izolacji i unieśmiertelniania mikro naczyniowych komórek śródbłonka z mózgu myszy. Przedstawiamy szczegółowy protokół, obejmujący kolejno homogenizację tkanki mózgowej, etapy trawienia, wysiew oraz unieśmiertelnianie komórek. Uzyskanie homogennej, unieśmiertelnionej linii mikro naczyniowych komórek śródbłonka zajmuje zazwyczaj około pięciu tygodni.

Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Ten film pokazuje izolację naczyń włosowatych od świeżych mózgów świń. Proces ten polega na usunięciu opon mózgowych, wyizolowaniu istoty szarej z tkanki mózgowej, homogenizacji i filtrowaniu istoty szarej w celu wyizolowania naczyń włosowatych, a na koniec zastosowaniu trawienia enzymatycznego w celu dalszego oczyszczenia naczyń włosowatych.

Oczyszczanie naczyń włosowatych z mózgu świni

Stworzenie ludzkich modeli bariery krew-mózg (BBB) może przynieść korzyści badaniom nad chorobami mózgu związanymi z niewydolnością bariery krew-mózg. Opisujemy tutaj ulepszoną technikę przygotowania kontaktowego modelu BBB, która umożliwia kokulturację ludzkich astrocytów i komórek śródbłonka mózgu po przeciwnych stronach porowatej błony.

Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Tutaj opisujemy mysi model bariery krew-mózg in vitro, który wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, koncentrując się na konsekwencjach dla integralności i przepuszczalności komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Izolowane naczynia włosowate mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej mogą być użyte jako model przedkliniczny do badania funkcji bariery w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od świeżej ludzkiej tkanki mózgowej.

Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej

Ludzka bariera krew-mózg selektywnie zapobiega przenikaniu hydrofilowych cząsteczek i patogenów do mózgu. Kilka patologii, w tym zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i majaczenie pooperacyjne, wiąże się ze zwiększoną przepuszczalnością bariery krew-mózg. W tym miejscu opisujemy model hodowli komórek śródbłonka w celu zbadania przepuszczalności bariery przez przenikanie drobnoustrojów.

Analiza przepuszczalności bariery krew-mózg przez przenikanie drobnoustrojów przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Ten protokół opisuje metodę tworzenia ludzkiej bariery krew-mózg (BBB) w modelu in vitro. Komórki śródbłonka i perycyty są wysiewane po obu stronach wkładki filtracyjnej (przedział krwi), a astrocyty są wysiewane w dolnej studzience (przedział mózgowy). Scharakteryzowany model wykorzystano w eksperymentach z transportem nanocząstek.

System potrójnej hodowli komórkowej modelujący ludzką barierę krew-mózg

Bariera krew-mózg (BBB) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu stabilnego i zdrowego środowiska mózgu. Dysfunkcja bariery krew-mózg jest związana z wieloma chorobami neurologicznymi. Opracowaliśmy trójwymiarowy model bariery krew-mózg pochodzący z komórek macierzystych, aby zbadać patologię naczyń mózgowych, integralność bariery krew-mózg oraz sposób, w jaki bariera krew-mózg jest zmieniona przez genetykę i chorobę.

Rekonstrukcja bariery krew-mózg in vitro w celu modelowania i terapeutycznego ukierunkowania choroby neurologicznej

Poznaj ulepszoną metodę tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro z użyciem pierwotnych komórek śródbłonka mózgu świni. Protokół zapewnia wysoką powtarzalność i szczelność barierę z wysokim TEER.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Przeglądaj więcej filmów