G2-seq: Wysokoprzepustowa technika oparta na sekwencjonowaniu do identyfikacji późno replikujących się regionów genomu
March 22nd, 2018
Opisujemy technikę łączenia cytometrii przepływowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji późno replikujących się regionów genomu.
Ogólnym celem tej procedury głębokiego sekwencjonowania DNA z komórek, które zostały posortowane przepływowo zgodnie z fazą cyklu komórkowego, jest identyfikacja regionów genomu, które replikują się bardzo późno w cyklu komórkowym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie replikacji DNA, takie jak to, które regiony genomu mają problemy z zakończeniem replikacji DNA i dlatego są szczególnie podatne na rearanżacje genomu. Główną zaletą tej techniki jest to, że mimo że jest ona bardzo prosta z eksperymentalnego punktu widzenia, zapewnia zaskakująco bogaty wgląd w dynamikę replikacji genomowej.
Na początek zaszczep 15-mililitrowe probówki zawierające osiem mililitrów YEPD interesującymi komórkami drożdży. Dopuszczalne jest podłoże syntetyczne lub bogate. Hoduj komórki przez noc przez co najmniej 12 godzin, aby zebrać je podczas ich rzeczywistego rozkładu w fazie logarytmicznej.
Następnego dnia, gdy kultury osiągną gęstość od pięciu do 15 milionów komórek na mililitr, odwiruj komórki i ponownie zawieś je w 1,5 mililitra 70% etanolu. Następnie przenieś zawiesinę do 1,6 mililitrowej probówki do mikrofuge i pozwól komórkom inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę lub przez co najmniej trzy godziny na lodzie. Po inokulacji odwiruj komórki i ponownie zawieś je w jednym mililitrze cytrynianu sodu.
Na koniec krótko poddaj komórki podwójnej sonizacji. Następnie powtórzyć cykl wirowania i ponownie zawiesić drożdże w jednym mililitrze cytrynianu sodu zawierającego RNazę. Pozwól RNazie reagować z drożdżami w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę lub przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w bloku grzewczym lub łaźni wodnej.
Po zabiegu RNazy dodać do mieszaniny 50 mikrolitrów roztworu proteinazy K i kontynuować reakcję przez godzinę w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś je w jednym mililitrze cytrynianu sodu. Następnie odwirować komórki i odessać supernatant za pomocą próżni.
Następnie w przyćmionym świetle ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze cytrynianu sodu z zielonym barwnikiem kwasu nukleinowego. Teraz inkubuj w drożdżach w ciemności przez godzinę w temperaturze pokojowej. Aby kontynuować, policz komórki za pomocą sortera komórek, korzystając z danych emisji 530 nanometrów.
Posortuj je według zawartości DNA w fazach cyklu komórkowego, G1 S, wczesnym G2 i późnym G2. Zbierz co najmniej 1,6 miliona komórek haploidalnych z każdej fazy. Natychmiast po posortowaniu komórek obracaj je przez 20 minut. Odessać supernatant i zamrozić osad w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do przechowywania.
Odkryliśmy, że najważniejszym krokiem w tej procedurze jest po prostu odwirowanie komórek natychmiast po ich zebraniu, maksymalnie godzinę po sortowaniu. Ekstrakcja ta opiera się na zestawie do ekstrakcji genomowego DNA drożdży. Zacznij od dodania 120 mikrolitrów buforu wytrawiającego i pięciu mikrolitrów enzymu litycznego drożdży.
Następnie zmiksuj komórki z mieszaniną reakcyjną za pomocą wiru i inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 do 60 minut. Następnie dodaj 120 mikrolitrów buforu do lizy i wiruj mieszaninę z dużą prędkością przez 10 do 20 sekund. Następnie dodaj 250 mikrolitrów chloroformu i przez minutę dokładnie mieszaj zawartość tubki.
Następnie wiruj rurkę z maksymalną prędkością przez dwie minuty. Następnie przenieś supernatant na kolumnę wiążącą DNA. Odwirować supernatant przez kolumnę, stosując jednominutowy cykl wirowania z maksymalną prędkością.
Aby przepłukać DNA na membranie kolumny, przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej i nałóż 300 mikrolitrów buforu do przemywania DNA. Następnie powtórz wirowanie z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.
Aby pobrać DNA, przenieś kolumnę wirową do świeżej probówki. Dodaj 60 mikrolitrów wody i odczekaj od jednej do trzech minut. Następnie odwirować kolumnę z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby wyizolować wodę zawierającą eluowane DNA.
Teraz dodaj od pięciu do 195 mikrolitrów dwuniciowego buforu DNA o wysokiej czułości zawierającego odczynnik w stężeniu od jednego do 200. Następnie zmierz fluorescencję próbki, aby obliczyć wydajność. Spodziewaj się zebrać od 10 do 50 nanogramów DNA.
Teraz użyj sonikacji, aby rozbić DNA na fragmenty, które mają od 250 do 350 par zasad. Następnie użyj standardowego zestawu, aby przygotować bibliotekę DNA i zsekwencjonować ją przy użyciu co najmniej 10 milionów 50 par zasad odczytów pojedynczych końców. Opisana procedura została wykorzystana do identyfikacji późnych miejsc replikacji w pączkujących drożdżach.
Normalne komórki porównano z tymi, którym brakowało Sir2, białka deacetylazy. Surowe dane zawierały duże skoki, głównie ze względu na obecność elementów TY. Kolce te zostały usunięte poprzez ograniczenie głębokości odczytu do 2,5-krotności mediany głębokości czerwonej dla każdej próbki.
Dane z usuniętymi kolcami zostały następnie wygładzone za pomocą przesuwanego okna o rozmiarze 20 kb. Na koniec dane zostały znormalizowane i wykreślone jako stosunki do poziomów w G1. Całkowicie niezreplikowana komórka pojawiłaby się na poziomie 0,5, a całkowicie zreplikowana komórka pojawiłaby się na poziomie jedności. W tych danych z chromosomu siódmego znaleziono dowody na znany region późnej replikacji w mutancie Sir2.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować te regiony genomu, które jako ostatnie kończą replikację DNA i które dlatego są szczególnie podatne na pęknięcia DNA i inne problemy związane z późną replikacją.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje technikę, która łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie wysoko przepustowe w celu zidentyfikowania regionów genomu replikacji późnej. Ta metoda zapewnia wgląd w dynamikę replikacji genomowej i pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie replikacji DNA.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Genomika
- Analiza cyklu komórkowego
- Replikacja DNA
Tło
- Zrozumienie regionów genomu replikacji późnej jest kluczowe dla badań nad replikacją DNA.
- Te regiony mogą być podatne na rearanjacje genomu.
- Sortowanie przepływowe pozwala na izolację komórek na podstawie fazy cyklu komórkowego.
- Wysoko przepustowe sekwencjonowanie zapewnia kompleksowy widok dynamiki genomowej.
Cel badania
- Zidentyfikować regiony genomu, które replikują się późno w cyklu komórkowym.
- Zbadać implikacje niekompletnej replikacji DNA.
- Zwiększyć zrozumienie stabilności genomu i rearanjacji.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa do sortowania komórek na podstawie fazy cyklu komórkowego.
- Głębokie sekwencjonowanie DNA z posortowanych komórek.
- Hodowla komórek drożdży w pożywce YEPD.
- Nocna inkubacja w celu uzyskania dystrybucji fazy logarytmicznej.
Główne wyniki
- Technika ujawnia bogaty widok dynamiki replikacji genomowej.
- Zidentyfikowane regiony replikacji późnej mogą wskazywać na obszary podatne na niestabilność.
- Prosty eksperymentalny projekt dostarcza istotnych informacji.
- Zapewnia ramy dla dalszych badań nad replikacją DNA.
Wnioski
- Ta metoda jest skuteczna w badaniu późnej replikacji w genomie.
- Może pomóc w identyfikacji słabych punktów w replikacji DNA.
- Podejście jest dostępne i informacyjne dla badaczy w tej dziedzinie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Identifying late-replicating genomic regions provides critical insights into chromosomal instability, a key factor in oncogenesis and aging-related pathologies. This technique enables early detection of genomic regions prone to breakage and mutation, supporting target validation in DNA damage response pathways. By linking replication timing to functional vulnerability, it enhances predictive confidence in preclinical models of genome maintenance.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of replication timing as a biomarker for genomic instability in disease models.
- Operational Value: Combines flow cytometry with sequencing to isolate and analyze phase-specific DNA populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, genome-wide replication timing profiles for comparative screening.
- Operational Value: Standardized workflow using DNA content sorting and library preparation supports assay reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals regions with elevated breakage and mutation rates, informing mechanistic de-risking of genome stability targets.
- Operational Value: Enables comparison between wild-type and mutant backgrounds (e.g., Sir2) to assess genetic modifiers of replication timing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery by providing functional genomic data that informs target selection and pathway analysis prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of replication timing effects on genomic stability and chromosomal integrity.
- Screening: Delivers normalized, spiking-corrected sequencing data enabling quantitative comparison of replication completion across conditions.
- Analytics: Uses sliding window smoothing and G1-normalized ratios to produce interpretable replication timing maps.
- Translational Research: Connects late replication to phenotypic outcomes like breakage and mutation, supporting translational biomarker relevance.
- Enterprise Reuse: Adaptable to any flow-sortable cell type, enabling cross-project application in mammalian or yeast systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in identifying mechanistically vulnerable genomic loci.
- Operational Value: Standardized, scalable workflow from cell sorting to sequencing library preparation.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by highlighting targets associated with replication stress and instability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of genome maintenance targets based on replication timing vulnerability.
Implementation Considerations
- Expertise in flow cytometry, nucleic acid extraction, and next-generation sequencing library preparation.
- Instrumentation for cell sorting, sonication, and high-throughput sequencing platforms.
- Standardization of spike removal (capping read depth) and smoothing parameters across samples.
- Adaptation considerations for varying genome sizes and cell types beyond yeast.
- Practical limitation: Requires sufficient cell numbers (1.6M per phase) and careful timing post-sort to prevent degradation.
