G2-seq: Wysokoprzepustowa technika oparta na sekwencjonowaniu do identyfikacji późno replikujących się regionów genomu
22 marca 2018
Opisujemy technikę łączenia cytometrii przepływowej i sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji późno replikujących się regionów genomu.
Ogólnym celem tej procedury głębokiego sekwencjonowania DNA z komórek, które zostały posortowane przepływowo zgodnie z fazą cyklu komórkowego, jest identyfikacja regionów genomu, które replikują się bardzo późno w cyklu komórkowym. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie replikacji DNA, takie jak to, które regiony genomu mają problemy z zakończeniem replikacji DNA i dlatego są szczególnie podatne na rearanżacje genomu. Główną zaletą tej techniki jest to, że mimo że jest ona bardzo prosta z eksperymentalnego punktu widzenia, zapewnia zaskakująco bogaty wgląd w dynamikę replikacji genomowej.
Na początek zaszczep 15-mililitrowe probówki zawierające osiem mililitrów YEPD interesującymi komórkami drożdży. Dopuszczalne jest podłoże syntetyczne lub bogate. Hoduj komórki przez noc przez co najmniej 12 godzin, aby zebrać je podczas ich rzeczywistego rozkładu w fazie logarytmicznej.
Następnego dnia, gdy kultury osiągną gęstość od pięciu do 15 milionów komórek na mililitr, odwiruj komórki i ponownie zawieś je w 1,5 mililitra 70% etanolu. Następnie przenieś zawiesinę do 1,6 mililitrowej probówki do mikrofuge i pozwól komórkom inkubować w temperaturze pokojowej przez godzinę lub przez co najmniej trzy godziny na lodzie. Po inokulacji odwiruj komórki i ponownie zawieś je w jednym mililitrze cytrynianu sodu.
Na koniec krótko poddaj komórki podwójnej sonizacji. Następnie powtórzyć cykl wirowania i ponownie zawiesić drożdże w jednym mililitrze cytrynianu sodu zawierającego RNazę. Pozwól RNazie reagować z drożdżami w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę lub przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w bloku grzewczym lub łaźni wodnej.
Po zabiegu RNazy dodać do mieszaniny 50 mikrolitrów roztworu proteinazy K i kontynuować reakcję przez godzinę w temperaturze 50 stopni Celsjusza. Następnie odwiruj komórki i ponownie zawieś je w jednym mililitrze cytrynianu sodu. Następnie odwirować komórki i odessać supernatant za pomocą próżni.
Następnie w przyćmionym świetle ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze cytrynianu sodu z zielonym barwnikiem kwasu nukleinowego. Teraz inkubuj w drożdżach w ciemności przez godzinę w temperaturze pokojowej. Aby kontynuować, policz komórki za pomocą sortera komórek, korzystając z danych emisji 530 nanometrów.
Posortuj je według zawartości DNA w fazach cyklu komórkowego, G1 S, wczesnym G2 i późnym G2. Zbierz co najmniej 1,6 miliona komórek haploidalnych z każdej fazy. Natychmiast po posortowaniu komórek obracaj je przez 20 minut. Odessać supernatant i zamrozić osad w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do przechowywania.
Odkryliśmy, że najważniejszym krokiem w tej procedurze jest po prostu odwirowanie komórek natychmiast po ich zebraniu, maksymalnie godzinę po sortowaniu. Ekstrakcja ta opiera się na zestawie do ekstrakcji genomowego DNA drożdży. Zacznij od dodania 120 mikrolitrów buforu wytrawiającego i pięciu mikrolitrów enzymu litycznego drożdży.
Następnie zmiksuj komórki z mieszaniną reakcyjną za pomocą wiru i inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 do 60 minut. Następnie dodaj 120 mikrolitrów buforu do lizy i wiruj mieszaninę z dużą prędkością przez 10 do 20 sekund. Następnie dodaj 250 mikrolitrów chloroformu i przez minutę dokładnie mieszaj zawartość tubki.
Następnie wiruj rurkę z maksymalną prędkością przez dwie minuty. Następnie przenieś supernatant na kolumnę wiążącą DNA. Odwirować supernatant przez kolumnę, stosując jednominutowy cykl wirowania z maksymalną prędkością.
Aby przepłukać DNA na membranie kolumny, przenieś kolumnę do nowej probówki zbiorczej i nałóż 300 mikrolitrów buforu do przemywania DNA. Następnie powtórz wirowanie z maksymalną prędkością przez jedną minutę. Powtórz ten krok prania jeszcze raz.
Aby pobrać DNA, przenieś kolumnę wirową do świeżej probówki. Dodaj 60 mikrolitrów wody i odczekaj od jednej do trzech minut. Następnie odwirować kolumnę z maksymalną prędkością przez 10 sekund, aby wyizolować wodę zawierającą eluowane DNA.
Teraz dodaj od pięciu do 195 mikrolitrów dwuniciowego buforu DNA o wysokiej czułości zawierającego odczynnik w stężeniu od jednego do 200. Następnie zmierz fluorescencję próbki, aby obliczyć wydajność. Spodziewaj się zebrać od 10 do 50 nanogramów DNA.
Teraz użyj sonikacji, aby rozbić DNA na fragmenty, które mają od 250 do 350 par zasad. Następnie użyj standardowego zestawu, aby przygotować bibliotekę DNA i zsekwencjonować ją przy użyciu co najmniej 10 milionów 50 par zasad odczytów pojedynczych końców. Opisana procedura została wykorzystana do identyfikacji późnych miejsc replikacji w pączkujących drożdżach.
Normalne komórki porównano z tymi, którym brakowało Sir2, białka deacetylazy. Surowe dane zawierały duże skoki, głównie ze względu na obecność elementów TY. Kolce te zostały usunięte poprzez ograniczenie głębokości odczytu do 2,5-krotności mediany głębokości czerwonej dla każdej próbki.
Dane z usuniętymi kolcami zostały następnie wygładzone za pomocą przesuwanego okna o rozmiarze 20 kb. Na koniec dane zostały znormalizowane i wykreślone jako stosunki do poziomów w G1. Całkowicie niezreplikowana komórka pojawiłaby się na poziomie 0,5, a całkowicie zreplikowana komórka pojawiłaby się na poziomie jedności. W tych danych z chromosomu siódmego znaleziono dowody na znany region późnej replikacji w mutancie Sir2.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować te regiony genomu, które jako ostatnie kończą replikację DNA i które dlatego są szczególnie podatne na pęknięcia DNA i inne problemy związane z późną replikacją.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje technikę łączącą cytometrię przepływową z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym w celu identyfikacji późno replikujących się regionów genomu. Metoda ta dostarcza wglądu w dynamikę replikacji genomowej i pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie replikacji DNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genomika
- Analiza cyklu komórkowego
- Replikacja DNA
Wprowadzenie
- Zrozumienie późno replikujących się regionów genomu jest kluczowe dla badania replikacji DNA.
- Regiony te mogą być podatne na reorganizacje genomu.
- Sortowanie przepływowe pozwala na izolację komórek na podstawie fazy cyklu komórkowego.
- Sekwencjonowanie wysokoprzepustowe zapewnia kompleksowy wgląd w dynamikę genomową.
Cel badania
- Identyfikacja regionów genomu, które replikują się późno w cyklu komórkowym.
- Zbadanie konsekwencji niepełnej replikacji DNA.
- Pogłębienie zrozumienia stabilności genomu i reorganizacji genomowych.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa w celu sortowania komórek na podstawie fazy cyklu komórkowego.
- Sekwencjonowanie głębokie DNA z posortowanych komórek.
- Hodowla komórek drożdży w pożywce YEPD.
- Inkubacja przez noc w celu uzyskania rozkładu w fazie logarytmicznej.
Główne wyniki
- Technika ta pozwala na wnikliwy wgląd w dynamikę replikacji genomu.
- Zidentyfikowane regiony replikujące się późno mogą wskazywać obszary podatne na niestabilność.
- Prosty projekt doświadczalny dostarcza istotnych informacji.
- Stanowi ramy dla dalszych badań nad replikacją DNA.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu późnej replikacji w genomie.
- Może ona pomóc w identyfikacji podatności w procesie replikacji DNA.
- Podejście to jest dostępne i dostarcza cennych informacji badaczom w tej dziedzinie.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Identyfikacja późno replikujących się regionów genomowych dostarcza kluczowych informacji na temat niestabilności chromosomowej, która jest istotnym czynnikiem w onkogenezie oraz patologiach związanych ze starzeniem się organizmu. Technika ta umożliwia wczesne wykrywanie regionów genomu podatnych na pęknięcia i mutacje, co wspiera walidację celów w szlakach odpowiedzi na uszkodzenia DNA. Poprzez powiązanie czasu replikacji z funkcjonalną podatnością, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w przedklinicznych modelach utrzymania genomu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie czasu replikacji jako biomarkera niestabilności genomicznej w modelach chorób.
- Wartość operacyjna: Łączy cytometrię przepływową z sekwencjonowaniem w celu izolacji i analizy populacji DNA specyficznych dla danej fazy.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe, genomowe profile czasu replikacji do badań przesiewowych porównawczych.
- Wartość operacyjna: Ustandaryzowany proces roboczy z wykorzystaniem sortowania według zawartości DNA i przygotowania bibliotek zapewnia powtarzalność analizy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala zidentyfikować regiony o zwiększonej częstotliwości pęknięć i mutacji, co umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka w odniesieniu do celów stabilności genomu.
- Wartość operacyjna: Umożliwia porównanie typów dzikich z mutantami (np. Sir2) w celu oceny genetycznych modyfikatorów czasu replikacji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap odkrywania leków, dostarczając funkcjonalnych danych genomicznych, które pomagają w wyborze celu i analizie szlaków sygnałowych przed identyfikacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wpływu czasu replikacji na stabilność genomową i integralność chromosomów.
- Skrining: Dostarcza znormalizowane dane z sekwencjonowania, skorygowane o wewnętrzne standardy (spiking), co umożliwia ilościowe porównanie stopnia ukończenia replikacji w różnych warunkach.
- Analityka: Wykorzystuje wygładzanie metodą przesuwnego okna oraz stosunki znormalizowane względem fazy G1 w celu opracowania interpretowalnych map czasu replikacji.
- Badania translacyjne: Łączy późną replikację z efektami fenotypowymi, takimi jak pęknięcia i mutacje, co potwierdza znaczenie w kontekście biomarkerów translacyjnych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do każdego typu komórek poddawalnych sortowaniu przepływowemu, co umożliwia zastosowanie w różnych projektach w systemach ssaków lub drożdży.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w identyfikacji locus genomowych podatnych pod względem mechanistycznym.
- Wartość operacyjna: Zstandaryzowany, skalowalny przepływ pracy, od sortowania komórek po przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania.
- Wartość strategiczna: Wsparcie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań poprzez wskazanie celów związanych ze stresem replikacyjnym i niestabilnością.
- Wpływ na portfolio: Wsparcie priorytetyzacji celów utrzymania genomu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o podatność wynikającą z czasu replikacji.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Doświadczenie w zakresie cytometrii przepływowej, ekstrakcji kwasów nukleinowych oraz przygotowania bibliotek do sekwencjonowania nowej generacji.
- Aparatura do sortowania komórek, sonikacji oraz platformy do sekwencjonowania wysokoprzepustowego.
- Standaryzacja usuwania wartości odstających (ograniczanie głębokości odczytu) i parametrów wygładzania we wszystkich próbkach.
- Kwestie adaptacji dla różnych rozmiarów genomów i typów komórek poza drożdżami.
- Ograniczenie praktyczne: Wymagana jest wystarczająca liczba komórek (1,6M na fazę) oraz precyzyjne przestrzeganie czasu po sortowaniu w celu zapobiegania degradacji.
