Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji transkrypcji, takie jak rola interakcji chromatyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona stosunkowo bezstronne uchwycenie interakcji dla miejsca zainteresowania. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje wzmacniacza promotora, może być również stosowana do identyfikacji innych typów interakcji chromatyny.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ protokół zajmuje kilka dni, a projekt startera wymaga prób i błędów oraz nietypowej orientacji startera. Aby zachować interakcje chromatyny w wybranych komórkach, usieciuj je, dodając 9,5 mililitra formaldehydu klasy 1% do mikroskopii elektronowej w PBS na 10 milionów komórek. Inkubuj komórki, kołysząc się przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Przenieś probówki reakcyjne do lodu, aby wygasić reakcję sieciowania i dodaj lodowato zimną glicynę molową do końcowego stężenia 0,125 mola i wymieszać przez delikatną inwersję. Po odwirowaniu i umyciu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, ponownie zawiesić osad w 125 mikrolitrach pięciu milimolowych EDTA z 0,5% SDS i jednym inhibitorem proteazy X. Zawiesinę komórkową inkubować na lodzie przez 10 minut.

Aby upewnić się, że liza komórek jest kompletna, wymieszaj sześć mikrolitrów komórek z sześcioma mikrolitrami błękitu trypanowego na szkiełku mikroskopowym i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Spójrz pod mikroskopem, aby zobaczyć wnętrze komórek zlizowanych na niebiesko, a niezlizowanych komórek na biało. Do pierwszego trawienia restrykcyjnego dodaj 30 mikrolitrów 10 X buforu enzymatycznego restrykcyjnego i 27 mikrolitrów 20% Triton X-100 do zawiesiny komórkowej i dostosuj całkowitą objętość do 300 mikrolitrów wodą.

Usuń podwielokrotność 15 mikrolitrów i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza jako niestrawioną kontrolę. Do pozostałej mieszaniny reakcyjnej dodać 200 jednostek enzymu restrykcyjnego jeden. Inkubować przez noc w temperaturze odpowiedniej dla enzymu w wytrząsającym bloku grzewczym z mieszaniem 900 obr./min.

Następnego dnia dodaj dodatkowe 200 jednostek enzymu i kontynuuj inkubację przez noc. Usunąć podwielokrotność 15 mikrolitrów i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza jako strawioną kontrolę. Aby określić wydajność trawienia, dodaj 82,5 mikrolitrów 10 milimolowych Tris-HCl, pH 7,5, do każdej niestrawionej i strawionej kontroli.

Dodaj 2,5 mikrolitra proteinazy K i inkubuj przez godzinę w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby odwrócić sieciowanie formaldehydu. Aby wyizolować strawione DNA, dodaj 100 mikrolitrów chloroformu fenolowego do probówki. Wymieszaj przez kilka szybkich inwersji, aby usunąć resztki zanieczyszczenia białkowe.

Wirować w temperaturze pokojowej 16, 100 G przez pięć minut. Po odwirowaniu przenieś fazę wodną do nowej probówki. Dodaj octan sodu, glikogen i 100% etanol do probówki i delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.

Inkubować w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę, aby wytrącić DNA. Odwirować probówkę w temperaturze 16, 100 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Usuń supernatant, a następnie dodaj 500 mikrolitrów 70% etanolu, aby przepłukać osad DNA.

Wirować w temperaturze pokojowej 16, 100 G przez pięć minut. Po usunięciu sklarowanego powietrza należy wysuszyć osad w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, aby usunąć resztki etanolu. Ponownie zawiesić wysuszony osad w 50 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz i przystąp do określenia wydajności trawienia za pomocą QPCR, jak opisano w protokole tekstowym.

Aby przygotować się do podwiązania, podgrzej i aktywuj enzym restrykcyjny, inkubując probówkę przez 20 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnie przenieś zawartość probówki do 50-mililitrowej stożkowej probówki i dodaj wodę wolną od nukleaz, bufor ligazy 10 X i ligazę DNA T4. Delikatnie wymieszać przez wirowanie i inkubować przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza i postępować zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Aby odwrócić sieciowanie, dodaj 15 mikrolitrów proteinazy K i inkubuj przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj 30 mikrolitrów RNazy A i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby kontynuować izolację chromatyny, dodaj siedem mililitrów chloroformu fenolowego i wymieszaj przez kilka szybkich inwersji.

Odwirować probówkę w temperaturze pokojowej o stężeniu 3 300 g przez 15 minut. Po odwirowaniu przenieś fazę wodną do nowej 50-mililitrowej probówki i dodaj wodę wolną od nukleaz, trzy molowe octan sodu, glikogen i 100% etanol. Wymieszaj zawartość i inkubuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę.

Po inkubacji odwirować probówkę w temperaturze 3 900 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Usuń supernatant, a następnie umyj osad 10 mililitrami lodowatego 70% etanolu. Wirować w 3 300 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.

Usunąć supernatant i krótko wysuszyć osad w temperaturze pokojowej. Rozpuść osad w 150 mikrolitrach 10 milimolowego Tris-HCl pH 7,5 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub kontynuować drugie trawienie restrykcyjne, podwiązanie i oczyszczanie DNA, jak opisano w protokole tekstowym.

Po oczyszczeniu DNA wykonaj QPCR przy użyciu starterów odwróconego PCR oraz barwników cyber i ROX, aby określić liczbę cykli amplifikacji dla odwrotnej amplifikacji PCR nieznanych sekwencji oddziałujących, jak opisano w tekście. Aby przygotować DNA do sekwencjonowania, należy odciąć sekwencje przynęty z trzecim trawieniem restrykcyjnym, trawiąc jeden mikrogram oczyszczonego produktu odwrotnego PCR, a także monitor enzymu restrykcyjnego. Uruchomić trawiony enzym restrykcyjny lub monitor RE na żelu agarozowym o stężeniu odpowiednim dla oczekiwanych fragmentów.

Po określeniu wydajności trawienia za pomocą elektroforezy żelowej, należy kontynuować oczyszczanie produktu metodą odwrotnego PCR i przygotowanie biblioteki sekwencjonowania, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Trzecie trawienie restrykcyjne jest ważne w tym protokole dla sekwencjonowania nowej generacji potwierdzenia chromosomów kołowych. To trawienie odcina sekwencje przynęty, które mogą ułatwić identyfikację przyciągania chromatyny.

Elektroforeza w żelu agarozowym strawionego monitora RE wykazała wystarczające trawienie produktu odwrotnego PCR trawionego równolegle. Po zakończeniu czterech sekwencjonowania C odczyty zostały przycięte i zmapowane do ludzkiego genomu referencyjnego hg38 przy użyciu pakietu oprogramowania BWA. Większość odczytów jest wyrównywana w witrynach z ograniczeniami HindiIII lub CviQ1I sąsiadujących z witrynami HindiIII zgodnie z oczekiwaniami.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że komórki są poddane lizie, a chromatyna jest wystarczająco strawiona. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunoprecypitacja chromatyny lub CHIP, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w interakcje chromatyny. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chromatyną do badania fizycznych sieci regulacyjnych.