Name: Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj zmodyfikowany protokół 4C-seq do identyfikacji interakcji chromatyny z minimalnym błędem PCR. Ta metoda umożliwia badanie regulacji transkrypcyjnej i sieci regulatorowych w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIAMS (R01AR065523).

<ol><li>Dunham, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Hoffman, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+chromatin+elements+from+ENCODE+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data.</a> Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).</li>
<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+Chromosome+Conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Capturing Chromosome Conformation.</a> Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
<li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+promoter-centered+chromatin+interactions+provide+a+topological+basis+for+transcription+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation.</a> Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).</li>
<li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circular+chromosome+conformation+capture+%284C%29+uncovers+extensive+networks+of+epigenetically+regulated+intra-+and+interchromosomal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+genetics%22%5BJournal%5D)">Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions.</a> Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).</li>
<li>Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+long-range+chromatin+interactions+for+selected+genomic+sites+using+4C-seq+technology%3A+From+fixation+to+computation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation.</a> Methods. 58 (3), 221-230 (2012).</li>
<li>Van De Werken, H. J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4C+technology%3A+Protocols+and+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">4C technology: Protocols and data analysis.</a> Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).</li>
<li>Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+Interrogation+of+3D+Genome+Topology+Using+Chromosome+Conformation+Capture+Coupled+to+High-Throughput+Sequencing+%284C-Seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Transcriptional+and+Post-Transcriptional+Gene+Expression+Regulation%22%5BJournal%5D)">Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq).</a> Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).</li>
<li>Matelot, M., Noordermeer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+High-Resolution+3D+Chromatin+Organization+Using+Circular+Chromosome+Conformation+Capture+%284C-seq%29%5BTitle%5D)+AND+%22Polycomb+Group+Proteins%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq).</a> Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).</li>
<li>Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Long-Range+Chromatin+Interactions+Using+the+Chromosome+Conformation+Capture+Sequencing+%284C-seq%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Regulatory+Networks%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method.</a> Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).</li>
<li>Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+circular+chromosome+conformation+capture+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution circular chromosome conformation capture assay.</a> Nature. 3 (2), 303-313 (2008).</li>
<li>Hagège, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+chromosome+conformation+capture+assays+%283C-qPCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR).</a> Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).</li>
<li>Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+digestion+monitors+facilitate+plasmid+construction+and+PCR+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning.</a> BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).</li>
<li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Galaxy+platform+for+accessible%2C+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses%3A+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+long-read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic4Cseq%3A+An+R%2FBioconductor+package+for+analyzing+4C-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data.</a> Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).</li>
<li>Raviram, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4C-ker%3A+A+Method+to+Reproducibly+Identify+Genome-Wide+Interactions+Captured+by+4C-Seq+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments.</a> PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).</li>
<li>Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FourCSeq%3A+analysis+of+4C+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FourCSeq: analysis of 4C sequencing data.</a> Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).</li>
<li>Williams, R. L. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fourSig+a+method+for+determining+chromosomal+interactions+in+4C-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data.</a> Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).</li>
<li>McLean, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GREAT+improves+functional+interpretation+of+cis-regulatory+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions.</a> Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).</li>
<li>Stolzenburg, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+dynamics+of+11p13+suggest+a+role+for+EHF+in+modifying+CF+lung+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity.</a> Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).</li>
<li>Meddens, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+chromatin+interactions+at+disease+associated+loci+links+novel+candidate+genes+to+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease.</a> Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).</li>
<li>Yeung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+activity+rhythms+and+tissue-specific+chromatin+interactions+explain+circadian+gene+expression+across+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs.</a> Genome research. , 207787(2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wyniki 4C mogą potencjalnie ujawnić interakcje chromatyny, które mogą zidentyfikować nieznane wcześniej elementy regulatorowe i/lub geny docelowe, które są ważne w określonym kontekście biologicznym 24,25,26. Jednak przeszkody techniczne mogą ograniczać dane uzyskane z tych eksperymentów. Prawdopodobny jest błąd PCR wynikający z nadmiernej amplifikacji matrycy w protokołach 4C. Protokół ten rozwiązuje ten problem, wykorzystując ...

Identyfikacja elementów regulatorowych dla ekspresji genów została ułatwiona dzięki projektowi Encyklopedia Elementów DNA (ENCODE), który kompleksowo opisywał aktywność funkcjonalną dla 80% ludzkiego genomu1,2. Identyfikacja miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych in vivo, nadwrażliwości na DNazę I oraz epigenetycznych modyfikacji histonów i metylacji DNA w poszczególnych typach komórek utorowała drogę do analiz funkcjonalnych potencjalnych elementów regulatorowych do ekspresji genów docelowych. Uzbrojeni w te odkrycia, stoimy przed wyzwaniem określenia funkcjonalnych wzajemnych powiązań między elementami regulatorowymi a genami. W szczególności, jaki jest związek między danym genem docelowym a jego wzmacniaczem (wzmacniaczami)? Metoda wychwytywania konformacji chromatyny (3C) bezpośrednio odpowiada na to pytanie, identyfikując fizyczne i prawdopodobnie funkcjonalne interakcje między regionem zainteresowania a potencjalnymi sekwencjami oddziałującymi poprzez przechwycone zdarzenia w utrwalonej chromatynie3. Jednak wraz ze wzrostem naszej wiedzy na temat interakcji chromatyny jasne jest, że badanie wstępnie wybranych loci kandydujących jest niewystarczające, aby zapewnić pełne zrozumienie interakcji gen-wzmacniacz. Na przykład w ramach projektu ENCODE wykorzystano wysokoprzepustową metodę wychwytywania konformacji chromosomowej (5C) w celu zbadania niewielkiej części ludzkiego genomu (1%, pilotażowego zestawu 44 loci) i opisano złożone wzajemne powiązania loci. Geny i wzmacniacze ze zidentyfikowanymi interakcjami miały średnio 2–4 różnych oddziałujących partnerów, z których wielu znajdowało się setki kilozasad dalej w przestrzeni liniowej4. Ponadto Li i wsp. wykorzystał analizę interakcji chromatyny za pomocą sekwencjonowania znaczników na sparowanym końcu (ChIA-PET) do analizy interakcji promotora całego genomu i stwierdził, że 65% miejsc wiązania polimerazy II RNA było zaangażowanych w interakcje chromatyny. Niektóre z tych interakcji skutkowały dużymi, wielogenowymi kompleksami obejmującymi setki kilozasad odległości genomowej i zawierającymi średnio 8-9 genów każdy5. Łącznie odkrycia te podkreślają potrzebę bezstronnych metod badania całego genomu do badania interakcji chromatyny. Niektóre z tych metod zostały omówione w Schmitt i wsp. 6.
Nowsze metody badania konformacji chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (Hi-C i 4C-seq) umożliwiają odkrycie nieznanych sekwencji oddziałujących z interesującym regionem6. W szczególności opracowano wychwytywanie konformacji chromosomów kołowych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (sekwencjonowanie 4C) w celu identyfikacji loci oddziałujących z sekwencją będącą przedmiotem zainteresowania w sposób bezstronny7 poprzez sekwencjonowanie DNA z przechwyconej chromatyny proksymalnie do obszaru zainteresowania w przestrzeni 3D. Krótko mówiąc, chromatyna jest utrwalana w celu zachowania natywnych interakcji białko-DNA, rozszczepiana enzymem restrykcyjnym, a następnie ligowana w rozcieńczonych warunkach, aby uchwycić biologicznie istotne "splotu" oddziałujących loci (<silna klasa = "xfig">Figura 1). Wiązania krzyżowe są odwracane w celu usunięcia białka, pozostawiając w ten sposób DNA dostępne do dodatkowego rozszczepienia za pomocą drugiego enzymu restrykcyjnego. Końcowa ligacja generuje mniejsze kręgi oddziałujących ze sobą loci. Startery do interesującej nas sekwencji są następnie wykorzystywane do generowania amplifikowanej biblioteki nieznanych sekwencji z cyklicznych fragmentów, a następnie sekwencjonowania nowej generacji.
Przedstawiony tutaj protokół, który skupia się na przygotowaniu próbki, wprowadza dwie główne zmiany do istniejących metod sekwencyjnych 4C8,9,10,11,12. Po pierwsze, wykorzystuje metodę opartą na qPCR do empirycznego określenia optymalnej liczby cykli amplifikacji dla etapów przygotowania biblioteki sekwencyjnej 4C, a tym samym łagodzi potencjalne odchylenie PCR wynikające z nadmiernej amplifikacji bibliotek. Po drugie, wykorzystuje dodatkowy etap skrótu ograniczeń w celu zmniejszenia jednorodności znanych sekwencji "przynęty", co utrudnia dokładne wywołanie bazy przez instrument sekwencjonujący, a tym samym maksymalizuje unikalną, informacyjną sekwencję w każdym odczycie. Inne protokoły omijają ten problem, łącząc wiele (12-15)8 bibliotek 4C-seq z różnymi sekwencjami przynęty i/lub miejscami ograniczeń, co jest liczbą eksperymentów, które mogą być nieosiągalne dla innych laboratoriów. Przedstawione tutaj modyfikacje pozwalają na indeksację i zebranie niewielkiej liczby eksperymentów, próbek i/lub powtórzeń w jednym tonie.

<table><tbody><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>CviQI</td><td>NEB</td><td>R0639S</td> Startery oligonukleotydowe <td></td></tr><tr><td>DNA</td><td>IDT</td><td></td><td>Do zaprojektowania przez czytelnika</td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,7 ml</td><td>MidSci</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td> <td>buforowana fosforanemThermo Fisher</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd, bez metanolu</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>JT Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td>stołowa</tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td>z chłodzeniem</tr><tr><td>Etylenodiaminotetraoctowy kwas (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2SS</td><td></td></tr><tr><td>20% roztwór SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05030</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>VWR</td><td>16004-094</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td>świetlny</tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsający blok</td><td></td><td></td><td></td>grzewczy</tr><tr><td>2 M Tris-HCl</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>351-048-101</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td> Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy <td></td></tr><tr><td>(25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>20 mg/ ml glikogenu</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-223</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>cykler qPCR</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>płytki qPCR</td><td>Thermo Fisher</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Probówki paskowe do PCR</td><td>MidSci</td><td>AVSST-FL</td><td></td></tr><tr><td>1 M Chlorek magnezu</td><td>Jakość Biologiczna</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreotol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Trifosforan adenozyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Thermo Fisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Zestaw do oczyszczania PCR</td><td></td> Spektrofotometr <td></td> Qiagen 28004 <td></td></tr><tr><td>Rozwiń system PCR z długim szablonem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td></td></tr><tr><td></td> dNTP mix Thermo <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Fisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>ROX</td><td>BioRad</td><td>172-5858</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA End-It End-Repair Kit</td><td>Lucigen</td><td>ER0720</td><td></td></tr><tr><td>LigaFast Rapid System ligacji DNA</td><td>Promega</td><td>M8221</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Thermo Fisher</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Taq Polimeraza</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td></td></tr><tr><td>UltraSieve Agaroza</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70054</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu Qiaquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4c-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

Identyfikacja elementów regulatorowych dla danego genu docelowego stanowi poważne wyzwanie techniczne ze względu na zmienność w umiejscowieniu i rozmiarach efektów elementów regulatorowych dla genu docelowego. Poczyniono pewne postępy w bioinformatycznym przewidywaniu istnienia i funkcji proksymalnych modyfikacji epigenetycznych związanych z aktywowaną ekspresją genów przy użyciu konserwatywnych miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego. Badania nad wychwytywaniem konformacji chromatyny zrewolucjonizowały naszą zdolność do odkrywania fizycznych kontaktów chromatyny między sekwencjami, a nawet w obrębie całego genomu. Wychwytywanie konformacji chromatyny kołowej w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (sekwencjonowanie 4C) ma na celu odkrycie wszystkich możliwych interakcji fizycznych chromatyny dla danej sekwencji (punktu widzenia), takiej jak gen docelowy lub wzmacniacz regulatorowy. Obecne strategie sekwencyjne 4C sekwencjonują bezpośrednio z punktu widzenia, ale wymagają jednoczesnego sekwencjonowania wielu i różnorodnych punktów widzenia, aby uniknąć wyzwań technicznych związanych z jednolitym wywoływaniem bazy (obrazowaniem) za pomocą platform sekwencjonowania nowej generacji. Taka ilość eksperymentów może nie być praktyczna dla wielu laboratoriów. W tym miejscu przedstawiamy zmodyfikowane podejście do protokołu 4C-seq, które obejmuje zarówno dodatkowe trawienie enzymu restrykcyjnego, jak i etapy amplifikacji oparte na qPCR, które mają na celu ułatwienie lepszego przechwytywania różnych odczytów sekwencji i złagodzenie potencjalnego błędu PCR. Nasza zmodyfikowana metoda 4C jest zgodna ze standardowym laboratorium biologii molekularnej do oceny architektury chromatyny.

Pierwotne ludzkie keratynocyty wyizolowano z 2–3 odrzuconych przedskórków noworodków, połączono i hodowano w pośrodku KSFM uzupełnionym o 30 µg/mL ekstraktu z przysadki bydlęcej, 0,26 ng/mL rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu naskórka oraz 0,09 mM chlorku wapnia (CaCl2) w temperaturze 37 °C i przy 5% dwutlenku węgla. Komórki rozdzielono do dwóch kolb, a w jednej z nich indukowano różnicowanie poprzez dodanie CaCl2 do stężenia końcowego 1,2 mM na 72 h. Po 10<su...

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regulacji transkrypcji, takie jak rola interakcji chromatyny. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona stosunkowo bezstronne uchwycenie interakcji dla miejsca zainteresowania. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w interakcje wzmacniacza promotora, może być również stosowana do identyfikacji innych typów interakcji chromatyny.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ protokół zajmuje kilka dni, a projekt startera wymaga prób i błędów oraz nietypowej orientacji startera. Aby zachować interakcje chromatyny w wybranych komórkach, usieciuj je, dodając 9,5 mililitra formaldehydu klasy 1% do mikroskopii elektronowej w PBS na 10 milionów komórek. Inkubuj komórki, kołysząc się przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Przenieś probówki reakcyjne do lodu, aby wygasić reakcję sieciowania i dodaj lodowato zimną glicynę molową do końcowego stężenia 0,125 mola i wymieszać przez delikatną inwersję. Po odwirowaniu i umyciu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, ponownie zawiesić osad w 125 mikrolitrach pięciu milimolowych EDTA z 0,5% SDS i jednym inhibitorem proteazy X. Zawiesinę komórkową inkubować na lodzie przez 10 minut.Aby upewnić się, że liza komórek jest kompletna, wymieszaj sześć mikrolitrów komórek z sześcioma mikrolitrami błękitu trypanowego na szkiełku mikroskopowym i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Spójrz pod mikroskopem, aby zobaczyć wnętrze komórek zlizowanych na niebiesko, a niezlizowanych komórek na biało. Do pierwszego trawienia restrykcyjnego dodaj 30 mikrolitrów 10 X buforu enzymatycznego restrykcyjnego i 27 mikrolitrów 20% Triton X-100 do zawiesiny komórkowej i dostosuj całkowitą objętość do 300 mikrolitrów wodą.Usuń podwielokrotność 15 mikrolitrów i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza jako niestrawioną kontrolę. Do pozostałej mieszaniny reakcyjnej dodać 200 jednostek enzymu restrykcyjnego jeden. Inkubować przez noc w temperaturze odpowiedniej dla enzymu w wytrząsającym bloku grzewczym z mieszaniem 900 obr./min.Następnego dnia dodaj dodatkowe 200 jednostek enzymu i kontynuuj inkubację przez noc. Usunąć podwielokrotność 15 mikrolitrów i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza jako strawioną kontrolę. Aby określić wydajność trawienia, dodaj 82,5 mikrolitrów 10 milimolowych Tris-HCl, pH 7,5, do każdej niestrawionej i strawionej kontroli.Dodaj 2,5 mikrolitra proteinazy K i inkubuj przez godzinę w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby odwrócić sieciowanie formaldehydu. Aby wyizolować strawione DNA, dodaj 100 mikrolitrów chloroformu fenolowego do probówki. Wymieszaj przez kilka szybkich inwersji, aby usunąć resztki zanieczyszczenia białkowe.Wirować w temperaturze pokojowej 16, 100 G przez pięć minut. Po odwirowaniu przenieś fazę wodną do nowej probówki. Dodaj octan sodu, glikogen i 100% etanol do probówki i delikatnie wymieszaj przez odwrócenie.Inkubować w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę, aby wytrącić DNA. Odwirować probówkę w temperaturze 16, 100 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Usuń supernatant, a następnie dodaj 500 mikrolitrów 70% etanolu, aby przepłukać osad DNA.Wirować w temperaturze pokojowej 16, 100 G przez pięć minut. Po usunięciu sklarowanego powietrza należy wysuszyć osad w temperaturze pokojowej przez dwie minuty, aby usunąć resztki etanolu. Ponownie zawiesić wysuszony osad w 50 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz i przystąp do określenia wydajności trawienia za pomocą QPCR, jak opisano w protokole tekstowym.Aby przygotować się do podwiązania, podgrzej i aktywuj enzym restrykcyjny, inkubując probówkę przez 20 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnie przenieś zawartość probówki do 50-mililitrowej stożkowej probówki i dodaj wodę wolną od nukleaz, bufor ligazy 10 X i ligazę DNA T4. Delikatnie wymieszać przez wirowanie i inkubować przez noc w temperaturze 16 stopni Celsjusza i postępować zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Aby odwrócić sieciowanie, dodaj 15 mikrolitrów proteinazy K i inkubuj przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj 30 mikrolitrów RNazy A i inkubuj przez 45 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby kontynuować izolację chromatyny, dodaj siedem mililitrów chloroformu fenolowego i wymieszaj przez kilka szybkich inwersji.Odwirować probówkę w temperaturze pokojowej o stężeniu 3 300 g przez 15 minut. Po odwirowaniu przenieś fazę wodną do nowej 50-mililitrowej probówki i dodaj wodę wolną od nukleaz, trzy molowe octan sodu, glikogen i 100% etanol. Wymieszaj zawartość i inkubuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę.Po inkubacji odwirować probówkę w temperaturze 3 900 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut. Usuń supernatant, a następnie umyj osad 10 mililitrami lodowatego 70% etanolu. Wirować w 3 300 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut.Usunąć supernatant i krótko wysuszyć osad w temperaturze pokojowej. Rozpuść osad w 150 mikrolitrach 10 milimolowego Tris-HCl pH 7,5 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub kontynuować drugie trawienie restrykcyjne, podwiązanie i oczyszczanie DNA, jak opisano w protokole tekstowym.Po oczyszczeniu DNA wykonaj QPCR przy użyciu starterów odwróconego PCR oraz barwników cyber i ROX, aby określić liczbę cykli amplifikacji dla odwrotnej amplifikacji PCR nieznanych sekwencji oddziałujących, jak opisano w tekście. Aby przygotować DNA do sekwencjonowania, należy odciąć sekwencje przynęty z trzecim trawieniem restrykcyjnym, trawiąc jeden mikrogram oczyszczonego produktu odwrotnego PCR, a także monitor enzymu restrykcyjnego. Uruchomić trawiony enzym restrykcyjny lub monitor RE na żelu agarozowym o stężeniu odpowiednim dla oczekiwanych fragmentów.Po określeniu wydajności trawienia za pomocą elektroforezy żelowej, należy kontynuować oczyszczanie produktu metodą odwrotnego PCR i przygotowanie biblioteki sekwencjonowania, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Trzecie trawienie restrykcyjne jest ważne w tym protokole dla sekwencjonowania nowej generacji potwierdzenia chromosomów kołowych. To trawienie odcina sekwencje przynęty, które mogą ułatwić identyfikację przyciągania chromatyny.Elektroforeza w żelu agarozowym strawionego monitora RE wykazała wystarczające trawienie produktu odwrotnego PCR trawionego równolegle. Po zakończeniu czterech sekwencjonowania C odczyty zostały przycięte i zmapowane do ludzkiego genomu referencyjnego hg38 przy użyciu pakietu oprogramowania BWA. Większość odczytów jest wyrównywana w witrynach z ograniczeniami HindiIII lub CviQ1I sąsiadujących z witrynami HindiIII zgodnie z oczekiwaniami.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że komórki są poddane lizie, a chromatyna jest wystarczająco strawiona. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak immunoprecypitacja chromatyny lub CHIP, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak identyfikacja czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w interakcje chromatyny. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chromatyną do badania fizycznych sieci regulacyjnych.

high-throughput-identification-gene-regulatory-sequences-using-next

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten artykuł przedstawia czułą metodę o nazwie Circle-Seq do oczyszczania pozachromosomalnego kolistego DNA (eccDNA). Metoda obejmuje oczyszczanie kolumny, usuwanie pozostałego liniowego chromosomalnego DNA, amplifikację w okręgu toczonym i sekwencjonowanie wysokoprzepustowe. Circle-Seq ma zastosowanie do badań przesiewowych eukariotycznego eccDNA w skali genomu oraz badania niestabilności genomu i zmienności liczby kopii.

Oczyszczanie całego genomu pozachromosomalnego kolistego DNA z komórek eukariotycznych

Ten protokół dostarcza badaczom nowego narzędzia do monitorowania wierności transkrypcji w wielu organizmach modelowych.

Nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych

Biblioteka CRISPR/sgRNA została zastosowana do badania genów kodujących białka. Jednak wykonalność biblioteki sgRNA w celu odkrycia funkcji granicy CTCF w regulacji genów pozostaje niezbadana. W tym miejscu opisujemy bibliotekę sgRNA specyficzną dla loci HOX, aby wyjaśnić funkcję granic CTCF w loci HOX.

PRZEKĄTNA TERENU Badania przesiewowe biblioteki CRISPR/sgRNA skoncentrowane na loci identyfikujące krytyczne granice CTCF

Koliste RNA (circRNA) to niekodujące RNA, które mogą odgrywać rolę w regulacji transkrypcji i pośredniczeniu w interakcjach między białkami. Po dokonaniu oceny różnych parametrów budowy bibliotek sekwencjonowania circRNA, opracowano protokół wykorzystujący przygotowanie biblioteki nici całkowitego RNA ze wstępną obróbką RNazy R i przedstawiono go tutaj.

Identyfikacja kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA

Informujemy o zastosowaniu ilościowego wychwytywania konformacji chromosomów, a następnie sekwencjonowania wysokoprzepustowego w ciałach embrionalnych generowanych z embrionalnych komórek macierzystych. Technika ta pozwala na identyfikację i ilościowe określenie kontaktów między domniemanymi wzmacniaczami a regionami promotorowymi danego genu podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych.

Identyfikacja kontaktów wzmacniacz-promotor w ciałach embrionalnych poprzez ilościowe wychwytywanie konformacji chromosomów (4C)

Hi-C 3.0 to ulepszony protokół Hi-C, który łączy sieciujące formaldehyd i glutaran disuccinimidylu z koktajlem enzymów restrykcyjnych DpnII i DdeI, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu i rozdzielczość wykrywania interakcji chromatyny.

Rejestrowanie konformacji chromosomów w różnych skalach długości

Ten protokół opisuje metodę Capture Hi-C używaną do charakteryzowania organizacji 3D docelowych regionów genomowych o rozmiarach mega w wysokiej rozdzielczości, w tym granic topologicznie asojacujących domen (TADs) i interakcji chromatyny dalekiego zasięgu między regulatorowymi i innymi elementami sekwencji DNA.

Rozszyfrowywanie organizacji chromatyny 3D w wysokiej rozdzielczości za pomocą Capture Hi-C

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Ekspresja genów jest regulowana przez interakcje promotorów genów z dystalnymi elementami regulatorowymi. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób niski poziom wejściowy Capture Hi-C (liCHi-C) pozwala na identyfikację tych interakcji w rzadkich typach komórek, które wcześniej były niemierzalne.

Zintegrowany proces pracy do badania architektury genomu czasoprzestrzennego skoncentrowanej na promotorze w rzadkich populacjach komórek

Istotną przeszkodą dla technologii takich jak CRISPR są zdarzenia niezgodne z celem, które mogą zakłócić działanie ważnych genów. "Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing" (CIRCLE-seq) jest techniką opracowaną w celu identyfikacji niezamierzonych miejsc rozszczepienia. Metoda ta mapuje aktywność CRISPR-Cas9 w całym genomie z wysoką czułością i bez uprzedzeń.

CIRCLE-Seq do badania edycji genów poza celem

Poznaj zmodyfikowany protokół 4C-seq do identyfikacji interakcji chromatyny z minimalnym błędem PCR. Ta metoda umożliwia badanie regulacji transkrypcyjnej i sieci regulatorowych w komórkach.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq) (Wideo) | JoVE Journal

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Przeglądaj więcej filmów