Kwantyfikacja transmigracji monocytów i tworzenia komórek piankowatych u osób z przewlekłymi stanami zapalnymi
October 17th, 2017
Opisujemy protokół pomiaru transmigracji monocytów przez monowarstwy ludzkiego śródbłonka i ich późniejszego dojrzewania do komórek piankowych. Zapewnia to wszechstronną metodę oceny właściwości miażdżycowych monocytów wyizolowanych od osób z różnymi stanami chorobowymi oraz oceny czynników we krwi, które mogą zwiększać tę skłonność.
Ogólnym celem tego testu jest ilościowe określenie zdolności monocytów z ludzkich próbek klinicznych do migracji przezśródbłonkowej i tworzenia komórek piankowatych. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie układu sercowo-naczyniowego, takie jak potencjał aterogenny komórek pochodzących od osób zagrożonych ostrą chorobą wieńcową. Główną zaletą tej techniki jest to, że próbki kliniczne mogą być mierzone zarówno ze świeżej krwi pełnej, jak i z przechowywanych kohort pacjentów.
Co więcej, tworzenie się komórek piankowatych można określić ilościowo zarówno za pomocą mikroskopii, jak i cytometrii przepływowej. Najpierw przygotuj spolimeryzowane żele kolagenowe ze świeżej zawiesiny kolagenu. Do pięciomililitrowej rurki polistyrenowej dodaj wodorotlenek sodu, następnie 10 razy M199, następnie kwas kwaśny, a na koniec dodaj kolagen włóknisty.
Dobrze wymieszaj to pipetując. Następnie podwielokrotność 50 mikrolitrów do wewnętrznych studzienek sterylnej płaskodennej 96-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Na zewnętrzne krawędzie studzienek załaduj 200 mikrolitrów jednorazowego Dulbecco PBS, aby zapobiec wysuszeniu.
Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza kolagen ulegnie polimeryzacji. Następnie nałóż żele na 150 mikrolitrów jednorazowo uzupełnionego M199 i inkubuj je, aż będą potrzebne do użycia pięć dni później. Aby rozszerzyć zmagazynowane ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej, przygotuj kolbę hodowlaną o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych z jednym mililitrem roztworu fibronektyny i inkubuj naczynie przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
W międzyczasie rozmrozić przechowywane komórki w łaźni wodnej, aby ponownie zawiesić je w M20. Po rozmrożeniu komórek odessaj resztki roztworu fibronektyny z naczynia i ułóż komórki na płytce. Następnie kultura do zbiegu, wymieniając pożywkę po dwóch do trzech dniach.
HUVEC powinny zlewać się w piątym dniu hodowli. Odłączyć je przez zasysanie supernatantu kultury z kolby, a następnie zmyć pożywkę zawierającą surowicę za pomocą dwóch do trzech mililitrów jednorazowego PBS. Następnie dodaj pięć mililitrów rozcieńczonej trypsyny i krótko inkubuj komórki w temperaturze pokojowej, delikatnie potrząsając komórkami, aż będą wyglądały na oderwane.
Następnie szybko zbierz je z pięciomililitrowymi M20 i przenieś zawiesinę do 10-mililitrowej probówki i odwirowanych komórek. Teraz ponownie zawieś ogniwa w M20 przy 200 000 ogniw na mililitr. Następnie odessać M199 z przygotowanej płytki kolagenowej i dodać 100 mikrolitrów HUVEC do każdego żelu.
Kontynuuj uprawę przez trzy dni. W ósmym dniu hodowli HUVEC aktywuj monowarstwy przed dodaniem monocytów. Po zaessaniu pożywki nakładającej dodać 100 mikrolitrów ludzkiego roztworu TNF-alfa do każdej studzienki.
Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Po inkubacji usunąć pożywkę i umyć żele dwukrotnie, używając 100 mikrolitrów M199 na pranie. Teraz dodaj 50 000 świeżo wyizolowanych monocytów lub oczyszczonych podzbiorów monocytów w 100 mikrolitrach M20 do monowarstw HUVEC.
Po dodaniu monocytów inkubuj płytkę przez godzinę, aby umożliwić transmigrację komórek do przodu. Po godzinie zbierz nietransmigrowane komórki w roztworze do płukania. Zacznij od zebrania dwóch myć EGTA, używając 100 mikrolitrów na studzienkę.
Następnie odwirować połączone roztwory myjące o stężeniu 300 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w 30 mikrolitrach PBS i policz komórki, aby określić procent komórek transmigrujących do przodu. Teraz umyj studzienki płytkowe raz M199 i dodaj 100 mikrolitrów świeżego M20 do dołków na płytki i inkubuj płytkę przez dwa dni.
Po dwóch dniach powtórz procedurę zbierania nietransmigrowanych komórek w roztworze płuczącym EGTA w celu zebrania odwrotnie transmigrowanych komórek i przystąp do analizy fenotypowej komórek. Aby fenotypowo scharakteryzować komórki związane żelem za pomocą analizy FACS, trawić komórki, dodając 100 mikrolitrów kolagenu D o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubując przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po inkubacji należy zmacerować żele za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów i inkubować je przez kolejne 20 minut, aby w pełni strawić żele.
Po całkowitym strawieniu przefiltruj i połącz strawione replikaty żeli przez nylonową siatkę o grubości 35 mikronów w probówce FACS na lodzie. Teraz przemyj przefiltrowane komórki raz zimnym roztworem do płukania FACS. Odwirować komórki i ponownie zawiesić je w 100 mikrolitrach roztworu do płukania na zimno.
Następnie wykonaj barwienie i analizę FACS zgodnie z protokołem tekstowym. Aby przeanalizować komórki za pomocą mikroskopii, najpierw wybarwić komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby odłączyć poplamione komórki, obrzeżyć dołki za pomocą igły o rozmiarze 21 z fazą skierowaną na zewnątrz.
Następnie przygotuj szkiełka do montażu żeli. Wybij dwa małe otwory w pasku taśmy dwustronnej, a następnie przymocuj taśmę do suwaka i usuń powłokę ochronną. Następnie dodaj kroplę wody do każdego otworu w taśmie.
Następnie za pomocą pęsety delikatnie przenieś dwa żele na dwa otwory i zakryj taśmę. Na koniec ostrożnie przymocuj szkiełko nakrywkowe do taśmy i przystąp do wizualizacji komórek. Po transmigracji komórki nietransmigrowane zostały policzone zgodnie z opisem.
W sumie odzyskano 15 000 komórek nietransmigrowanych, a odsetek transmigracji do przodu określono na 95%Po 48 godzinach dalszej inkubacji odzyskano 36 000 komórek transmigrowanych wstecznie, co stanowiło 12,6% transmigracji odwrotnej. Zabarwienie żeli olejem czerwonym O ujawniło komórki piany zaznaczone białymi strzałkami i makrofagi zaznaczone czarnymi strzałkami. Te monocyty traktowano utlenionym LDL podczas transmigracji, substancją używaną do indukowania tworzenia komórek piankowatych w konwencjonalnych modelach indukcji komórek piankowych.
Zagregowane dane dotyczące liczby komórek od 12 dawców potwierdziły, że inkubacja monocytów z utlenionym LDL indukowała tworzenie większej ilości komórek piankowatych niż w przypadku inkubacji monocytów z samymi natywnymi pożywkami LDL lub M199. Transmigrowane komórki analizowano również za pomocą cytometrii przepływowej. Po wykluczeniu martwych komórek, dubletów i CD45 ujemnych HUVEC, wybrano główną populację migrowanych komórek i porównano średnią intensywność fluorescencji interesujących receptorów z danymi kontrolnymi fluorescencji minus jeden lub izotypem.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać tego testu do ilościowego określania migracji przezśródbłonka monocytów i tworzenia komórek piankowatych z ludzkich próbek klinicznych. Nie zapominaj, że praca z ludzkimi próbkami klinicznymi może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy stosować dobrą technikę laboratoryjną.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół pomiaru transmigracji monocytów przez ludzkie warstwy komórek śródbłonkowych i ich dojrzewanie do komórek piennych. Ta metoda jest cennq dla oceny właściwości aterogennych monocytów u osób z różnymi stanami chorobowymi.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Badania nad układem krążenia
- Biologia komórki
- Immunologia
Tło
- Monocyty odgrywają kluczową rolę w aterosklerozie.
- Zrozumienie ich zachowania może dostarczyć wglądu w choroby układu krążenia.
- Transendotelialna migracja jest kluczowym procesem w funkcji monocytów.
- Tworzenie się komórek piennych jest istotnym wydarzeniem w aterogenezie.
Cel badania
- Aby sprecyzować transendotelialną migrację monocytów z ludzkich próbek klinicznych.
- Aby ocenić tworzenie się komórek piennych jako miarę potencjału aterogennego.
- Aby ocenić wpływ różnych czynników we krwi na zachowanie monocytów.
Stosowane metody
- Przygotowanie żeli kolagenowych z świeżej zawiesiny kolagenowej.
- Testy transmigracji za pomocą ludzkich warstw komórek śródbłonkowych.
- Ilościowa ocena tworzenia się komórek piennych za pomocą mikroskopii.
- Cytometria przepływowa do szczegółowej analizy zmian komórkowych.
Główne wyniki
- Wykazano zdolność do efektywnego pomiaru transmigracji monocytów.
- Wykazano, że próbki kliniczne mogą być analizowane zarówno ze świeżej krwi, jak i przechowywanych kohortach.
- Ustalono korelację między zachowaniem monocytów a ryzykiem aterogennym.
- Zweryfikowano zastosowanie mikroskopii i cytometrii przepływowej do ilościowego oznaczania komórek piennych.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia wszechstronną metodę badania zachowania monocytów w badaniach nad układem krążeniem.
- Może pomóc w identyfikacji osób zagrożonych ostrym zawałem mięśnia sercowego.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać tę metodę do eksploracji interwencji terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This human in vitro model enables direct assessment of monocyte transmigration and foam cell formation from clinical samples, providing a disease-relevant system for evaluating atherogenic potential in comorbid conditions such as HIV and aging. By capturing key early atherogenic events in a human cellular context, the assay supports mechanistic de-risking in cardiovascular target validation and lead identification efforts. It bridges the gap between murine model limitations and human pathophysiology, offering predictive value for prioritizing therapeutic candidates targeting monocyte-driven inflammation in atherosclerosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying monocyte transmigration and foam cell formation as functional readouts of atherogenic potential in disease-relevant human cells.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets involved in monocyte-endothelial interactions using primary monocytes from defined clinical cohorts.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating monocyte behavior with known atherogenic stimuli like oxidized LDL, enhancing confidence in target mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative outputs via microscopy or flow cytometry to assess monocyte migration and lipid-laden macrophage formation under controlled conditions.
- Operational Value: Establishes a reproducible platform for screening serum or plasma factors that modulate monocyte transmigration or foam cell maturation.
- Scalability: Compatible with 96-well format and cryopreserved samples, enabling batch processing of clinical cohorts for biomarker discovery.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant human monocytes from individuals with chronic inflammatory conditions (e.g., HIV, aging) to model human-specific atherogenic mechanisms not fully recapitulated in mice.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase monocyte behavior to preclinical validation by measuring responses to pro-atherogenic ligands like oxidized LDL.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables evaluation of how comorbid diseases alter monocyte phenotype, informing patient stratification strategies in therapeutic development.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing functional immune cell assays that inform early cardiovascular drug development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on monocyte activation states and endothelial crosstalk in atherosclerosis pathogenesis.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized readouts for evaluating compound effects on monocyte transmigration and foam cell formation.
- Analytics: Generates quantitative metrics (e.g., % transmigration, mean fluorescence intensity) enabling comparison across experimental conditions and donor groups.
- Translational Research: Uses primary human monocytes to enhance clinical relevance of mechanistic findings before preclinical investment.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular platform adaptable to various stimuli (e.g., cytokines, lipids, serum) and readouts across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by measuring functional monocyte behavior in a human disease-relevant system.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through defined steps for collagen gel preparation, endothelial monolayer formation, and cell isolation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying targets that modulate monocyte-driven atherogenic processes early in discovery.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of compounds based on effects in human monocyte assays from clinically relevant cohorts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cell isolation, endothelial cell culture, and sterile technique for handling clinical blood samples.
- Dependent on consistent sourcing of fibrinolytic collagen, endothelial cells (HUVECs), and endotoxin-free reagents for reproducible gel polymerization.
- Necessitates standardized protocols for monocyte isolation (e.g., PBMC purification) and activation status assessment across donor cohorts.
- Requires access to flow cytometry or fluorescence microscopy platforms for endpoint quantification of transmigrated and foam cells.
- Limited by donor variability and sample availability; necessitates adequate cohort sizing for statistical power in comparative studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Culturing HUVEC Monolayer on Collagen Gels
3:38
Activation of HUVEC Monolayer and Isolation/Activation of Monocytes for Transmigration
5:44
Quantification of Foam Cells and Macrophages by Microscopy or Flow Cytometry
7:42
Results: Characterizing the Transmigrating Mice
9:09
Conclusion
