Ocena wpływu związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego na rozwój funkcji sieci neuronalnej kręgowców z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest przetestowanie wpływu związków zaburzających gospodarkę hormonalną, takich jak bisfenole, na aktywność impulsową sieci neuronalnych kręgowców utworzonych na układach wieloelektrodowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwojowej i toksykologii środowiskowej, takie jak mechanizm działania toksyn środowiskowych na rozwój aktywności sieci w mózgu embrionalnym. Główną zaletą tej techniki jest to, że można teraz badać wpływ na parametry sieci neuronalnej, takie jak średnia szybkość wypalania, całkowita liczba impulsów i amplituda impulsów, a także synchronizacja.

Nasze poprzednie badanie wykazało, że EDC wpływają na słowa i zachowanie, które są bezpośrednim wyjściem sieci neuronowych, a nasz protokół ma teraz na celu zrozumienie wpływu EDC na te sieci. W dniu posiewu neuronów wyjmij fiolkę z macierzą zewnątrzkomórkową z zamrażarki o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza, spryskaj 70% etanolem i umieść na lodzie. Pamiętaj, aby rozmrozić macierz zewnątrzkomórkową na lodzie.

Nie rozmrażać w temperaturze pokojowej, ponieważ ECM polimeryzuje w temperaturze powyżej zera stopni Celsjusza. Pracuj w okapie BSL2, aby rozcieńczyć macierz zewnątrzkomórkową do 25%, dodając 300 mikrolitrów zimnej pożywki neuropodstawowej do podwielokrotności 100 mikrolitrów. Następnie za pomocą pipety P200 dodaj 100 mikrolitrów 25% roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej do środka układu wieloelektrodowego, uważając, aby nie dotknąć elektrod.

Natychmiast wyjmij ECM, pozostawiając cienką warstwę na powierzchni. Przykryj układ wieloelektrodowy i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych, aż będzie gotowy do płytki neuronów. Rozpocznij izolację neuronu pisklęcia od sterylizacji zewnętrznej skorupy jaja E7 70% etanolem.

Ważne jest, aby od tego momentu utrzymywać sterylne warunki. Upewnij się, że wszystkie narzędzia są sterylizowane 70% etanolem, a roztwory są sterylne. Pomocne jest użycie okapu preparacyjnego, ale nie jest to absolutnie konieczne w przypadku sekcji, jeśli jest ona wykonywana szybko.

Następnie po odzyskaniu i odcięciu głowy zarodka należy przeciąć okolice oczu i usunąć gałki oczne. Następnie użyj cienkich kleszczy numer pięć Dumonta i nożyczek sprężynowych, aby wykonać nacięcie po stronie brzusznej i usunąć zewnętrzne warstwy skóry, aby odsłonić przodomózgowie i osłonę wzrokową. Ostrożnie obierz i usuń błonę peel

Przenieś przodomózgowie na inną szalkę Petriego zawierającą HBSS i pokrój ją na małe kawałki o wielkości około dwóch milimetrów za pomocą nożyczek sprężynowych. Użyj sterylnej pipety transferowej, aby przenieść kawałki przodomózgowia do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Po tym, jak kawałki przodomózgowia opadną na dno probówki wirówkowej, usuń jak najwięcej HBSS.

Następnie dodaj jeden mililitr podgrzanej, 0,5% trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Użyj pipety Pasteura, aby ostrożnie usunąć trypsynę, nie naruszając kawałków tkanki. Dodaj jeden mililitr pożywki neuropodstawowej i pozwól, aby kawałki tkanki opadły na dno.

Po usunięciu pożywki i powtórzeniu prania dodaj dwa mililitry pożywki neuropodstawowej i delikatnie rozcieraj, aż nie będzie widać więcej kawałków tkanki. Rozcieńczyć zawieszone komórki w stosunku 1 do 10 podłożem neuropodstawnym. Policz żywe komórki za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego i hemocytometru.

Po zliczeniu umieść zdysocjowane ogniwa na pokrytych ECM, wieloelektrodowych układach o gęstości 2 200 komórek na milimetr kwadratowy. Następnego dnia dodaj 10 mikromolowych BPA w podłożu neurobazalnym do leczonych układów wieloelektrodowych. W dniu pobrania należy zastąpić pożywkę hodowlaną świeżą pożywką neurobazalną i umieścić matryce z powrotem w inkubatorze CO2 na co najmniej dwie godziny przed rejestracją.

Uruchom oprogramowanie do nagrywania i ustaw temperaturę matrycy wieloelektrodowej na 37 stopni Celsjusza, klikając ikonę temperatury. Ustaw parametry akwizycji, wybierając strumienie w lewym panelu okna i klikając prawym przyciskiem myszy ikonę muse. Następnie wybierz dodaj przetwarzanie i detektor szczytów i kliknij OK w wyskakującym okienku.

Detektor spajków sześć przez STD pojawi się pod nazwą pliku. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy detektor skoków, wybierz dodaj detektor przetwarzania i impulsu, a następnie kliknij OK w wyskakującym okienku. Detektor serii ISI pojawi się pod ikoną muzy.

Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy detektor serii, wybierz dodaj kompilator przetwarzania i statystyk neuronowych. W oknie podręcznym upewnij się, że wybrano nagłówek pliku, zagregowane statystyki studni i synchronizację, kliknij przycisk OK. Kompilator statystyk pojawi się poniżej. Kliknij ikonę zegara u dołu ekranu i zmień informacje w sekcji ustawień, aby nagrywać co 5.1 minuty i nagrywać przez pięć minut.

Zostanie to uruchomione natychmiast i zostanie wykonane raz. Po wyjęciu matrycy wieloelektrodowej z inkubatora należy umieścić ją na jednostce rejestrującej i zablokować na miejscu. Rozpocznij rejestrowanie aktywności sieciowej, klikając rozpocznij nagrywanie w sekcji zaplanowanego nagrywania.

Zazwyczaj wystarczy czas nagrywania wynoszący pięć minut, chociaż można uzyskać dłuższe nagrania do 10 minut. Po nagraniu włóż układ wieloelektrodowy z powrotem do inkubatora. Średnia liczba kolców jest znacznie niższa w kulturach przodomózgowia piskląt E7 poddanych działaniu BPA w porównaniu z kulturami kontrolnymi.

Średni wskaźnik synchronizacji jest znacznie niższy w kulturach przodomózgowia piskląt E7 poddanych działaniu BPA w porównaniu z kulturami kontrolnymi. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o utrzymaniu sterylnych warunków przez cały czas, nawet podczas rejestrowania aktywności kolca.

Zgodnie z tą procedurą, wpływ potencjalnych leków, takich jak leki przeciwpadaczkowe i przeciwdepresyjne, na aktywność sieci może być oceniany jako krok w kierunku zrozumienia ich mechanizmu działania. Wiele EDC ma subtelny wpływ na mózg podczas rozwoju, który objawia się zmianami w zachowaniu. Zachowanie jest bezpośrednim wyjściem podstawowej aktywności sieciowej.

Nasz protokół ma na celu przeanalizowanie wpływu tych związków na aktywność sieci.