Name: Ocena wpływu związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego na rozwój funkcji sieci neuronalnej kręgowców z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj metodę oceny wpływu bisfenoli na aktywność sieci neuronalnej zarodków kurzych z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych. Technika ta pozwala badać mechanizmy działania toksyn środowiskowych na rozwój mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie jest wspierane przez NSF (HBCU-UP Research Initiation Award, HRD 1401426 i EPSCoR EPS-0814251) oraz NIH (COBRE 1P20GM103653-01A1). K.S. jest wspierany przez stypendium z Delaware INBRE-III 6404.

Poniższy protokół został ustandaryzowany do testowania efektów ekspozycji na BPA podczas (wczesnej) embriogenezy i może być zmodyfikowany do użycia z BPS, BPF lub innym EDC w neuronach embrionalnych piskląt.
Ten protokół jest zgodny z polityką instytucjonalną Uniwersytetu Stanowego Delaware oraz polityką NIH dotyczącą ptasich embrionów. Protokół jest również zgodny z wytycznymi DSU dotyczącymi bezpieczeństwa materiałowego i chemicznego.
1. Ustawienia materiału
<ol>
	<li>Rozpuść BPA (m.w. 228.29) w 10% etanolu (v/v) w wodzie, aby uzyskać 1 mM roztwór podstawowy (0,23 mg na ml 10% etanolu). Wykonać kolejne rozcieńczenia (0,1 μM, 0,5 μM, 1 μM, 5 μM i 10 μM) w podłożu neuropodstawowym. 
	Uwaga: BPA jest toksyną środowiskową i należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z proszkiem.</li>
	<li>Inkubować jaja piskląt w dostępnym w handlu inkubatorze stołowym w temperaturze 37 °C. Inkubować jaja przez 7 dni w przypadku zarodków E7.</li>
	<li>Przygotuj MEA. Wysterylizuj wymaganą liczbę MEA, mocząc w 70% etanolu przez 3 do 4 godzin, a następnie spłucz trzykrotnie w około 10 ml sterylnej wody destylowanej w okapie BSLII. 
	UWAGA: MEA zawierają 64 nanoporowate elektrody platynowe ułożone w siatkę 8 x 8. Średnica elektrody wynosi 30 μm, a odstęp między elektrodami wynosi 200 μm. Nie używaj denaturowanego etanolu do sterylizacji MEA, ponieważ doprowadzi to do korozji MEA.</li>
	<li>Umieść MEA w sterylnym pojemniku z pokrywką (w celu utrzymania sterylnych warunków) i przenieś do inkubatora stołowego. Piecz przez co najmniej 6 godzin w temperaturze 55 °C. Ten krok ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej sterylizacji, a temperatura nie powinna przekraczać 60 °C. Zachowując sterylność, należy przenieść naczynie zawierające MEA do okapu BSLII w celu przechowywania do dalszego użycia. 
	UWAGA: Używamy szklanego naczynia do pieczenia nadającego się do pieczenia w piekarniku z plastikową pokrywką i sterylizujemy je powierzchniowo 70% etanolem i umieszczamy w okapie BSLII do wysuszenia.</li>
	<li>Podzielić roztwór ECM macierzy pozakomórkowej. Rozmrozić fiolkę w temperaturze 4 °C przez noc i zamrozić 100 μl porcji w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: ECM jest dostarczany w stanie zamrożonym. ECM nie powinien być doprowadzany do temperatury pokojowej, dopóki nie będzie gotowy do powlekania, ponieważ polimeryzuje w temperaturze pokojowej, a po polimeryzacji nie jest możliwe powlekanie. ECM bez czynników wzrostu jest preferowany, aby zapobiec dodatkowym skutkom spowodowanym nieznanymi czynnikami.</li>
	<li>Wysterylizuj wszystkie narzędzia preparacyjne (kleszcze Dumont #5, kleszcze zakrzywione, małe nożyczki i nożyczki sprężynowe) oraz naczynia preparacyjne pokryte materiałem samouszczelniającym się 70% etanolem i pozwól im wyschnąć w okapie preparacyjnym</li>.
</ol>
2. Hodowla neuronów embrionalnych piskląt i aktywność sieci
<ol>
	<li>W dniu powlekania wyjąć fiolkę ECM z zamrażarki w temperaturze -20 °C, spryskać 70% etanolem i umieścić na lodzie. Rozcieńczyć do 25%, dodając 300 μl zimnego podłoża neurobazalnego do okapu BSLII.</li>
	<li>Za pomocą pipety P200 dodaj 100 μl 25% ECM do środka MEA, uważając, aby nie dotknąć elektrod i natychmiast usuń, pozostawiając cienką warstwę na powierzchni. Przykryj MEA i umieść w inkubatorze CO2 (37 ° C i 5% CO2 ), aż będzie gotowy do płytki neuronów.</li>
	<li>Wysterylizować zewnętrzną skorupę jaja E7 (7. dzień zarodkowy, inkubowany w temperaturze 37 °C przez 7 dni) 70% etanolem. Odetnij zarodek do dolnego naczynia preparacyjnego Sylgarda zawierającego zimny sterylny roztwór zrównoważonych soli Hanka (HBSS) bez wapnia. Wytnij wokół oczu i usuń gałki oczne. Za pomocą cienkich kleszczyków DuMont #5 i nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie po stronie brzusznej i usuń zewnętrzne warstwy skóry, aby odsłonić przodomózgowie i osłonę wzrokową. Ostrożnie obierz i usuń błonę pial. Przenieś przodomózgowie na inną szalkę Petriego i pokrój je na małe kawałki o wielkości około 2 mm za pomocą nożyczek sprężynowych. 
	UWAGA: Po usunięciu błony mózgowia nie powinny być przyczepione żadne naczynia krwionośne. Jeśli to możliwe, lepiej jest przeprowadzić sekcję w sterylnym kapturze preparacyjnym, chociaż uzyskaliśmy dość dobre wyniki, gdy sekcja jest wykonywana poza kapturem, o ile narzędzia i obszar sekcji są dokładnie wysterylizowane 70% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pipety do przenoszenia zbierz kawałki przodomózgowia do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i usuń jak najwięcej HBSS po pozostawieniu kawałków przodomózgowia na dno probówki wirówkowej.</li>
	<li>Dodać 1 ml 0,05% trypsyny/EDTA (podgrzanej do 37 °C) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie usuń trypsynę, nie naruszając kawałków tkanki i dodaj 1 ml pożywki neurobazalnej. Pozwól kawałkom tkanki opaść na dno i usuń podłoże. Powtórz to pranie jeszcze raz. Ten krok polega na zmyciu trypsyny/EDTA.</li>
	<li>Dodaj 2 ml pożywki neuropodstawowej i zacznij trytuować. Tryturacja polega na pobraniu sterylnej, wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura i delikatnym przepuszczeniu przez nią tkanki kilka razy, aż nie będzie widać więcej kawałków tkanki. Jeśli po wielokrotnych przejściach pozostaną jakieś kawałki, po prostu pozostaw je do osiadania na dnie. 
	UWAGA: Unikaj spieniania podczas rozcierania - jeśli utworzy się piana, zatrzymaj się i usuń przez aspirację.</li>
	<li>Rozcieńczyć ponownie zawieszone komórki w stosunku 1:10 pożywką neurobazalną i policzyć żywe komórki za pomocą barwnika błękitu trypanowego i hemocytometru. Zmieszać 50 μl rozcieńczonych komórek z 50 μl roztworu błękitu trypanowego w probówce wirówkowej o pojemności 0,5 ml. Dodać 10 μl do hemekytometru po umieszczeniu na szkiełku nakrywkowym i policzyć jasne, przezroczyste komórki (niebieskie komórki są martwe i nie powinny być liczone). 
	UWAGA: Typowa liczba komórek z pojedynczego czujnika optycznego E7 waha się od 1 do 5 x 107 komórek/ml.</li>
	<li>Płytkować zdysocjowane komórki na MEA pokrytych ECM o gęstości 2,200 komórek/mm kwadratowy. W przypadku naszego systemu MEA przekłada się to na około 130 000 komórek na MEA. Dodaj pożywkę neuropodstawną, aby zwiększyć objętość w MEA do 1 ml i umieść MEA w inkubatorze CO2 na noc w celu przyłączenia komórek i przedłużenia neurytów (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1). 
	UWAGA: W przypadku MEA o różnych obszarach i liczbie elektrod można wypróbować różne gęstości komórek - ogólnie rzecz biorąc, wyższa gęstość komórek powoduje większą aktywność sieci, ale także prowadzi do krótszych hodowli.</li>
	<li>Następnego dnia dodać BPA do końcowego stężenia 10 μM w podłożu neurobazalnym z 1 mM zapasu wykonanego w kroku 1.1 do MEA poddanego działaniu środka terapeutycznego. Do kontrolnego MEA dodać taką samą objętość 10% roztworu etanolu w wodzie (v/v).</li>
	<li>Zastąp zużytą pożywkę pożywką neurobazalną zawierającą 10 μM BPA co drugi dzień przez 7 dni in vitro (7DIV), a następnie codziennie, wraz ze wzrostem aktywności sieci. 
	UWAGA: Wraz ze wzrostem aktywności sieci wzrasta aktywność metaboliczna, a zmiany podłoża muszą być częstsze. Nie pozwól, aby podłoże zmieniło kolor na pomarańczowy.</li>
</ol>
3. Rejestrowanie aktywności sieci neuronalnej
<ol>
	<li>W dniu pozyskania należy wymienić pożywkę hodowlaną na świeżą pożywkę neurobazalną i umieścić MEA w inkubatorze CO2 przez co najmniej 2 godziny przed rejestracją. Uruchom oprogramowanie rejestrujące i ustaw temperaturę MEA na 37 °C, klikając ikonę temperatury (rysunek uzupełniający 3.1a-b). 
	UWAGA: Nagrywanie może rozpocząć się już w 3 dniu posiewu i może trwać tak długo, jak długo kultury są żywe.</li>
	<li>Ustaw parametry akwizycji, klikając prawym przyciskiem myszy ikonę "Muse" (w sekcji Strumienie w lewym panelu okna) i wybierz "Dodaj przetwarzanie" i "Detektor spajków", a następnie kliknij OK w wyskakującym okienku. "Spike Detector (6 x STD)" pojawi się pod nazwą pliku (Rysunek uzupełniający 3.2a-b).</li>
	<li>Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy Spike Detector, wybierz "Dodaj przetwarzanie" i "Burst Detector", a następnie kliknij OK w wyskakującym okienku. "Burst Detector" (ISI) pojawi się pod ikoną Muse (Rysunek uzupełniający 3.3a-b).</li>
	<li>Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy Burst Detector, wybierz "Dodaj przetwarzanie" i "Kompilator statystyk neuronowych". W wyskakującym okienku upewnij się, że wybrano Nagłówek pliku, Zagregowane statystyki studni i Synchronizacja. Kliknij OK. "Kompilator statystyk" pojawi się poniżej (Rysunek uzupełniający 3.4a-b). 
	UWAGA: Spowoduje to ustawienie adaptacyjnego przekraczania progu (filtr 6x STD), interwał między spajkami na 100 ms z minimalną liczbą skoków na 5, wykrywanie średniej szybkości wypalania na 10 s z parametrem synchronicznym na 20 ms oraz minimalna szybkość skoków na 0,083333 skoków na minutę.</li>
	<li>Ustaw zaplanowane nagrywanie na czas nagrywania 5 minut (300 000 ms), klikając ikonę zegara na dole. Osiąga się to poprzez zmianę informacji w sekcji ustawień, aby nagrywać co 5,1 minuty i nagrywać przez 5 minut. Zostanie to uruchomione natychmiast i zostanie wykonane jednorazowo (rysunek uzupełniający 3.5).</li>
	<li>Upewnij się, że temperatura MEA osiągnęła 37 °C przed przemieszczeniem MEA. Wyjmij MEA z inkubatora, umieść go na jednostce rejestrującej i zablokuj MEA. Rozpocznij nagrywanie aktywności sieciowej, klikając przycisk rozpocznij nagrywanie w sekcji zaplanowanego nagrywania lub ikonę nagrywania w oknie "Odtwarzanie plików". Zazwyczaj czas nagrywania wynosi 5 minut (300 000 ms), chociaż można uzyskać dłuższe nagrania do 10 minut.</li>
	<li>Po nagraniu włóż MEA z powrotem do inkubatora. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność w celu utrzymania sterylności i zminimalizowania czasu przebywania MEA poza inkubatorem.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Analiza surowych danych może odbywać się w trybie offline za pomocą oprogramowania do nagrywania. Kliknij menu rozwijane Plik i otwórz nagrywanie. Wybierz plik danych pierwotnych, który ma zostać przeanalizowany. Odtwórz ponownie surowe nagrania, aby uchwycić wymagane parametry pikowania.</li>
	<li>Aby uzyskać średnią liczbę skoków, użyj modułu Detektor spajków, a aby uzyskać wskaźnik synchronizacji, użyj modułu Kompilator statystyk neuronowych.</li>
	<li>Załaduj moduły Spike Detector, Burst Detector i Statistics Compiler jak poprzednio (Sekcja 3).</li>
	<li>Z menu rozwijanych w oknach modułu Detektor szczytów, Detektor serii i Kompilator statystyk wybierz odpowiednio Lista wartości szczytowych, Lista serii sieci i Metryki zaawansowane.</li>
	<li>Kliknij przycisk nagrywania, aby rozpocząć nagrywanie pliku danych, który utworzy plik .csv w przekierowanym folderze. Parametry spajków - całkowita liczba skoków i indeks synchronizacji - zostaną zapisane w pliku .csv. 
	UWAGA: Analiza w czasie rzeczywistym podczas rejestrowania surowych danych nie jest zalecana, ponieważ może to zużywać czas procesora i zasoby obliczeniowe.</li>
</ol>

<ol><li>Anahara, R., Yoshida, M., Toyama, Y., Maekawa, M., Masayuki, K., Ishino, F., Toshimori, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16819149">Estrogen agonists, 17 beta-estradiol, bisphenol A, and diethylstilbestrol, decrease cortactin expression in the mouse testis.</a> Arch. of Histol. Cytol. 69 (2), 101-107 (2006).</li>
<li>Dodds, C. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/bmb/article-abstract/11/2/131/256818/SYNTHETIC-OESTROGENS?redirectedFrom=fulltext">Synthetic oestrogens.</a> Br. Med. Bull. 11 (2), 131-134 (1955).</li>
<li>Grignard, E., Lapenna, S., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Weak+estrogenic+transcriptional+activities+of+Bisphenol+A+and+Bisphenol+S%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Weak estrogenic transcriptional activities of Bisphenol A and Bisphenol S.</a> Toxicology In Vitro. 26 (5), 727-731 (2012).</li>
<li>Herbst, A. L., Ulfelder, H., Poskanzer, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenocarcinoma+of+the+vagina%3A+association+of+maternal+stilbestrol+therapy+with+tumor+appearance+in+young+women%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Adenocarcinoma of the vagina: association of maternal stilbestrol therapy with tumor appearance in young women.</a> New Eng. J. Med. 284, 878-881 (1971).</li>
<li>Jenkins, S., Raghuraman, N., Eltoum, I., Carpenter, M., Russo, J., Lamartiniere, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+exposure+to+bisphenol+A+increases+dimethylbenzanthracene-induced+mammary+cancer+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Persp%22%5BJournal%5D)">Oral exposure to bisphenol A increases dimethylbenzanthracene-induced mammary cancer in rats.</a> Environ Health Persp. 117 (6), 910-915 (2009).</li>
<li>Okada, A., Kai, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+estradiol-17beta+and+bisphenol+A+administered+chronically+to+mice+throughout+pregnancy+and+lactation+on+the+male+pups%27+reproductive+system%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Androl%22%5BJournal%5D)">Effects of estradiol-17beta and bisphenol A administered chronically to mice throughout pregnancy and lactation on the male pups' reproductive system.</a> Asian J Androl. 10 (2), 271-276 (2008).</li>
<li>Palanza, P., Gioiosa, L., Vom Saal, F. S., Parmigiani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+developmental+exposure+to+bisphenol+A+on+brain+and+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of developmental exposure to bisphenol A on brain and behavior in mice.</a> Environ. Res. 108 (2), 150-157 (2008).</li>
<li>Mimoto, A., Fujii, M., Usami, M., Shimamura, M., Hirabayashi, N., Kaneko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+estrogenic+hormone+receptor+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of an estrogenic hormone receptor in Caenorhabditis elegans.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 364 (4), 883-888 (2007).</li>
<li>Allard, P., Colaiacovo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+impairs+the+double-strand+break+repair+machinery+in+the+germLine+and+causes+chromosome+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A impairs the double-strand break repair machinery in the germLine and causes chromosome abnormalities.</a> Proceedings Natl. Acad. Sci. 107 (47), 20405-20410 (2010).</li>
<li>Mersha, M. D., Patel, B. M., Patel, D., Richardson, B. N., Dhillon, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+BPA+and+BPS+exposure+limited+to+early+embryogenesis+persist+to+impair+non-associative+learning+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Brain+Funct.+%3A+BBF%22%5BJournal%5D)">Effects of BPA and BPS exposure limited to early embryogenesis persist to impair non-associative learning in adults.</a> Behav. Brain Funct. : BBF. 11, 27(2015).</li>
<li>Chen, Y., Shu, L., Qiu, Z., Lee, D. Y., Settle, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+BPA-Substitute+Bisphenol+S+Causes+Unique+Alterations+of+GermLine+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exposure to the BPA-Substitute Bisphenol S Causes Unique Alterations of GermLine Function.</a> PLOS Genetics. 12 (7), 1006223(2016).</li>
<li>Shein Idelson, M., Ben-Jacob, E., Hanein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+Synchronous+Oscillations+in+Freely-Organized+Small+Neuronal+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Innate Synchronous Oscillations in Freely-Organized Small Neuronal Circuits.</a> PLoS ONE. 5 (12), 14443(2010).</li>
<li>Baltz, T., Herzog, A., Voigt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+Oscillating+Population+Activity+in+Developing+Cortical+Networks%3A+Models+and+Experimental+Results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Slow Oscillating Population Activity in Developing Cortical Networks: Models and Experimental Results.</a> J. Neurophysiol. 106 (3), 1500-1514 (2011).</li>
<li>Pettmann, B., Louis, J. C., Sensenbrenner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+Biochemical+Maturation+of+Neurones+Cultured+in+the+Absence+of+Glial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Morphological and Biochemical Maturation of Neurones Cultured in the Absence of Glial Cells.</a> Nature. 281 (5730), 378-380 (1979).</li>
<li>Zhang, H., Wu, C. Y., Wang, W., Harrington, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interneuronal+Synapses+Formed+by+Motor+Neurons+Appear+to+Be+Glutamatergic%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Interneuronal Synapses Formed by Motor Neurons Appear to Be Glutamatergic.</a> NeuroReport. 22 (16), 809-813 (2011).</li>
<li>Paiva, A. R. C., Park, I., Príncipe, J. C. <a target="_blank" href="http://www.sci.utah.edu/~arpaiva/pubs/2010b.pdf">A Comparison of Binless Spike Train Measures.</a> Neural Comp. and Appl. 19 (3), 405-419 (2010).</li>
<li>Cretu, A., Fotos, J. S., Little, B. W., Galileo, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Rat+Glioma+Growth%2C+Invasion%2C+and+Vascularization+in+a+Novel+Chick+Embryo+Brain+Tumor+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Human and Rat Glioma Growth, Invasion, and Vascularization in a Novel Chick Embryo Brain Tumor Model.</a> Clin Exp Metastasis. 22, 225-236 (2005).</li>
<li>Chiappalone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociated+cortical+networks+show+spontaneously+correlated+activity+patterns+during+in+vitro+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Dissociated cortical networks show spontaneously correlated activity patterns during in vitro development.</a> Brain Res. 93, (2006).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+recording+on+multi-electrode+array+reveals+degraded+inhibitory+connection+in+neuronal+network+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Long-term recording on multi-electrode array reveals degraded inhibitory connection in neuronal network development.</a> Biosens Bioelectron. 22 (7), 1538-1543 (2007).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Fazy szybkiego wzrostu i rozwoju, takie jak embriogeneza, są szczególnie podatne na szkodliwe działanie różnych związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego, w tym BPA. Udostępniamy szczegółowe protokoły badania skutków ekspozycji na BPA w modelu sieci neuronalnej kręgowców in vitro . Korzystając z tego protokołu, ustaliliśmy, że BPA obniża szybkość skoków, a także wskaźnik synchronizacji w rozwijających się sieciach neuronalnych (ryc. 2a-b).
Nasza metodologia została opracowana do badania ekspozycji na BPA podczas wczesnej embriogenezy i może być łatwo dostosowana do badania wpływu innych EDC. Embrionalne kultury neuronalne piskląt są stosunkowo łatwe do ustalenia w porównaniu z innymi modelami kręgowców, w tym szczura lub myszy. Co więcej, nie ma potrzeby posiadania osobnego pomieszczenia dla zwierząt – do przeprowadzenia tych testów wystarczy prosty inkubator na stole laboratoryjnym. Opisujemy zastosowanie systemu wieloelektrodowego (MEA) do oceny wpływu EDC, BPA, na aktywność sieci. Opisane tutaj protokoły mogą być stosowane w innych systemach. Krytycznym aspektem tego protokołu jest utrzymanie sterylności. Obejmuje to preparację zarodka w sterylnych warunkach - wystarczy sterylizacja narzędzi z 70% etanolem i użycie sterylnego roztworu soli Hanka Balanced Salts. Ze względu na to, że dane są zbierane przez okres kilku tygodni, kluczowe znaczenie ma utrzymanie sterylnego obchodzenia się z MEA. Raz założone kultury neuronalne mogą być hodowane długoterminowo - do trzech miesięcy - i dlatego są przydatne do badania długotrwałej ekspozycji na EDC i inne związki w sieciach neuronalnych. Innym ważnym aspektem tego protokołu jest czas od sekcji do poszycia. Optymalny czas to 30 minut, łącznie z inkubacją tkanki z trypsyną. Im dłuższy czas, tym gorsza przeżywalność komórek.
Opisujemy tutaj podstawowy protokół, który można zastosować do oceny dowolnej substancji chemicznej lub leku, który wpływa na zachowanie i funkcje neuronalne. W tym przypadku zastosowaliśmy gęstość komórek wynoszącą 2 200 komórek na mm2; Można to jednak modyfikować i stosować inne gęstości komórek. Ogólnie rzecz biorąc, odkryliśmy, że zwiększenie gęstości komórek zwiększa aktywność sieci - więcej skoków w krótszym czasie. Opisana metoda, choć bardzo przydatna w ocenie wpływu substancji chemicznych na aktywność sieci, ma jednak ograniczenia. Jednym z największych ograniczeń tej metody jest to, że te dwuwymiarowe hodowle in vitro mogą nie odzwierciedlać trójwymiarowej architektury mózgu kręgowców. Można temu zaradzić, korzystając z nagrań slice. Inną alternatywą jest zastosowanie leczenia do rozwijającego się zarodka pisklęcia za pomocą małego okienka wyciętego na szerokim końcu jaja15, wypreparowanie mózgu pod koniec schematu leczenia, wykonanie grubych skrawków na wibratomie i umieszczenie w MEA w celu zarejestrowania aktywności sieci.
Nasz protokół jest istotny, ponieważ umożliwia badanie wpływu EDC na rozwój aktywności sieci i oferuje eksplorację mechanistycznych podstaw działania tych substancji chemicznych.

4,4′-Isopropylidenediphenol, powszechnie określany jako Bisphenol-A lub BPA, jest dodatkiem przeciwutleniającym występującym w szerokiej gamie produktów na bazie poliwęglanu i żywicy epoksydowej, począwszy od papieru termicznego, płyt CD i nietłukącego szkła, a skończywszy na wewnętrznej powłoce puszek po napojach. Chociaż wiadomo, że BPA jest środkiem zaburzającym gospodarkę hormonalną, który naśladuje estrogen1, badania nad jego szkodliwymi skutkami wynikającymi z codziennego, przypadkowego narażenia na BPA pojawiły się głównie w ciągu ostatnich 10-15 lat. Konsekwencje nawet niskiego poziomu ekspozycji na BPA są najgłębsze we wczesnych okresach rozwojowych, w tym podczas embriogenezy poprzez ekspozycję matek2,3. Narażenie żeńskich zarodków w okresie życia płodowego na działanie substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego wiąże się również ze zwiększoną podatnością na choroby od raka pochwy do raka piersi4,5. Badania na zwierzętach wykazały, że narażenie na BPA prowadzi do nietypowej struktury mózgu i nieprawidłowości funkcjonalnych objawiających się w zachowaniu6. W związku z tym stosowanie BPA w butelkach do karmienia niemowląt zostało zakazane przez większość agencji regulacyjnych w Europie i Ameryce Północnej, w tym FDA. Aby zachować zgodność z przepisami, wielu producentów przestawiło się na 4,4'-sulfonylodifenol lub bisfenol-S (BPS). Biorąc pod uwagę fakt, że BPA i BPS są analogami strukturalnymi i że ostatnie doniesienia wykazały porównywalną siłę działania BPS w transkrypcji estrogenowej7, ważne jest zbadanie toksyczności tego związku w stosunku do BPA.
Tutaj opisujemy protokół do testowania wpływu BPA (i innych EDC) na sieci neuronów za pomocą modelu kręgowców, zarodka pisklęcia. Hodowle neuronów in vitro tworzą kontakty synaptyczne i generują potencjały czynnościowe (zwane również kolcami). Aktywność impulsową tych kultur można rejestrować za pomocą systemów wieloelektrodowych (MEA). Uważa się, że skoki są zsynchronizowane, gdy występują w odstępie 5 ms. Początkowa losowa aktywność impulsowa, która ostatecznie się synchronizuje, jest kluczową cechą rozwijających się sieci neuronowych8,9. Synchronizacja może być mierzona przy użyciu różnych metod, a kilka algorytmów opisano w literaturze9,10,11. W naszych analizach korzystamy z algorytmu opracowanego przez Paivę i współpracowników12, który jest zintegrowany z oprogramowaniem rejestrującym, które steruje systemem akwizycji MEA. Silna aktywność impulsowa embrionalnych neuronów piskląt stanowi prototyp do badania wpływu BPA na aktywność sieci neuronowych13. Używając układów wieloelektrodowych do rejestrowania aktywności impulsowej, zaobserwowaliśmy, że ekspozycja na BPA hamuje rozwój synchronizacji impulsów neuronalnych9,14. W tym miejscu przedstawiamy szczegółową metodologię badania ekspozycji na BPA na neurony zarodków piskląt w hodowli wraz z reprezentatywnymi wynikami dotyczącymi rozwoju synchronizacji impulsów neuronalnych w kulturach zarodkowych piskląt.

<table><tbody><tr><td>#5 foreceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Axion Muse MEA</td><td>Axion Biosystems</td><td>M64-GL1-30Pt200</td><td>Będzie nazywany systemem MEA w rękopisie</td></tr><tr><td>Axis Software</td><td>Axion Biosystems</td><td></td><td>Będzie nazywany oprogramowaniem do nagrywania w rękopisie</td></tr><tr><td>BPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239658-250g</td><td></td></tr><tr><td>zakrzywione kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-50</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Zapłodnione jaja kurze</td><td>z dowolnej lokalnej farmy lub Spafas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; 02-671-6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced Phenol Red-Free</td><td>BD Biosciences</td><td>356231</td><td>Będzie nazywany Extra Cellular Matrix (ECM) w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Neurobaseal medium</td><td>BrainBits</td><td>Nb4-500</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne Neuroexplorer</td><td>Nex Technologies</td><td>Neuroexplorer wersja 5</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; 13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki</td> precyzyjnej <td>15514-12</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia do preparowania dna Sylgard</td><td>Living Systems Instrumentaion</td><td>DD-90-S-BLK-3PK</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue dye</td><td>Fisher</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Fisher</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena wpływu związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego na rozwój funkcji sieci neuronalnej kręgowców z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Bis-fenole, takie jak bis-fenol A (BPA) i bis-fenol-S (BPS), są powszechnie stosowanymi środkami polimeryzującymi w produkcji tworzyw sztucznych i licznych produktów codziennego użytku. Zaliczane są do związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) o właściwościach podobnych do estradiolu. Długotrwałe narażenie na EDC, nawet w niskich dawkach, wiąże się z różnymi wadami zdrowotnymi, w tym rakiem, zaburzeniami zachowania i niepłodnością, z większą podatnością we wczesnych okresach rozwojowych. Aby zbadać wpływ BPA na rozwój funkcji neuronalnych, jako model wykorzystaliśmy sieć neuronalną in vitro pochodzącą z wczesnego mózgu embrionalnego piskląt. Odkryliśmy, że narażenie na BPA wpłynęło na rozwój aktywności sieciowej, w szczególności na wzrost aktywności i synchronizację. Zmiana aktywności sieci jest kluczowym ogniwem między celem molekularnym leku lub związku a jego wpływem na wynik behawioralny. Matryce wieloelektrodowe stają się coraz częściej użytecznymi narzędziami do badania wpływu leków na aktywność sieci in vitro. Na rynku dostępnych jest kilka systemów i chociaż istnieją różnice w liczbie elektrod, rodzaju i jakości matrycy elektrod oraz oprogramowania analitycznego, podstawowych zasadach i uzyskanych danych jest taka sama w różnych systemach. Chociaż obecnie ograniczają się do analizy dwuwymiarowych kultur in vitro, te systemy MEA są ulepszane, aby umożliwić aktywność sieci in vivo w wycinkach mózgu. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół ekspozycji embrionalnej oraz rejestrowania aktywności i synchronizacji sieci neuronalnej, wraz z reprezentatywnymi wynikami.

Zbadaliśmy wpływ BPA na rozwój synchronizacji w kulturach neuronalnych embrionów kurzych. Synchronizacja aktywności impulsowej jest wskaźnikiem prawidłowego rozwoju sieci neuronalnych in vitro. Kiedy dwa impulsy wystąpią w odstępie 5 ms od siebie, uznaje się je za synchroniczne. Kultury neuronalne in vitro wykazują początkowo przypadkową aktywność impulsową — impulsy występują w sposób losowy, a odstępy między impulsami wykazują rozkład normalny. Wraz z dojrzewaniem kultur aktywność impulsowa staje się bardziej zsynchronizowana, a odstępy między impulsami stają się stałe. Synchroniczną aktywność impulsową kultury ilościowo określono za pomocą analizy korelacji krzyżowej czasów wystąpienia impulsów przy użyciu oprogramowania rejestrującego12 w celu obliczenia wskaźnika synchronizacji (SI). Stwierdziliśmy, że ekspozycja na BPA niekorzystnie wpływa na rozwój aktywności sieci poprzez zmniejszenie aktywności impulsowej i wskaźnika synchronizacji (Rycina 2a i 2b). Podsumowując, wykazaliśmy, że szkodliwe skutki ekspozycji na BPA w okresie embrionalnym wpływają na rozwój zarodka, w tym na funkcje neuronalne, które można ocenić poprzez analizę rozwoju synchronizacji w hodowlach neuronów kurzych.
<img alt="Od przedmózgowia kurczaka do elektrofizjologii w układzie MEA; schemat 25% ECM traktowanego EDC." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56300/56300fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat protokołu przedstawiający etapy od preparowania przedmózgowia kurczaka, poprzez dysocjację i wysiew, aż po rejestrację aktywności sieci. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56300/56300fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy słupkowe porównujące aktywność impulsową i indeks synchronii; wyniki grupy kontrolnej vs. grupy traktowanej BPA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56300/56300fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: (A) Średnia liczba impulsów jest znacząco niższa w kulturach przedmózgowia zarodków kurzych E7 traktowanych BPA w porównaniu z kulturami kontrolnymi. Średnią liczbę impulsów wyekstrahowano za pomocą oprogramowania do rejestracji. Średnie (kontrola, 14 890 ± 949,0, N = 15 oraz BPA, 5 624 ± 465,9, N = 22) różniły się znacząco (nieparzysty test t, p &lt;0,0001). (B) Średni indeks synchronii (SI) jest znacząco niższy w kulturach przedmózgowia zarodków kurzych E7 traktowanych BPA w porównaniu z kulturami kontrolnymi. SI wyekstrahowano za pomocą modułu Neural Statistics Compiler w oprogramowaniu do rejestracji. Średnie SI (kontrola, 0,5159 ± 0,06547 N = 15 oraz BPA, 0,1140 ± 0,01840 N = 22) różniły się znacząco (nieparzysty test t, p &lt;0,0001). Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56300/56300fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Narażenie na toksyny środowiskowe może mieć dotkliwy wpływ na rozwijające się zarodki. Wiadomo, że substancje chemiczne zaburzające gospodarkę hormonalną, takie jak bisfenole, niekorzystnie wpływają na układ nerwowy. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący model sieci neuronalnej kręgowców (zarodków piskląt) in vitro w celu zbadania funkcjonalnego wpływu ekspozycji na toksyny na wczesne zarodki.

Ocena wpływu związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego na rozwój funkcji sieci neuronalnej kręgowców z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Ogólnym celem tego eksperymentalnego protokołu jest przetestowanie wpływu związków zaburzających gospodarkę hormonalną, takich jak bisfenole, na aktywność impulsową sieci neuronalnych kręgowców utworzonych na układach wieloelektrodowych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwojowej i toksykologii środowiskowej, takie jak mechanizm działania toksyn środowiskowych na rozwój aktywności sieci w mózgu embrionalnym. Główną zaletą tej techniki jest to, że można teraz badać wpływ na parametry sieci neuronalnej, takie jak średnia szybkość wypalania, całkowita liczba impulsów i amplituda impulsów, a także synchronizacja.Nasze poprzednie badanie wykazało, że EDC wpływają na słowa i zachowanie, które są bezpośrednim wyjściem sieci neuronowych, a nasz protokół ma teraz na celu zrozumienie wpływu EDC na te sieci. W dniu posiewu neuronów wyjmij fiolkę z macierzą zewnątrzkomórkową z zamrażarki o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza, spryskaj 70% etanolem i umieść na lodzie. Pamiętaj, aby rozmrozić macierz zewnątrzkomórkową na lodzie.Nie rozmrażać w temperaturze pokojowej, ponieważ ECM polimeryzuje w temperaturze powyżej zera stopni Celsjusza. Pracuj w okapie BSL2, aby rozcieńczyć macierz zewnątrzkomórkową do 25%, dodając 300 mikrolitrów zimnej pożywki neuropodstawowej do podwielokrotności 100 mikrolitrów. Następnie za pomocą pipety P200 dodaj 100 mikrolitrów 25% roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej do środka układu wieloelektrodowego, uważając, aby nie dotknąć elektrod.Natychmiast wyjmij ECM, pozostawiając cienką warstwę na powierzchni. Przykryj układ wieloelektrodowy i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych, aż będzie gotowy do płytki neuronów. Rozpocznij izolację neuronu pisklęcia od sterylizacji zewnętrznej skorupy jaja E7 70% etanolem.Ważne jest, aby od tego momentu utrzymywać sterylne warunki. Upewnij się, że wszystkie narzędzia są sterylizowane 70% etanolem, a roztwory są sterylne. Pomocne jest użycie okapu preparacyjnego, ale nie jest to absolutnie konieczne w przypadku sekcji, jeśli jest ona wykonywana szybko.Następnie po odzyskaniu i odcięciu głowy zarodka należy przeciąć okolice oczu i usunąć gałki oczne. Następnie użyj cienkich kleszczy numer pięć Dumonta i nożyczek sprężynowych, aby wykonać nacięcie po stronie brzusznej i usunąć zewnętrzne warstwy skóry, aby odsłonić przodomózgowie i osłonę wzrokową. Ostrożnie obierz i usuń błonę peel.Przenieś przodomózgowie na inną szalkę Petriego zawierającą HBSS i pokrój ją na małe kawałki o wielkości około dwóch milimetrów za pomocą nożyczek sprężynowych. Użyj sterylnej pipety transferowej, aby przenieść kawałki przodomózgowia do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Po tym, jak kawałki przodomózgowia opadną na dno probówki wirówkowej, usuń jak najwięcej HBSS.Następnie dodaj jeden mililitr podgrzanej, 0,5% trypsyny EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Użyj pipety Pasteura, aby ostrożnie usunąć trypsynę, nie naruszając kawałków tkanki. Dodaj jeden mililitr pożywki neuropodstawowej i pozwól, aby kawałki tkanki opadły na dno.Po usunięciu pożywki i powtórzeniu prania dodaj dwa mililitry pożywki neuropodstawowej i delikatnie rozcieraj, aż nie będzie widać więcej kawałków tkanki. Rozcieńczyć zawieszone komórki w stosunku 1 do 10 podłożem neuropodstawnym. Policz żywe komórki za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego i hemocytometru.Po zliczeniu umieść zdysocjowane ogniwa na pokrytych ECM, wieloelektrodowych układach o gęstości 2 200 komórek na milimetr kwadratowy. Następnego dnia dodaj 10 mikromolowych BPA w podłożu neurobazalnym do leczonych układów wieloelektrodowych. W dniu pobrania należy zastąpić pożywkę hodowlaną świeżą pożywką neurobazalną i umieścić matryce z powrotem w inkubatorze CO2 na co najmniej dwie godziny przed rejestracją.Uruchom oprogramowanie do nagrywania i ustaw temperaturę matrycy wieloelektrodowej na 37 stopni Celsjusza, klikając ikonę temperatury. Ustaw parametry akwizycji, wybierając strumienie w lewym panelu okna i klikając prawym przyciskiem myszy ikonę muse. Następnie wybierz dodaj przetwarzanie i detektor szczytów i kliknij OK w wyskakującym okienku.Detektor spajków sześć przez STD pojawi się pod nazwą pliku. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy detektor skoków, wybierz dodaj detektor przetwarzania i impulsu, a następnie kliknij OK w wyskakującym okienku. Detektor serii ISI pojawi się pod ikoną muzy.Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy detektor serii, wybierz dodaj kompilator przetwarzania i statystyk neuronowych. W oknie podręcznym upewnij się, że wybrano nagłówek pliku, zagregowane statystyki studni i synchronizację, kliknij przycisk OK. Kompilator statystyk pojawi się poniżej. Kliknij ikonę zegara u dołu ekranu i zmień informacje w sekcji ustawień, aby nagrywać co 5.1 minuty i nagrywać przez pięć minut.Zostanie to uruchomione natychmiast i zostanie wykonane raz. Po wyjęciu matrycy wieloelektrodowej z inkubatora należy umieścić ją na jednostce rejestrującej i zablokować na miejscu. Rozpocznij rejestrowanie aktywności sieciowej, klikając rozpocznij nagrywanie w sekcji zaplanowanego nagrywania.Zazwyczaj wystarczy czas nagrywania wynoszący pięć minut, chociaż można uzyskać dłuższe nagrania do 10 minut. Po nagraniu włóż układ wieloelektrodowy z powrotem do inkubatora. Średnia liczba kolców jest znacznie niższa w kulturach przodomózgowia piskląt E7 poddanych działaniu BPA w porównaniu z kulturami kontrolnymi.Średni wskaźnik synchronizacji jest znacznie niższy w kulturach przodomózgowia piskląt E7 poddanych działaniu BPA w porównaniu z kulturami kontrolnymi. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż trzy godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o utrzymaniu sterylnych warunków przez cały czas, nawet podczas rejestrowania aktywności kolca.Zgodnie z tą procedurą, wpływ potencjalnych leków, takich jak leki przeciwpadaczkowe i przeciwdepresyjne, na aktywność sieci może być oceniany jako krok w kierunku zrozumienia ich mechanizmu działania. Wiele EDC ma subtelny wpływ na mózg podczas rozwoju, który objawia się zmianami w zachowaniu. Zachowanie jest bezpośrednim wyjściem podstawowej aktywności sieciowej.Nasz protokół ma na celu przeanalizowanie wpływu tych związków na aktywność sieci.

assessment-effects-endocrine-disrupting-compounds-on-development

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten protokół dostarcza niezbędnych informacji do zakładania, pielęgnacji, rejestrowania i elektrycznego stymulowania kultur na MEA. Sieci in vitro dostarczają środków do zadawania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie sieci i komórki, co prowadzi do lepszego zrozumienia funkcji i dysfunkcji mózgu.

Jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na matrycach mikroelektrod (MEA)

Ten film demonstruje metodę izolowania neuronów z przodomózgowia zarodka pisklęcia we wczesnym stadium i hodowli ich na matrycy mikroelektrod w celu utworzenia sieci neuronalnej.

Izolowanie i hodowla neuronów embrionalnych piskląt na matrycy wieloelektrodowej

Wideo pokazuje, jak używać zestawu mikroelektrod (MEA) do rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Aktywność elektrofizjologiczna z wielodołkowego MEA zawierającego kokulturę neuronów i astrocytów jest rejestrowana w celu wykrycia potencjałów czynnościowych z wielu neuronów w sieci, potwierdzając pomyślne różnicowanie hiPSC w neurony.

Pomiar aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnych za pomocą układów mikroelektrod

Ten film demonstruje test oparty na matrycy mikroelektrod do badania aktywności sieci neuronalnej w odcinkach rdzenia kręgowego myszy. Najpierw rejestruje się aktywność elektrofizjologiczną z powierzchownego rogu grzbietowego (SDH) warstwy. Następnie wprowadza się inhibitor kanału potasowego w celu przedłużenia depolaryzacji, co skutkuje synchroniczną aktywnością rytmiczną w całej sieci neuronalnej.

Oparta na mikroelektrodach ocena sieci neuronalnych w wycinkach rdzenia kręgowego myszy

Ten film demonstruje użycie matryc wieloelektrodowych (MEA) do badania wpływu toksyn na wczesne hodowle neuronalne piskląt embrionalnych. Monitorując synchroniczną aktywność neuronów w sieci neuronalnej, MEA rejestruje dynamikę funkcjonalną sieci neuronalnej w odpowiedzi na ekspozycję na toksyny. Zmniejszona synchronizacja i szybkość odpalania po ekspozycji na toksynę podkreślają jej szkodliwy wpływ na dojrzewanie i funkcjonowanie sieci neuronowej.

Ocena wpływu toksyn na rozwój sieci neuronowej zarodka pisklęcia przy użyciu układów wieloelektrodowych

Różne powłoki elektrod wpływają na wydajność rejestracji neuronowej poprzez zmiany właściwości elektrochemicznych, chemicznych i mechanicznych. Porównanie elektrod in vitro jest stosunkowo proste, jednak porównanie odpowiedzi in vivo jest zwykle skomplikowane ze względu na różnice w odległości między elektrodami a neuronami oraz między zwierzętami. Ten artykuł zawiera solidną metodę porównywania elektrod do rejestracji neuronowej.

Metoda systematycznej oceny elektrochemicznej i elektrofizjologicznej elektrod rejestrujących działanie neuronów

Przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych w celu zbadania profili odpowiedzi neuronalnej i optymalizacji parametrów stymulacji. Takie badania mają na celu poprawę interfejsu neuron-elektroda implantów ślimakowych z korzyścią dla słuchu pacjentów, a także zużycia energii przez urządzenie.

Hodowla eksplantatów neuronów zwojów spiralnych i elektrofizjologia na układach wieloelektrodowych

Komórki neuronalne myszy hodowane na układach wieloelektrodowych wykazują zwiększoną reakcję po stymulacji elektrycznej. Protokół ten pokazuje, jak hodować neurony, jak rejestrować aktywność i jak ustanowić protokół trenowania sieci w celu reagowania na wzorce stymulacji.

Zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod

Tutaj używamy HD-MEA, aby zagłębić się w dynamikę obliczeniową dużych zespołów neuronalnych, szczególnie w hipokampie, obwodach opuszki węchowej i ludzkich sieciach neuronowych. Uchwycenie aktywności czasoprzestrzennej w połączeniu z narzędziami obliczeniowymi zapewnia wgląd w złożoność zespołu neuronalnego. Metoda ta pomaga lepiej zrozumieć funkcje mózgu, potencjalnie identyfikując biomarkery i metody leczenia zaburzeń neurologicznych.

Rejestrowanie i analizowanie multimodalnej dynamiki zespołów neuronalnych na zintegrowanej z CMOS matrycy mikroelektrod o dużej gęstości

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj metodę oceny wpływu bisfenoli na aktywność sieci neuronalnej zarodków kurzych z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych. Technika ta pozwala badać mechanizmy działania toksyn środowiskowych na rozwój mózgu.

Ocena wpływu związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego na rozwój funkcji sieci neuronalnej kręgowców z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych (Wideo) | JoVE Journal

Ocena wpływu związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego na rozwój funkcji sieci neuronalnej kręgowców z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych

Przeglądaj więcej filmów