Zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i powiązanie tkanki neuronalnej myszy E17 w celu hodowli, rejestracji i stymulacji sieci neuronalnych na układach mikroelektrod. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu dynamiki sieci, ponieważ odnoszą się one do podstawowych mechanizmów uczenia się i pamięci. Główną zaletą tej techniki jest to, że matryce mikroelektrod są w stanie nagrywać z wielu miejsc jednocześnie, a zatem mogą zapewnić lepszą rozdzielczość przestrzenną, czasową w porównaniu z bardziej tradycyjnymi szklanymi pipetami do nagrywania w jednym miejscu.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w dynamikę sieci uczenia się i pamięci, może być również wykorzystana do badania toksyczności leków lub projektowania paradygmatów dla spersonalizowanej medycyny nowej generacji. Wizualna demonstracja tego procesu ma kluczowe znaczenie, ponieważ manipulacja tkanką podczas procesu sekcji i dysocjacji jest trudna do nauczenia się po prostu czytając same protokoły. Aby przygotować matrycę, dodaj 40 do 50 mikrolitrów rozmrożonej lamininy do środka każdego MEA i 0,2 mililitra lamininy do płytek kontrolnych, używając sterylnych końcówek pipet.

Przykryj wszystkie MEA i szalki kontrolne w kapturze biologicznym i przenieś je do inkubatora w temperaturze 37 stopni Celsjusza na jedną godzinę. Po godzinie ostrożnie usuń nadmiar lamininy ze środka MEA, odsysając sterylnymi pipetami Pasteura i pozostaw powierzchnię do wyschnięcia na powietrzu przed posiewem. Następnie wlej pożywkę L-15 do czterech 100-milimetrowych szalek Petriego, przykryj je i umieść w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na około 40 do 60 minut, aż podłoże będzie miało konsystencję brei, ale nie zostanie zamrożone w postaci stałej.

Aby przygotować się do sekcji, umieść szklaną szalkę Petriego twarzą do dołu na tacy pełnej lodu. Teraz spryskaj dolną część brzucha zwierząt 70% etanolem. Za pomocą małych nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie w kształcie litery V przez skórę i podskórną tkankę tłuszczową dolnej części brzucha, przedłużając cięcie do dystalnych końców klatki piersiowej i odsłaniając macicę.

Za pomocą kleszczy ostrożnie podnieś macicę między zarodkami. Odetnij tkankę łączną nożyczkami do preparowania, aż cała macica będzie wolna. Następnie krótko przepłucz macicę 70% etanolem, aby usunąć krew i umieść ją na jednej z czterech szalek Petriego wypełnionych zimnym L-15.

Następnie uwolnij każdy zarodek z macicy i wewnętrznego woreczka zarodkowego za pomocą dwóch par kleszczy z cienką końcówką. Uwolnione zarodki umieścić w drugim naczyniu pełnym zimnego L-15, następnie przenieść głowy na trzecią szalkę Petriego, a ciała na czwartą. W biokapturze umieść klin autoklawowanej bibuły filtracyjnej na schłodzonej szklanej szalce Petriego i umieść jedną główkę zarodka na bibule filtracyjnej.

Następnie umieść krawędź tnącą dolnego nożyczki do tęczówki w podstawie czaszki, trzymając dolne ścinanie przy wewnętrznej powierzchni czaszki i z dala od mózgu, przeciąć płytkę potyliczną, a następnie wzdłuż linii środkowej między płytkami ciemieniowymi. Kontynuuj cięcie rostralnie między chrzęstnymi czołowymi płytkami czaszki. Następnie, zaczynając od środka płytki potylicznej, wykonaj prostopadłe cięcie po lewej i prawej stronie środkowego cięcia.

Następnie ostrożnie wsuń małą szpatułkę między brzuszną powierzchnię mózgu a dolną płytką czaszki, aż znajdzie się całkowicie pod mózgiem. Następnie podnieś szpatułkę do góry, aby usunąć mózg. Za pomocą czystej szpatułki najpierw usuń opuszkę węchową, a następnie wypreparuj płat czołowy w trapezoidalny wzór.

Następnie przenieś tkankę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej pożywkę magazynującą. W tej procedurze użyj dwóch sterylnych ostrzy skalpela, aby zmielić tkankę. Następnie dodaj 2,5 mililitra mieszanki papainy Dnazy do tkanki mielonej na szalce Petriego.

Delikatnie obracaj szalką Petriego, aby upewnić się, że cała tkanka jest wolna w roztworze i nie przylega do dna szalki. Następnie umieść naczynie w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut. W kapturze biologicznym użyj sterylnej pipety transferowej o szerokim otworze, aby przenieść wszystkie media i tkanki do sterylnej probówki kriogenicznej o pojemności pięciu mililitrów.

Umieść końcówkę tej samej pipety transferowej blisko dna probówki i delikatnie poćwiartuj mieszaninę od 10 do 15 razy. Następnie dodaj dwa mililitry podgrzanego DMEM 5/5 do zdysocjowanej mieszaniny komórek i zakryj probówkę wirówkową. Delikatnie wymieszaj go przez odwrócenie i odwiruj w ilości 573 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

W biokapturze wyrzuć cały supernatant bez rozbijania palety. Następnie dodaj jeden mililitr podgrzanego DMEM 5/5 do palety w probówce, aby ponownie zawiesić komórki. Użyj sterylnej pipety transferowej o małym otworze, aby rozbić paletę, delikatnie piperując w górę i w dół, aż mieszanina będzie jednorodna.

Następnie przenieś 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do probówki do mikrowirówki. Na zewnątrz kaptura biologicznego dodaj 10 mikrolitrów błękitu trypanowego do 10 mikrolitrów zawiesiny komórkowej w probówce do mikrowirówki. Następnie załaduj 10 mikrolitrów zawiesiny niebieskich komórek trypanowych na chip hemocytometru do utylizacji w celu policzenia komórek.

W kapturze biologicznym użyj sterylnej mikropipety, aby przenieść 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do środka każdej matrycy i każdej kontrolnej szalki Petriego. Następnie umieść przykryte szalki Petriego w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza na trzy do czterech godzin. Następnie delikatnie dodaj jeden mililitr podgrzanego DMEM 5/5 do każdego MEA.

Ostrożnie dodawaj pożywkę po jednej kropli na raz wokół wewnętrznych krawędzi MEA i unikaj zmywania komórek z dala od środka tablicy. Następnie umieść nasadkę zawierającą gazoprzepuszczalną membranę FEP na każdym MEA przed powrotem do inkubatora. Po dwóch dniach należy dokonać całkowitej wymiany pożywki na podgrzany DMEM+, wyciągając pożywkę z naczynia.

Ostrożnie umieść końcówkę pipety na wewnętrznej ścianie i dozuj jeden mililitr podgrzanego DMEM+Do kolejnych karmień wyciągnij 500 mikrolitrów pożywki z naczynia i ponownie dozuj 500 mikrolitrów podgrzanego DMEM+. W tej procedurze należy sprawdzać próbki naczyń co drugi dzień pod mikroskopem, aby poszukać pokrycia komórek w matrycy oraz zanieczyszczenia bakteriami lub grzybami. Przed wyjęciem kultur z inkubatora podłącz regulator temperatury i włącz system, pozwalając podgrzanej płycie podstawy przedwzmacniacza osiągnąć 35 stopni Celsjusza.

Następnie umieść zaślepioną kulturę w przedwzmacniaczu, tak aby linia w studni MEA pokrywała się z masą odniesienia. Upewnij się, że preamplifier piny są wyrównane tak, że górna część przedwzmacniacza jest zabezpieczona, a nasadka kulturowa jest nadal założona. Następnie naciśnij start w środowisku oprogramowania, aby rozpocząć wizualizację sygnałów.

W oknie głównym wybierz opcję Skoki, Wykrywanie, Automatyczne, zmień wartość odchylenia standardowego na minus pięć, a następnie kliknij przycisk Odśwież, aby zresetować próg. Po wizualizacji sygnałów kliknij przycisk Zatrzymaj, Nagraj i Odtwórz, aby rozpocząć nagrywanie. Embrionalne neurony myszy są umieszczone na 60 kanałach MEA, które pozwalają na jednoczesne rejestrowanie aktywności neuronalnej w całej sieci z każdej elektrody.

Poniżej znajduje się reprezentatywny wykres rastrowy aktywności ośmiu elektrod w odpowiedzi na stymulację przed i po treningu. Pionowa czerwona linia wskazuje czas bodźca, a czarne znaczniki wskazują potencjały czynnościowe. W treningu wstępnym następuje natychmiastowa reakcja na impuls bodźca w różnych kanałach.

Po treningu sieć wykazuje bardziej przedłużoną reakcję na aktywność, a także natychmiastową reakcję na stymulację. Pokazana tutaj jest średnia z 12 wytrenowanych sieci i 10 sieci kontrolnych, wytrenowane sieci wskazują na znacznie zmienione częstotliwości skoków. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować i powiązać tkankę neuronalną od embrionalnych myszy oraz być w stanie hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe z układów mikroelektrod.