Name: Zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę hodowli i stymulacji sieci neuronowych myszy E17 na układach mikroelektrod w celu badania dynamiki sieciowej związanej z uczeniem się i pamięcią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca została sfinansowana przez grant Narodowej Fundacji Nauki CMMI-1300007. Chcielibyśmy podziękować poprzednim członkom laboratorium, którzy pomagali w projektowaniu tych protokołów i utrzymywaniu kultur przez ponad pięć lat na Uniwersytecie George'a Masona: dr Joseph J. Pancrazio, dr Hamid Charkhkar, dr Gretchen Knaack, dr Franz Hamilton, Michael Maquera i Robert Graham.

<ol><li>Charkhkar, H., Frewin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cortical+neuronal+networks+for+in+vitro+material+biocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing.</a> Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).</li>
<li>Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+stimulation+enhances+burst+activity+in+cortical+cultures+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development.</a> Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).</li>
<li>Fröhlich, F., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+fields+may+guide+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric fields may guide neocortical network activity.</a> Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).</li>
<li>Ozen, S., Sirota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electric+stimulation+entrains+cortical+neuronal+populations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats.</a> J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).</li>
<li>Marom, S., Shahaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+learning+and+memory+in+large+random+networks+of+cortical+neurons%3A+lessons+beyond+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy.</a> Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).</li>
<li>Marom, S., Eytan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+ex-vivo+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons.</a> Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+learning+in+cultured+neuronal+networks+with+antagonists+of+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors.</a> Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synchronized+bursts+in+cultured+hippocampal+neuronal+networks+with+learning+training+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays.</a> Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).</li>
<li>le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+slow+electrical+stimuli+to+achieve+learning+in+cultured+networks+of+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons.</a> PloS one. 5 (1), 8871(2010).</li>
<li>Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+neurocomputer%3A+image+processing+and+pattern+recognition+with+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).</li>
<li>Hamilton, F., Graham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Dependent+Increase+in+Network+Response+to+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation.</a> PloS one. 10 (11), 0142399(2015).</li>
<li>Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf">https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf</a> (2016).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="https://mitpress.mit.edu/books/culturing-nerve-cells">Culturing Nerve Cells: Business Source</a>. , MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-latency+cross-and+autocorrelation+identify+clusters+of+interacting+cortical+neurons+recorded+from+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array.</a> J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).</li>
<li>Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Adaptation+in+Networks+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons.</a> J. Neurosci. 23 (28), (2003).</li>
<li>Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+properties+of+information+processing+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Statistical properties of information processing in neuronal networks.</a> Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kroki opisane w tym protokole dostarczają początkującym wystarczających szczegółów, aby umieścić swoje własne kultury neuronalne na MEA i zarejestrować aktywność sieci. Protokół ten pomoże zapewnić, że kultury prawidłowo przylegają, tworząc warstwę dywanową komórek na układach elektrod i pozostają zdrowe i wolne od zanieczyszczeń przez wiele miesięcy.
Chociaż najlepiej jest przestrzegać wszystkich części protokołu, w trakcie procesu istnieją kroki, które mają kluczowe znaczenie dla pomyślnego wyniku. Stosowanie techniki aseptycznej w całym procesie jest konieczne, aby zapobiec zanieczyszczeniu kultur. Nowe MEA muszą być hydrofilowe, jak opisano w protokole, w przeciwnym razie dojdzie do słabej adhezji komórek. Unikanie ostrego pipetowania i tworzenia się pęcherzyków powietrza podczas dysocjacji zmniejszy liczbę uszkodzonych komórek i doprowadzi do wyższej i zdrowszej wydajności. Ważne jest również przejście z DMEM 5/5 na DMEM+ po pierwszym karmieniu. DMEM 5/5 zawiera surowicę końską, która spowoduje, że komórki glejowe zdominują hodowlę, jeśli będą stosowane w sposób ciągły i spowodują słabą aktywność neuronalną, chociaż kultury będą wyglądać na zdrowe17. Kluczowe znaczenie ma również karmienie kultur zgodnie z planem i utrzymywanie ich w odpowiednich warunkach inkubacji.
Posiewanie kultur komórkowych na MEA wiąże się z wieloma zmiennymi, które mogą prowadzić do nieoptymalnych wyników. Chociaż celem jest stworzenie idealnego "dywanu" komórek, niezastosowanie się do krytycznych kroków wymienionych powyżej spowoduje słabe dojrzewanie komórek lub zanieczyszczenie. Problemem jest również słaba adhezja komórek, która różni się od słabego dojrzewania komórek. Może to być spowodowane kilkoma czynnikami, w tym złym przygotowaniem MEA przed posiewem lub użyciem starego podłoża. Jeśli użyjesz starej pożywki zawierającej stabilizowaną formę L-glutaminy i bezsurowicowego suplementu do hodowli komórek nerwowych (patrz tabela materiałów), komórki początkowo przylegają, ale następnie odlatują po około dwóch tygodniach. Jeśli zanieczyszczenie bakteryjne jest uporczywym problemem, do pożywki można dodać antybiotyk, taki jak ampicylina lub paciorkowce. Dostępne są również fungicydy do leczenia zanieczyszczenia grzybiczego. Są to niektóre z bardziej powszechnych zmiennych, które mogą wpływać na wyniki kultur. Jest wiele innych, z którymi spotkasz się dopiero po czasie i doświadczeniu.
W porównaniu z zastosowaniem mikroelektrod szklanych, technika ta doskonale nadaje się do badania dynamiki sieci i reakcji farmakologicznych. Umożliwia wykorzystanie wielu różnych wzorców stymulacji czasoprzestrzennej i pozwala na rejestrację odpowiedzi neuronalnych z wielu obszarów jednocześnie. Poprzednie grupy wykazały interesujące wyniki przy użyciu protokołów podobnych do tych opisanych tutaj18. Ponieważ kultury utrzymują się przez tygodnie lub miesiące i te same kultury mogą być ponownie wykorzystane, technika ta pozwala również na wiele eksperymentów w czasie w tej samej sieci.
Technika ta ma jednak swoje ograniczenia. MEA są nieinwazyjne. W związku z tym mogą rejestrować tylko aktywność zewnątrzkomórkową, w przeciwieństwie do zaciskania plastrów lub rejestrowania wewnątrzkomórkowego za pomocą pipet. Co więcej, ponieważ każda elektroda w matrycy jest pokryta kilkoma komórkami, nie jest możliwe rozdzielenie aktywności pojedynczego neuronu. I odwrotnie, ponieważ są to kultury in vitro , nie mogą w pełni odtworzyć właściwości strukturalnych sieci w mózgu. Ponadto aktywność może być rejestrowana tylko przez mniej niż 30 minut na raz bez jakiegoś mechanizmu zapewniającego atmosferę CO2 dla komórek w celu utrzymania równowagi pH.
Po opanowaniu tej techniki można badać manipulacje farmakologiczne ze stymulacją elektryczną lub bez niej. Można również zaprojektować i przetestować nowe protokoły do badania uczenia się i tworzenia pamięci w sieciach neuronowych, a także protokoły dla sieci hipokampa lub rdzenia kręgowego. Protokoły stymulacji i szkolenia sieci zostały już wcześniej opublikowane, a niektóre z nich zostały następnie rozwinięte w protokoły in vivo, takie jak "selektywna adaptacja" zaproponowana przez Eytana i wsp.19. Przetestowano kilka protokołów. Przedstawiono tu jednak jedynie wyniki modyfikacji procedury leczenia tężca zaproponowanej przez Ruaro w 2005 r.14,20.

Matryce mikroelektrod (MEA) mogą być używane do badania toksyczności leków, projektowania paradygmatów dla medycyny spersonalizowanej nowej generacji oraz badania dynamiki sieci w kulturach neuronalnych1. W przeciwieństwie do bardziej tradycyjnych metod, takich jak zaciskanie krosowe, które może rejestrować aktywność tylko z pojedynczej komórki, lub nagrywanie w terenie za pomocą szklanej pipety, która może rejestrować odpowiedzi zewnątrzkomórkowe z neuronów otaczających elektrodę w jednym miejscu - MEA mogą jednocześnie rejestrować z wielu miejsc w hodowli komórkowej bez konieczności żmudnego zadania umieszczania każdej elektrody z osobna. Pozwala to na badanie dynamicznych interakcji między grupami komórek, które tworzą sieć w tej hodowli. Co więcej, wpływ stymulacji elektrycznej na wzorce uruchamiania sieci2,3,4,5 i network control6 w hodowlach neuronalnych zostały dobrze udokumentowane, a liczne konfiguracje stymulacji elektrycznej i kontroli mogą być łatwo zastosowane w ramach tej samej konfiguracji eksperymentalnej, co pozwala na szeroki zakres dynamiki czasoprzestrzennej Zbadać.
Jedną z kluczowych dynamik zainteresowania w tych badaniach in vitro był stopień, w jakim sieci hodowlane wykazują właściwości wskazujące na uczenie się7,8,9,10,11,12,13. Laboratorium Peixoto wcześniej badało wpływ sygnałów treningowych o wysokiej częstotliwości, jak opisano w Ruaro i wsp.14, o sieciach mysich neuronów pokrytych układami mikroelektrod15. W tych eksperymentach sieci wykazały wzrost odpowiedzi po treningu wywołanym stymulacją elektryczną. Zwiększona reakcja została uznana za formę uczenia się poprzez rozpoznawanie bodźców, przy czym sieci reagowały w spójny sposób na zmianę bodźca po zastosowaniu określonego protokołu stymulacji (tj. treningu).
Ten protokół pokazuje, jak hodować komórki neuronalne na MEA, skutecznie rejestrować z ponad 95% podanych naczyń, ustanowić protokół do trenowania sieci reagowania na wzorce stymulacji, sortować aktywność pojedynczej jednostki, wykreślać histogramy i interpretować wyniki takich eksperymentów. Przedstawiono wykorzystanie zastrzeżonego systemu (patrz Spis materiałów) do stymulacji i rejestrowania kultur neuronalnych, a także zastosowanie pakietów oprogramowania (patrz Spis materiałów) do sortowania jednostek neuronalnych. Specjalnie zaprojektowany graficzny interfejs użytkownika (patrz tabela materiałów) służy do wizualizacji histogramów czasu po bodźcu, interwałów między impulsami i czasu trwania serii, a także do porównywania odpowiedzi komórkowej na stymulację przed i po protokole treningowym.

<table><tbody><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td>Make 4 mg / ml porcji</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Suplement bez surowicy do hodowli komórek nerwowych. Przygotuj 1 ml porcji i zamroź</td></tr><tr><td>Zlewki - szkło - 100 ml</td><td>VWR</td><td>13912-160</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki - szkło - 500 ml</td><td>VWR</td><td>10754-956</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do kciuków z końcówką</td><td>World Precision Instruments</td><td>500365-G</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka kriogeniczna - sterylna, 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka kriogeniczna - sterylna, 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-27</td><td></td></tr><tr><td>DMEM z technologią Glutamax</td><td>Gibco Life</td><td>10569-010</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych zawierająca stabilizowaną formę L-glutaminy</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003172</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2030</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td> <td>do kciuków z cienką końcówkąWorld Precision Instruments</td><td>501324-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipety szklane</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -- I (100X)</td><td>Gibco Life Technology</td><td>35050-061</td><td>Stabilizowana forma L-glutaminy stosowana jako suplement</td></tr><tr><td>Chip hemocytometru</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-101</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate EB complete</td><td>BrainBits</td><td>D00118</td><td>Ambient CO2 nośniki pamięci komórkowej</td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12195H</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz filtrujący MCS</td><td>System wielokanałowy</td><td>FA60SBC</td> MCS Stacja główna/przedwzmacniacz System wielokanałowy MEA1060-INV <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matryca mikroelektrod MCS</td><td>System wielokanałowy</td><td>60MEA200/ Zasilacz 10iR-ITO</td><td></td></tr><tr><td>MCS System</td><td>wielokanałowy</td><td>PS20W</td><td></td></tr><tr><td>Dzielnik sygnału MCS</td><td>System wielokanałowy</td><td>SDMEA</td><td></td></tr><tr><td>Generator bodźców MCS</td><td>System wielokanałowy</td><td>STG4002</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury MCS</td> System <td>wielokanałowy</td><td>TC02</td><td></td></tr><tr><td>Butelka do przechowywania nośników - szklana 500 ml</td><td>VWR</td><td>10754-818</td><td>Probówki do mikrowirówek do autoklawu</td></tr><tr><td>- 0,4 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>3485</td> Probówki do mikrowirówek <td>do autoklawu</td></tr><tr><td>- 2 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>3434ECONO</td><td>Końcówki do mikropipet do autoklawu</td></tr><tr><td>- 10 &mu; L</td><td>VWR</td><td>37001-166</td> Końcówki do <td>mikropipet do autoklawu</td></tr><tr><td>- 1 000 &mu; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13503-464</td> Końcówki do <td>mikropipet do autoklawu</td></tr><tr><td>- 200 &mu; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>37001-596</td><td>Autoklawowy</td></tr><tr><td>mikropipeter - 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Mikropipeter Thermo Fisher</td><td>4641170N</td><td></td></tr><tr><td>- 1 000 &mu; L&nbsp;</td><td>Mikropipeter Thermo Fisher</td><td>4641210N</td><td></td></tr><tr><td>- 200 &mu; L&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641230N</td><td></td></tr><tr><td>Papaina - 0,22 Filtrowany</td><td>Worthington Biochemiczny</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (Pen Strep)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego -100 mm jednorazowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>szalki Petriego -100 mm szkło</td><td>VWR</td><td>10754-788</td><td></td></tr> szalki <tr><td>Petriego -35 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS) (1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>System czyszczenia plazmowego</td><td>Wytrawianie plazmowe, Inc.</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny (PDL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenowa stożkowa probówka (wirówka) -15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowa stożkowa probówka (wirówka) -50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Maski zabiegowe</td><td>Imco</td><td>1530-imc</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4562-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza skalpela World</td><td>Precision Instruments</td><td>&nbsp; 500237-G</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki - iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>14111-G</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki - duże</td><td>World Precision Instruments</td><td>14214</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki - małe chirurgiczne</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501733-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna - sterylna, 1 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-892</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna - sterylna, 2 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna - sterylna, 25 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna - sterylna, 50 mL&nbsp;</td><td>Oprogramowanie VWR</td><td>89130-902</td><td></td></tr><tr><td>: Matlab GUI</td><td>Peixoto Lab</td><td>npeixoto@gmu.edu</td><td>Służy do analizy plików .mat.&nbsp; Dostępne za darmo na żądanie.&nbsp; Skontaktuj się z npeixoto@gmu.edu, aby poprosić o kopię.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie: MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td>N/A</td><td>Służy do akwizycji danych</td></tr><tr><td>Oprogramowanie: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/neuroexplorer</td><td>Służy do konwersji plików .nex na .mat</td></tr><tr><td>Oprogramowanie: Sortownik offline</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/offline-sorter</td><td>Służy do sortowania impulsów neuronowych i konwersji plików danych do formatu .plx, a następnie do .nex</td></tr><tr><td>Instrukcja oprogramowania: MCS MC_Rack</td><td>MultiChannel System</td><td></td><td>https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf</td></tr><tr><td>Instrukcja oprogramowania: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf Instrukcja oprogramowania: Sortownik offline</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td>www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf</td></tr><tr><td>Spatula - mała dwustronna</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 503440</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0,22 &mikro; m filtr porowy - 250 mL</td><td>Pipeta transferowa Millipore</td><td>SCGVU02RE</td><td></td></tr><tr><td>- duży otwór&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>335-1S</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa - mały otwór&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>242-1S</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman</td><td>Whatman</td><td>1442 150</td><td>Pokrój na 8 ćwiartek ciasta i autoklaw w szklanej szalce Petriego</td></tr></tbody></table>

zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Matryce mikroelektrod (MEA) mogą być używane do badania toksyczności leków, projektowania paradygmatów dla medycyny spersonalizowanej nowej generacji oraz badania dynamiki sieci w kulturach neuronalnych. W przeciwieństwie do bardziej tradycyjnych metod, takich jak zaciskanie krosowe, które mogą rejestrować aktywność tylko z jednej komórki, MEA mogą rejestrować jednocześnie z wielu miejsc w sieci, bez konieczności żmudnego umieszczania każdej elektrody z osobna. Co więcej, wiele konfiguracji sterowania i stymulacji może być łatwo zastosowanych w tej samej konfiguracji eksperymentalnej, co pozwala na zbadanie szerokiego zakresu dynamiki. Jedną z kluczowych dynamik zainteresowania w tych badaniach in vitro był stopień, w jakim sieci hodowlane wykazują właściwości wskazujące na uczenie się. Komórki neuronalne myszy hodowane na MEA wykazują zwiększoną odpowiedź po treningu wywołanym stymulacją elektryczną. Protokół ten pokazuje, jak hodować komórki neuronalne na MEA; z powodzeniem nagrywaj z ponad 95% platerowanych potraw; ustanowić protokół szkolenia sieci w zakresie reagowania na wzorce stymulacji; oraz sortować, kreślić i interpretować wyniki takich eksperymentów. Zademonstrowano zastosowanie autorskiego systemu do stymulacji i rejestracji kultur neuronalnych. Pakiety oprogramowania są również używane do sortowania jednostek neuronalnych. Specjalnie zaprojektowany graficzny interfejs użytkownika służy do wizualizacji histogramów czasu po bodźcu, interwałów między seriami i czasu trwania serii, a także do porównywania odpowiedzi komórkowej na stymulację przed i po protokole treningowym. Na koniec omówiono reprezentatywne wyniki i przyszłe kierunki tych prac badawczych.

Komórki neuronalne myszy hodowane na układach wieloelektrodowych wykazują zwiększoną reakcję po stymulacji elektrycznej. Protokół ten pokazuje, jak hodować neurony, jak rejestrować aktywność i jak ustanowić protokół trenowania sieci w celu reagowania na wzorce stymulacji.

Zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i asocjacja tkanki neuronalnej myszy w 17. dniu embrionalnym (E17), w celu hodowli, rejestracji i stymulacji sieci neuronalnych na macierzach mikroelektrod. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad dynamiką sieci w kontekście podstawowych mechanizmów uczenia się i pamięci. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że macierze mikroelektrod umożliwiają jednoczesną rejestrację z wielu miejsc, co pozwala na uzyskanie lepszej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w porównaniu do tradycyjnych rejestracji z pojedynczego miejsca za pomocą szklanych pipet.Chociaż metoda ta może dostarczyć wglądu w dynamikę sieci uczenia się i pamięci, może być również wykorzystana do badania toksyczności leków lub projektowania paradygmatów dla spersonalizowanej medycyny następnej generacji. Wizualna demonstracja tego procesu jest kluczowa, ponieważ manipulacja tkanką podczas procesu sekcji i dysocjacji jest trudna do opanowania na podstawie samego czytania protokołów. Aby przygotować matrycę, należy za pomocą sterylnych końcówek pipety dodać od 40 do 50 µL rozmrożonej lamininy do centrum każdego MEA oraz 0,2 mL lamininy do płytek kontrolnych.Przykryj wszystkie MEA oraz naczynia kontrolne w komorze z laminarnym przepływem powietrza i przenieś je do inkubatora w temperaturze 37 °C na jedną godzinę. Po upływie godziny ostrożnie usuń nadmiar lamininy z centrum MEA za pomocą ssania z użyciem sterylnych pipet Pasteura i pozostaw powierzchnię do wyschnięcia przed wysiewaniem. Następnie wlej pożywkę L-15 do czterech szalek Petriego o średnicy 100 mm, przykryj je i umieść w zamrażarce w temperaturze -20 °C na około 40 do 60 minut, aż pożywka uzyska konsystencję półpłynną, ale nie zamarznie całkowicie.Aby przygotować się do sekcji, należy położyć szklaną płytkę Petriego odwróconą do góry dnem w tacy wypełnionej lodem. Następnie spryskać dolną część brzucha zwierzęcia 70% ethanol. Używając małych nożyczek chirurgicznych, wykonać cięcie w kształcie litery V przez skórę i tkankę tłuszczową podskórną dolnego brzucha, przedłużając cięcie do dystalnych końców jamy klatki piersiowej, aby odsłonić macicę.Używając pęsety, ostrożnie unieś macicę pomiędzy zarodkami. Wycinaj tkankę łączną nożyczkami do sekcji, aż cała macica zostanie uwolniona. Następnie krótko opłucz macicę 70% etanolem w celu usunięcia krwi i umieść ją w jednej z czterech płytek Petri wypełnionych zimnym L-15.Następnie, używając dwóch par pęset z cienkimi końcówkami, wydobądź każdy embrion z macicy i wnętrza woreczka żółtkowego. Umieść uwolnione embriony w drugiej płytce wypełnionej zimnym L-15, a następnie przenieś głowy do trzeciej płytki Petriego, a ciała do czwartej. W komorze z laminarnym przepływem powietrza umieść kawałek autoklawowanej papierowej filtracji na schłodzonym szklanym podłożu z płytki Petriego, a na papierze filtracyjnym połóż jedną głowę embrionu.Następnie umieść ostrze dolnej części nożyczek irydowych u podstawy czaszki; trzymając dolne ostrze przy wewnętrznej powierzchni czaszki i z dala od mózgu, przetnij kość potyliczną, a następnie wykonaj cięcie wzdłuż linii środkowej między kośćmi ciemieniowymi. Kontynuuj cięcie w kierunku rostralnym pomiędzy chrzęstnymi płytkami czołowymi czaszki. Następnie, zaczynając od centrum kości potylicznej, wykonaj cięcia prostopadłe w lewo i w prawo od cięcia środkowego.Następnie ostrożnie wsuń małą szpatułkę między powierzchnię brzuszną mózgu a dolne płytki czaszki, aż znajdzie się ona całkowicie pod mózgiem. Następnie unieś szpatułkę, aby wyjąć mózg. Używając czystej szpatułki, usuń najpierw cebulkę węchową, a następnie wypreparuj płat czołowy w kształcie trapezu.Następnie przenieś tkankę do probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów zawierającej medium do przechowywania. W tej procedurze użyj dwóch sterylnych ostrzy skalpela, aby posiekać tkankę. Następnie dodaj 2,5 mililitra mieszaniny Dnase i papainy do posiekanej tkanki w czarce Petriego.Delikatnie zakręć szalką Petriego, aby upewnić się, że cała tkanka jest swobodna w roztworze i nie przylega do dna naczynia. Następnie umieść szalkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 15 minut. W komorze z laminarnym przepływem powietrza użyj sterylnej pipety transferowej o szerokim wylocie, aby przenieść całe medium i tkankę do sterylnej probówki kriogenicznej o pojemności 5 mL.Umieść końcówkę tej samej pipety transferowej blisko dna probówki i delikatnie pipetuj mieszaninę od 10 do 15 razy. Następnie dodaj 2 mL ogrzanego DMEM 5/5 do mieszaniny rozdzielonych komórek i zamknij probówkę wirówkową. Delikatnie wymieszaj ją przez odwracanie i wiruj przy 573 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.W komorze z laminarnym przepływem powietrza odlej cały nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu. Następnie do osadu w probówce dodaj 1 mL podgrzanego DMEM 5/5 w celu resuspensji komórek. Używając sterylnej pipety transferowej o małej średnicy otworu, rozbij osad, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół, aż do uzyskania homogenicznej mieszaniny.Następnie przenieś 10 µL zawiesiny komórkowej do probówki do mikrocentryfugi. Poza komorą z laminarnym przepływem powietrza dodaj 10 µL błękitu trypanowego do 10 µL zawiesiny komórkowej w probówce. Następnie nanieś 10 µL zawiesiny komórkowej z błękitem trypanowym na jednorazowy chip hemocytometru w celu zliczenia komórek.W komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając sterylnej mikropipety, przenieś 50 µL zawiesiny komórkowej do centrum każdego układu oraz do każdej kontrolnej szalki Petriego. Następnie umieść przykryte szalki Petriego w inkubatorze ustawionym na 37 °C na trzy do czterech godzin. Następnie delikatnie dodaj 1 mL ogrzanego DMEM 5/5 do każdego MEA.Ostrożnie dodawaj pożywkę, kropla po kropli, wzdłuż wewnętrznych krawędzi MEA, unikając wypłukania komórek z centrum macierzy. Następnie na każde MEA nałóż zatyczkę zawierającą przepuszczalną dla gazów membranę FEP przed ponownym umieszczeniem ich w inkubatorze. Po dwóch dniach przeprowadź całkowitą wymianę pożywki na ogrzane DMEM+, odsysając pożywkę z naczynia.Ostrożnie umieść końcówkę pipety na wewnętrznej ściance i nanieś 1 ml podgrzanego DMEM+. W przypadku kolejnych dokarmiań odessaj 500 µL pożywki z naczynia i ponownie nanieś 500 µL podgrzanego DMEM+. W trakcie tej procedury co drugi dzień sprawdzaj próbki w naczyniach pod mikroskopem, aby ocenić stopień pokrycia matrycy przez komórki oraz sprawdzić obecność zanieczyszczeń bakteryjnych lub grzybiczych. Przed wyjęciem kultur z inkubatora podłącz kontroler temperatury i uruchom system, aby podgrzewana płyta podstawowa przedwzmacniacza osiągnęła 35 °C.Następnie umieść zamkniętą kulturę w przedwzmacniaczu w taki sposób, aby czarna linia w studzience MEA pokrywała się z uziemieniem referencyjnym. Upewnij się, że piny przedwzmacniacza są odpowiednio dopasowane, tak aby górna część przedwzmacniacza była zabezpieczona, a nakrętka kultury wciąż pozostawała na miejscu. Następnie naciśnij przycisk start w środowisku programowym, aby rozpocząć wizualizację sygnałów.W głównym oknie wybierz Spikes, Detection, Automatic, zmień wartość odchylenia standardowego na minus pięć i kliknij Refresh, aby zresetować próg. Po zwizualizowaniu sygnałów kliknij Stop, Record i Play, aby rozpocząć rejestrację aktywności. Embrionalne neurony mysie są wysiewane na MEA z 60 kanałami, co umożliwia jednoczesną rejestrację aktywności neuronalnej w całej sieci z każdej elektrody.Poniżej przedstawiono reprezentatywny wykres rastrowy aktywności z ośmiu elektrod w odpowiedzi na stymulację przed i po treningu. Pionowa czerwona linia oznacza moment podania bodźca, a czarne znaczniki wskazują potencjały czynnościowe. Przed treningiem w obrębie kanałów występuje natychmiastowa odpowiedź na impuls stymulujący.W fazie po treningu sieć wykazuje bardziej przedłużoną odpowiedź aktywności, jak również odpowiedź natychmiastową na stymulację. Przedstawiono tutaj średnią z 12 sieci wytrenowanych oraz 10 sieci kontrolnych; sieci wytrenowane wykazują istotnie zmienione częstotliwości impulsów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować i wiązać tkankę neuronalną z embrionów myszy, a także być w stanie hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronalne z macierzy mikroelektrod.

time-dependent-increase-network-response-to-stimulation-neuronal-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten protokół dostarcza niezbędnych informacji do zakładania, pielęgnacji, rejestrowania i elektrycznego stymulowania kultur na MEA. Sieci in vitro dostarczają środków do zadawania fizjologicznie istotnych pytań na poziomie sieci i komórki, co prowadzi do lepszego zrozumienia funkcji i dysfunkcji mózgu.

Jak hodować, rejestrować i stymulować sieci neuronowe na matrycach mikroelektrod (MEA)

Niezawodna metoda badania lawin neuronalnych, czyli niezależnych od skali czasowo-przestrzennych wybuchów aktywności, które świadczą o dynamice stanu krytycznego w korze mózgu. Lawiny pojawiają się spontanicznie w rozwijających się warstwach powierzchownych hodowli kory, co umożliwia długoterminowe pomiary aktywności przy użyciu planarnych zintegrowanych matryc wieloelektrodowych (MEA) w ściśle kontrolowanych warunkach.

Rejestracja lawin neuronalnych w kulturach organotypowych za pomocą macierzy wieloelektrodowej

Wideo pokazuje, jak używać zestawu mikroelektrod (MEA) do rejestrowania aktywności elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Aktywność elektrofizjologiczna z wielodołkowego MEA zawierającego kokulturę neuronów i astrocytów jest rejestrowana w celu wykrycia potencjałów czynnościowych z wielu neuronów w sieci, potwierdzając pomyślne różnicowanie hiPSC w neurony.

Pomiar aktywności elektrofizjologicznej sieci neuronalnych za pomocą układów mikroelektrod

Ten film demonstruje procedurę użycia matrycy wieloelektrodowej (MEA) do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D. Metoda ta pozwala zrozumieć dynamikę sieci neuronowych i aktywność impulsów sieci synaptycznych w sferach 3D.

Wykorzystanie matryc wieloelektrodowych do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D

W tej pracy nowatorski model eksperymentalny, w którym hodowle neuronów 3D są sprzężone z płaskimi matrycami mikroelektrod (MEAs), presented. 3D sieci są budowane przez umieszczanie neuronów w rusztowaniu wykonanym ze szklanych mikrokulek, na których neurony rosną i tworzą połączone ze sobą struktury 3D.

Łączenie kultur neuronalnych 3D z matrycami mikroelektrod: innowacyjny model eksperymentalny in vitro

Przedstawiamy protokół hodowli pierwotnych eksplantatów neuronów spiralnych myszy na matrycach wieloelektrodowych w celu zbadania profili odpowiedzi neuronalnej i optymalizacji parametrów stymulacji. Takie badania mają na celu poprawę interfejsu neuron-elektroda implantów ślimakowych z korzyścią dla słuchu pacjentów, a także zużycia energii przez urządzenie.

Hodowla eksplantatów neuronów zwojów spiralnych i elektrofizjologia na układach wieloelektrodowych

Narażenie na toksyny środowiskowe może mieć dotkliwy wpływ na rozwijające się zarodki. Wiadomo, że substancje chemiczne zaburzające gospodarkę hormonalną, takie jak bisfenole, niekorzystnie wpływają na układ nerwowy. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący model sieci neuronalnej kręgowców (zarodków piskląt) in vitro w celu zbadania funkcjonalnego wpływu ekspozycji na toksyny na wczesne zarodki.

Ocena wpływu związków zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego na rozwój funkcji sieci neuronalnej kręgowców z wykorzystaniem układów wieloelektrodowych

Ten protokół ma na celu pokazanie, jak połączyć układy mikroelektrod in vitro z urządzeniami mikroprzepływowymi do badania transmisji potencjału czynnościowego w kulturach neuronalnych. Analiza danych, a mianowicie wykrywanie i charakteryzacja rozchodzących się potencjałów czynnościowych, odbywa się za pomocą nowego, zaawansowanego, a jednocześnie przyjaznego dla użytkownika i ogólnodostępnego narzędzia obliczeniowego.

Łączenie mikrofluidyki z układami mikroelektrod do badania komunikacji neuronalnej i propagacji sygnałów aksonalnych

Ten artykuł zawiera zestaw protokołów do rozwoju ludzkich sieci indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-CM) hodowanych na wielodołkowych płytkach MEA w celu odwracalnego elektroportowania błony komórkowej do pomiarów potencjału czynnościowego. Nagrania o wysokiej przepustowości są uzyskiwane z tych samych lokalizacji komórkowych wielokrotnie przez kilka dni.

Sieci kardiomiocytów pochodzące z ludzkich iPSC na wielodołkowych układach mikroelektrod do powtarzalnych zapisów potencjału czynnościowego

Druk 3D w skali mikrometrycznej umożliwia szybkie prototypowanie urządzeń polimerowych do hodowli komórek neuronalnych. Jako dowód słuszności zasady, połączenia strukturalne między neuronami były ograniczane przez tworzenie barier i kanałów wpływających na rozrost neurytów, podczas gdy funkcjonalne konsekwencje takiej manipulacji zaobserwowano za pomocą elektrofizjologii zewnątrzkomórkowej.

Polimeryzacja dwufotonowa: druk 3D urządzeń do hodowli komórek neuronalnych w mikroskali

Ten protokół ma na celu stabilne umieszczanie grzbietowo-brzusznych zrośniętych asembloidów na wieloelektrodowych układach do modelowania padaczki in vitro.

Wieloelektrodowa platforma matrycowa do modelowania padaczki przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych zespołów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Poznaj metodę hodowli i stymulacji sieci neuronowych myszy E17 na układach mikroelektrod w celu badania dynamiki sieciowej związanej z uczeniem się i pamięcią.

Zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod

Przeglądaj więcej filmów