Izolowanie i hodowla neuronów embrionalnych piskląt na matrycy wieloelektrodowej

Weź zapłodnione jajo kurze zawierające zarodek we wczesnym stadium rozwoju.

Wysterylizuj skorupę i ostrożnie ją otwórz.

Usuń zarodek. Rozciąć głowę i przenieść ją na płytkę hodowlaną zawierającą bufor. Usuń gałkę oczną.

Wykonaj nacięcie i usuń warstwy skóry, odsłaniając przodomózgowie i śródmózgowie.

Usuń wewnętrzną warstwę błoniastą i naczynia krwionośne. Wypreparuj i przenieś przodomózgowie na płytkę hodowlaną z buforem.

Pokrój tkankę na mniejsze fragmenty i przenieś je do stożkowej rurki. Gdy fragmenty osiądą, usuń bufor.

Dodaj roztwór enzymu proteolitycznego. Inkubuj w celu strawienia macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki i rozluźnienia neuronów.

Usuń pożywki bogate w enzymy, przemyj pożywką neuropodstawną, usuwając wszelkie pozostałe enzymy.

Dodaj podłoże neuropodstawne. Mechanicznie dysocjuj tkankę, aby uzyskać zawiesinę neuronalną.

Zasiej te neurony w systemie wieloelektrodowym pokrytym macierzą zewnątrzkomórkową. Dodaj pożywkę neurobazalną i inkubuj.

Neurony przyłączają się i wydłużają projekcje, tworząc sieć neuronalną.

W dniu posiewu neuronów wyjmij fiolkę z macierzą zewnątrzkomórkową z zamrażarki o temperaturze -20 stopni Celsjusza. Spryskaj 70% etanolem i umieść na lodzie. Pamiętaj, aby rozmrozić macierz zewnątrzkomórkową na lodzie. Nie rozmrażać w temperaturze pokojowej, ponieważ ECM polimeryzuje w temperaturze powyżej 0 stopni Celsjusza.

Pracuj w okapie BSL-2, aby rozcieńczyć macierz zewnątrzkomórkową do 25%, dodając 300 mikrolitrów zimnej pożywki neuropodstawowej do podwielokrotności 100 mikrolitrów. Następnie za pomocą pipety P200 dodaj 100 mikrolitrów 25% roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej do środka układu wieloelektrodowego, uważając, aby nie dotknąć elektrod. Natychmiast wyjmij ECM, pozostawiając cienką warstwę na powierzchni.

Przykryj układ wieloelektrodowy i umieść w inkubatorze do hodowli tkankowych, aż będzie gotowy do płytki neuronów. Rozpocznij izolację neuronu pisklęcia od sterylizacji zewnętrznej skorupy jaja E7 70% etanolem. Ważne jest, aby od tego momentu utrzymywać sterylne warunki. Upewnij się, że wszystkie narzędzia są wysterylizowane 70% etanolem, a roztwory są sterylne. Pomocne jest użycie kaptura preparacyjnego, ale nie jest to absolutnie konieczne w przypadku sekcji, jeśli jest wykonywane szybko.

Następnie, po pobraniu i odcięciu głowy zarodka, naciąć okolice oczu i usunąć gałki oczne. Następnie użyj cienkich kleszczyków Dumont numer 5 i nożyczek sprężynowych, aby wykonać nacięcie po stronie brzusznej i usunąć zewnętrzne warstwy skóry, aby odsłonić przodomózgowie i osłonę wzrokową. Ostrożnie obierz i usuń błonę peel

Przenieś przodomózgowie na inną szalkę Petriego zawierającą HBS i pokrój ją na małe kawałki o wielkości około 2 milimetrów za pomocą nożyczek sprężynowych. Użyj sterylnej pipety transferowej, aby przenieść kawałki przodomózgowia do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Po tym, jak kawałki przodomózgowia opadną na dno probówki wirówkowej, usuń jak najwięcej HBS.

Następnie dodaj 1 mililitr podgrzanej 0,5% trypsyny-EDTA i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Użyj pipety Pasteura, aby ostrożnie usunąć trypsynę, nie naruszając kawałków tkanki. Dodaj 1 mililitr pożywki neuropodstawowej i pozwól, aby kawałki tkanki opadły na dno. Po usunięciu pożywki i powtórzeniu prania dodaj 2 mililitry pożywki neuropodstawowej i delikatnie rozcieraj, aż nie będzie widać więcej kawałków tkanki.

Rozcieńczyć zawieszone komórki od 1 do 10 pożywką neurobazalną i policzyć żywe komórki za pomocą barwnika błękitu trypanowego i hemocytometru. Po zliczeniu umieść powiązane ogniwa na matrycach wieloelektrodowych pokrytych ECM z gęstością 2 200 ogniw na milimetr kwadratowy.