Warunkowe obniżenie ekspresji genów w liniach komórek nowotworowych w celu zbadania rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza

Ogólnym celem tego protokołu jest wykorzystanie warunkowego knockdownu ekspresji genów w komórkach nowotworowych do badania rekrutacji monocytów i makrofagów do mikrośrodowiska guza in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrośrodowiska nowotworu, dotyczące charakteru krzyżówki między komórkami rakowymi a komórkami układu odpornościowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że zastosowany tutaj system wymaga klonowania pojedynczych wektorów, pozwala na szybkie generowanie wielu klonów i wykazuje bardzo niski poziom grubości.

Zademonstrowano również metodę oczyszczania ludzkich monocytów bez bezpośredniego kontaktu z przeciwciałami, która pozwala uniknąć przypadkowej aktywacji, a jednocześnie daje ponad 95% czystą populację ludzkich monocytów. Aby wytworzyć cząsteczki wirusa, należy przetransfekować 70% zlewające się 150-milimetrowe szalki komórek HEK-293 z 25 mikrogramami pLKO-tet-on shRNA, 25 mikrogramami plazmidu pakującego psPAX i pięcioma mikrogramami plazmidu pMD2 wyrażającego otoczkę. G przy użyciu odczynnika do transfekcji zgodnie ze standardowymi protokołami.

Dodaj mieszankę do naczyń o średnicy 150 milimetrów. Następnego dnia indukuj produkcję lentiwirusa w komórkach, zmieniając pożywkę na DMEM uzupełnioną 10 milimolowym maślanem sodu i 20 milimolowym HEPES. Hodowla przez osiem godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po ośmiu godzinach umyj komórki PBS i dodaj 25 mililitrów świeżej pożywki DMEM z 20 milimolowym HEPESEM i bez maślanu sodu. Po inkubacji przez 48 godzin ostrożnie zebrać pożywkę zawierającą wirusa za pomocą pipety. Aby wygenerować stabilne linie komórkowe, zacznij od wysiewu komórek raka jelita grubego HCT-116 i komórek raka piersi MDA-MB-231 do 12-dołkowej płytki i 50 000 komórek na dołek.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki są w 60-70% zlewne, umyj komórki PBS i dodaj jeden mililitr pożywki zawierającej wirusa do każdej studzienki. Następnego dnia ostrożnie usuń pożywkę zawierającą wirusa przez aspirację.

Następnie, po umyciu komórek PBS, dodać pożywkę zawierającą FBS bez tetracykliny. Po 72 godzinach umyj komórki jak poprzednio i dodaj pożywkę uzupełnioną o jeden mikrogram na mililitr puromycyny w celu selekcji komórek transfekowanych wirusem. Wybierz komórki transdukowane wirusem, hodując komórki w obecności puromycyny przez trzy do 14 dni.

Obserwuj częściowe zabijanie studzienek przez puromycynę w komórkach z komórkami transdukowanymi wirusem. Komórki nietransdukowane nie będą rosły w obecności puromycyny. Kiedy te komórki kontrolne umrą, kontynuuj hodowlę warunkowo regulowanych linii komórkowych przez dwa tygodnie w obecności antybiotyków, aby stworzyć warunkowo regulowane linie komórkowe.

Sprawdź skuteczność warunkowego knockdownu w komórkach raka jelita grubego HCT-116 opornego na puromycynę i raka piersi MDA-MB-231, dodając pożywkę o różnych stężeniach doksycykliny i hodując komórki przez 72 godziny. Po przygotowaniu lizatu komórkowego sprawdź poziom knockdownu za pomocą analizy western blot. Poziomy PAI-1 są pokazane tutaj.

Aby wyizolować monocyty krwi obwodowej, najpierw przygotuj trzy 50-mililitrowe probówki zawierające 15 mililitrów roztworu gradientu gęstości. Następnie użyj kontrolera pipet ustawionego na przepływ grawitacyjny, aby powoli nałożyć 30 mililitrów rozcieńczonej krwi na roztwór gradientu gęstości. Wirować w wirniku obrotowym o sile 400 g w temperaturze pokojowej bez przerw przez 25 minut.

Po odwirowaniu usunąć górną warstwę i przenieść środkową warstwę zawierającą komórki jednojądrzaste krwi obwodowej do świeżej 50-mililitrowej probówki i dodać uzupełniony FBS PBS do 50 mililitrów. Wirować przy 120 g w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po odwirowaniu usunąć zawierający sklarent zawierający płytki krwi.

Po końcowym odwirowaniu i zebraniu ponownie zawieś osad w 50 mililitrach PBS uzupełnionego FBS i policz komórki jednojądrzaste krwi obwodowej za pomocą hemocytometru. Po odwirowaniu komórek w stężeniu 120 g, ponownie zawiesić osad w PBS uzupełnionym FBS zawierającym jeden milimolowy EDTA do końcowego stężenia 50 milionów komórek na mililitr. Następnie zacznij wzbogacać monocyty, dodając 50 mikrolitrów koktajlu przeciwciał selekcji negatywnej na każdy mililitr zawiesiny komórkowej i mieszanki.

Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodaj 50 mikrolitrów kulek magnetycznych na mililitr, wymieszaj i inkubuj przez kolejne 10 minut. Następnie dodaj PBS z FBS i EDTA do 25 mililitrów i umieść mieszaninę jednojądrzastą krwi obwodowej w magnesie, który może pomieścić rurkę o pojemności 50 mililitrów.

Po inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej kulki magnetyczne przylgną do ścianek probówki i odizolują komórki niemonocytowe z roztworu. Użyj pipety o pojemności 25 mililitrów, aby usunąć roztwór zawierający monocyty z probówki, uważając, aby nie dotknąć pipetą boków probówki. Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu, ponownie zawiesić osad zawierający monocyty w pożywce RPMI zawierającej 10% FBS wolnego od TET i 1% paciorkowca piórowego.

Rozpocznij test od wysiewu 40 000 komórek HCT-116 lub MDA-MB-231 w objętości 0,5 mililitra w dołkach 24-dołkowej płytki w trzech powtórzeniach. Następnego dnia dodaj filtr do studni. Następnie umieść 8 000 monocytów w objętości 0,3 mililitra na porowatej wkładce membranowej poddanej działaniu BSA umieszczonej na wierzchu komórek rakowych i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Zbierz wkładki po 48 godzinach. Strząśnij nadmiar podłoża i precyzyjnie przetrzyj wewnętrzną powierzchnię aplikatorem z bawełnianą końcówką, aby usunąć komórki, które nie migrowały. Zewnętrzną stronę wkładu należy zabarwić metodą Wrighta-Giemsa.

Po zamontowaniu filtrów migrowanymi makrofagami stroną do góry, zobrazuj szkiełka za pomocą mikroskopu świetlnego z obiektywem o mocy 20. Zrób zdjęcia dziewięciu pól na filtr i policz migrowane makrofagi we wszystkich polach. Test z komorą Boydena wykorzystano do ilościowego określenia migracji monocytów w kierunku komórek nowotworowych.

W obecności komórek raka piersi MDA-MB-231 migracja monocytów została zahamowana o 33% po dodaniu doksycykliny do kokultury w celu obniżenia regulacji PAI-1. To zahamowanie migracji monocytów było bardziej wyraźne w obecności komórek raka jelita grubego HCT-116, w których knockdown PAI-1 przez podanie doksycykliny zmniejszył migrację monocytów o 74%Podobne wyniki zaobserwowano, gdy podłoże dla komórek rakowych leczonych doksycykliną umieszczono na dnie studzienek jako źródło chemoatraktantów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać funkcjonalnego systemu tet-on do knockdown ekspresji genów w ludzkich liniach komórkowych raka w celu zbadania wpływu chemoatraktantu wydzielanego przez raka białka PAI-1 na ludzkie monocyty.