Ektopowy model ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo

Opisany tutaj protokół pozwala nam na zbadanie funkcji chemokiny i zachowania makrofagów in vivo. Większość istniejących eksperymentalnych modeli chemotaksji komórkowej opiera się na eksperymentach komórkowych in vitro. Jednak eksperymenty in vitro są czasami zbyt proste, aby można było modelować złożone środowisko in vivo.

Ponadto mogą nie reprezentować zdolności chemoprzyciągania in vivo. Metody te wykorzystują specyficzną zaletę danio pręgowanego do bezpośredniej obserwacji zachowania komórek, co jest trudne dla myszy. Zacznij od wygenerowania transgenicznych konstruktów interleukiny-34 TGFABP-10A.

Wstrzyknąć konstrukty interleukiny-34 FABP-10A do jednego stadium komórkowego Tg (mpeg1: GFP) transgenicznych i dzikich zarodków ryb wraz z transpozazą MRNA. Wyhoduj i zbierz zarodki zgodnie z instrukcjami rękopisu. Następnie utrwal je 4% paraformaldehydem przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza lub przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Po utrwaleniu przemyj zarodki PBST trzy razy przez pięć minut na pranie. Odwodnić zarodki oddzielnie za pomocą 50% metanolu w PBST, a następnie 100% metanolu, a następnie zmienić na świeży 100% metanol i przechowywać je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej 2 godziny. Gdy są gotowe do hybrydyzacji sondy, należy ponownie nawodnić zarodki oddzielnie w 50% metanolu w PBST.

Następnie umyj je PBST trzy razy przez pięć minut na pranie. Trawić zarodki za pomocą proteinazy K w PBST w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzuć roztwór wytrawiający i powtórz utrwalanie z 4% paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Po utrwaleniu przemyj zarodki dwukrotnie PBST przez 10 minut na pranie. Przeprowadzić prehybrydyzację z podgrzanym buforem hybrydyzacyjnym w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę. Następnie podgrzej sondę interleukiny-34 do 65 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Recykling buforu hybrydyzacyjnego do oryginalnej probówki i przeprowadzenie hybrydyzacji za pomocą wstępnie podgrzanej sondy w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przemyj zarodki 50% formamidem i 2X SSCT, a następnie 2X SSCT, a następnie 0,2X SSCT w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Powtórz każde pranie trzy razy po 20 minut na pranie.

Następnie umyj zarodki trzy razy PBST przez pięć minut na pranie. Zablokować próbki za pomocą 600 mililitrów buforu blokującego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 400 mikrolitrów roztworu przeciwciała anty-digoksygeniny HRP i inkubuj zarodki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia usuń przeciwciało i przemyj zarodki sześć razy PBST przez 20 minut na przemycie. Po ostatnim praniu przepłukać każdą próbkę 30 mikrolitrami 1X plus rozcieńczalnik do amplifikacji przez pięć minut. Próbki należy inkubować w roztworze roboczym fluoroforu tyraminy przez pięć do 15 minut w ciemności.

Wydłużenie czasu inkubacji do 30 minut, jeśli sygnały są słabe. Następnie umyj zarodki PBST trzy razy przez 10 minut na pranie. I inkubuj je z pierwotnym przeciwciałem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia przemyj zarodki pięć razy PBST przez 30 minut na przemycie i inkubuj je z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia umyj zarodki trzy razy w PBST przez 10 minut na pranie i przechowuj je w 70% glicerolu w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub ujemnych 20 stopni Celsjusza przez dłuższy czas. Przed obrazowaniem należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego, aby wybrać podwójnie dodatnie zarodki DS czerwone i GFP.

Aby zamontować rybę, użyj metalowej kąpieli, aby podgrzać jeden mililitr 1% niskotopliwej agarozy do ponad 90 stopni Celsjusza. Następnie schłodzić go do temperatury ciała i wymieszać z 50 mikrolitrami 0,2% trikainy. Przenieś znieczulone zarodki do małego naczynia zamontowanego ze szkiełkiem nakrywkowym na dnie.

Usuń otaczającą wodę i powoli upuść niskotopliwą agarozę na zarodki. Ostrożnie ustaw pozycję ryby, zanim agaroza zastygnie, trzymając obszar wątroby blisko szkiełka przykrywkowego. Gdy agaroza zastygnie, ostrożnie przykryj ją kolejną warstwą agarozy, aby ją wzmocnić.

Umieść naczynie na stole nośnym mikroskopu konfokalnego, przykryj rybę roztworem E2 z tricainą i rozpocznij obrazowanie. Aby uruchomić mikroskop konfokalny, otwórz oprogramowanie Zen Black 2.3 i kliknij zlokalizuj, następnie inkubacja, a następnie ustaw temperaturę na 29 stopni Celsjusza. Kliknij menu akwizycji i wybierz żądany tryb skanowania i lasery z menu inteligentnych ustawień.

Następnie wybierz Z-stack i pozycję. Kliknij menu projektanta eksperymentu i wybierz opcję włącz eksperyment wieloblokowy w pierwszym bloku, aby znaleźć próbkę w małym powiększeniu. Następnie przełącz się na duże powiększenie i pozwól, aby obserwowany obszar znalazł się w środku pola widzenia.

Ustaw informacje o pozycji i stosie Z. Następnie wybierz odpowiednią intensywność lasera, warstwy skanowania i prędkość obrazowania. Po skonfigurowaniu wszystkich bloków ustaw odpowiednią liczbę pętli i rozpocznij nagrywanie.

Protokół ten został wykorzystany do wstrzyknięcia specyficznego dla wątroby plazmidu interleukiny-34 nadekspresyjnego do zarodków transgenicznych ryb, których makrofagi zostały oznaczone GFP. Do analizy ekspresji makrofagów znakowanych interleukiną-34 i GFP wykorzystano hybrydyzację in situ z pełną fluorescencją i barwienie immunologiczne. Liczbę komórek makrofagów analizowano ilościowo w wątrobie i okolicy ogona zarodków bez wstrzyknięć i konstruktażu.

Obrazowanie na żywo wykorzystano do bezpośredniej obserwacji makrofagów, oznaczonych na zielono, przechodzących przez wątrobę ryby kontrolnej i migrujących do wątroby interleukiny-34 nad ekspresją ryby. Do ważnych etapów tego protokołu należy wybór odpowiedniej linii transgenicznej do oznakowania interesującej nas komórki. I odpowiednia tkanka do obrazowania ekspresji genu transgenicznego, a także odpowiednie okno czasowe obserwacji.

Technika ta może być zastosowana do badania funkcji innych chemokin w zachowaniu innych komórek, takich jak limfocyty T i neutrofile in vivo.