Name: Ektopowy model ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Poznaj metodę ektopowej ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo w modelu Danio rerio. Technika obejmuje hybrydyzację in situ i obrazowanie na żywo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Jingrong Peng za udostępnienie transgenicznej linii Tg (fabp10a: DsRed); Dr. Zilong Wen za udostępnienie linii transgenicznych Tg (mpeg1: GFP); Dr. Koichi Kawakami za dostarczenie wektora pTol2. Prace te były wspierane przez Chińską Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych (31771594), projekty Planu Nauki i Technologii Guangdong (2019A030317001) oraz Fundusze Badań Podstawowych dla Uniwersytetów Centralnych (D2191450).

UWAGA: Wszystkie próbki zostały potraktowane wodą z jaj fenylotiomocznikowych(PTU) w celu zahamowania pigmentu.
1. Generowanie konstruktów transgenicznych Tg (fabp10a:il34) i wstrzykiwanie ryb
<ol>
	<li>Sklonuj 2,8 kb fabp10a promoter8 i regiony kodujące IL-34 (ENSDART00000126460.3) danio pręgowanego do wektora pTol2, aby wygenerować konstrukcję fabp10a-il34. Wstrzyknąć konstrukty do zarodków ryb w stadium jednokomórkowym Tg (mpeg1: GFP) i WT wraz z mRNA transpozazy. Podnieś zarodki WT z wstrzykniętymi fabp10a-il34 do dorosłego 9 i zidentyfikuj transgenicznego założyciela przez hybrydyzację in situ. 
	nuta: Wstrzyknięcie konstruktu Tol2 bezpośrednio do innego transgenu może być problematyczne, jeśli druga linia transgeniczna jest wykonana przy użyciu tego samego układu transpozonowego. Powszechną praktyką byłoby stworzenie niezależnej linii transgenicznej, a następnie przecięcie nowej linii z inną linią reporterową. Gwarantuje to, że nie będzie żadnego wpływu nowej transgenezy na wcześniej wprowadzony transgen.</li>
</ol>
2. Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (WISH) w połączeniu z barwieniem immunologicznym
<ol>
	<li>Utrwalanie próbki
	<ol>
		<li>Pobrać zarodki przejściowego wstrzyknięcia lub stabilnej linii transgenicznej IL-34, które krzyżowały się z Tg (mpeg1: GFP) w pożądanych stadiach. 
		nuta: W tym przypadku zarodki pobrano w 4 dni po zapłodnieniu (dpf). (W razie potrzeby) usunąć kosmówkę za pomocą strzykawki.</li>
		<li>Utrwalić zarodki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C lub 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) (około 25 °C).</li>
		<li>Umyj zarodki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami i Tween 20 (PBST) 3x 5 min.</li>
		<li>Odwodnić zarodki oddzielnie za pomocą 50% metanolu w PBST (50% metanolu/PBST) i 100% metanolu, 1x 5 min każdy. Następnie zmień na świeży 100% metanol i przechowuj w temperaturze -20 °C (co najmniej 2 godziny). 
		nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hybrydyzacja sondy (dzień I)
	<ol>
		<li>Ponownie nawodnij zarodki w poprzednich krokach 50% metanolem w PBST (50% metanolu/PBST), a następnie przemyj PBST 3x 5 min.</li>
		<li>Trawić zarodki za pomocą proteinazy K w PBST w temperaturze pokojowej (stężenie końcowe: 10 μg/ml; 1:2000 w PBST). 
		nuta: Czas trawienia zależy od stadium zarodka: mniej niż 36 godzin po zapłodnieniu (hpf), nie ma potrzeby; 36 zarodków HPF-2 DPF, 3-5 min; 2-3 dpf zarodek, 10 min; 3-4 dpf zarodek, 15 min; 4-5 dpf zarodek, 15-20 min; 5-6 dpf zarodek, 20-27 min; >6 dpf zarodek, 25-30 min w temperaturze pokojowej (około 25 °C).</li>
		<li>Wyrzucić roztwór wytrawiający i ponownie przeprowadzić utrwalanie z 4% PFA, przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj zarodki PBST 2x 10 min.</li>
		<li>Odrzucić PBST, przeprowadzić wstępną hybrydyzację z podgrzanym buforem hybrydyzacyjnym (buforem HB) w temperaturze 65 °C przez 5 minut, zawracać bufor HB do oryginalnej probówki.</li>
		<li>Przeprowadzić wstępną hybrydyzację z nowym podgrzanym buforem HB w temperaturze 65 °C przez co najmniej 1 godzinę.</li>
		<li>Podgrzej sondę9 (w tym przypadku była to sonda il34, 1 ng/ml) w temperaturze 65 °C przez co najmniej 10 minut. Następnie należy załadować bufor HB do oryginalnej probówki. Przeprowadzić hybrydyzację z wstępnie podgrzaną sondą w temperaturze 65 °C przez noc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie przeciwciałami (dzień II)
	<ol>
		<li>Podgrzej wstępnie 50% formamidu/2x sól fizjologiczną cytrynianu sodu plus Tween 20 (SSCT), 2x SSCT, 0,2x SSCT w temperaturze 65 °C.</li>
		<li>Umieść sondę z recyklingu w oryginalnej rurce i przechowuj ją w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Umyć zarodki oddzielnie 50% formamidem/2x SSCT; 2x SSCT; 0,2x SSCT, 3x 20 min lub 2x 30 min każdy w temperaturze 65 °C.</li>
		<li>Umyj zarodki PBST 3x 5 min.</li>
		<li>Próbki należy zablokować 600 μl buforu blokującego (5% przefiltrowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w PBST) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 400 μl roztworu przeciwciała anty-digoksygeniny-HRP (1:1 000-1:2 000 w buforze blokującym) i inkubować zarodki w temperaturze 4 °C przez noc. Jeśli sygnały są słabe, użyj rozcieńczenia przeciwciała w stosunku 1:500.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie i inkubacja przeciwciał pierwszorzędowych (dzień III)
	<ol>
		<li>Usunąć przeciwciało, przemyć zarodki PBST, 6 x 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przepłukać próbkę 30 μl rozcieńczalnika 1x Plus Amplification przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wyrzucić rozcieńczalnik przez pipetowanie; rozcieńczyć roztwór podstawowy fluoroforu i tyramdu (odczynnik do amplifikacji cyjaniny 3 plus (Cy3) lub odczynnika do amplifikacji cyjaniny 5 plus (Cy5), w tym przypadku użyto Cy3) 1:50 w 1x rozcieńczalnik do amplifikacji Plus, aby uzyskać roztwór roboczy fluoroforu i tyramdu. Przygotować 50-100 μl roztworu roboczego dla każdej próbki.</li>
		<li>Inkubować próbkę w roztworze roboczym fluoroforu tyramidowego przez 5-15 minut w ciemności w temperaturze pokojowej. Jeśli sygnały są słabe, wydłuż czas inkubacji do 30 minut.</li>
		<li>Zatrzymaj reakcję, zmieniając roztwór roboczy za pomocą PBST i zbadaj sygnały.</li>
		<li>Umyj zarodki PBST 3x 10 min w temperaturze RT.</li>
		<li>Inkubować próbkę z pierwszorzędowym przeciwciałem w temperaturze 4 °C przez noc. W takim przypadku należy użyć przeciwciała Goat-Anti-GFP jako przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wtórne barwienie przeciwciałami (dzień IV)
	<ol>
		<li>Myj zarodki PBST przez 4x 30 min.</li>
		<li>Inkubować zarodki z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze 4 °C przez noc. W takim przypadku użyj przeciwciała Alexa 488-Anti-Goat jako przeciwciała drugorzędowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Robienie zdjęć (Dzień V)
	<ol>
		<li>Umyj zarodki PBST 3x 10 min w temperaturze RT.</li>
		<li>Przechowuj zarodki w 70% glicerolu w ciemności w temperaturze 4 °C przez noc lub w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie na żywo
<ol>
	<li>Wybór próbki 
	UWAGA: Użyj obrazu na żywo, aby bezpośrednio zaobserwować, czy makrofagi ryb Tg (fabp10a: il34; fabp10a: DsRed; mpeg1: GFP) migrowałyby do wątroby pod wpływem indukcji IL-34 podczas 3-3,5 dpf. W tym przypadku linia transgeniczna Tg (fabp10a-DsRed) jest używana do oznaczania obszaru wątroby i uwidaczniania go, ułatwiania lokalizacji wątroby i określenia, czy makrofagi migrują do wątroby. Przed obrazowaniem użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby wybrać podwójnie dodatnie zarodki DsRed i GFP.</li>
	<li>Montowanie ryb
	<ol>
		<li>Za pomocą metalowej kąpieli podgrzej 1 ml 1% niskotopliwej agarozy do temperatury powyżej 90 °C, aby całkowicie ją stopić.</li>
		<li>Po schłodzeniu niskotopliwej agarozy do temperatury ciała należy dodać 50 μl 0,2% tricainy i równomiernie wymieszać tricainę z agarozą.</li>
		<li>Przenieś znieczulone zarodki do małego naczynia zamontowanego ze szkiełkiem zakrywającym na dnie, usuń otaczającą wodę, powoli upuść niskotopliwą agarozę na zarodki, ostrożnie ustaw pozycję ryby przed zestaleniem się agarozy, trzymaj obszar wątroby blisko szkiełka nakrywkowego na dnie naczynia.</li>
		<li>Po zestaleniu się niskotopliwej agarozy ostrożnie przykryj ją kolejną warstwą agarozy, aby ją wzmocnić.</li>
		<li>Umieść naczynie na stole nośnym mikroskopu konfokalnego, przykryj rybę roztworem E210 trikainą i rozpocznij obrazowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obsługa oprogramowania mikroskopu konfokalnego
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie ZEN black 2.3, zainstaluj stół warsztatowy z żywymi komórkami na stole nośnym mikroskopu.</li>
		<li>Kliknij przycisk Zlokalizuj | Inkubacja | Temperatura, aby ustawić temperaturę na 29 °C.</li>
		<li>Umieść naczynie na środku stołu warsztatowego z żywymi komórkami, przykryj rybę roztworem E210 z trikainą.</li>
		<li>Kliknij menu Akwizycja, wybierz żądany tryb skanowania i lasery z menu Smart Setup, a następnie wybierz opcję Z-Stack and Position (Stos Z i pozycja).</li>
		<li>Kliknij menu Projektant eksperymentów, wybierz opcję Włącz eksperyment z wieloma blokami w pierwszym bloku, aby znaleźć próbkę w małym powiększeniu, a następnie przełącz się na wysokie powiększenie, niech obserwowany obszar znajdzie się w środku pola widzenia.</li>
		<li>Ustaw pozycję i informacje o Z-Stack, wybierz odpowiednią intensywność lasera, warstwy skanowania i prędkość obrazowania.</li>
		<li>Utwórz nowy blok i powtórz powyższe kroki. Po ustawieniu wszystkich bloków ustaw odpowiednią liczbę pętli i rozpocznij nagrywanie (Rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-34+is+a+tissue-restricted+ligand+of+CSF1R+required+for+the+development+of+Langerhans+cells+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia.</a> Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).</li>
<li>Lin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+a+cytokine+and+its+receptor+by+functional+screening+of+the+extracellular+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome.</a> Science. 320 (5877), 807-811 (2008).</li>
<li>Wei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+overlap+but+differential+expression+of+CSF-1+and+IL-34+in+their+CSF-1+receptor-mediated+regulation+of+myeloid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+leukocyte+biology%22%5BJournal%5D)">Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells.</a> Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).</li>
<li>Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-34+Induces+the+Differentiation+of+Human+Monocytes+into+Immunosuppressive+Macrophages.+Antagonistic+Effects+of+GM-CSF+and+IFNc%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc.</a> PLoS One. 8 (2), e56045(2013).</li>
<li>Segaliny, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-1+regulates+the+biological+activities+of+interleukin-34%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).</li>
<li>Zhou, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-28-5p-IL-34-macrophage+feedback+loop+modulates+hepatocellular+carcinoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis.</a> Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).</li>
<li>Gordon, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+expression+and+developmental+regulation+of+two+genes+coding+for+rat+fatty+acid+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%3A+a+practical+approach%22">Zebrafish: a practical approach</a>. , Oxford University Press. New York. (2002).</li>
<li>Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopically+Expressed+IL-34+Can+Efficiently+Induce+Macrophage+Migration+to+the+Liver+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół pozwala nam zbadać funkcję chemokiny na zachowanie makrofagów in vivo, a procedura wymaga pewnej wiedzy technicznej. Podsumowując, istnieje kilka krytycznych kroków, aby uniknąć komplikacji w protokole: 1) wybierz odpowiednią linię transgeniczną, która wykazuje specyficzny i silny sygnał transgeniczny, aby oznaczyć komórkę będącą przedmiotem zainteresowania; 2) dobrać odpowiednią tkankę, która jest dostępna do obrazowania i nadekspresji genów transgenicznych; 3) wykonać czułą i specyficzną sondę RN...

Danio pręgowany to mała tropikalna ryba słodkowodna o twardych kościach, pochodząca z Indii. Jeśli chodzi o ochronę genów, danio pręgowany ma podobieństwo do human1. Może dostarczyć nam wglądu w powiązane tematy związane z człowiekiem, badając regulację genów, funkcję białek i zachowanie komórek, takie jak migracja, proliferacja et.al u danio pręgowanego. Zarodek danio pręgowanego może być wykorzystany do obserwacji rozwoju wczesnych zarodków na różnych etapach po zahamowaniu pigmentu. Tymczasem danio pręgowany potrzebuje tylko trzech miesięcy, aby osiągnąć dojrzałość płciową, wtedy danio pręgowany może produkować setki jaj co 4 dni. Miniaturowy rozmiar, prosta hodowla, silna zdolność reprodukcyjna, te zalety sprawiają, że hodowla danio pręgowanego jest bardzo oszczędzająca miejsce, sprzyja hodowli na dużą skalę. Tradycyjny model myszy ssaków ma wyższe koszty utrzymania niż danio pręgowany, co ogranicza skalę hodowli myszy. W aspekcie wczesnego rozwoju zarodka, zarodek myszy jest trudny do zaobserwowania w warunkach żywych ze względu na charakterystykę rozwoju zarodka myszy w łonie matki. Wręcz przeciwnie, zarodki danio pręgowanego rozwijają się zewnętrznie i są przezroczyste, dlatego łatwo je obserwować pod mikroskopem. Co więcej, danio pręgowany jest bardzo łatwy do skonstruowania różnych linii transgenicznych do badań nad funkcjami genów. Obecnie dostępne są różne linie transgeniczne danio pręgowanego do znakowania różnych typów komórek. Obecnie bardzo wygodne jest konstruowanie linii transgenicznych do nadekspresji chemokin w określonych lokalizacjach i badanie funkcji chemokin w zachowaniu komórek u danio pręgowanego.
Tutaj udostępniliśmy przepływ pracy umożliwiający wykorzystanie linii transgenicznej danio pręgowanego do zbadania funkcji IL-34 na zachowanie makrofagów in vivo2,3,4,5,6,7. Po pierwsze, skonstruowaliśmy specyficzny dla wątroby plazmid nadekspresji genu il34 i wstrzyknęliśmy plazmid do zarodków ryb w stadium jednokomórkowym Tg (mpeg1: GFP), które specyficznie znakowały makrofagi za pomocą białka fluorescencyjnego GFP. Następnie użyliśmy fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i barwienia immunologicznego w celu wykrycia wzorca ekspresji il34 oraz liczby lub lokalizacji makrofagów. Wstrzyknięte zarodki WT zostały wyhodowane w celu wytworzenia stabilnej linii transgenicznej. Na tych etapach ustaliliśmy i zwalidowaliśmy linię produkującą cytokiny oraz wizualnie oceniliśmy wpływ, który można zaobserwować na rozmieszczenie makrofagów. Wreszcie, aby zbadać zachowanie makrofagów w odpowiedzi na cytokinę, użyliśmy konfokalnego obrazowania na żywo, aby bezpośrednio obserwować migrację makrofagów, aby potwierdzić funkcję il34 w migracji makrofagów in vivo.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-Przeciwciało przeciwkozie</td><td>Invitrogen</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>Anty-Digoxigenin-HRP&nbsp;</td><td>perkinelmer</td><td>NEF832001EA</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało kozie-anty-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab6658</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>21097</td><td></td></tr><tr><td>Cyjanina 3 Plus Odczynnik do amplifikacji</td><td>perkinelmeru</td><td>NEL745001KT</td><td></td></tr><tr><td>E2 rozwiązanie</td><td></td><td></td><td>15 mM&nbsp; NaCl +0,5 mM KCl +1,0 mM MgSO4+150 &mikro; M&nbsp; KH2PO4 + 50 & mikro; M&nbsp; Na2HPO4 +1,0 mM CaCl2 + 0,7 mM NaHCO3&nbsp;</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Life</td><td>10099-133</td><td></td></tr><tr><td>Diament formamidowy</td><td></td><td>A100314</td><td></td></tr><tr><td>glicerol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>V900860</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Bufor hybrydyzacyjny (HB)</td><td></td><td></td> <td>50% formamidu + 5 razy; SSC+9 mM cytrynian sodu+50 &mu; g/ml heparyny sodu+ 500 &m; g/mL tRNA+ 0,1% Tween20</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza niskotopliwa</td><td>Sigma</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>GHTECH</td><td>1.17112.023</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>158127</td><td>Zawiesić 16 g PFA w 400 ml 1x PBS, podgrzewać w temperaturze 60 &; C&nbsp; rozpuścić się ok. 30 min. Roztwór ten można przygotować z wyprzedzeniem i przechowywać w temperaturze -4 stopni Celsjusza. Uwaga. Manipuluj za pomocą maski.</td></tr><tr><td>10 i razy; PBS</td><td></td><td></td><td>14,2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2,4 g KH2PO4 in 1L ddH2O</td></tr><tr><td>Phenylthiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>1&razy; Plus Amplifikacja Rozcieńczalnik</td><td>perkinelmeru</td><td>NEL745001KT</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K&nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>E00492</td><td></td></tr><tr><td>20 razy; Sól fizjologiczna cytrynian sodu (SSC)</td><td></td><td></td> <td>175,3 g NaCl + 88,2 g cytrynian sodu w 1 l ddH2O, pH 7,0</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Trikaine</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>tRNA&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R6625</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pBLK-fabp10a-il34-sv40</td><td></td><td></td><td>Dla generacji linii transgenicznej Tg (fab10a:il34) generacji linii transgenicznej</td></tr><tr><td>pBSK-il34</td><td></td><td></td><td>Do przygotowania sondy il34</td></tr><tr><td>Fish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg (mpeg1: GFP)</td><td></td><td></td><td>Znakuj makrofagi GFP</td></tr><tr><td>Tg (fabp10a: DsRed)</td><td></td><td></td><td>Znakuj komórki wątroby DsRed</td></tr><tr><td>Tg (fab10a:il34)</td><td></td><td></td><td>Nadekspresja IL-34 w komórkach wątroby</td></tr></tbody></table>

ektopowy model ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo

An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo

Danio pręgowany jest szeroko stosowany w badaniach podstawowych i biomedycznych. Obecnie dostępnych jest wiele linii transgenicznych danio pręgowanego do znakowania różnych typów komórek. Ze względu na przezroczyste ciało embrionalne danio pręgowanego wygodnie jest nam badać wpływ jednej chemokiny na zachowanie określonego typu komórek in vivo. W tym miejscu przedstawiliśmy przepływ pracy w celu zbadania funkcji chemokiny w migracji makrofagów in vivo. Skonstruowaliśmy specyficzny tkankowo plazmid nadekspresji w celu nadekspresji IL-34 i wstrzyknęliśmy plazmid do transgenicznych zarodków ryb w stadium jednokomórkowym, których makrofagi zostały specjalnie znakowane przez białko fluorescencyjne. Następnie zastosowaliśmy fluorescencyjną hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu wykrycia wzorca ekspresji chemokin oraz liczby lub lokalizacji makrofagów. Wstrzyknięte zarodki WT zostały wyhodowane w celu wytworzenia stabilnej linii transgenicznej. Na koniec wykorzystaliśmy konfokalne obrazowanie na żywo, aby bezpośrednio obserwować zachowanie makrofagów w stabilnych rybach transgenicznych, aby zbadać funkcję IL-34 na makrofagach in vivo.

Kroki zawarte w protokole dotyczącym rybek zebrafish zostały przedstawione w Rycina 2Najpierw wygenerowaliśmy konstrukt pBLK-fabp10a-il34-sv40, w którym il34 był napędzany przez fabp10a promotor (Rysunek 2). Konstrukt wstrzyknięto za pomocą mikroiniekcji w stadium jednego komórki Tg (mpeg1: GFPzarodki danio pręgowanego, w których makrofagi mogą być znakowane GFP, oraz zarodki WT, które zostały ...

Aby przetestować wpływ chemokiny na rekrutację makrofagów in vivo, do wykrycia ektopowej ekspresji chemokiny użyto całej hybrydyzacji in situ, a do oznaczania makrofagów użyto barwienia immunologicznego. Obrazowanie na żywo wykorzystano do obserwacji migracji makrofagów w czasie rzeczywistym.

Ektopowy model ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo

Zebrafish are widely used in basic and biomedical research. Many zebrafish transgenic lines are currently available to label various types of cells. Owing ...

Opisany tutaj protokół pozwala nam na zbadanie funkcji chemokiny i zachowania makrofagów in vivo. Większość istniejących eksperymentalnych modeli chemotaksji komórkowej opiera się na eksperymentach komórkowych in vitro. Jednak eksperymenty in vitro są czasami zbyt proste, aby można było modelować złożone środowisko in vivo.Ponadto mogą nie reprezentować zdolności chemoprzyciągania in vivo. Metody te wykorzystują specyficzną zaletę danio pręgowanego do bezpośredniej obserwacji zachowania komórek, co jest trudne dla myszy. Zacznij od wygenerowania transgenicznych konstruktów interleukiny-34 TGFABP-10A.Wstrzyknąć konstrukty interleukiny-34 FABP-10A do jednego stadium komórkowego Tg (mpeg1: GFP) transgenicznych i dzikich zarodków ryb wraz z transpozazą MRNA. Wyhoduj i zbierz zarodki zgodnie z instrukcjami rękopisu. Następnie utrwal je 4% paraformaldehydem przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza lub przez dwie godziny w temperaturze pokojowej.Po utrwaleniu przemyj zarodki PBST trzy razy przez pięć minut na pranie. Odwodnić zarodki oddzielnie za pomocą 50% metanolu w PBST, a następnie 100% metanolu, a następnie zmienić na świeży 100% metanol i przechowywać je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez co najmniej 2 godziny. Gdy są gotowe do hybrydyzacji sondy, należy ponownie nawodnić zarodki oddzielnie w 50% metanolu w PBST.Następnie umyj je PBST trzy razy przez pięć minut na pranie. Trawić zarodki za pomocą proteinazy K w PBST w temperaturze pokojowej. Następnie wyrzuć roztwór wytrawiający i powtórz utrwalanie z 4% paraformaldehydem przez 20 minut w temperaturze pokojowej.Po utrwaleniu przemyj zarodki dwukrotnie PBST przez 10 minut na pranie. Przeprowadzić prehybrydyzację z podgrzanym buforem hybrydyzacyjnym w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez co najmniej jedną godzinę. Następnie podgrzej sondę interleukiny-34 do 65 stopni Celsjusza przez 10 minut.Recykling buforu hybrydyzacyjnego do oryginalnej probówki i przeprowadzenie hybrydyzacji za pomocą wstępnie podgrzanej sondy w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia przemyj zarodki 50% formamidem i 2X SSCT, a następnie 2X SSCT, a następnie 0,2X SSCT w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Powtórz każde pranie trzy razy po 20 minut na pranie.Następnie umyj zarodki trzy razy PBST przez pięć minut na pranie. Zablokować próbki za pomocą 600 mililitrów buforu blokującego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 400 mikrolitrów roztworu przeciwciała anty-digoksygeniny HRP i inkubuj zarodki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia usuń przeciwciało i przemyj zarodki sześć razy PBST przez 20 minut na przemycie. Po ostatnim praniu przepłukać każdą próbkę 30 mikrolitrami 1X plus rozcieńczalnik do amplifikacji przez pięć minut. Próbki należy inkubować w roztworze roboczym fluoroforu tyraminy przez pięć do 15 minut w ciemności.Wydłużenie czasu inkubacji do 30 minut, jeśli sygnały są słabe. Następnie umyj zarodki PBST trzy razy przez 10 minut na pranie. I inkubuj je z pierwotnym przeciwciałem w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia przemyj zarodki pięć razy PBST przez 30 minut na przemycie i inkubuj je z przeciwciałami drugorzędowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia umyj zarodki trzy razy w PBST przez 10 minut na pranie i przechowuj je w 70% glicerolu w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub ujemnych 20 stopni Celsjusza przez dłuższy czas. Przed obrazowaniem należy użyć mikroskopu fluorescencyjnego, aby wybrać podwójnie dodatnie zarodki DS czerwone i GFP.Aby zamontować rybę, użyj metalowej kąpieli, aby podgrzać jeden mililitr 1% niskotopliwej agarozy do ponad 90 stopni Celsjusza. Następnie schłodzić go do temperatury ciała i wymieszać z 50 mikrolitrami 0,2% trikainy. Przenieś znieczulone zarodki do małego naczynia zamontowanego ze szkiełkiem nakrywkowym na dnie.Usuń otaczającą wodę i powoli upuść niskotopliwą agarozę na zarodki. Ostrożnie ustaw pozycję ryby, zanim agaroza zastygnie, trzymając obszar wątroby blisko szkiełka przykrywkowego. Gdy agaroza zastygnie, ostrożnie przykryj ją kolejną warstwą agarozy, aby ją wzmocnić.Umieść naczynie na stole nośnym mikroskopu konfokalnego, przykryj rybę roztworem E2 z tricainą i rozpocznij obrazowanie. Aby uruchomić mikroskop konfokalny, otwórz oprogramowanie Zen Black 2.3 i kliknij zlokalizuj, następnie inkubacja, a następnie ustaw temperaturę na 29 stopni Celsjusza. Kliknij menu akwizycji i wybierz żądany tryb skanowania i lasery z menu inteligentnych ustawień.Następnie wybierz Z-stack i pozycję. Kliknij menu projektanta eksperymentu i wybierz opcję włącz eksperyment wieloblokowy w pierwszym bloku, aby znaleźć próbkę w małym powiększeniu. Następnie przełącz się na duże powiększenie i pozwól, aby obserwowany obszar znalazł się w środku pola widzenia.Ustaw informacje o pozycji i stosie Z. Następnie wybierz odpowiednią intensywność lasera, warstwy skanowania i prędkość obrazowania. Po skonfigurowaniu wszystkich bloków ustaw odpowiednią liczbę pętli i rozpocznij nagrywanie.Protokół ten został wykorzystany do wstrzyknięcia specyficznego dla wątroby plazmidu interleukiny-34 nadekspresyjnego do zarodków transgenicznych ryb, których makrofagi zostały oznaczone GFP. Do analizy ekspresji makrofagów znakowanych interleukiną-34 i GFP wykorzystano hybrydyzację in situ z pełną fluorescencją i barwienie immunologiczne. Liczbę komórek makrofagów analizowano ilościowo w wątrobie i okolicy ogona zarodków bez wstrzyknięć i konstruktażu.Obrazowanie na żywo wykorzystano do bezpośredniej obserwacji makrofagów, oznaczonych na zielono, przechodzących przez wątrobę ryby kontrolnej i migrujących do wątroby interleukiny-34 nad ekspresją ryby. Do ważnych etapów tego protokołu należy wybór odpowiedniej linii transgenicznej do oznakowania interesującej nas komórki. I odpowiednia tkanka do obrazowania ekspresji genu transgenicznego, a także odpowiednie okno czasowe obserwacji.Technika ta może być zastosowana do badania funkcji innych chemokin w zachowaniu innych komórek, takich jak limfocyty T i neutrofile in vivo.

an-ectopic-chemokine-expression-model-for-testing-macrophage

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie badamy interakcję guz-makrofag za pomocą testu interakcji makrofagów transwell opartego na fluorescencji. Test obejmuje analizę migracji makrofagów przez chemotaksję wywołaną chemicznie.

Test przyciągania makrofagów Transwell oparty na fluorescencji: metoda in vitro do badania interakcji guza-makrofag poprzez chemotaksję indukowaną chemicznie

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Ten protokół służy jako schemat do tworzenia funkcjonalnego systemu Tet-ON w liniach komórek nowotworowych i jego późniejszego wykorzystania, w szczególności do badania roli białek pochodzących z komórek nowotworowych w rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza.

Warunkowe obniżenie ekspresji genów w liniach komórek nowotworowych w celu zbadania rekrutacji monocytów/makrofagów do mikrośrodowiska guza

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego określenia aktywności chemotaktycznej monocytów krwi w modelach mysich, do oceny wpływu interwencji żywieniowych, farmakologicznych i genetycznych na monocyty krwi oraz do scharakteryzowania makrofagów pochodzących z monocytów krwi w modelach mysich przy użyciu zatyczek żelowych pochodzących z błony podstawnej monocytów-chemoattraktantu-1 (MCP-1).

Kwantyfikacja aktywności chemotaktycznej monocytów in vivo i charakterystyka makrofagów pochodzących z monocytów we krwi

Ten artykuł przedstawia użyteczny test in vitro do oceny zdolności kondycjonowanej pożywki z komórek nowotworowych do przyciągania makrofagów.

Test in vitro w celu zbadania interakcji między guzem a makrofagami

Prezentowany tutaj jest protokół do wykrywania produkcji pułapek zewnątrzkomórkowych makrofagów (MET) w hodowli żywych komórek za pomocą mikroskopii i barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten można dalej rozszerzyć w celu zbadania specyficznych markerów białka MET za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Stymulacja in vitro i wizualizacja uwalniania pułapek zewnątrzkomórkowych w zróżnicowanych ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię poklatkową z kontrastem fazowym do obrazowania makrofagów otrzewnowych rezydujących myszy w chemotaktycznym gradiencie dopełniacza C5a. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki odpornościowe.

Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji pierwotnych ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów z sferoidą guza w trójwymiarowej (3D) matrycy kolagenu I, z możliwością porównania wpływu rozpuszczalnych i fizycznych właściwości mikrośrodowiska na inwazję komórek.

Test koinwazji sferoidów makrofagów i guzów

Monocyty i makrofagi to bardzo plastyczne i reprogramowalne komórki odpornościowe, kluczowe dla zdrowia i choroby. Wyczuwają i reagują na szeroki zakres bodźców, przyjmując określone programy różnicowania i fenotypy. Ustandaryzowaliśmy model in vitro do badania polaryzacji i przeprogramowania makrofagów, zapewniając cenne narzędzie do badań.

Przeprogramowanie modelu ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów do testów in vitro

Biorąc pod uwagę ograniczone modele ksenoprzeszczepów dostępne do badania interakcji między ludzkim CART-em a komórkami szpikowymi, stworzyliśmy modele in vitro i in vivo , aby zrozumieć wpływ ludzkich makrofagów na komórki CART. Wyniki można potencjalnie uogólnić, aby ocenić rolę makrofagów w mikrośrodowisku guza i przetestować immunoterapie ukierunkowane na makrofagi.

Badanie interakcji między komórkami szpikowymi a limfocytami CAR T in vitro i in vivo

Poznaj metodę ektopowej ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo w modelu Danio rerio. Technika obejmuje hybrydyzację in situ i obrazowanie na żywo.

Ektopowy model ekspresji chemokiny do badania rekrutacji makrofagów in vivo

Przeglądaj więcej filmów