Rozwarstwienie i przygotowanie plastra koronalnego rozwijającego się mysiego przysadki mózgowej

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie prawidłowych odcinków koronalnych przysadki mózgowej z dobrze zachowaną architekturą tkanek od rozwijających się myszy. Ta procedura może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju przysadki, takie jak histologia przysadki, różnicowanie komórek, proliferacja i apoptoza. Główną zaletą tej techniki jest to, że rozwijające się mysie przysadki mózgowe można wypreparować bez widocznych uszkodzeń i odpowiednio zorientować do uzyskania przekrojów koronalnych.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy odkryliśmy, że w przypadku rozwoju mysich przysadek mózgowych technicznie trudno jest uzyskać odpowiednie przekroje koronalne. Po znieczuleniu i naprawieniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, użyj nożyczek, aby rozciąć kość czaszki. Następnie za pomocą kleszczy delikatnie unieś tyłomózgowie z podstawy czaszki.

Następnie, przy pierwszych oznakach siodła turcica, przestań podnosić, ale przytrzymaj tyłomózgowie i użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć łodygę przysadki mózgowej i włókna nerwowe połączone z podstawą mózgu. Kontynuuj podnoszenie i usuwanie całego mózgu, aby w pełni odsłonić przysadkę mózgową. Przysadka mózgowa spoczywa na grzbietowej powierzchni kości klinowej i jest otoczona bocznie nerwami trójdzielnymi.

Następnie użyj nożyczek, aby przeciąć cały obszar sellar, w tym przysadkę mózgową, boczne nerwy trójdzielne i poniżej kości klinowej. Umieść tkankę w naczyniu o średnicy 35 mm zawierającym 4% PFA i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 40 minut do 3 godzin, w zależności od wieku. Następnie użyj 10 ml PBS, aby przemyć utrwaloną tkankę przez pięć zmian po 15 minut każda.

Przenieś utrwaloną tkankę do 35-milimetrowej płytki zawierającej 1 ml PBS i pod mikroskopem stereoskopowym zdysocjuj przysadkę mózgową. W przypadku przysadek P5 do P14 za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek usuń błony łączne między nerwami a kością i ostrożnie odizoluj przysadkę mózgową wraz z bocznymi nerwami trójdzielnymi jako całością, ale pozostawiając siodło tureckie. W przypadku P21 i przysadki mózgowej u dorosłych należy usunąć nerwy i błony łączne wokół przysadki mózgowej i uwolnić gruczoł z otaczających tkanek.

Po odwodnieniu, oczyszczeniu ksylenu i infiltracji woskiem przeprowadzonym zgodnie z protokołem tekstowym, na konsoli do zatapiania tkanek, wyjmij próbkę z kasety i umieść ją w formie bazowej wypełnionej do połowy stopionym woskiem parafinowym. W przypadku P21 i przysadki mózgowej osoby dorosłej użyj rozgrzanych drobnych kleszczy, aby ustawić przysadkę mózgową tak, aby jej krótka oś była prostopadła do dolnej powierzchni formy podstawowej. W przypadku przysadek mózgowych od P0 do P4 należy ustawić próbki tak, aby kości klinowe były prostopadłe do dolnej powierzchni formy podstawowej.

W przypadku przysadki mózgowej od P5 do P14 należy ustawić próbki tak, aby ich nerwy trójdzielne były prostopadłe do dolnej powierzchni formy podstawowej. Po ustawieniu gruczołu użyj rozgrzanych cienkich kleszczyków, aby delikatnie przytrzymać tkankę w pożądanej pozycji, aż wosk stanie się półstały na płytce chłodzącej. Uzupełnij formę stopionym woskiem parafinowym.

Pozostaw blok parafiny do ostygnięcia, aż wosk całkowicie zastygnie. Schłodź blok parafiny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 10 do 20 minut, a następnie za pomocą mikrotomu pokrój go w cienkie plasterki, precyzyjnie dostrajając położenie bloku parafiny podczas cięcia. Przeprowadzić znakowanie immunologiczne zgodnie z protokołem tekstowym.

Jak pokazano tutaj, aby wypreparować przysadkę mózgową od nowonarodzonej myszy, cały obszar sellar zawierający przysadkę mózgową, nerwy trójdzielne i kość klinową pod spodem został wypreparowany z podstawy czaszki. Maleńka i delikatna przysadka mózgowa pozostała nienaruszona podczas procesu. U myszy starszych niż pięć dni wyizolowano przysadkę mózgową przyczepioną do bocznych nerwów trójdzielnych.

Struktura wzrostu przysadki mózgowej odizolowanej od myszy P7 była dobrze zachowana. W tym przypadku przysadka mózgowa myszy P21 została pomyślnie odizolowana bez widocznych uszkodzeń podczas usuwania otaczającej ją tkanki. Na tym rysunku barwienie H&E prawidłowo zorientowanych odcinków koronalnych wykazuje dobrze zachowaną morfologię zarówno przysadki mózgowej, jak i przysadki mózgowej P0, P7 i P21.

Wreszcie, przetworzone preparaty były również kompatybilne z znakowaniem immunofluorescencyjnym. Na przykład przysadka gruczolakowa i przysadka mózgowa wykazały specyficzne znakowanie immunologiczne odpowiednio GH i GFAP. Po opanowaniu proces od sekcji do osadzenia można przeprowadzić w ciągu 7,5 godziny u dorosłych myszy, a nawet krócej u młodszych myszy, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wypreparowaniu całego obszaru sellara, aby uniknąć dotykania przysadki mózgowej żadnymi narzędziami chirurgicznymi. Po tej procedurze można również wyizolować przysadkę, która nie została poprzedzona prefiksem. W takim przypadku należy zachować większą ostrożność, aby uniknąć niepożądanych uszkodzeń.

Gruczoł należy również wypreparować tak szybko, jak to możliwe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak preparować przysadkę mózgową myszy i przygotowywać przekroje koronalne przysadki na różnych etapach rozwoju.