Name: Rozwarstwienie i przygotowanie plastra koronalnego rozwijającego się mysiego przysadki mózgowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Poznaj metodę rozwarstwiania i przygotowania plastrów koronalnych rozwijającej się mysiej przysadki mózgowej. Technika zachowuje architekturę tkanek i umożliwia badanie histologii oraz różnicowania komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31201086, 31470759 i 31671219) oraz Shanghai Natural Science Foundation (12ZR1436900).

myszy C57BL/6 są hodowane w specyficznych warunkach wolnych od patogenów. Wszystkie metody eksperymentalne na zwierzętach są zgodne z wytycznymi zatwierdzonymi przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Drugiego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego.
1. Rozwarstwienie rozwijającej się przysadki mózgowej po urodzeniu
<ol>
	<li>Wykonaj znieczulenie: Umieść nowonarodzone myszy (P0 - P5) na kruszonym lodzie, aby wywołać hipotermię. W przypadku myszy w wieku powyżej 5 dni należy wstrzyknąć 5% uretanu (30 μl/g masy ciała) dootrzewnowo w celu wywołania znieczulenia. Oceń reakcje na szczypanie ogona/palców u nóg. Kontynuuj tylko wtedy, gdy mysz przestanie reagować na szkodliwe bodźce.</li>
	<li>Zabezpiecz mysz w pozycji leżącej na plecach (leżąc na plecach twarzą do góry), delikatnie przyklejając przednie i tylne łapy do powierzchni roboczej, którą można przypiąć (np. styropianu) do okapu oparów chemicznych.</li>
	<li>Wykonaj perfuzję przezsercową.
	<ol>
		<li>Przetnij klatkę piersiową myszy nożyczkami chirurgicznymi, aby odsłonić serce (i inne narządy klatki piersiowej).</li>
		<li>Zabezpiecz bijące serce kleszczami i włóż igłę 26G (0,45 mm) do lewej komory. Igła jest przymocowana do strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej heparynizowanym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS; uzupełnionym 5 mg/ml azotynu sodu i 10 U/ml heparyny, pH 7,4, podgrzanym do 37 °C przed użyciem). Natychmiast przetnij prawy przedsionek cienkimi nożyczkami i zacznij perfuzjować ciało ciepłym PBS, aż płyn wychodzący z prawego przedsionka będzie czysty. 
		UWAGA: Dla nowonarodzonych myszy potrzeba około 5 - 10 ml PBS i 10 - 20 ml PBS dla dorosłych myszy.</li>
		<li>Utrzymać igłę na miejscu i zmienić ją na inną strzykawkę wypełnioną 4% paraformaldehydem (PFA; pH 7,4). Wykonaj 10 ml i 20 ml utrwalacza odpowiednio dla noworodków i myszy P21. 
		Uwaga: PFA jest toksyczny. Może powodować podrażnienia skóry i dróg oddechowych oraz uszkodzenie oczu. Nosić rękawice i pracować pod kapturem chemicznym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odetnij głowę myszy z PFA i rozetnij kość czaszki nożyczkami.
	<ol>
		<li>Delikatnie unieś tyłomózgowie z podstawy czaszki za pomocą małych kleszczy. Przy pierwszych oznakach siodła turcica przestań podnosić, ale przytrzymaj tyłomózgowie, odetnij łodygę przysadki mózgowej i włókna nerwowe łączące się z podstawą mózgu cienkimi nożyczkami. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby upewnić się, że przysadka mózgowa nie jest podnoszona z mózgu.</li>
		<li>Następnie kontynuuj podnoszenie mózgu i usuń cały mózg, aby w pełni odsłonić przysadkę mózgową. Wytnij nożyczkami cały obszar siodła, w tym przysadkę mózgową, boczne nerwy trójdzielne i dolną kość klinową (około 3 x 5 mm2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść wypreparowaną tkankę w naczyniu o średnicy 35 mm lub w jednym dołku na 6-dołkowej płytce zawierającej 2 ml zimnego 4% PFA (pH 7,4). Utrwalić tkankę w temperaturze 4 °C przez 40 minut dla przysadek P0 - P7, 1 godzinę dla przysadek P14, 1,5 godziny dla przysadek P21 - P28 i 3 godziny dla przysadek dorosłych.</li>
	<li>Dalsza dysocjacja przysadki mózgowej
	<ol>
		<li>Przemyj utrwaloną tkankę 10 ml PBS, 5 zmian po 15 minut każda. Przysadka mózgowa noworodka wraz z otaczającymi ją tkankami i dolną kością klinową może być przetwarzana bezpośrednio do odwodnienia. Jednak przysadka mózgowa myszy starszych niż 5 dni powinna być dalej dysocjowana pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
		<li>Utrwaloną tkankę umieścić w naczyniu o średnicy 35 mm zawierającym 1 ml PBS. W przypadku przysadek P5 - P14 usuń błony łączne między nerwami a kością za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek i ostrożnie odizoluj przysadkę mózgową wraz z bocznymi nerwami trójdzielnymi jako całością, pozostawiając siodło tureckie. Izolowany gruczoł i nerwy są połączone błonami łącznymi o wyglądzie podobnym do litery "H" (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B).</li>
		<li>W przypadku P21 i przysadki mózgowej u dorosłych należy usunąć nerwy i błony łączne wokół przysadki mózgowej i uwolnić gruczoł z otaczających tkanek. Owiń tkankę przysadki mózgowej chusteczką do czyszczenia soczewek i włóż ją do kasety do zatapiania. 
		UWAGA: Owinięcie maleńkiej przysadki bibułką do czyszczenia soczewek pomaga zapobiec potencjalnej utracie próbek i zachować integralność tkanek w następującej procedurze zatapiania parafiny. Owijanie przysadki mózgowej może nie być konieczne, jeśli jest ona przetwarzana w małej butelce w procedurze kriozatapiania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Osadzanie i cięcie parafiny
<ol>
	<li>Odwodnić próbki w kasetach do zatapiania z 50%, 65%, 75% i 95% roztworami etanolu przez 15 minut każda. Następnie odwodnić za pomocą 3 podmian czystego etanolu, po 3 minuty dla gruczołów P0 - P4, po 4 minuty dla gruczołów P5 - P14 i po 5 minut dla gruczołów P21 i starszych. Wyczyść ksylenem, 3 przemiany, po 3 minuty dla gruczołów P0 - P4, po 4 minuty dla gruczołów P5 - P14 i po 5 minut dla gruczołów P21 i starszych. Naciekać stopionym woskiem parafinowym, 3 przemiany, po 7 minut dla gruczołów P0 - P4 i dwukrotnie 8 minut, a następnie 6 minut raz dla gruczołów P5 i starszych. 
	UWAGA: Optymalne parametry przetwarzania tkanek można dostosować empirycznie. Aby uzyskać wysokiej jakości sekcje, należy unikać niewystarczającego lub nadmiernego odwodnienia. To samo dotyczy oczyszczania tkanki za pomocą ksylenu.</li>
	<li>Orientacja podczas osadzania
	<ol>
		<li>Na konsoli do zatapiania tkanek wyjmij próbkę z kasety i umieść ją w formie bazowej wypełnionej do połowy stopionym woskiem parafinowym. Właściwa orientacja osadzającej się przysadki mózgowej jest niezbędna do zaspokojenia odcinków koronalnych.</li>
		<li>W przypadku P21 i przysadki mózgowej osoby dorosłej należy ustawić przysadkę mózgową tak, aby jej krótka oś była prostopadła do dolnej powierzchni formy podstawowej (płaszczyzny przekroju). Użyj kości klinowych i nerwów trójdzielnych jako anatomicznych punktów orientacyjnych odpowiednio dla przysadek P0 - P4 i P5 - P14. Zorientuj próbki za pomocą nerwów trójdzielnych lub blaszki poprzecznej kości klinowych prostopadłych do dolnej powierzchni formy podstawowej.</li>
		<li>Delikatnie przytrzymaj tkankę w żądanej pozycji za pomocą rozgrzanych cienkich kleszczyków, aż wosk stanie się półstały na płytce chłodzącej. Uzupełnij formę stopionym woskiem parafinowym. Pozwól blokowi parafiny ostygnąć, aż wosk całkowicie zastygnie. 
		UWAGA: Przysadka mózgowa w 18,5 dniu zarodkowym (E18,5) może być leczona w taki sam sposób, jak przysadka u noworodka. Ale przysadki (woreczki Rathkego) młodsze niż E16,5 powinny być osadzone całą głową i zorientowane z osią strzałkową (od ust do potylicy) prostopadłą do dolnej powierzchni formy podstawowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Schłodzić blok parafiny w temperaturze -20 °C przez 10 - 20 minut, a następnie pokroić go w cienkie plasterki (preferowana grubość 4 μm) za pomocą mikrotomu. Aby uzyskać zadowalające przekroje koronalne, należy dostroić położenie bloków parafinowych podczas cięcia. Zamontuj plastry chusteczki na szkiełkach pokrytych polilizyną, aby zapobiec odklejaniu się plastrów podczas wykonywania następujących procedur. 
	UWAGA: Alternatywnie, próbki można odwodnić w 15%, 30% (w/v) roztworach sacharozy (w PBS) w temperaturze 4 °C, aż opadną na dno, zatopić w związku do zatapiania w krioprocesie przy użyciu tej samej metody orientacji i szybko zamrozić na suchym lodzie. Następnie pokrój zamrożone bloki tkanek na plastry o wielkości 8 - 10 μm za pomocą kriostatu. Morfologia kriosekcji jest jednak często gorsza od sekcji parafinowych.</li>
</ol>
3. Barwienie H&E i znakowanie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Podgrzej szkiełka na bloku grzewczym w temperaturze 55 °C i odwoskuj ksylenem, 2 przemiany po 4 minuty każda. Odwodnić próbki 95% etanolem dwa razy i 75% etanolem dwa razy po 3 minuty każde. Myj szkiełka wodą destylowaną przez 5 minut na shakerze.</li>
	<li>W przypadku barwienia H&E należy zabarwić skrawki w roztworze ałunu hematoksyliny przez 6 minut, płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 2 minuty, różnicować 0,2% wodą amoniakalną przez 45 s i ponownie płukać pod bieżącą wodą przez 2 minuty. Następnie odwodnić skrawki 95% etanolem przez 1 min i zabarwić eozyną przez 2 min. Sekwencyjnie odwodnić, wyczyścić i zamontować.</li>
	<li>Znakowanie immunofluorescencyjne
	<ol>
		<li>Traktuj skrawki metanolem zawierającym 3%H2O2i 0,01%NaN3 przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu dezaktywacji endogennych peroksydaz. Odzyskać antygeny przez gotowanie skrawków w buforze do pobierania (1 mM EDTA i 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) w szybkowarze przez 2 minuty. Inkubować skrawki z buforem blokującym (5% surowicy koziej w PBS) przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Inkubować skrawki z przeciwciałem przeciwko hormonowi wzrostu (GH) królika (1:2 000) lub przeciwciałem przeciwko glejowemu kwasowemu białku fibrylarnemu (GFAP) (1:2 000) rozcieńczonym w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Inkubować skrawki z przeciwciałem drugorzędowym (kozie przeciwciało anty-królicze IgG-HRP, 1:300 w buforze blokującym) przez 35 minut w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wzmacniaj sygnały za pomocą biotynylu tyramidu (1:50 w buforowanej soli fizjologicznej Tris zawierającej 0,3%H2O2) przez 15 minut w temperaturze pokojowej i wizualizuj za pomocą Streptavidin-Alexa594 lub 488 (1:300 w buforze blokującym, 30 min, 37 °C).</li>
		<li>Przeciwbarwić jądra DAPI (50 mg/L w PBS) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Może nie być konieczne wzmacnianie sygnału za pomocą systemu Tyramide Signal Amplification (TSA). Alternatywnie, do wizualizacji sygnału można użyć przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluorescencją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w zestawy filtrów DAPI, Texas Red i FITC, obiektywów ×4/0,13 do ×40/0,75 i kamery o rozdzielczości 5,0 megapikseli. Użyj długości fal lasera 360, 488 i 594 nm do obrazowania odpowiednio sekcji barwionych DAPI, Alexa 488 i Alexa 594. Zoptymalizuj moc lasera (ogólnie używano 0,8) i czas ekspozycji do pożądanych poziomów dla każdego kanału. Uchwyć obraz pod kontrolą oprogramowania do akwizycji obrazu, a następnie nałóż obrazy fluorescencyjne za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazu.</li>
</ol>

<ol><li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+face+of+the+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li>
<li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li>
<li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+pituitary+development%3A+signaling+and+transcriptional+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li>
<li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+gland+development%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Dev%22%5BJournal%5D)">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li>
<li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+pituitary+gland+development+in+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse.</a> Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).</li>
<li>Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsurgical+anatomy+of+the+lateral+walls+of+the+pituitary+fossa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa.</a> Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).</li>
<li>Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size%2C+shape%2C+and+appearance+of+the+normal+female+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22AJR+Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland.</a> AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).</li>
<li>Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+proliferation+in+the+anterior+pituitary+of+the+rat+during+the+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period.</a> Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).</li>
<li>Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+postnatal+pituitary+expansion%3A+proliferation%2C+progenitors%2C+and+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification.</a> Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).</li>
<li>Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+pituitary+immunogen+for+the+induction+of+experimental+autoimmune+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li>
<li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+%28lit%29+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li>
<li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121(2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W przypadku rozwijających się mysich przysadek mózgowych uzyskanie odpowiednich przekrojów koronalnych było technicznie trudne ze względu na ich drobne i delikatne cechy oraz unikalne cechy anatomiczne 6,8. Niektóre grupy badawcze wybrały więc wycinki środkowe do analizy morfologii przysadki embrionalnej i noworodkowej11,12. Chociaż środkowa część przysadki mózgowej jest również w stanie pokazać przednie,...

Przysadka mózgowa lub przysadka mózgowa jest ważnym organem wydzielającym hormony odpowiedzialne za homeostazę1,2. Anatomicznie przysadka mózgowa jest strukturą "dwa w jednym" składającą się z przysadki mózgowej i przysadki mózgowej. Części te mają różne pochodzenie embrionalne i funkcjonują bardzo różnie. Przysadka nerwowa wywodzi się z ektodermy nerwowej i wydziela oksytocynę i hormon antydiuretyczny. Przysadka gruczołowa wywodzi się z torebki Rathkego i jest odpowiedzialna za uwalnianie hormonów, w tym hormonu wzrostu, prolaktyny, hormonu stymulującego tarczycę, hormonu folikulotropowego, hormonu luteinizującego, hormonu adrenokortykotropowego i hormonu stymulującego melanocyty3,4,5.
Przysadka mózgowa spoczywa na grzbietowej powierzchni kości klinowej (sella turcica) czaszki myszy i jest przymocowana do podłogi mózgu za pomocą delikatnej łodygi. Jest otoczony bocznie nerwami trójdzielnymi, a z przodu skrzyżowaniem wzrokowym6,7. Gruczoł ma wydłużony owalny kształt z długą osią prostopadłą do głowy głowy. Na jego grzbietowej powierzchni przysadkę nerwową i przysadkę przysadkową można łatwo odgraniczyć, przy czym pierwsza zajmuje grzbietową część przyśrodkową, a druga rozciąga się bocznie i brzusznie. Podczas rozwoju postnatalnego rozmiar przysadki gwałtownie wzrasta w pierwszym miesiącu po urodzeniu8,9. Niemniej jednak, przysadka mysza jest nadal bardzo mała ze średnią wagą 1,9 mg i długą średnicą osi ~3 mm u dorosłych10, średnicą długiej osi 2 - 2,5 mm w 21 dniu po urodzeniu (P21) i tylko 1 - 1,5 mm w P0.
Preferowany jest przekrój koronalny do wyświetlania zarówno przysadki adhenohypophysis, jak i neurohypophysis w jednym wycinku przysadki myszy. Jednak wymagane są pewne umiejętności techniczne, aby uzyskać satysfakcjonujące odcinki koronalne przysadki mózgowej od rozwijających się myszy ze względu na jej wyjątkowo mały rozmiar i wyraźną anatomię. W tym artykule wideo pokazujemy, jak przeprowadzić sekcję przysadki mózgowej myszy i przygotować przekroje koronalne przysadki na różnych etapach rozwoju.

<table><tbody><tr><td>Narzędzia/Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne proste</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>kleszcze</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td>do izolacji</td></tr><tr><td>igły przysadki mózgowej 26G (0,45 mm)</td><td>HongDa</td><td></td><td>do perfuzji przezsercowej</td></tr><tr><td>Strzykawka (1 ml)</td><td>BD</td><td>300841</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Strzykawkę (10 ml)</td><td>BD</td><td></td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Talerz 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Papier do czyszczenia soczewek</td><td>ShuangQuan</td><td></td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Mikroskop anatomiczny</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX-ILLB2-200</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Kaseta do zatapiania</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>System konsoli do zatapiania tkanek</td><td>KEDEE</td><td>KD-BM11</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>można kupić u innych dostawców</td></tr><tr><td>Prowadnice Superfrost-Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>można kupić od innych dostawców</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td>BBI</td><td>EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>dla PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>dla PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>dla PBS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td>dla PBS</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>Sigma</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna Sodowa do wstrzykiwań</td><td>SPH</td><td>H31022051</td><td>do perfuzyjnej soli fizjologicznej</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>Parafina</td><td>Thermo Fisher</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma</td><td>H9627</td><td>dla H& E barwienie</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td>dla H& E barwienie</td></tr><tr><td>królika hormon przeciw wzrostowi (GH)</td><td>Narodowy hormon</td><td></td><td>do immunologicznego przeciwciała barwiącego</td></tr><tr><td></td><td>Program</td><td></td><td></td>przysadki</tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-mysie GFAP</td><td>Sigma</td><td>G9269</td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Kozioł anty-królik IgG, HRP</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>System TSA</td><td>NEN Produkty z zakresu nauk przyrodniczych</td><td>NEL700</td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Streptawidyny, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>S32356</td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr><tr><td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11090</td><td>do barwienia immunologicznego</td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie i przygotowanie plastra koronalnego rozwijającego się mysiego przysadki mózgowej

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Przysadka mózgowa lub przysadka mózgowa jest ważnym organem wydzielającym hormony niezbędne dla homeostazy. Składa się z dwóch gruczołów o odrębnym pochodzeniu i funkcjach embrionalnych - przysadki mózgowej i przysadki mózgowej. Rozwijająca się przysadka mózgowa myszy jest malutka i delikatna o wydłużonym owalnym kształcie. Preferowany jest przekrój koronalny, aby wyświetlić zarówno przysadkę adenoprzysadkową, jak i przysadkę nerwową w jednym wycinku przysadki myszy.
Celem tego protokołu jest uzyskanie prawidłowych odcinków koronalnych przysadki mózgowej z dobrze zachowanymi architekturami tkanek od rozwijających się myszy. W tym protokole szczegółowo opisujemy, jak prawidłowo wypreparować i przetworzyć przysadkę mózgową od rozwijających się myszy. Po pierwsze, myszy są utrwalane przez przezsercową perfuzję formaldehydu przed preparacją. Następnie stosuje się trzy różne techniki preparacyjne w celu uzyskania nienaruszonej przysadki mózgowej w zależności od wieku myszy. W przypadku płodów myszy w wieku embrionalnym (E) 17,5 - 18,5 i noworodków do 4 dni preparuje się całe obszary siodła, w tym kość klinową, gruczoł i nerwy trójdzielne. W przypadku szczeniąt w wieku poporodowym (P) 5 - 14 przysadki mózgowej połączone z nerwami trójdzielnymi są preparowane jako całość. W przypadku myszy w wieku powyżej 3 tygodni przysadka mózgowa jest starannie wycinana z otaczających tkanek. Pokazujemy również, jak osadzić przysadkę mózgową we właściwej orientacji, wykorzystując otaczające tkanki jako punkty orientacyjne, aby uzyskać satysfakcjonujące odcinki koronalne. Metody te są przydatne w analizie histologicznych i rozwojowych cech przysadki mózgowej u rozwijających się myszy.

Niniejszy protokół przedstawia metodę wypreparowywania przysadek z rozwijających się myszy. W przypadku myszy noworodkowej z podstawy czaszki wypreparowano całe regiony siodła tureckiego zawierające przysadkę, nerwy trójdzielne oraz znajdującą się pod nimi kość klinową. Mała i delikatna przysadka pozostała nienaruszona podczas tego procesu (Rysunek 1A). W przypadku myszy starszych niż 5 dni wyizolowano następnie przysadki przytwierdzone do bocznych gałęzi ner...

Przedstawiamy protokół do preparowania przysadki mózgowej i przygotowania przekrojów przysadki koronalnej od rozwijających się myszy.

Rozwarstwienie i przygotowanie plastra koronalnego rozwijającego się mysiego przysadki mózgowej

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie prawidłowych odcinków koronalnych przysadki mózgowej z dobrze zachowaną architekturą tkanek od rozwijających się myszy. Ta procedura może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju przysadki, takie jak histologia przysadki, różnicowanie komórek, proliferacja i apoptoza. Główną zaletą tej techniki jest to, że rozwijające się mysie przysadki mózgowe można wypreparować bez widocznych uszkodzeń i odpowiednio zorientować do uzyskania przekrojów koronalnych.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy odkryliśmy, że w przypadku rozwoju mysich przysadek mózgowych technicznie trudno jest uzyskać odpowiednie przekroje koronalne. Po znieczuleniu i naprawieniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, użyj nożyczek, aby rozciąć kość czaszki. Następnie za pomocą kleszczy delikatnie unieś tyłomózgowie z podstawy czaszki.Następnie, przy pierwszych oznakach siodła turcica, przestań podnosić, ale przytrzymaj tyłomózgowie i użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć łodygę przysadki mózgowej i włókna nerwowe połączone z podstawą mózgu. Kontynuuj podnoszenie i usuwanie całego mózgu, aby w pełni odsłonić przysadkę mózgową. Przysadka mózgowa spoczywa na grzbietowej powierzchni kości klinowej i jest otoczona bocznie nerwami trójdzielnymi.Następnie użyj nożyczek, aby przeciąć cały obszar sellar, w tym przysadkę mózgową, boczne nerwy trójdzielne i poniżej kości klinowej. Umieść tkankę w naczyniu o średnicy 35 mm zawierającym 4% PFA i inkubuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 40 minut do 3 godzin, w zależności od wieku. Następnie użyj 10 ml PBS, aby przemyć utrwaloną tkankę przez pięć zmian po 15 minut każda.Przenieś utrwaloną tkankę do 35-milimetrowej płytki zawierającej 1 ml PBS i pod mikroskopem stereoskopowym zdysocjuj przysadkę mózgową. W przypadku przysadek P5 do P14 za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek usuń błony łączne między nerwami a kością i ostrożnie odizoluj przysadkę mózgową wraz z bocznymi nerwami trójdzielnymi jako całością, ale pozostawiając siodło tureckie. W przypadku P21 i przysadki mózgowej u dorosłych należy usunąć nerwy i błony łączne wokół przysadki mózgowej i uwolnić gruczoł z otaczających tkanek.Po odwodnieniu, oczyszczeniu ksylenu i infiltracji woskiem przeprowadzonym zgodnie z protokołem tekstowym, na konsoli do zatapiania tkanek, wyjmij próbkę z kasety i umieść ją w formie bazowej wypełnionej do połowy stopionym woskiem parafinowym. W przypadku P21 i przysadki mózgowej osoby dorosłej użyj rozgrzanych drobnych kleszczy, aby ustawić przysadkę mózgową tak, aby jej krótka oś była prostopadła do dolnej powierzchni formy podstawowej. W przypadku przysadek mózgowych od P0 do P4 należy ustawić próbki tak, aby kości klinowe były prostopadłe do dolnej powierzchni formy podstawowej.W przypadku przysadki mózgowej od P5 do P14 należy ustawić próbki tak, aby ich nerwy trójdzielne były prostopadłe do dolnej powierzchni formy podstawowej. Po ustawieniu gruczołu użyj rozgrzanych cienkich kleszczyków, aby delikatnie przytrzymać tkankę w pożądanej pozycji, aż wosk stanie się półstały na płytce chłodzącej. Uzupełnij formę stopionym woskiem parafinowym.Pozostaw blok parafiny do ostygnięcia, aż wosk całkowicie zastygnie. Schłodź blok parafiny w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 10 do 20 minut, a następnie za pomocą mikrotomu pokrój go w cienkie plasterki, precyzyjnie dostrajając położenie bloku parafiny podczas cięcia. Przeprowadzić znakowanie immunologiczne zgodnie z protokołem tekstowym.Jak pokazano tutaj, aby wypreparować przysadkę mózgową od nowonarodzonej myszy, cały obszar sellar zawierający przysadkę mózgową, nerwy trójdzielne i kość klinową pod spodem został wypreparowany z podstawy czaszki. Maleńka i delikatna przysadka mózgowa pozostała nienaruszona podczas procesu. U myszy starszych niż pięć dni wyizolowano przysadkę mózgową przyczepioną do bocznych nerwów trójdzielnych.Struktura wzrostu przysadki mózgowej odizolowanej od myszy P7 była dobrze zachowana. W tym przypadku przysadka mózgowa myszy P21 została pomyślnie odizolowana bez widocznych uszkodzeń podczas usuwania otaczającej ją tkanki. Na tym rysunku barwienie H&E prawidłowo zorientowanych odcinków koronalnych wykazuje dobrze zachowaną morfologię zarówno przysadki mózgowej, jak i przysadki mózgowej P0, P7 i P21.Wreszcie, przetworzone preparaty były również kompatybilne z znakowaniem immunofluorescencyjnym. Na przykład przysadka gruczolakowa i przysadka mózgowa wykazały specyficzne znakowanie immunologiczne odpowiednio GH i GFAP. Po opanowaniu proces od sekcji do osadzenia można przeprowadzić w ciągu 7,5 godziny u dorosłych myszy, a nawet krócej u młodszych myszy, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wypreparowaniu całego obszaru sellara, aby uniknąć dotykania przysadki mózgowej żadnymi narzędziami chirurgicznymi. Po tej procedurze można również wyizolować przysadkę, która nie została poprzedzona prefiksem. W takim przypadku należy zachować większą ostrożność, aby uniknąć niepożądanych uszkodzeń.Gruczoł należy również wypreparować tak szybko, jak to możliwe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak preparować przysadkę mózgową myszy i przygotowywać przekroje koronalne przysadki na różnych etapach rozwoju.

dissection-coronal-slice-preparation-developing-mouse-pituitary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano metodę przygotowania translacyjnie aktywnych, nienaruszonych synaptoneurosomów (SNs) z kory mózgu myszy. Metoda ta wykorzystuje nieciągły gradient gęstości Percoll-sukroza, co umożliwia szybkie przygotowanie aktywnych SNs.

Przygotowanie synaptoneurosomów z kory mózgu myszy z wykorzystaniem nieciągłego gradientu gęstości Percoll-sukroza

Opisujemy procedury przygotowania oraz rejestracji elektrofizjologicznej z plastrów mózgu, które zachowują oś grzbietowo-brzuszną przyśrodkowej kory entorynalnej (MEC). Ponieważ neuronalne kodowanie lokalizacji wykazuje organizację grzbietowo-brzuszną w obrębie MEC, procedury te ułatwiają badanie mechanizmów komórkowych istotnych dla nawigacji i pamięci.

Przygotowanie przekrojów parasagitalnych do badania organizacji grzbietowo-brzusznej przyśrodkowej kory entorynalnej gryzoni

Film pokazuje przygotowanie kolikulo-wzgórzowo-korowych wycinków mózgu z mózgów mysich szczeniąt. Izolowany mózg jest ustawiany na zaznaczonym slajdzie i cięty pod kątem, aby wyrównać słuchowe śródmózgowie i przodomózgowie w tej samej płaszczyźnie. Mózg jest następnie krojony za pomocą wibratomu, a wycinki zawierające główne struktury słuchowe śródmózgowia i przodomózgowie są przenoszone do komory przetrzymywania w celu konserwacji.

Przygotowanie plastrów kollicyczno-wzgórzowo-korowych z mózgu szczeniaka myszy

Mitoza neuronalnego progenitora jest krytycznym parametrem neurogenezy. Znaczna część naszej wiedzy na temat mitozy progenitorowej neuronów opiera się na analizie utrwalonej tkanki. Obrazowanie na żywo w embrionalnych wycinkach mózgu jest wszechstronną techniką oceny mitozy z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną w kontrolowanym środowisku.

Obrazowanie na żywo mitozy w rozwijającej się korze embrionalnej myszy

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Używając wielu kątów do cięcia mózgu szczeniaka myszy, ulepszamy poprzednio opisany ostry wycinek mózgu, który rejestruje połączenia między większością głównych struktur słuchowych śródmózgowia i przodomózgowia.

Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Wiele typów ludzkich guzów mózgu jest zlokalizowanych w określonych regionach mózgu i są trudne do wyhodowania w kulturze. Protokół ten odnosi się do roli mikrośrodowiska guza i bada nowe terapie lekowe poprzez analizę fluorescencyjnych pierwotnych komórek guza mózgu rosnących w organotypowym wycinku mózgu myszy.

System kohodowli guzów mózgu/organotypowych plastrów do badania mikrośrodowiska guza i celowanych terapii lekowych

W tym artykule szczegółowo opisujemy protokół generowania kultur neurosfery z pourodzeniowych mysich nerwowych komórek macierzystych pochodzących z głównych nisz neurogennych myszy. Neurosfery służą do identyfikacji nerwowych komórek macierzystych z tkanki mózgowej, co pozwala na oszacowanie liczby komórek prekursorowych. Co więcej, te struktury 3D mogą być powlekane w warunkach różnicowania, dając początek neuronom, oligodendrocytom i astrocytom, umożliwiając badanie losu komórek.

Izolacja i ekspansja neurosfer z postnatalnych (P1−3) mysich nisz neurogennych

Przedstawiamy praktyczny, krok po kroku, szybki protokół usuwania mózgu myszy i preparowania dyskretnych obszarów z świeżej tkanki mózgowej. Pozyskiwanie regionów mózgu do analizy molekularnej stało się rutyną w wielu laboratoriach neurobiologicznych. Te obszary mózgu są natychmiast zamrażane w celu uzyskania wysokiej jakości danych transkryptomicznych do analizy na poziomie systemu.

Mikrodysekcja mózgu myszy na funkcjonalnie i anatomicznie różne regiony

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Przysadka mózgowa jest kluczowym regulatorem układu hormonalnego organizmu. W artykule opisano rozwój organoidów z przysadki myszy jako nowatorski model 3D in vitro do badania populacji komórek macierzystych gruczołu, których biologia i funkcja pozostają słabo poznane.

Rozwój organoidów z przysadki mysiej jako modelu in vitro w celu zbadania biologii przysadkowych komórek macierzystych

Poznaj metodę rozwarstwiania i przygotowania plastrów koronalnych rozwijającej się mysiej przysadki mózgowej. Technika zachowuje architekturę tkanek i umożliwia badanie histologii oraz różnicowania komórek.

Rozwarstwienie i przygotowanie plastra koronalnego rozwijającego się mysiego przysadki mózgowej

Przeglądaj więcej filmów