Metodologia indukcji plwociny i przetwarzania laboratoryjnego

Technika indukowanej plwociny została opracowana na początku lat 90-tych. Technika ta została zaproponowana w celu zbadania nowych informacji na temat obturacyjnych chorób dróg oddechowych, takich jak astma, POChP, a ostatnio pojawiło się również zainteresowanie poszukiwaniem nowych informacji na temat zwłóknienia płuc. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo nieinwazyjna w przeciwieństwie do bronchoskopii.

Przetwarzanie wymaga pracy laboratoryjnej i wymaga czasu, więc jest dość wymagające, czasochłonne i wymaga pewnej wiedzy specjalistycznej w laboratorium, więc jest to oczywiście technika, którą trudno uzyskać w każdym ośrodku. Technika indukowanej plwociny składa się z dwóch części, pierwsza część to indukcja, a druga część to przetwarzanie. Przed indukcją plwociny musimy wykonać spirometrię, która polega na ocenie objętości i szybkości przepływu, jaką pacjent jest w stanie wytworzyć.

Musimy to zrobić, ponieważ indukcja plwociny sama w sobie może powodować skurcz oskrzeli, więc bezwzględnie musimy znać wartość wyjściową spirometrii pacjentów. Dlatego najpierw wykonujemy spirometrię, a następnie podajemy pacjentom leki rozszerzające oskrzela, zwykle podajemy 400 mikrogramów salbutamolu, aby maksymalnie otworzyć drogi oddechowe pacjentów, a także zapobiec skurczowi oskrzeli, który może wystąpić w fazie indukcji. Po 15 minutach ponownie mierzymy spirometrię, aby uzyskać to, co nazywamy wartością wyjściową spirometrii, a w szczególności patrzymy na FEV1, czyli objętość, którą pacjent jest w stanie wydychać w ciągu jednej sekundy.

Wlej wodę destylowaną do komory nebulizatora do zalecanego poziomu. Umieść czystą filiżankę w komorze nebulizatora. Przykryj napełnioną nakrętkę odpowiednią pokrywką.

Napełnij kubek 50 ml hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej 5%, jeśli FEV1 po leku rozszerzającym oskrzela jest większy niż 65%, lub 50 ml soli fizjologicznej izotonicznej 9%, jeśli FEV1 po rozszerzeniu oskrzeli jest mniejszy niż 65%. Dodać do filiżanki 1,75 roztworu siarczanu salbutamolu o stężeniu pięciu miligramów na ml. Podłącz rurki i zawory zgodnie z instrukcjami producenta.

Technika musi być wykonywana pod nadzorem lekarza. Wyjaśnij pacjentowi zasadę testu. Poproś pacjenta o użycie klipsa na nos.

Uruchom nebulizator i wybierz najniższy poziom aerozolu i ustawienia wentylatora. Poproś pacjenta o wdychanie aerozolu przez ustnik z oddychaniem oddechowym. Poziom aerozolu i ustawienie wentylatora może być zwiększony w zależności od tolerancji pacjenta.

W przypadku ucisku w klatce piersiowej lub dyskomfortu oddechowego należy przerwać zabieg i wykonać spirometrię w celu zmierzenia wartości FEV1 pacjenta. Po pięciu minutach inhalacji lub w przypadku kaszlu lub nudności należy przerwać działanie nebulizatora. Poproś pacjenta o zdjęcie klipsa na nos, wypłukanie ust i dwukrotne płukanie gardła wodą z kranu, a następnie wylanie tej wody do zlewu.

Następnie, jako pacjent, aby odkrztusić plwocinę i wypluć to, co wydostaje się z gardła do plastikowego pojemnika. Wykonaj pierwszy manewr oddechowy, aby zmierzyć FEV1. Po każdym wstępnym ustaleniu produkcji plwociny mierzymy wartość FEV1.

Jeśli wartość FEV1 spadnie o więcej niż 20%, przerywamy zabieg i podajemy pacjentom nebulizację bromku ipratropium, który jest lekiem antycholinergicznym, który będzie działał w połączeniu z agonistami beta-dwa, które już podaliśmy podczas zabiegu. Jeśli wartość FEV1 nie spadnie o więcej niż 20%, przeprowadzamy zabieg przez łączny czas od 10 do 20 minut, w zależności od jakości i objętości plwociny wytwarzanej przez pacjenta. Po otrzymaniu próbki plwociny przechowuj ją w lodówce do czasu przetworzenia.

Tak więc druga część składa się z przetwarzania plwociny, a w tym celu musimy najpierw przygotować dwa roztwory, których zamierzamy użyć do tego przetwarzania. Musimy więc przygotować Ditiothreitol znany również jako DTT. Roztwór należy przygotować przez rozcieńczenie naziemnej telewizji cyfrowej sterylną wodą w celu uzyskania roztworu o stężeniu 6,5 milimolowym.

Należy więc unikać wystawiania naziemnej telewizji cyfrowej na działanie powietrza z otoczenia, a do tego używamy strzykawki i igły. Po drugie, musisz przygotować roztwór błękitu trypanowego, a w tym celu musisz rozcieńczyć DPBS błękitem trypanowym, aby uzyskać roztwór 0,08%Więc jeśli chodzi o plwocinę, musisz przenieść całą plwocinę do plastikowej probówki o stożkowym dnie o pojemności 50 ml i zważyć próbkę. Dodać trzykrotnie wagową ilość roztworu DPBS.

Powoli wirować próbkę przez 30 sekund, odwirować przy 800 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant w plastikowej probówce o pojemności 50 ml ze stożkowym dnem, po przefiltrowaniu przez dwie pojedyncze warstwy sterylnej gazy. Umieść supernatant w plastikowych probówkach o pojemności 2 ml i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Należy pamiętać, że próbki supernatantu są dla nas przydatne jako trójfazowy składnik plwociny. Jeśli objętość palety komórek jest mniejsza niż 5 ml, dodaj DPBS, aby osiągnąć objętość 5 ml zawiesiny komórek. Rozcieńczyć zawiesinę komórek jedną objętością naziemnej telewizji cyfrowej o stężeniu 6,5 milimola.

Kołysz zawiesiną ogniw przez 20 minut w temperaturze pokojowej z pracownikiem laboratoryjnym. Rozcieńczyć zawiesinę komórek co najmniej trzykrotnie za pomocą DPBS. Odwirować rozcieńczoną zawiesinę komórkową o sile 550 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant. Zawiesić paletę komórek w około jednym ml DPBS. Oceń i zapisz dokładną objętość zawiesiny komórek.

Dodać 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do 50 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu błękitu trypanowego i homogenizować. Umieść próbkę pod szkiełkiem nakrywkowym cytometru hemotylowego i umieść ją pod mikroskopem optycznym. Oceń stężenie komórek w zawiesinie komórek, procent komórek płaskonabłonkowych i procent żywotności komórek niepłaskonabłonkowych.

Rozcieńczyć przydział zawiesiny za pomocą DPBS, aby uzyskać co najmniej 350 mikrolitrów zawiesiny komórek przy 500 000 komórek na ml. Koncentrator ogniw należy zamontować zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej z trzech komór koncentratora komórek.

Wirować dwie minuty w temperaturze 150 g w temperaturze pokojowej w wirówce cyto. Odrzucić supernatant. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu.

Zabejcuj szkiełko za pomocą div quick lub zestawu do barwienia niklowego zgodnie z instrukcją producenta. Zamontować za pomocą medium montażowego i szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełko pod mikroskopem optycznym z zanurzeniami olejowymi.

Policz co najmniej 500 komórek niepłaskonabłonkowych, neutrofili, eozynofili, makrofagów, limfocytów i komórek nabłonkowych oraz zapisz wartości bezwzględne oraz procent i typ komórki. Jeśli chodzi o wyniki, za pomocą hemocytometru musimy policzyć żywe komórki niepłaskonabłonkowe, które są bezbarwne. Również martwe komórki niepłaskonabłonkowe, które są zabarwione na niebiesko.

I komórki płaskonabłonkowe. Komórki te są komórkami nabłonkowymi, które pochodzą z jamy ustnej. Są duże, więc łatwo je rozpoznać w porównaniu z małymi komórkami ludzkimi.

Trzeba więc unikać liczenia bakterii, drożdży, czy złomu. Jeśli zawiesina komórkowa zawiera więcej niż 80% komórek płaskonabłonkowych, próbka ta jest uważana za słabej jakości i nieodpowiednią do szkiełka cytospinowego. W związku z tym próbkę tę uznaje się za nieudaną.

Liczenie barwionej cytospiny przeprowadza się zgodnie z kolorem komórek i ich morfologią. Neutrofile, główne cechy to wielopłatkowe jądro, które ułatwiało identyfikację komórek. Te komórki są okrągłe, małe i zabarwione na neutralny róż

Eozynofile, komórki te składają się z czerwonych granulek, łatwych do zidentyfikowania. Wielkość tych komórek jest zbliżona do neutrofili. Makrofagi są od dwóch do pięciu razy większe niż neutrofile i są zabarwione na niebiesko.

Cytoplazma może zawierać szczątki i wakuole. Limfocyty, te komórki są okrągłe i małe, zabarwione na niebiesko i mają duże i gęste jądro. Komórki nabłonka mają kształt kolumnowy, są zabarwione na różowo i często mają rzęski na górze.

Oto kilka przykładów nieczytelnych próbek cytospinowych z ponad 80% komórek płaskonabłonkowych. Myślę, że jest to technika, która jest bardzo przydatna, jednak musimy być bardzo ostrożni, ponieważ indukcja plwociny musi być wykonywana pod nadzorem lekarza, ale technika indukcji plwociny daje wiele informacji o stanie zapalnym pacjentów w drogach oddechowych. Może pozwolić na pomiar różnych markerów biochemicznych w supernatancie, a także można mierzyć różne rzeczy na częściach komórkowych, więc plwocina indukowana pozwala na wykonanie cytometrii przepływowej, proteomiki, transkryptomiki, a nawet genomiki.