Name: Metodologia indukcji plwociny i przetwarzania laboratoryjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Poznaj metodę indukcji plwociny w chorobach układu oddechowego, w tym astmie i POChP. Technika ta umożliwia nieinwazyjną analizę komórkową i badanie markerów zapalnych w próbkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Szpital Uniwersytecki w Liège (CHU Liege). Za produkcję wideo dziękujemy firmie "Instants productions". Składamy również wyrazy uznania Cedricowi François, pacjentowi, który wystąpił w filmie.

Wszystkie metody opisane w tej sekcji zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Szpitala Uniwersyteckiego w Liège i wszyscy zdrowi uczestnicy wyrazili pisemną zgodę na uczestnictwo.
1.Indukcja plwociny
<ol>
	<li>Spirometria przed i po leczeniu rozszerzającym oskrzela
	<ol>
		<li>Wykonaj spirometrię (manewr natężonej objętości wydechowej w ciągu 1 sekundy [FEV1] i manewru namuszonej pojemności życiowej [FVC]) zgodnie ze standardowymi kryteriami American Thoracic Society (ATS)/European Respiratory Society (ERS)12.</li>
		<li>Podać 400 μg wziewnego salbutamolu z inhalatora z dozownikiem (MDI) przez urządzenie dystansowe. 
		UWAGA: U dorosłych działania niepożądane wziewnego salbutamolu obejmują drżenie i tachykardię13.</li>
		<li>Powtórz spirometrię (manewr FEV1 i FVC) 15 minut później, zgodnie ze standardowymi kryteriami ATS/ERS12.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie nebulizatora ultradźwiękowego 
	UWAGA: Nebulizator musi być dokładnie oczyszczony i zdezynfekowany przed każdym użyciem, zgodnie z instrukcjami producenta.
	<ol>
		<li>Napełnij komorę nebulizatora wodą destylowaną do zalecanego poziomu.</li>
		<li>Umieść czystą filiżankę w komorze nebulizatora.</li>
		<li>Przykryj kubek odpowiednią pokrywką.</li>
		<li>Napełnij kubek 50 ml hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej (5%) dla pacjenta z FEV1 po rozszerzeniu oskrzeli >65% przewidywanych lub 50 ml izotonicznego roztworu soli fizjologicznej (0,9%) dla pacjenta z FEV po rozszerzeniu oskrzeli 1≤65% przewidywanym.</li>
		<li>Dodać 1,75 ml roztworu siarczanu salbutamolu (5 mg/ml) do filiżanki.</li>
		<li>Podłącz rurki i zawory zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nebulizacja i pobieranie plwociny 
	UWAGA: Technikę należy wykonywać pod nadzorem lekarza.
	<ol>
		<li>Wyjaśnij pacjentowi procedurę.</li>
		<li>Poproś pacjenta o użycie klipsa na nos.</li>
		<li>Włącz nebulizator i wybierz najniższy poziom ustawień aerozolu i wentylatora.</li>
		<li>Poproś pacjenta o wdychanie aerozolu przez ustnik z oddychaniem oddechowym przez 5 min. 
		UWAGA: Ustawienia aerozolu i wentylatora mogą zostać zwiększone w zależności od tolerancji pacjenta.
		<ol>
			<li>W przypadku nieznośnego kaszlu lub nudności przerwij procedurę i przejdź do kroku 1.3.5.</li>
			<li>W przypadku ucisku w klatce piersiowej lub dyskomfortu w oddychaniu przejdź do kroku 1.3.8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wyłącz nebulizator.</li>
		<li>Poproś pacjenta, aby zdjął klips na nos, przepłukał usta wodą i dwukrotnie przepłukał gardło przed wyrzuceniem go do zlewu. 
		UWAGA: Komórki śliny mogą zanieczyścić próbkę plwociny i doprowadzić do tego, że próbka stanie się bezużyteczna.</li>
		<li>Poproś pacjenta, aby odkrztusił plwocinę do plastikowego pojemnika.</li>
		<li>Wykonaj spirometrię (manewr wymuszonego wydechu), aby zmierzyć FEV1.</li>
		<li>Oceń spadek FEV1 w następujący sposób: (FEV1 mierzony w kroku 3,8 [ml]) - (FEV 1 po rozszerzeniu oskrzeli mierzony w kroku 1,3 [ml]) / (FEV 1 po rozszerzeniu oskrzela mierzony w kroku 1,3 [ml])*100.
		<ol>
			<li>Jeśli FEV1 spadnie o 20% lub więcej w stosunku do wartości po rozszerzeniu oskrzeli, należy przerwać procedurę. Zmierz FEV1 ponownie 10 minut później. Jeśli FEV1 spadnie o 20% lub więcej, należy poprosić lekarza o podanie nebulizowanego bromku ipratropium (0,25 mg/2 ml) i pozostawać pod obserwacją lekarską. Przejdź do kroku 1.3.10.</li>
			<li>Jeśli FEV1 nie spadnie o 20% lub więcej od wartości po rozszerzeniu oskrzeli, powtórz kroki od 3,2 do 3,9 raz do trzech razy, aby osiągnąć całkowity czas nebulizacji od 10 do 20 minut 
			UWAGA: Całkowity czas nebulizacji będzie zależał od jakości (obecność zatyczek lub lepkich części) i ilości próbki plwociny. Jeśli jakość i/lub ilość próbki jest niska po 10 minutach nebulizacji, procedurę należy przedłużyć, aby osiągnąć całkowity czas nebulizacji od 15 do 20 minut.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Próbkę plwociny należy przechowywać w lodówce do czasu przetworzenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przetwarzanie plwociny
UWAGA: Przetwarzaj plwocinę w ciągu 3 godzin od pobrania, aby uzyskać optymalną żywotność komórek.
Uwaga: Noś fartuch laboratoryjny, rękawice ochronne i gogle.
<ol>
	<li>Przygotowania wstępne
	<ol>
		<li>Stężony roztwór ditiotreitolu (środek mukolityczny) należy 10-krotnie rozcieńczyć sterylną wodą destylowaną, aby otrzymać 10 ml roztworu o stężeniu 6,5 mM, zgodnie z instrukcjami producenta. 
		UWAGA: Aby zapobiec mieszaniu się stężonego roztworu ditiotreitolu z powietrzem otoczenia, należy pobrać roztwór z fiolki za pomocą sterylnej strzykawki i igły. Po otwarciu fiolkę ze stężonym roztworem należy przechowywać w temperaturze pokojowej i zużyć w ciągu 5 dni. Rozcieńczony roztwór przygotowuje się codziennie. 
		UWAGA: Ze względu na ryzyko podrażnienia oczu i skóry należy nosić sprzęt ochronny (odzież, rękawice i okulary).</li>
		<li>Roztworu błękitu trypanowego (0,4%) należy 5-krotnie rozcieńczyć roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco, aby otrzymać 0,08% roztwór. Rozcieńczony roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej i zużyć w ciągu 2 tygodni. 
		UWAGA: Ze względu na zagrożenia rakotwórcze należy nosić sprzęt ochronny (odzież, rękawice i okulary).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie supernatantu plwociny
	<ol>
		<li>Przenieść całą plwocinę do plastikowej probówki o stożkowym dnie o pojemności 50 ml i zważyć próbkę.</li>
		<li>Dodać 3-krotną wagę roztworu DPBS.</li>
		<li>Powoli wirować próbkę przez 30 sekund.</li>
		<li>Wirować przy 800 x g i 4 °C przez 10 min.</li>
		<li>Przefiltrować próbkę przez 2 pojedyncze warstwy sterylnej gazy i zebrać supernatant w plastikowej probówce o stożkowym dnie o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Porcję supernatantu rozmieścić w plastikowych probówkach o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Próbki sklarowanego osadu są przydatne do oznaczania składników fazy płynnej plwociny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mukoliza plwociny
	<ol>
		<li>W razie potrzeby dodać DPBS do osadu komórkowego, aby osiągnąć całkowitą objętość zawiesiny komórek wynoszącą 5 ml.</li>
		<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek 1 objętością 6,5 mM ditiotreitolu. Użyj bujaka stołowego, aby kołysać zawiesiną ogniw przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
		<ol>
			<li>Powtórz co najmniej 3 razy z DPBS.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odwirować rozcieńczoną zawiesinę komórkową w temperaturze 550 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Odrzucić sklarowany osad.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w około 1 ml DPBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena właściwości jakościowych próbki plwociny (stężenie komórek, zanieczyszczenie komórek płaskonabłonkowych i żywotność metodą wykluczenia błękitu trypanowego) za pomocą liczby hemocytometrów
	<ol>
		<li>Oceń i zapisz dokładną objętość zawiesiny komórek.</li>
		<li>Dodać 50 μl zawiesiny komórkowej do 50 μl 0,08% roztworu błękitu trypanowego i homogenizować.</li>
		<li>Umieść próbkę pod szkiełkiem nakrywkowym hemocytometru (komora Thoma) i umieść ją pod mikroskopem optycznym (400X).</li>
		<li>Policz komórki płaskonabłonkowe, żywe komórki niepłaskonabłonkowe (komórki bezbarwne) i martwe komórki niepłaskonabłonkowe (komórki koloru niebieskiego). 
		UWAGA: W przypadku zbyt małej lub zbyt dużej gęstości komórek, należy zagęścić lub rozcieńczyć zawiesinę komórek i powtórzyć kroki 2.4.1-2.4.3.</li>
		<li>Ocenić stężenie komórek w zawiesinie, procent komórek płaskonabłonkowych i procent żywotności komórek niepłaskonabłonkowych. 
		UWAGA: Obliczyć całkowitą liczbę komórek niepłaskonabłonkowych/g plwociny: stężenie komórek w zawiesinie (krok 5.4) * objętość zawiesiny komórek (krok 4.8) * % komórek niepłaskonabłonkowych / masa próbki plwociny (krok 2.2.1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie barwionego szkiełka cytospinowego z zawiesiną komórek i przechowywaniem resztek komórek, jeśli jest to potrzebne 
	UWAGA: Jeśli zawiesina komórek zawiera więcej niż 80% komórek płaskonabłonkowych, próbka jest uważana za niskiej jakości i nieodpowiednią do cytospin slide14. W takim przypadku przerwij przetwarzanie i uznaj tę próbkę za nieudaną.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć podwielokrotność zawiesiny komórkowej za pomocą DPBS, aby uzyskać co najmniej 350 μl zawiesiny komórkowej przy 500 000 komórek/ml.</li>
		<li>Koncentrator komórek należy zmontować zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Wypełnić każdą z 3 komór koncentratora komórek 100 μl tej zawiesiny komórek.</li>
		<li>W cytowirówce wirować przez 2 minuty w temperaturze 150 x g i temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatanty.</li>
		<li>Zdemontuj koncentrator komórek zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu. 
		UWAGA: Na tym etapie pozostałe komórki mogą być przechowywane w odpowiednim buforze, jeśli jest to potrzebne do dalszych eksperymentów.</li>
		<li>Zabejcuj szkiełko dostępnym w handlu zestawem do barwienia (patrz Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Zamontuj szkiełko za pomocą odpowiedniego medium montażowego i szkiełka nakrywkowego.</li>
		<li>Umieść szkiełko pod mikroskopem optycznym (600X) z zanurzeniem w olejku.</li>
		<li>Policz co najmniej 500 komórek niepłaskonabłonkowych: neutrofile, eozynofile, makrofagi, limfocyty i komórki nabłonkowe. 
		UWAGA: Różnicowe zliczanie komórek jest zwykle wykonywane tylko przez jednego lub dwóch dedykowanych i przeszkolonych obserwatorów, aby ograniczyć rozbieżności między obserwatorami.</li>
		<li>Rejestruj wartości bezwzględne i procentowe każdego typu komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jayaram, L., Parameswaran, K., Sears, M. R., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum+cell+counts%3A+their+usefulness+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice.</a> European Respiratory Journal. 16 (1), 150-158 (2000).</li>
<li>Pavord, I. D., Pizzichini, M. M., Pizzichini, E., Hargreave, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+induced+sputum+to+investigate+airway+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">The use of induced sputum to investigate airway inflammation.</a> Thorax. 52 (6), 498-501 (1997).</li>
<li>Leigh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+induction+for+diagnosis+of+Pneumocystis+carinii+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Sputum induction for diagnosis of Pneumocystis carinii pneumonia.</a> The Lancet. 334 (8656), 205-206 (1989).</li>
<li>Pin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+induced+sputum+cell+counts+to+investigate+airway+inflammation+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma.</a> Thorax. 47 (1), 25-29 (1992).</li>
<li>Pizzichini, M. M. M., Leigh, R., Djukanović, R., Sterk, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+of+sputum+induction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Safety of sputum induction.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 9s-18s (2002).</li>
<li>Delvaux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nebulised+salbutamol+administered+during+sputum+induction+improves+bronchoprotection+in+patients+with+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Nebulised salbutamol administered during sputum induction improves bronchoprotection in patients with asthma.</a> Thorax. 59 (2), 111-115 (2004).</li>
<li>Efthimiadis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+sputum+processing+for+cell+counts%2C+immunocytochemistry+and+in+situ+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 19s-23s (2002).</li>
<li>Kelly, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12361360">Analysis of fluid-phase mediators.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 24s-39s (2002).</li>
<li>Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+sputum%3A+assessing+inflammation+and+immune+response+elements+in+the+bronchial+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Inhalation+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways.</a> Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).</li>
<li>Vignola, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Future directions.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 51s-55s (2002).</li>
<li>Brightling, C. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16685028">Clinical applications of induced sputum.</a> Chest. 129 (5), 1344-1348 (2006).</li>
<li>Miller, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16055882">Standardisation of spirometry.</a> European Respiratory Journal. 26 (2), 319-338 (2005).</li>
<li>Global Initiative for Asthma (GINA) Global Strategy for Asthma Management and Prevention. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ginasthma.org/">http://www.ginasthma.org/</a> (2017).</li>
<li>Szefler, S. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3390196/">Asthma outcomes: biomarkers.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3 Suppl), S9-S23 (2012).</li>
<li>Douwes, J., Gibson, P., Pekkanen, J., Pearce, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-eosinophilic+asthma%3A+importance+and+possible+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Non-eosinophilic asthma: importance and possible mechanisms.</a> Thorax. 57 (7), 643-648 (2002).</li>
<li>Schleich, F. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+concomitant+local+and+systemic+eosinophilia+in+uncontrolled+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Importance of concomitant local and systemic eosinophilia in uncontrolled asthma.</a> The European Respiratory Journal. 44 (1), 97-108 (2014).</li>
<li>Demarche, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+sputum+and+systemic+inflammation+in+asthma+phenotypes%3A+are+paucigranulocytic+asthmatics+really+non-inflammatory%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+pulmonary+medicine%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of sputum and systemic inflammation in asthma phenotypes: are paucigranulocytic asthmatics really non-inflammatory?</a> BMC pulmonary medicine. 16, 46(2016).</li>
<li>Pavord, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+applications+of+assessment+of+airway+inflammation+using+induced+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal.+Supplement%22%5BJournal%5D)">Clinical applications of assessment of airway inflammation using induced sputum.</a> The European Respiratory Journal. Supplement. 37, 40s(2002).</li>
<li>Guiot, J., Henket, M., Corhay, J. L., Moermans, C., Louis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sputum+biomarkers+in+IPF%3A+Evidence+for+raised+gene+expression+and+protein+level+of+IGFBP-2%2C+IL-8+and+MMP-7%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Sputum biomarkers in IPF: Evidence for raised gene expression and protein level of IGFBP-2, IL-8 and MMP-7.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0171344(2017).</li>
<li>Green, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+exacerbations+and+sputum+eosinophil+counts%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomised controlled trial.</a> Lancet. 360 (9347), 1715-1721 (2002).</li>
<li>Siva, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eosinophilic+airway+inflammation+and+exacerbations+of+COPD%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Eosinophilic airway inflammation and exacerbations of COPD: a randomised controlled trial.</a> European Respiratory Journal. 29 (5), 906-913 (2007).</li>
<li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+infiltration%2C+ICAM-1+expression%2C+and+eosinophil+chemotactic+activity+in+asthmatic+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell infiltration, ICAM-1 expression, and eosinophil chemotactic activity in asthmatic sputum.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 466-472 (1997).</li>
<li>Maes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+inflammatory+phenotypes+show+differential+microRNA+expression+in+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Asthma inflammatory phenotypes show differential microRNA expression in sputum.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1433-1446 (2016).</li>
<li>Moermans, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+systemic+cellular+inflammation+and+cytokine+release+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Local and systemic cellular inflammation and cytokine release in chronic obstructive pulmonary disease.</a> Cytokine. 56 (2), 298-304 (2011).</li>
<li>Gibson, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://erj.ersjournals.com/content/20/37_suppl/44s">Sputum induction in children.</a> European Respiratory Journal. 20 (37 suppl), 44s-46s (2002).</li>
<li>Reddel, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Official+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society+Statement%3A+Asthma+Control+and+Exacerbations%3A+Standardizing+Endpoints+for+Clinical+Asthma+Trials+and+Clinical+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Official American Thoracic Society/European Respiratory Society Statement: Asthma Control and Exacerbations: Standardizing Endpoints for Clinical Asthma Trials and Clinical Practice.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 180 (1), 59-99 (2009).</li>
<li>Duncan, C. J. A., Lawrie, A., Blaylock, M. G., Douglas, J. G., Walsh, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+eosinophil+apoptosis+in+induced+sputum+correlates+with+asthma+severity%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Reduced eosinophil apoptosis in induced sputum correlates with asthma severity.</a> The European Respiratory Journal. 22 (3), 484-490 (2003).</li>
<li>Demarche, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asthma+Control+and+Sputum+Eosinophils%3A+A+Longitudinal+Study+in+Daily+Practice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%3A+In+Practice%22%5BJournal%5D)">Asthma Control and Sputum Eosinophils: A Longitudinal Study in Daily Practice.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 5 (5), 1335-1343 (2017).</li>
<li>Belda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+sputum+cell+counts+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induced sputum cell counts in healthy adults.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (2 Pt 1), 475-478 (2000).</li>
<li>Brooks, C. R., Gibson, P. G., Douwes, J., Dalen, C. J. V., Simpson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+airway+neutrophilia+and+ageing+in+asthmatics+and+non-asthmatics%3A+Airway+neutrophilia+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">Relationship between airway neutrophilia and ageing in asthmatics and non-asthmatics: Airway neutrophilia and ageing.</a> Respirology. 18 (5), 857-865 (2013).</li>
<li>Thomas, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+age+on+induced+sputum+differential+cell+counts+in+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The influence of age on induced sputum differential cell counts in normal subjects.</a> Chest. 126 (6), 1811-1814 (2004).</li>
<li>Chalmers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoking+and+airway+inflammation+in+patients+with+mild+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Smoking and airway inflammation in patients with mild asthma.</a> Chest. 120 (6), 1917-1922 (2001).</li>
<li>Hansel, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Evaluation+of+Nasal+and+Bronchial+Cytokines+and+Chemokines+Following+Experimental+Rhinovirus+Infection+in+Allergic+Asthma%3A+Increased+Interferons+%28IFN-%CE%B3+and+IFN-%CE%BB%29+and+Type+2+Inflammation+%28IL-5+and+IL-13%29%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Evaluation of Nasal and Bronchial Cytokines and Chemokines Following Experimental Rhinovirus Infection in Allergic Asthma: Increased Interferons (IFN-γ and IFN-λ) and Type 2 Inflammation (IL-5 and IL-13).</a> EBioMedicine. 19, 128-138 (2017).</li>
<li>Popov, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+technical+factors+influencing+the+induction+of+sputum+for+cell+analysis%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis).</a> European Respiratory Journal. 8 (4), 559-565 (1995).</li>
<li>Holz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+sputum+composition+between+two+inductions+performed+on+consecutive+days%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Changes in sputum composition between two inductions performed on consecutive days.</a> Thorax. 53 (2), 83-86 (1998).</li>
<li>Louis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+processing+on+inflammatory+markers+in+induced+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">The effect of processing on inflammatory markers in induced sputum.</a> European Respiratory Journal. 13 (3), 660-667 (1999).</li>
<li>Fahy, J. V., Liu, J., Wong, H., Boushey, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+Biochemical+Analysis+of+Induced+Sputum+from+Asthmatic+and+from+Healthy+Subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Review+of+Respiratory+Disease%22%5BJournal%5D)">Cellular and Biochemical Analysis of Induced Sputum from Asthmatic and from Healthy Subjects.</a> American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1126-1131 (1993).</li>
<li>Pizzichini, E., Pizzichini, M. M., Efthimiadis, A., Hargreave, F. E., Dolovich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+inflammatory+indices+in+induced+sputum%3A+effects+of+selection+of+sputum+to+minimize+salivary+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Measurement of inflammatory indices in induced sputum: effects of selection of sputum to minimize salivary contamination.</a> The European Respiratory Journal. 9 (6), 1174-1180 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda indukowanej plwociny jest przydatnym narzędziem do badania przedziału dróg oddechowych. Istnieje kilka możliwych zastosowań tej techniki. Po pierwsze, może poszerzyć wiedzę na temat komórek odpornościowych i mechanizmów związanych z różnymi chorobami układu oddechowego. Na przykład technika ta pozwoliła na zbadanie stanu zapalnego dróg oddechowych w dużych kohortach pacjentów i wykazano, że około połowa pacjentów z astmą charakteryzuje się nieprawidłowym eozynofilowym zapaleniem dróg oddechowych 15,16,17, podczas gdy pacjenci z POChP zwykle wykazują podwyższoną liczbę neutrofili w plwocinie 18. Technika ta przyczyniła się również do lepszego scharakteryzowania zapalenia dróg oddechowych u pacjentów z idiopatycznym zwłóknieniem płuc oraz do wskazania mediatorów, które mogą przyczyniać się do tej choroby19. Po drugie, technika indukowanej plwociny może być przydatna do przewidywania odpowiedzi na leczenie. Na przykład wykazano, że obecność nieprawidłowego odsetka eozynofili w plwocinie jest predykcyjnym markerem odpowiedzi na kortykosteroidy11,18. W astmie i POChP wykazano, że dostosowanie dawki kortykosteroidów w celu normalizacji odsetka eozynofili w plwocinie jest skuteczniejsze w zmniejszaniu liczby zaostrzeń niż dostosowywanie leczenia zgodnie z aktualnymi wytycznymi klinicznymi 11,20,21. Po trzecie, analiza plwociny może pomóc w opracowaniu terapii celowanych. Na przykład obecność nieprawidłowej liczby neutrofili plwociny w POChP i u niektórych pacjentów z astmą doprowadziła do opracowania terapii przeciwneutrofilowych11. Po czwarte, technika ta może odgrywać rolę w diagnozie. Na przykład obecność eozynofilii plwociny jest niezbędna do postawienia diagnozy nieastmatycznego eozynofilowego zapalenia oskrzeli11.
Oprócz uzyskania różnicowej liczby komórek, technika indukowania plwociny pozwala również na wykonanie wielu dodatkowych analiz, poprzez badanie supernatantu plwociny lub komórek plwociny. Przykłady z supernatantem plwociny obejmują analizę mediatorów 8,19,22 i ocenę aktywności chemotaktycznej próbki pod kątem eozynofili 22. Z komórek plwociny RNA można wyekstrahować i wykorzystać do analiz ekspresji mikroRNA lub genów 19,23 . Komórki plwociny można również analizować za pomocą cytometrii przepływowej 9,23, która umożliwia m.in. immunofenotypowanie i sortowanie komórek. Ponadto komórki plwociny mogą być hodowane10, a ich produkcja mediatorów może być mierzona in vitro24. Warto zauważyć, że w tym przypadku zawartość mediatora różni się od tego, co można znaleźć w supernatancie plwociny. Rzeczywiście, na mediatory w supernatancie plwociny mogą wpływać wydzieliny z komórek rezydujących w drogach oddechowych i wysięk z osocza, w przeciwieństwie do modelu hodowli komórek plwociny24. Wreszcie, immunocytochemię i hybrydyzację in situ można również przeprowadzić przy użyciu komórek plwociny7.
Technika indukowanej plwociny ma pewne ograniczenia. Indukcja musi być wykonana pod nadzorem lekarza. Istotne jest również, aby operator udzielał pacjentom dokładnych instrukcji. Inne ograniczenia obejmują współpracę i stan zdrowia pacjentów, ponieważ konieczne są wysiłki oddechowe. Jeśli chodzi o wykonalność tej techniki u dzieci, kilka badań wykazało, że była ona skuteczna i bezpieczna u dzieci w wieku powyżej 6 lat25. Brakuje danych dotyczących dzieci w wieku <6 lat25, ale jest prawdopodobne, że indukcja plwociny jest trudna do przeprowadzenia u tych dzieci14. Technika ta jest obecnie ograniczona do usług badawczych i specjalistycznych ośrodków, ponieważ jest wymagająca technicznie, czasochłonna i wymaga przeszkolonego personelu1. Innym ograniczeniem jest to, że technika indukcji i analizy plwociny nie zawsze jest skuteczna, co oznacza, że nie zawsze uzyskuje się czytelną cytospinę26. Jednak wskaźnik sukcesu wynosi zwykle około 80% w różnych kohortach pacjentów 4,26,27,28,29. Wreszcie, należy zachować ostrożność podczas porównywania różnych kohort pacjentów pod kątem dopasowania wieku, ponieważ wykazano, że wpływa to na liczbę komórek plwociny30,31. Podobnie, inne parametry, takie jak płeć i nawyki tytoniowe, muszą być dopasowane, ponieważ mogą one również zakłócać liczbę komórek plwociny29,32. Gdy dopasowanie pacjentów nie jest możliwe, innym sposobem uwzględnienia wieku, płci lub palenia tytoniu jest dostosowanie analizy statystycznej do tych cech.
W porównaniu z innymi technikami, które umożliwiają pobieranie komórek z dróg oddechowych, takimi jak biopsje i płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe, metoda indukowanej plwociny ma tę zaletę, że jest prosta, dobrze tolerowana, bezpieczna, powtarzalna, opłacalna i nieinwazyjna. Zalety te pozwalają na wykonywanie techniki indukowanej plwociny na dużą skalę i wielokrotnie w czasie, co czyni ją alternatywą z wyboru dla pobierania próbek z dróg oddechowych. Bronchosorpcja jest kolejną techniką pozwalającą na pobranie płynu z błony śluzowej w celu oceny mediatorów dróg oddechowych33. Chociaż technika ta (wymagająca bronchoskopii) jest bardziej inwazyjna niż plwocina indukowana, ma zalety polegającą na unikaniu zanieczyszczenia śliną i uzyskiwaniu wyższych stężeń mediatorów niż w przypadku płukania oskrzelowo-pęcherzykowego33.
Krytyczne kroki wymagają uwagi w protokole. Po pierwsze, należy zachować ostrożność w odniesieniu do stężenia soli fizjologicznej i czasu indukcji, ponieważ te dwa parametry mogą mieć wpływ na wyniki i dlatego muszą być standaryzowane34,35. Po drugie, mukoliza z naziemną telewizją cyfrową jest ważnym etapem przetwarzania. W porównaniu z PBS, wykazano, że DTT lepiej rozprasza komórki plwociny7, co poprawia jakość szkiełka cytopsyny i jest niezbędne do uzyskania powtarzalnej liczby komórek2. Jednak czynnik mukolityczny może zakłócać pomiar składników biochemicznych. Eksperymenty z dopingiem powinny być następnie przeprowadzane podczas pomiaru nowego związku biochemicznego36. Wreszcie, kolejnym krytycznym etapem procedury jest etap liczenia komórek, który musi być wykonany przez przeszkolonego technika, aby zapewnić wiarygodne i możliwe do interpretacji wyniki.
Alternatywna metoda wykorzystująca czopy plwociny (lepkie lub gęstsze części) zamiast całej plwociny jest również opisana w literaturze7. Obie techniki mają zalety i wady. Cała technika plwociny pozwala na szybsze przetwarzanie7, ale często jest zanieczyszczona śliną, która rozcieńcza próbkę i może obniżyć jakość cytospinów 2,7. Dzięki technice doboru zatyczek zmniejsza się zanieczyszczenie śliny, co oznacza, że próbki są często lepszej jakości do dozowania mediatorów fazy płynnej i do szkiełek cytospinowych7. Przetwarzanie jest jednak dłuższe7 i wybrane wtyki mogą nie być reprezentatywne dla całej próbki37. Warto również zauważyć, że nie wszystkie próbki zawierają wtyczki, co może być ograniczające. Obie metody są zwalidowane i odtwarzalne, a obecnie nie ma dowodów na to, że różnicowa liczba komórek uzyskana za pomocą obu tych metod jest różna14,38.
W przyszłości indukowana plwocina może być wykorzystywana jako narzędzie kliniczne do dostarczania biomarkerów do badania, diagnozowania i leczenia wszelkiego rodzaju zapalnych chorób układu oddechowego.

Do badania zapalenia dróg oddechowych stosuje się kilka metod: bezpośrednie pomiary (takie jak biopsje oskrzeli lub płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe) i pośrednie metody (takie jak ocena objawów, analiza próbki krwi i testy czynności płuc)1. Techniki bezpośrednie mają tę zaletę, że wiarygodnie oceniają stan zapalny dróg oddechowych, ale są inwazyjne i niewykonalne na dużą skalę ze względu na dyskomfort pacjenta i ponoszone ryzyko1. Jeśli chodzi o metody pośrednie, to słabo korelują one z bezpośrednią oceną stanu zapalnego dróg oddechowych1.
Pobieranie plwociny to kolejny sposób pobierania próbek komórek z dróg oddechowych i pozwala na bezpośrednią ocenę stanu zapalnego dróg oddechowych. Niemniej jednak, spontaniczne wytwarzanie plwociny może prowadzić do próbek o niskiej jakości i nie jest możliwe dla wszystkich pacjentów2. Problem ten został rozwiązany dzięki zastosowaniu ultradźwiękowo nebulizowanej hipertonicznej soli fizjologicznej do indukowania produkcji plwociny2. Metoda ta była początkowo stosowana u pacjentów zakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) w diagnostyce zapalenia płuc wywołanego przez Pneumocystis carinii 3 i została dostosowana dla zdrowych ochotników i astmatyków w 1992 roku4. Indukcja plwociny jest również możliwa u pacjentów w cięższym stanie przy użyciu izotonicznego soli fizjologicznej5. Chociaż na ogół jest dobrze tolerowany, wdychanie soli fizjologicznej może powodować skurcz oskrzeli u pacjentów z nadreaktywnością dróg oddechowych5. Dlatego zaleca się podanie krótko działającego beta agonisty przed zabiegiem1. Co więcej, wykazaliśmy wcześniej, że dodanie salbutamolu do roztworu soli fizjologicznej w nebulizatorze ultradźwiękowym jeszcze bardziej zmniejszyło to ryzyko6. Zaletą indukcji plwociny jest to, że jest ona nieinwazyjna2 i bezpieczna, jeśli zostaną podjęte odpowiednie środki ostrożności5. 
Do przetwarzania próbek plwociny, obecnie w literaturze stosowane są dwie metody: technika całego plwociny i wybór zatyczki7. W naszym laboratorium wykonywana jest cała technika plwociny. Podstawowym celem przetwarzania plwociny jest uzyskanie różnicowej liczby komórek w celu zbadania rodzaju stanu zapalnego występującego w świetle dróg oddechowych. Jednak wiele dodatkowych analiz jest również możliwych do dalszego zbadania procesów zapalnych i mechanizmów immunologicznych, albo poprzez badanie mediatorów w supernatantze plwociny8, albo poprzez przeprowadzenie szczegółowych badań na komórkach plwociny (np. Cytometria przepływowa<klasa SUP='xref'>9, Hodowle komórkowe10, genomics10, proteomics10, immunocytochemia<klasa SUP='xref'>7, in situ hybridization7, itd.)
Technika indukcji i analizy plwociny jest obecnie ograniczona do usług badawczych i specjalistycznych ośrodków w praktyce klinicznej, ponieważ jest technicznie wymagająca, czasochłonna i wymaga przeszkolonego personelu1. Zapalenie dróg oddechowych można badać tą metodą pod kątem różnych chorób układu oddechowego, takich jak astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), przewlekły kaszel lub idiopatyczne zwłóknienie płuc11.

<table><tbody><tr><td>Spirometr - Spirobank</td><td>MIR Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Salbutamol MDI - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0135-913</td><td>Zobacz lek dostępny w kraju</td></tr><tr><td>Nebulizator</td><td>UltraNeb DeVilbiss Healthcare USA</td><td>UltraNeb U3000</td><td></td></tr><tr><td>Devilbiss UltraNeb Kubki jednorazowe i Pokrywki</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>100HD-647</td><td></td></tr><tr><td>Filtr bakteryjny DeVilbiss do nebulizatorów UltraNeb</td><td>DeVilbiss Healthcare USA</td><td>1001005879</td><td></td></tr><tr><td>Zawory jednokierunkowe</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41664</td><td></td></tr><tr><td>Zawory jednokierunkowe</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41665</td><td></td></tr><tr><td>Łącznik T w aerozolu&nbsp;</td><td>Hudson RCI USA</td><td>41077</td><td></td></tr><tr><td>Obwód wentylacyjny jednogałęziowy falisty</td><td>Int'Air Medical France</td><td>TA30A</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5 %&nbsp;</td><td>/</td><td>/</td><td>Wyprodukowany przez naszą aptekę szpitalną</td></tr><tr><td>Mini-Plasco NaCl 0,9%</td><td>B.Braun Medical&nbsp; Diegem Belgium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan salbutamolu 5 mg/ml - Ventolin</td><td>GLAXOSMITHKLINE</td><td>CNK: 0094-987</td><td>Zobacz lek dostępny w kraju</td></tr><tr><td>Bromek ipratropium 0,25 mg/2 ml - Atrovent</td><td>Boehringer Ingelheim Niemcy</td><td>CNK: 1543-305</td><td>Zobacz lek dostępny w kraju</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco</td><td>LONZA Belgia</td><td>BE17512F</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do splutolizyny</td><td>Calbiochem</td><td>56000</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy 0,4% roztwór 100 ml</td><td>LONZA Bio Whittaker Belgia</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr - komora Thoma</td><td>Labor Optik Lancing UK</td><td>1500000</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia Hemacolor</td><td>Merck Belgia</td><td>1116610001</td><td>Produkt alternatywny&nbsp; : Zestaw do barwienia Diff Quik &nbsp; Diagnostyka Medion&nbsp;</td></tr><tr><td>Medium montażowe - Entellan</td><td>Merck Belgia</td><td>107960</td><td></td></tr><tr><td>Statspin Cytofuge 12&nbsp;</td><td>Beckman Coulter Belgia</td><td>X00-003066-001</td><td></td></tr></tbody></table>

metodologia indukcji plwociny i przetwarzania laboratoryjnego

Methodology for Sputum Induction and Laboratory Processing

Technika indukcji i przetwarzania plwociny jest uznaną nieinwazyjną metodą pozwalającą na pobieranie i analizę komórek z dróg oddechowych, co jest interesujące w różnych chorobach układu oddechowego, takich jak astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), przewlekły kaszel lub idiopatyczne zwłóknienie płuc. Technika ta jest dobrze tolerowana, bezpieczna i nieinwazyjna, ale obecnie ogranicza się do usług badawczych i specjalistycznych ośrodków w praktyce klinicznej, ponieważ jest wymagająca technicznie, czasochłonna i wymaga przeszkolonego personelu. Wskaźnik powodzenia indukcji i analizy plwociny wynosi około 80%.
Tutaj opisujemy indukcję i laboratoryjne przetwarzanie próbek plwociny. Plwocina jest indukowana przez wdychanie hipertonicznego lub izotonicznego roztworu soli fizjologicznej z salbutamolem. Do przetwarzania używamy całej techniki plwociny. Ditiotreitol (DTT) jest stosowany w celu umożliwienia mukolizy próbek plwociny. Podstawowym celem przetwarzania plwociny jest uzyskanie różnicowej liczby komórek w celu zbadania typów komórek obecnych w świetle dróg oddechowych. Dodatkowe analizy mogą być również wykonywane na supernatance plwociny i komórkach plwociny, co może pozwolić na dalsze badania nad procesami zapalnymi i mechanizmami immunologicznymi. Przykłady obejmują badanie mediatorów w supernatancie plwociny i przeprowadzanie szerokiego spektrum analiz na komórkach plwociny, takich jak cytometria przepływowa, genomika lub proteomika.
Na koniec, przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy plwociny u zdrowych osób z grupy kontrolnej, astmatyków i pacjentów z POChP.

Hemocytometr 
Typowy obraz przedstawiono na Rysunku 1, który został zobrazowany za pomocą mikroskopu z wykorzystaniem hemocytometru. Komórki płaskie są łatwo identyfikowalne, ponieważ są znacznie większe od komórek niepłaskich. Te komórki płaskie to komórki nabłonkowe pochodzące z jamy ustnej. Oba typy komórek ulegają barwieniu błękitem trypanowym (Trypan Blue) w przypadku śmierci. Należy zachować ostrożność, aby nie wliczać drożdżaków, bakterii i zanieczyszczeń.
<img alt="Siatka do liczenia komórek w hemocytometrze, obraz mikroskopowy, analiza rozkładu komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Zdjęcie z hemocytometru przedstawiające (A) żywą komórkę niepłaską, (B) martwą komórkę niepłaską oraz (C) komórkę płaską. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Preparat z wirowania w komorze Cytospin: Rysunek 2 przedstawia reprezentacyjny obraz preparatu z wirowania w komorze Cytospin uzyskanego po opracowaniu plwociny. Różne typy komórek (neutrofile, eozynofile, makrofagi, limfocyty i komórki nabłonka) można rozróżnić na podstawie ich morfologii i zabarwienia. W niektórych przypadkach istotne może być zanieczyszczenie komórkami nabłonka płaskiego; jeśli odsetek komórek nabłonka płaskiego przekracza 80%, próbkę uznaje się za nieudaną (Rysunek 3).
<img alt="Preparat cytologiczny, komórki pod mikroskopem; identyfikacja struktur komórkowych do analizy diagnostycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Zdjęcie preparatu z cytocentryfugi przedstawiające (A) neutrofil, (B) makrofag, (C) eozynofil, (D) limfocyt oraz (E) komórkę nabłonkową. Pasek skali = 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopowy obraz barwionych komórek; jądro, cytoplazma; analiza struktury komórkowej; badanie histologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Przykład preparatu cytospin o niskiej jakości z &gt;80% komórek płaskich. Pasek skali = 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Współczynnik sukcesu 
W naszym oddziale współczynnik sukcesu procedury (łączący skuteczną indukcję i czytelny preparat cytospin), oparty na próbie 1 129 pacjentów (osób zdrowych, chorych na astmę lub POChS), wynosi 82% (924/1 129). W podanalizie według rodzaju pacjentów współczynnik sukcesu wynosi 75% (57/76) u osób zdrowych, 82% (827/1 004) u osób z astmą oraz 82% (40/49) u pacjentów z POChS.
Wyniki u zdrowych ochotników 
W analizie retrospektywnej serii 289 zdrowych ochotników z naszego oddziału mediana (rozstęp międzykwartylowy) masy plwociny wyniosła 3.72 g (rozstęp międzykwartylowy 2.46 g – 5.54 g), a mediana całkowitej liczby komórek niepłaskich/g plwociny wyniosła 0.59 x 106 (rozstęp międzykwartylowy 0.37 x 106 – 1.29 x 106).
U tych zdrowych ochotników udział komórek płaskich jest niski i wynosi 19% (10%-34%), a żywotność jest wysoka i wynosi 66% (54-78%). W odniesieniu do procentowego udziału poszczególnych typów komórek, wyniki przedstawiono w Rysunku 4A. Można zauważyć, że odsetek makrofagów (49% [31-68%]) jest wyższy niż odsetek neutrofili (34% [14%-60%]), podczas gdy odsetki limfocytów (2% [1-3%]), eosinofili (0% [0%-0%]) i komórek nabłonkowych (4% [2-11%]) są niskie. Wyniki te są podobne, gdy dane są wyrażone w wartościach bezwzględnych (Rysunek 4B).
<img alt="Wykresy słupkowe składu komórkowego przedstawiające procentowy udział komórek płaskich, żywotność oraz komórek odpornościowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne wyniki różnicowego liczenia komórek zaobserwowane u zdrowych ochotników, przedstawione jako (A) wartości procentowe lub (B) wartości bezwzględne. Wyniki przedstawiono jako medianę (rozstęp międzykwartylny). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Ważne jest również uwzględnienie wieku pacjentów. Rzeczywiście, występuje silna korelacja między wiekiem pacjenta a proporcją neutrofili w próbkach plwociny (Rycina 5). Podobnie, przy klasyfikacji pacjentów według 10-letnich grup wiekowych (Rycina 6), zaobserwowano istotny wzrost procentowej zawartości neutrofili wraz z wiekiem grupy. Z tego powodu zmienna ta musi być brana pod uwagę przy porównywaniu wyników z różnych kohort, a przy dobieraniu badanych należy zachować szczególną ostrożność.
<img alt="Wykres rozrzutu, wiek a neutrofile, regresja liniowa: korelacja dodatnia (r=0.45, p&lt;0.0001)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Korelacja między wiekiem a procentową zawartością neutrofili w plwocinie. Korelację obliczono za pomocą testu Spearmana. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig5large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący procentową zawartość neutrofili w poszczególnych kategoriach wiekowych, wykazujący istotność statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Zmiany procentowej zawartości neutrofili w zależności od kategorii wiekowej.Wartość p dla testu ANOVA wyniosła &lt;0.0001 dla porównania procentowej zawartości neutrofili między grupami wiekowymi. Porównania wielokrotne przeprowadzono za pomocą testu porównań wielokrotnych Dunna. Wartości p przedstawiono w następujący sposób: * p &lt;0.05, ** p &lt;0.01 oraz *** p &lt;0.001. Wyniki przedstawiono jako medianę (rozstęp międzykwartylowy). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Wyniki u pacjentów cierpiących na choroby układu oddechowego 
Technika indukowania plwociny jest powszechnie stosowana do oceny profilu komórek zapalnych u pacjentów z astmą. Technikę tę można zastosować również u pacjentów cierpiących na POChP, inną zapalną chorobę układu oddechowego. Porównując osoby zdrowe, pacjentów z astmą oraz pacjentów z POChP (trzy grupy dopasowane pod względem wieku, płci i nawyków tytoniowych), zaobserwowano, że profil komórek zapalnych jest znacząco różny pomiędzy tymi kohortami (Rysunek 7). W rzeczywistości pacjenci z astmą charakteryzują się zazwyczaj podwyższonym poziomem eozynofili w plwocinie, podczas gdy proporcja neutrofili w plwocinie jest zazwyczaj wyższa u pacjentów z POChP w porównaniu z grupą kontrolną osób zdrowych, co wiąże się z ciężkością choroby.
<img alt="Wykres słupkowy rozkładu typów komórek; neutrofile, makrofagi, eosinofile w astmie, POChP, u osób zdrowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56612/56612fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Profil komórek zapalnych w plwocinie u osób zdrowych (n = 45), pacjentów z astmą (n = 108) oraz pacjentów z POChP (n = 54). Trzy grupy zostały dopasowane pod względem płci, wieku i nawyków tytoniowych. Wartości p dla testu ANOVA wyniosły odpowiednio &lt;0,05, &lt;0,0001 i &lt;0,0001 dla porównania neutrofili, eosinofili i makrofagów pomiędzy grupami. Porównania wielokrotne wykonano za pomocą testu Dunn'a. Wartości p przedstawiono w następujący sposób: * p &lt;0,05 oraz *** p &lt;0,001. Wyniki przedstawiono jako medianę (rozstęp międzykwartylowy). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56612/56612fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj opisujemy technikę indukcji plwociny. Protokół ten wyjaśnia również przetwarzanie plwociny w celu przeprowadzenia różnicowej liczby komórek oraz pobrania supernatantu plwociny i komórek do dalszej analizy.

Metodologia indukcji plwociny i przetwarzania laboratoryjnego

The technique of sputum induction and processing is a recognized non-invasive method allowing the collection and analysis of cells from the airways, which ...

Technika indukowanej plwociny została opracowana na początku lat 90-tych. Technika ta została zaproponowana w celu zbadania nowych informacji na temat obturacyjnych chorób dróg oddechowych, takich jak astma, POChP, a ostatnio pojawiło się również zainteresowanie poszukiwaniem nowych informacji na temat zwłóknienia płuc. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo nieinwazyjna w przeciwieństwie do bronchoskopii.Przetwarzanie wymaga pracy laboratoryjnej i wymaga czasu, więc jest dość wymagające, czasochłonne i wymaga pewnej wiedzy specjalistycznej w laboratorium, więc jest to oczywiście technika, którą trudno uzyskać w każdym ośrodku. Technika indukowanej plwociny składa się z dwóch części, pierwsza część to indukcja, a druga część to przetwarzanie. Przed indukcją plwociny musimy wykonać spirometrię, która polega na ocenie objętości i szybkości przepływu, jaką pacjent jest w stanie wytworzyć.Musimy to zrobić, ponieważ indukcja plwociny sama w sobie może powodować skurcz oskrzeli, więc bezwzględnie musimy znać wartość wyjściową spirometrii pacjentów. Dlatego najpierw wykonujemy spirometrię, a następnie podajemy pacjentom leki rozszerzające oskrzela, zwykle podajemy 400 mikrogramów salbutamolu, aby maksymalnie otworzyć drogi oddechowe pacjentów, a także zapobiec skurczowi oskrzeli, który może wystąpić w fazie indukcji. Po 15 minutach ponownie mierzymy spirometrię, aby uzyskać to, co nazywamy wartością wyjściową spirometrii, a w szczególności patrzymy na FEV1, czyli objętość, którą pacjent jest w stanie wydychać w ciągu jednej sekundy.Wlej wodę destylowaną do komory nebulizatora do zalecanego poziomu. Umieść czystą filiżankę w komorze nebulizatora. Przykryj napełnioną nakrętkę odpowiednią pokrywką.Napełnij kubek 50 ml hipertonicznego roztworu soli fizjologicznej 5%, jeśli FEV1 po leku rozszerzającym oskrzela jest większy niż 65%, lub 50 ml soli fizjologicznej izotonicznej 9%, jeśli FEV1 po rozszerzeniu oskrzeli jest mniejszy niż 65%. Dodać do filiżanki 1,75 roztworu siarczanu salbutamolu o stężeniu pięciu miligramów na ml. Podłącz rurki i zawory zgodnie z instrukcjami producenta.Technika musi być wykonywana pod nadzorem lekarza. Wyjaśnij pacjentowi zasadę testu. Poproś pacjenta o użycie klipsa na nos.Uruchom nebulizator i wybierz najniższy poziom aerozolu i ustawienia wentylatora. Poproś pacjenta o wdychanie aerozolu przez ustnik z oddychaniem oddechowym. Poziom aerozolu i ustawienie wentylatora może być zwiększony w zależności od tolerancji pacjenta.W przypadku ucisku w klatce piersiowej lub dyskomfortu oddechowego należy przerwać zabieg i wykonać spirometrię w celu zmierzenia wartości FEV1 pacjenta. Po pięciu minutach inhalacji lub w przypadku kaszlu lub nudności należy przerwać działanie nebulizatora. Poproś pacjenta o zdjęcie klipsa na nos, wypłukanie ust i dwukrotne płukanie gardła wodą z kranu, a następnie wylanie tej wody do zlewu.Następnie, jako pacjent, aby odkrztusić plwocinę i wypluć to, co wydostaje się z gardła do plastikowego pojemnika. Wykonaj pierwszy manewr oddechowy, aby zmierzyć FEV1. Po każdym wstępnym ustaleniu produkcji plwociny mierzymy wartość FEV1.Jeśli wartość FEV1 spadnie o więcej niż 20%, przerywamy zabieg i podajemy pacjentom nebulizację bromku ipratropium, który jest lekiem antycholinergicznym, który będzie działał w połączeniu z agonistami beta-dwa, które już podaliśmy podczas zabiegu. Jeśli wartość FEV1 nie spadnie o więcej niż 20%, przeprowadzamy zabieg przez łączny czas od 10 do 20 minut, w zależności od jakości i objętości plwociny wytwarzanej przez pacjenta. Po otrzymaniu próbki plwociny przechowuj ją w lodówce do czasu przetworzenia.Tak więc druga część składa się z przetwarzania plwociny, a w tym celu musimy najpierw przygotować dwa roztwory, których zamierzamy użyć do tego przetwarzania. Musimy więc przygotować Ditiothreitol znany również jako DTT. Roztwór należy przygotować przez rozcieńczenie naziemnej telewizji cyfrowej sterylną wodą w celu uzyskania roztworu o stężeniu 6,5 milimolowym.Należy więc unikać wystawiania naziemnej telewizji cyfrowej na działanie powietrza z otoczenia, a do tego używamy strzykawki i igły. Po drugie, musisz przygotować roztwór błękitu trypanowego, a w tym celu musisz rozcieńczyć DPBS błękitem trypanowym, aby uzyskać roztwór 0,08%Więc jeśli chodzi o plwocinę, musisz przenieść całą plwocinę do plastikowej probówki o stożkowym dnie o pojemności 50 ml i zważyć próbkę. Dodać trzykrotnie wagową ilość roztworu DPBS.Powoli wirować próbkę przez 30 sekund, odwirować przy 800 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant w plastikowej probówce o pojemności 50 ml ze stożkowym dnem, po przefiltrowaniu przez dwie pojedyncze warstwy sterylnej gazy. Umieść supernatant w plastikowych probówkach o pojemności 2 ml i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Należy pamiętać, że próbki supernatantu są dla nas przydatne jako trójfazowy składnik plwociny. Jeśli objętość palety komórek jest mniejsza niż 5 ml, dodaj DPBS, aby osiągnąć objętość 5 ml zawiesiny komórek. Rozcieńczyć zawiesinę komórek jedną objętością naziemnej telewizji cyfrowej o stężeniu 6,5 milimola.Kołysz zawiesiną ogniw przez 20 minut w temperaturze pokojowej z pracownikiem laboratoryjnym. Rozcieńczyć zawiesinę komórek co najmniej trzykrotnie za pomocą DPBS. Odwirować rozcieńczoną zawiesinę komórkową o sile 550 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odrzucić supernatant. Zawiesić paletę komórek w około jednym ml DPBS. Oceń i zapisz dokładną objętość zawiesiny komórek.Dodać 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do 50 mikrolitrów rozcieńczonego roztworu błękitu trypanowego i homogenizować. Umieść próbkę pod szkiełkiem nakrywkowym cytometru hemotylowego i umieść ją pod mikroskopem optycznym. Oceń stężenie komórek w zawiesinie komórek, procent komórek płaskonabłonkowych i procent żywotności komórek niepłaskonabłonkowych.Rozcieńczyć przydział zawiesiny za pomocą DPBS, aby uzyskać co najmniej 350 mikrolitrów zawiesiny komórek przy 500 000 komórek na ml. Koncentrator ogniw należy zamontować zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej z trzech komór koncentratora komórek.Wirować dwie minuty w temperaturze 150 g w temperaturze pokojowej w wirówce cyto. Odrzucić supernatant. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na powietrzu.Zabejcuj szkiełko za pomocą div quick lub zestawu do barwienia niklowego zgodnie z instrukcją producenta. Zamontować za pomocą medium montażowego i szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełko pod mikroskopem optycznym z zanurzeniami olejowymi.Policz co najmniej 500 komórek niepłaskonabłonkowych, neutrofili, eozynofili, makrofagów, limfocytów i komórek nabłonkowych oraz zapisz wartości bezwzględne oraz procent i typ komórki. Jeśli chodzi o wyniki, za pomocą hemocytometru musimy policzyć żywe komórki niepłaskonabłonkowe, które są bezbarwne. Również martwe komórki niepłaskonabłonkowe, które są zabarwione na niebiesko.I komórki płaskonabłonkowe. Komórki te są komórkami nabłonkowymi, które pochodzą z jamy ustnej. Są duże, więc łatwo je rozpoznać w porównaniu z małymi komórkami ludzkimi.Trzeba więc unikać liczenia bakterii, drożdży, czy złomu. Jeśli zawiesina komórkowa zawiera więcej niż 80% komórek płaskonabłonkowych, próbka ta jest uważana za słabej jakości i nieodpowiednią do szkiełka cytospinowego. W związku z tym próbkę tę uznaje się za nieudaną.Liczenie barwionej cytospiny przeprowadza się zgodnie z kolorem komórek i ich morfologią. Neutrofile, główne cechy to wielopłatkowe jądro, które ułatwiało identyfikację komórek. Te komórki są okrągłe, małe i zabarwione na neutralny róż.Eozynofile, komórki te składają się z czerwonych granulek, łatwych do zidentyfikowania. Wielkość tych komórek jest zbliżona do neutrofili. Makrofagi są od dwóch do pięciu razy większe niż neutrofile i są zabarwione na niebiesko.Cytoplazma może zawierać szczątki i wakuole. Limfocyty, te komórki są okrągłe i małe, zabarwione na niebiesko i mają duże i gęste jądro. Komórki nabłonka mają kształt kolumnowy, są zabarwione na różowo i często mają rzęski na górze.Oto kilka przykładów nieczytelnych próbek cytospinowych z ponad 80% komórek płaskonabłonkowych. Myślę, że jest to technika, która jest bardzo przydatna, jednak musimy być bardzo ostrożni, ponieważ indukcja plwociny musi być wykonywana pod nadzorem lekarza, ale technika indukcji plwociny daje wiele informacji o stanie zapalnym pacjentów w drogach oddechowych. Może pozwolić na pomiar różnych markerów biochemicznych w supernatancie, a także można mierzyć różne rzeczy na częściach komórkowych, więc plwocina indukowana pozwala na wykonanie cytometrii przepływowej, proteomiki, transkryptomiki, a nawet genomiki.

methodology-for-sputum-induction-and-laboratory-processing

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Korzystając z przykładu dróg oddechowych mukowiscydozy, manuskrypt przedstawia kompleksowy przepływ pracy obejmujący kombinację podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych w celu scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych i wirusowych w próbkach związanych ze zwierzętami.

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Drogi oddechowe pacjentów z mukowiscydozą (CF) są idealnym środowiskiem dla rozwoju patogenów mikrobiologicznych. W manuskrypcie opisano nowatorską metodę badania mikrobiomu płuc mukowiscydozy w środowisku, które naśladuje miejsce, w którym powodują one chorobę i w jaki sposób zmiany warunków chemicznych mogą wpływać na dynamikę drobnoustrojów.

Model WinCF - niedrogi i łatwy w obsłudze mikrokosmos oskrzelika zatkanego śluzem do badania mikrobiologii infekcji płuc

Ten protokół dostarcza metod wizualizacji komórek bakteryjnych i polisacharydów syntezy locus (Psl) w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą.

Wizualizacja Pseudomonas aeruginosa w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą

Ten protokół opisuje ekstrakcję lotnych związków organicznych z próbki biologicznej za pomocą metody ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżniowo, chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas przy użyciu szyny Entech Sample Preparation Rail, oraz analizę danych. Opisano również hodowlę próbek biologicznych i sondowanie izotopów stabilnych.

Wychwytywanie aktywnie wytwarzanych mikrobiologicznych lotnych związków organicznych z próbek związanych z człowiekiem za pomocą ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią

Ten protokół opisuje skuteczną metodę dysocjacji plwociny na zawiesinę pojedynczej komórki i późniejszą charakterystykę podzbiorów komórkowych na standardowych platformach cytometrycznych przepływu.

Analiza plwociny pod kontrolą jakości za pomocą cytometrii przepływowej

Różne patogeny bakteryjne mogą powodować infekcje dróg oddechowych i prowadzić do poważnych problemów zdrowotnych, jeśli nie zostaną dokładnie wykryte i szybko leczone. Szybkie i dokładne wykrywanie tych patogenów za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli zapewnia skuteczne zarządzanie i kontrolę infekcji dróg oddechowych w warunkach klinicznych.

Szybkie wykrywanie patogenów bakteryjnych powodujących infekcje dolnych dróg oddechowych za pomocą amplifikacji izotermicznej opartej na chipach mikroprzepływowych

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół eksperymentalny do pomiaru zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych w celu oceny dawki ekspozycji wewnętrznej na poziomie indywidualnej ekspozycji na cząstki stałe.

Pomiar zawartości węgla w makrofagach dróg oddechowych narażonych na cząstki stałe zawierające węgiel

Przedstawiamy zoptymalizowaną metodę ekstrakcji DNA z odkażonej plwociny przy użyciu metody ekstrakcji opartej na matrycy w połączeniu z oczyszczaniem kulek magnetycznych w celu dalszego ukierunkowanego sekwencjonowania Mycobacterium tuberculosis.

Ekstrakcja DNA oparta na matrycy do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji na odkażonych próbkach plwociny

Aspiracja tkanki tłuszczowej z poduszeczki tłuszczowej jest preferowaną, małoinwazyjną i niskokosztową metodą wykrywania amyloidu w diagnostyce amyloidozy systemowej w porównaniu z innymi technikami. Niniejszy artykuł wideo przedstawia schemat procedury wykonywania aspiracji tkanki tłuszczowej wraz z odpowiednim przygotowaniem preparatu w celu uzyskania optymalnego wyniku diagnostycznego.

Wykonanie i przetwarzanie cienkoigłowej aspiracji (FNA) przedniej poduszki tłuszczowej w kierunku amyloidozy

Pomiar gentryfikacji (fałdowania kory) w dowolnym wieku stanowi wgląd we wczesny rozwój mózgu. W związku z tym opracowaliśmy wcześniej algorytm służący do pomiaru lokalnej gentryfikacji w tysiącach punktów na całej półkuli1. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy obliczanie tego wskaźnika lokalnej gentryfikacji.

Jak mierzyć fałdowanie kory na obrazach MR: samouczek krok po kroku dotyczący obliczania lokalnego wskaźnika gyryfikacji

Poznaj metodę indukcji plwociny w chorobach układu oddechowego, w tym astmie i POChP. Technika ta umożliwia nieinwazyjną analizę komórkową i badanie markerów zapalnych w próbkach.

Metodologia indukcji plwociny i przetwarzania laboratoryjnego

Przeglądaj więcej filmów