Ekstrakcja DNA oparta na matrycy do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji na odkażonych próbkach plwociny

Nasze badania mają na celu skrócenie czasu oczekiwania na diagnozę gruźlicy i jej późniejsze rozpoczęcie poprzez włączenie NGS do spersonalizowanej opieki nad pacjentem. Nasz protokół optymalizuje TNGS pod kątem rutynowego użytkowania, rozwiązując problemy z integracją przepływu pracy, kosztami i czasem realizacji, dążąc do zmniejszenia opóźnień diagnostycznych i poprawy terminowego rozpoczynania leczenia.

Protokół ten pozwala na opłacalną, szybką i wystarczającą jakość ekstrakcji DNA z próbek klinicznych w ciągu kilku godzin w porównaniu z konwencjonalnymi metodami CCAB, które trwają do trzech dni.

Nasze wyniki rodzą kluczowe pytania dotyczące integracji TNGS z rutynową diagnostyką i optymalizacji metod ekstrakcji dla próbek ujemnych i skąpych w celu poprawy czułości i użyteczności klinicznej. Zbadamy, czy próbki pozostałości z rutynowej diagnostyki można wykorzystać do dalszego sekwencjonowania, w tym bezpośredniego sekwencjonowania całego genomu plwociny, aby usprawnić i rozszerzyć nadzór genomowy nad gruźlicą.

[Narrator] Na początek uzyskaj inaktywowany termicznie osad plwociny. Odwirować próbkę z prędkością 16 800 G lub pełną prędkością przez 15 minut. Za pomocą pipety o pojemności od 20 do 200 mikrolitrów delikatnie odessać i wyrzucić supernatant, upewniając się, że osad pozostaje nienaruszony. Delikatnie potrząśnij zawiesiną matrycy, aby wymieszać, a następnie odpipetować 200 mikrolitrów dobrze wymieszanej matrycy, aby ponownie zawiesić osad. Przenieś całą objętość do 1,5-mililitrowej rurki z nakrętką zawierającą trzy wstępnie wysterylizowane szklane kulki o średnicy dwóch milimetrów. Teraz umieść próbki w bloku grzewczym w temperaturze 56 stopni Celsjusza na 15 minut. Po inkubacji homogenizować próbki za pomocą wiru przez 10 sekund w celu rozproszenia komórek, a następnie inkubować próbki w bloku grzewczym w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Homogenizować próbki za pomocą homogenizatora wysokoobrotowego z jednym cyklem trwającym 60 sekund z prędkością 4,0 metrów na sekundę. Następnie odwirować zawiesinę o sile 12 000 G przez pięć minut. Przenieś 130 mikrolitrów supernatantu zawierającego DNA do świeżej 1,5 mililitrowej probówki o niskim stopniu wiązania bez naruszania osadu. Wyrzuć pierwszą probówkę zawierającą matrycę i resztki komórek. Aby oczyścić DNA za pomocą kulek magnetycznych, najpierw dokładnie wymieszaj butelkę z kulkami magnetycznymi lub przygotowaną podwielokrotność, aby ponownie zawiesić kulki przed użyciem, a następnie dodaj 1,2-krotność objętości kulek magnetycznych do wyekstrahowanego DNA, odpipetuj zawiesinę 10 razy, aby wymieszać próbki przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Umieść próbki na stojaku magnetycznym o pojemności 1,5 mililitra na trzy minuty lub do momentu, gdy ciecz stanie się klarowna, a następnie ostrożnie zassaj i wyrzuć supernatant bez naruszania kulek. Za pomocą rurek na magnesie dodaj 200 mikrolitrów 80% etanolu, upewniając się, że kulki pozostaną nienaruszone. Po 30-sekundowej inkubacji ostrożnie odessać i wyrzucić etanol, nie naruszając kulek. Po drugim umyciu usuń resztki etanolu za pomocą pipety o pojemności od jednego do 10 mikrolitrów. Pozostaw probówki otwarte, aby wysuszyć koraliki na powietrzu przez 10 minut lub do momentu, gdy uzyskają matowy wygląd. Gdy kulki nabiorą matowego wyglądu, wyjmij rurki z magnesu i dodaj 50 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz bezpośrednio na kulki w każdej próbce. Następnie należy wymieszać każdą pojedynczą próbkę, pipetując 10 razy. Sprawdź rurkę pod kątem koralików, które utknęły w środku. Po pięciominutowej inkubacji w temperaturze pokojowej umieść probówki z powrotem na stojaku magnetycznym na trzy minuty lub do momentu, gdy płyn będzie klarowny. Za pomocą probówek umieszczonych na stojaku magnetycznym przenieś supernatant zawierający DNA do wyraźnie oznaczonej sterylnej probówki o niskim stopniu wiązania. Stężenie DNA było wyższe w dwumililitrowych próbkach osadu, w porównaniu do 500 mikrolitrów we wszystkich stopniach rozmazu. Większą zmienność wydajności DNA zaobserwowano w próbkach osadów o pojemności 500 mikrolitrów. Głębokość pokrycia odczytów sekwencjonowania była wyższa w dwumililitrowych próbkach osadów w porównaniu do 500 mikrolitrów we wszystkich stopniach rozmazu. Zmienność była większa w trzech próbkach o stopniu plus rozmaz wyekstrahowanych z osadu o objętości 500 mikrolitrów. Wyniki akceptowalności sekwencjonowania były na ogół wyższe w próbkach dwumililitrowych w porównaniu z 500 mikrolitrami, z większym odsetkiem wysoce akceptowalnych wyników. Próbki rozmazu trzeciego stopnia plus miały najwyższy odsetek akceptowalnych wyników w porównaniu z rozmazami klasy 1 plus i 2 plus. W próbkach o pojemności 500 mikrolitrów więcej przypadków zostało sklasyfikowanych jako niedopuszczalne lub nieokreślone.