Name: Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę optogenetyczną do analizy oscylacyjnej komunikacji międzykomórkowej w komórkach C2C12. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę dynamiki ekspresji genów i badanie szlaku Notch.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez JST, PRESTO (A.I.), Core Research for Evolutional Science and Technology (JPMJCR12W2 (R.K.)), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (MEXT), Japan 26119708 (A.I.) i 16H06480 (R.K.)), Scientific Research (A) (Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) 24240049 (R.K.)), i Młodych Naukowców (A) (JSPS 15H05326 (A.I.)) oraz grant na badania naukowe w innowacyjnych obszarach "Obrazowanie na żywo fluorescencji" MEXT w Japonii oraz Platformę Dynamicznych Podejść do Żywego Systemu z MEXT w Japonii.

1. Generowanie stabilnych linii komórkowych przez system Tol2
<ol>
	<li>Transfekcyjne wektory plazmidowe (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) modułów optogenetycznych opartych na Tol2 wraz z wektorem ekspresyjnym transpozazy (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) do komórek C2C12. Na wszystkich etapach hodowle komórek z pożywką DMEM uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną-streptomycyną w temperaturze 37 °C (Tabela 1), w obecności 5% CO2 oznaczone inaczej.
	<ol>
		<li>Policz trypsynizowane komórki za pomocą licznika komórek i umieść 5 x 104 komórek C2C12 na studzienkę na 12-dołkowej płytce na dzień przed transfekcją.</li>
		<li>Kotransfekcja 0,375 μg wektorów optogenetycznych na bazie Tol2 (pAI177 lub pAI218), 0,125 μg wektora selekcji leków (pAI170) i 0,5 μg wektora pCAGGS-mT2TP przy użyciu odczynnika do lipofekcji.</li>
		<li>Trypsynizuj transfekowane komórki i umieść je w 100-milimetrowych szalkach hodowlanych jeden dzień po transfekcji.</li>
		<li>Zamiana pożywki hodowlanej dla transfekowanych komórek na pożywkę hodowlaną uzupełnioną 100 mg/ml higromycyny.</li>
		<li>Hoduj komórki przez 3 dni w celu wyeliminowania komórek nietransfekowanych. Należy pamiętać, że zmiana medium nie jest konieczna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trypsynizuj transfekowane komórki i oczyszczaj populację komórek wyrażających białka fluorescencyjne do selekcji. W przypadku komórek odbiorczych przenoszących pAI177 należy ustawić bramkę sortującą na kanał Green-PE w celu oczyszczenia populacji komórek mCherry-dodatnich. W przypadku światłoczułych komórek nadawczych przenoszących pAI218 należy ustawić bramkę sortującą na kanał APC w celu oczyszczenia populacji komórek iRFP713-dodatnich.</li>
	<li>(opcjonalnie) Ustalić populację komórek klonalnych za pomocą standardowych metod, takich jak ograniczone rozcieńczenie lub sortowanie pojedynczych komórek za pomocą FACS.</li>
</ol>
2. Ocena wrażliwości na światło komórek zmodyfikowanych na poziomie populacji
UWAGA: Ta część opisuje protokół sprawdzania dynamicznej indukcji białek ligandu Dll1 przy oświetleniu światłem niebieskim za pomocą testów biochemicznych, takich jak qPCR i Western blotting.
<ol>
	<li>Skonfiguruj dwa typy inkubatorów ze źródłami światła lub bez, odpowiednio dla stanu wywołanego światłem lub stanu ciemności. Ustaw natężenie światła w niebieskim trans-iluminatorze LED, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1B, za pomocą światłomierza. Zaprogramuj czasy i czas trwania oświetlenia świetlnego, ładując skrypt sterujący do jednopłytkowego mikrokontrolera, który umożliwia programowalne harmonogramy oświetlenia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
	<li>Policz trypsynizowane komórki za pomocą licznika komórek i płytki 1,0 x 105 światłoczułych komórek nadawczych zawierających pAI218 i pAI170 na plastikowych szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm (więcej niż 12 szalek dla warunków jasnych i 1 szalka dla warunków ciemnych) i umieść szalki w oddzielnych inkubatorach dla warunków ciemnych/jasnych. Po ustawieniu szalek należy trzymać drzwi inkubatorów zamknięte do momentu zebrania lizatów komórkowych.</li>
	<li>Półtora dnia po posiewie rozpocznij oświetlenie światłem (oczekuje się, że komórki będą zlewać się w ponad 80%). Nie wystawiaj komórek na działanie światła, aby uniknąć niepożądanej fotostymulacji. 
	UWAGA: Harmonogramy oświetlenia zależą od celu eksperymentów. Należy pamiętać, że warunki stałego oświetlenia (np. 1-minutowy czas trwania i 10-minutowe interwały o natężeniu światła 40 μmol/m2/s) są wystarczające do prostego sprawdzenia fotoindukcji, a silne oświetlenie światłem jest szkodliwe dla komórek. Dlatego upewnij się, że wybrane są nieszkodliwe parametry oświetlenia.</li>
	<li>Około 2 dni po posiewie przygotuj lizat komórkowy w 30-minutowych odstępach. Przenieś szalki z próbek z inkubatorów na lód i zacznij przygotowywać lizaty komórkowe do dalszej analizy.</li>
</ol>
3. Dynamiczny test nadawczo-odbiorczy na poziomie populacji: monitorowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi komórkowych na stymulację optyczną przez PMT
<ol>
	<li>Trypsynizuj i policz liczby komórek nadawczych i odbiorczych standardowymi metodami. Przygotować 1 ml całkowitej objętości zawiesiny mieszającej 2,5 x 104 komórek odbiornika i 1,25 x 105 komórek nadawczych (stosunek 1:5). 
	UWAGA: Proporcje nadawca-odbiorca 2:1, 1:1 lub 1:2 działają również z całkowitą liczbą komórek 1,5 x 105. 10</li>
	<li>Płytki z mieszanymi komórkami w każdym dołku z 24-dołkowych czarnych płytek z pożywką hodowlaną zawierającą 1 mM lucyferynę.</li>
	<li>Przeanalizuj komórki na czytniku płytek pod kątem testu lucyferazy i upewnij się, że sygnały wyjściowe nie są zbyt wysokie dla systemu rejestrującego. 
	UWAGA: Jeśli sygnały wyjściowe są wyższe niż 1 x 106 zliczeń/s fotonów, mogą być nasycone. W takim przypadku należy zmniejszyć stężenie lucyferyny do optymalnych wartości, tak aby sygnały wyjściowe były niższe niż 1 x 106 zliczeń fotonów/s.</li>
	<li>Ustaw płytkę w systemie nagrywania i uruchom program do nagrywania (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D). Dla example, rozpocznij oświetlenie światłem po 18 h po ustawieniu nagrywania. 
	UWAGA: Filtrowanie czasowe, takie jak sygnały detrendingu z ruchomym uśrednianiem i filtrowanie Savitzky'ego-Golaya, są przydatne do wizualizacji kształtów fal i detekcji pików.</li>
</ol>
4. Dynamiczny test nadawczo-odbiorczy na poziomie pojedynczej komórki: obrazowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi pojedynczych komórek pod kontrolą perturbacji optogenetycznych
<ol>
	<li>Płytka 0,5 x 105 odbiorników i 2,5 x 105 komórek nadawczych na naczyniach o średnicy szklanej o średnicy 27 mm i średnicy 35 mm. Upewnij się, że proporcje mieszania i całkowita liczba komórek (gęstość komórek) są prawidłowo dostosowane.</li>
	<li>Jednego dnia po posiewie wymienić pożywkę na 2 ml pożywki rejestrującej (pożywka DMEM wolna od czerwieni fenolowej uzupełniona 5% FBS, penicylina-streptomycyna i 1 mM lucyferyna) i umieścić szklaną pożywkę na mikroskopie. W razie potrzeby wypłukać resztki martwych komórek za pomocą PBS (-). 
	UWAGA: Lepiej jest wykonać ten krok w ciemności.</li>
	<li>Ustawić mikroskop odwrócony wyposażony w komorę środowiskową o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Skonfiguruj chłodzoną kamerę CCD. Upewnij się, że temperatura czujnika CCD jest schłodzona do wartości docelowej (zwykle -90 °C).</li>
	<li>Ustaw parametry okna "Multi-Dimensional Timelapse" w oprogramowaniu do automatycznej akwizycji, aby przechwytywać obrazy w odstępach 5-minutowych i więcej niż 288 razy (więcej niż jedno nagranie w nocy).
	<ol>
		<li>Otwórz okno "Multi-Dimensional Timelapse", wybierz kanał luminescencji i tryb wolnego odczytu 50 kHz z menu rozwijanego i ustaw binning 4 x 4 z 4-minutową ekspozycją. Upewnij się, że tryb odczytu jest ustawiony na wolny tryb 50 kHz, co ma kluczowe znaczenie dla redukcji szumów odczytu w celu wykrycia słabo emitującego światła bioluminescencyjnego.</li>
		<li>Otwórz okno "Multi-Dimensional Timelapse", wybierz kanały fluorescencji i szybki tryb odczytu 1 MHz z menu rozwijanego i ustaw binning 2 x 2 z ekspozycją 400 ms. Upewnij się, że tryb odczytu jest ustawiony na szybki tryb 1 MHz, aby skrócić czas potrzebny na obrazowanie fluorescencyjne.</li>
		<li>Rozpocznij nagrywanie poklatkowe, klikając przycisk "Pobierz".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyodrębnij jednokomórkowe ślady kanałów luminescencyjnych z filmów poklatkowych za pomocą oprogramowania do analizy obrazu w następujący sposób. Najpierw utwórz obrazy stosu luminescencji i fluorescencji, importując dane obrazu do oprogramowania do analizy obrazu. W przypadku obrazów luminescencyjnych należy usunąć gorące piksele pochodzące z promieniowania kosmicznego, porównując intensywność pikseli na czasowo sąsiadujących obrazach, zastępując wartości pikseli średnią czasową poprzedniej i następnej klatki (zaimplementowane jako "filtr SpikeNoise"), zastosuj te przetworzone obrazy do filtra wygładzającego przestrzennie i odejmij wartości pikseli tła widoków zewnętrznego pola od każdej klatki. Następnie określ "obszar zainteresowania" (ROI) dla każdej komórki na obrazie fluorescencyjnym w każdym punkcie czasowym, zastosuj ROI do obrazów luminescencyjnych i zmierz intensywność luminescencji każdego ROI.</li>
</ol>

<ol><li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li>
<li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li>
<li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock%3A+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li>
<li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li>
<li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li>
<li>Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li>
<li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li>
<li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141(2012).</li>
<li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li>
<li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li>
<li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li>
<li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1. S7(2007).</li>
<li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3(2010).</li>
<li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li>
<li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pokazaliśmy metodę kontrolowania dynamiki ekspresji genów z okresowością od 2 do 3 godzin. Ta skala czasowa jest znacznie krótsza niż w innych konwencjonalnych systemach, w tym w systemie Tet-On i oryginalnym systemie LightOn. Kluczowymi parametrami, które pozwalają osiągnąć ultradobowe skale czasowe, są okresy półtrwania produktów molekularnych indukowanych światłem, mRNA i białek. Te parametry kinetyczne mogą zależeć od typów i gatunków komórek. W celu dostrojenia kinetyki zastąpienie sekwencji Hes1 3'UTR innymi jest p...

Komunikacja między komórkami odgrywa kluczową rolę w tworzeniu się embrionalnych wzorców w procesach rozwojowych. W zarodkach kręgowców struktury metameryczne zwane somitami tworzą się wzdłuż osi przednio-tylnej ciała z precyzyjną dokładnością czasową pod kontrolą zegara odmierzającego czas, zwanego zegarem segmentacyjnym1. Podczas tego procesu grupa komórek mezodermy presomitycznej (PSM) jest okresowo przekształcana w somity w sposób synchroniczny. Proces ten obejmuje zsynchronizowaną oscylacyjną ekspresję genów i komórki PSM, które oscylują w fazie, tworząc te same somity. Okres oscylacyjnej ekspresji genów wynosi około 2 do 3 godzin u myszy i około 30 minut u danio pręgowanego. Po dysocjacji komórki PSM tracą synchrony2,3, ale po ponownym zagregowaniu mogą się samoorganizować i odzyskiwać populację synchrony4, co sugeruje, że sprzężenie komórka-komórka jest kluczem do zsynchronizowanych oscylacji.
Szeroko zakrojone wysiłki wykazały, że cząsteczki sygnałowe w szlaku Delta-Notch są ściśle powiązane z zsynchronizowanymi oscylacjami genów zegara segmentacji. Albo inhibitory farmakologiczne, albo mutacje genetyczne sygnalizacji Notch desynchronizują populację oscylatorów. U danio pręgowanego mutanty komponentów sygnalizacyjnych Notch, takich jak DeltaC, DeltaD i Notch1a, wyświetlają oscylacje asynchroniczne5,6. W zarodkach piskląt lub myszy do zsynchronizowanych oscylacji wymagany jest nie tylko ligand Notch Delta-like1 (Dll1), ale także Obrzeża Lunatic Modulator Notch (Lfng)7,8,9. Trudno było jednak przetestować funkcjonalną zdolność takich cząsteczek do dynamicznego przekazywania informacji z komórki do komórki, ponieważ czasowe rozdzielczości konwencjonalnych zaburzeń dynamiki regulacji genów nie były wystarczające do zbadania procesów w skalach czasowych 2-3 h (rytmy ultradobowe).
Niedawno opracowaliśmy zintegrowaną metodę kontroli i monitorowania wzorców ekspresji genów w komórkach ssaków10. Technologia ta umożliwia indukcję impulsów ekspresji genów poprzez okresowe oświetlenie światłem w ultradobowych skalach czasowych. Protokół ten reprezentuje metody ustanawiania światłoczułych linii komórkowych i obserwacji dynamicznych odpowiedzi komórek reporterowych poprzez monitorowanie luminescencji żywych komórek w kontekście komunikacji między komórkami. Metoda ta ma zastosowanie do analizy wielu innych szlaków sygnałowych.

<table><tbody><tr><td>FACS</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>FACSAriaII SORP</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor</td><td>iKon M-934</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX-81 ZDC</td><td></td></tr><tr><td>PMT urządzenie</td><td>Churitsu eletric corp.</td><td>CL24B-LIC/B</td><td></td></tr><tr><td>Niebieski oświetlacz LED</td><td>OptoCode</td><td>LEDB-SBOXH</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td><td>08459-35</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Nacalai</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Sigma</td><td>172012</td><td></td></tr><tr><td>KRYSTAL24 (płytka 24-dołkowa)</td> <td>Hi-tech</td><td>303012</td><td></td></tr><tr><td>D-Lucyferyna Potas Sól</td><td>Nacalai</td><td>20028-24</td><td></td></tr><tr><td>Światłomierz</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>LI-250A przeciwciało</td><td></td></tr><tr><td>anty-HA-peroksydazy</td> Klon <td>Roche</td><td>3F10</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-aktyno-peroksydazy</td><td>Wako</td><td>klon 2F3</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Komórki powinny prawidłowo reagować na czasowo zmieniające się środowisko, na które wpływ mają różne czynniki pochodzące z otaczających komórek. Szlak sygnałowy Notch jest jedną z takich podstawowych maszynerii molekularnych do komunikacji międzykomórkowej, która odgrywa kluczową rolę w prawidłowym rozwoju zarodków. Szlak ten obejmuje transfer informacji oscylacyjnych z komórki do komórki z rytmami ultradowymi, ale pomimo postępu w technikach biologii molekularnej wyjaśnienie wpływu interakcji wielokomórkowych na dynamikę genów oscylacyjnych było wyzwaniem. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który pozwala na kontrolę optogenetyczną i monitorowanie na żywo wzorców ekspresji genów w precyzyjny sposób czasowy. Metoda ta z powodzeniem ujawniła, że wewnątrzkomórkowe i międzykomórkowe okresowe wejścia sygnalizacji Notch pociągają wewnętrzne oscylacje poprzez dostrojenie częstotliwości i przesunięcie fazowe w rozdzielczości pojedynczej komórki. Podejście to ma zastosowanie do analizy dynamicznych cech różnych szlaków sygnałowych, zapewniając unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia dynamicznych programów ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Zaadaptowaliśmy system LightOn1,12, który umożliwia fotoindukowaną ekspresję genów w komórkach ssaków, do badania oscylatorów genetycznych o periodyczności od 2 do 3 h. System ten składa się z dwóch części: fotoindukowalnego aktywatora transkrypcyjnego hGAVPO oraz kasety z promotorem UAS służącej do sterowania transkrypcją dowolnych genów zainteresowania. Aby przyspieszyć pulsującą kinetykę fotoindukowanej ekspresji genów, sekwenc...

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja transferu informacji oscylacyjnej z komórki do komórki poprzez kontrolę optogenetyczną i monitorowanie ekspresji genów na żywo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób komórki komunikują się ze sobą za pośrednictwem szlaku sygnałowego Notch, a w szczególności tego, w jaki sposób komórki przekazują sobie nawzajem informacje oscylacyjne. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy kontrolować i monitorować dynamikę ekspresji genów z bardzo dużą precyzją.Procedurę zademonstruje Akihiro Isomura, pracownik naukowy z mojego laboratorium, który opracował tę nową technologię. Aby transfekować wektory plazmidowe modułów optogenetycznych opartych na Tol2 wraz z wektorem ekspresji transpozazy do komórek C2C12, najpierw policz trypsynizowane komórki za pomocą licznika komórek. Płytkę 50 000 komórek C2C12 na basenik na płytce 12-dołkowej na dzień przed transfekcją.Następnie należy współtransfekować 0,375 mikrograma wektorów optogenetycznych na bazie Tol2, 0,125 mikrograma wektora selekcji leków i 0,5 mikrograma wektora ekspresyjnego transpozazy za pomocą odczynnika do lipofekcji. Trypsynizuj transfekowane komórki i umieść je w 100-milimetrowych szalkach hodowlanych jeden dzień po transfekcji. Zamień pożywkę hodowlaną dla transfekowanych komórek na pożywkę hodowlaną uzupełnioną 100 miligramami na mililitr higromycyny.Hoduj komórki przez trzy dni, aby wyeliminować nietransfekowane komórki. Należy pamiętać, że zmiana medium nie jest konieczna. Następnie trypsynizuj transfekowane komórki i oczyść populację komórek wyrażających białka fluorescencyjne do selekcji poprzez sortowanie komórek odbiorczych i światłoczułych, jak opisano w protokole tekstowym.Skonfiguruj dwa typy inkubatorów ze źródłami światła lub bez nich, aby dostosować się do stanu wywołanego światłem lub stanu ciemności. Użyj światłomierza, aby ustawić natężenie światła transiluminatora z niebieską diodą LED. Zmierz natężenie światła po zamknięciu drzwi.Zaprogramuj czasy i czas trwania oświetlenia świetlnego poprzez załadowanie skryptu sterującego do jednopłytkowego mikrokontrolera, który umożliwia programowalne harmonogramy oświetlenia. Policz trypsynizowane komórki za pomocą licznika komórek i umieść 100 000 światłoczułych komórek nadawczych zawierających pAI218 i pAI170 na plastikowych naczyniach hodowlanych o średnicy 35 milimetrów. Ustaw naczynia w osobnych inkubatorach na ciemne i jasne warunki.Po ustawieniu szalek należy trzymać drzwi inkubatorów zamknięte do momentu zebrania lizatów komórkowych. Półtora dnia po poszyciu rozpocznij oświetlenie światłem. Nie wystawiaj komórek na niekontrolowane światło, aby uniknąć niepożądanej fotostymulacji.Wykonaj więc ten krok bez otwierania drzwi. Zwróć uwagę, że otwarcie drzwi w tym miejscu służy tylko do demonstracji. Około dwa dni po posianiu należy w 30-minutowych odstępach przenieść szalki z inkubatorów do lodu i rozpocząć przygotowanie lizatów komórkowych do dalszej analizy.Aby monitorować reakcje komórkowe na stymulację optyczną przez PMT w czasie rzeczywistym, najpierw trypsynizuj i policz liczbę komórek nadawczych i odbiorczych za pomocą standardowych metod. Przygotuj jednomililitrową zawiesinę całkowitej objętości 25 000 komórek odbiorczych i 125 000 komórek nadawczych. Płytki z mieszanymi komórkami w każdym dołku z 24-dołkowych czarnych płytek z pożywką hodowlaną zawierającą jednomilimolową lucyferynę.Przeanalizuj komórki na czytniku płytek pod kątem testu lucyferazy, aby potwierdzić, że sygnały wyjściowe nie są zbyt wysokie dla systemu nagrywającego. Następnie ustaw płytkę w systemie nagrywającym i uruchom program nagrywający. Na przykład rozpocznij podświetlenie po 18 godzinach od ustawienia nagrywania.Do obrazowania w czasie rzeczywistym odpowiedzi pojedynczych komórek pod kontrolą perturbacji optogenetycznej, najpierw umieść 50 000 komórek odbiorczych i 250 000 komórek nadawczych na szalkach o średnicy 27 milimetrów i szklanej podstawie o średnicy 35 milimetrów. Upewnij się, że proporcje mieszania i całkowita liczba komórek są prawidłowo dostosowane. Jednego dnia po posiewie wymienić pożywkę na dwa mililitry nośnika rejestrującego.Ustaw czaszę ze szklaną podstawą na odwróconym mikroskopie wyposażonym w komorę środowiskową o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Skonfiguruj chłodzoną kamerę CCD. Upewnij się, że temperatura czujnika CCD jest schłodzona do wartości docelowej.Ustaw parametry wielowymiarowego okna poklatkowego w oprogramowaniu do automatycznej akwizycji, aby rejestrować obrazy w odstępach pięciominutowych i więcej niż 288 razy. W wielowymiarowym oknie poklatkowym wybierz kanał luminescencji. Upewnij się, że tryb odczytu jest ustawiony na wolny tryb odczytu 50 kiloherców, co ma kluczowe znaczenie dla redukcji szumów odczytu w celu wykrycia słabo emitującego światła bioluminescencyjnego.W wielowymiarowym oknie poklatkowym wybierz kanały fluorescencji. Upewnij się, że tryb odczytu jest ustawiony na szybki tryb jednego megaherca, aby skrócić czas potrzebny na obrazowanie fluorescencyjne. Na koniec ustaw binning dwa na dwa z 400-milisekundową ekspozycją.Następnie wybierz kartę dziennika, aby ustawić harmonogramy stymulacji komórek za pomocą okresowego oświetlenia światłem niebieskim. Kliknij przycisk plusa, aby dodać nową konfigurację dziennika. Wybierz plik dziennika z pola dziennika, wybierz wiele punktów czasowych i ustaw wartości w polach punktu początkowego i interwału, aby zaplanować stymulację.Upewnij się, że określony plik dziennika zawiera sekwencyjne protokoły wyboru oświetlenia, otwarcia migawki, opóźnienia, zamknięcia migawki i opóźnienia. Następnie ustaw harmonogramy, aby stymulować komórki za pomocą okresowego oświetlenia światłem niebieskim. Na koniec rozpocznij nagrywanie poklatkowe, klikając przycisk Uzyskaj.Na koniec wyodrębnij jednokomórkowe ślady kanałów luminescencyjnych z filmów poklatkowych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Reprezentatywne wyniki optogenetycznych testów nadawczo-odbiorczych przedstawiono tutaj. Fotoindukowane komórki nadawcze wytwarzały oscylacyjne wzorce ekspresji liganda Delta w obecności okresowego oświetlenia światłem niebieskim, zgodnie z oczekiwaniami.Gdy komórki odbiorcze są hodowane wspólnie z światłoczułymi komórkami nadawczymi i wystawiane na powtarzalne oświetlenie świetlne, system rejestracji bioluminescencji w czasie rzeczywistym wykrywa cykliczne reakcje komórek odbiorczych w różnych warunkach mieszania proporcji. Co więcej, mikroskopia poklatkowa z powtarzalnym oświetleniem świetlnym ujawnia również zsynchronizowane reakcje komórek odbiorczych na poziomie pojedynczej komórki. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki, którzy badali, w jaki sposób dynamiczne informacje o ekspresji genów są przenoszone w interakcjach komórka-komórka.

an-optogenetic-method-to-control-analyze-gene-expression-patterns

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Optogenetyka stała się potężnym narzędziem do wykorzystania w eksperymentach neuronauki behawioralnej. Protokół ten oferuje przewodnik krok po kroku po projektowaniu i konfiguracji systemów laserowych oraz zapewnia pełny protokół przeprowadzania wielokrotnych i jednoczesnych stymulacji optogenetycznych in vivo zgodnych z większością paradygmatów testów behawioralnych gryzoni.

In vivo (in vivo) Stymulacja optogenetyczna ośrodkowego układu nerwowego gryzoni

Ten protokół dostarcza przepływ pracy, jak połączyć sztuczną interferencję RNA za pośrednictwem mikroRNA z optogenetyką, aby stymulować specyficznie presynaptyczne butony ze zmniejszoną ekspresją selektywnych genów w nienaruszonych obwodach neuronalnych.

Połączenie optogenetyki ze sztucznymi mikroRNA w celu scharakteryzowania wpływu knockdownu genów na funkcję presynaptyczną w nienaruszonych obwodach neuronalnych

Dzięki optogenetycznej manipulacji określonych populacji neuronów lub obszarów mózgu, zachowanie może być modyfikowane z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną u swobodnie poruszających się zwierząt. Stosując różne narzędzia optogenetyczne w połączeniu z przewlekle wszczepionymi światłowodami, można przeprowadzić różnorodne modulacje neuronalne i testy behawioralne.

Optogenetyczna manipulacja aktywnością neuronalną w celu modulacji zachowania u swobodnie poruszających się myszy

Niezawodna kontrola komórek ssaków reagujących na światło wymaga standaryzacji metod optogenetycznych. Aby osiągnąć ten cel, badanie to nakreśla linię budowy obwodów genowych, inżynierii komórkowej, obsługi sprzętu optogenetycznego i testów weryfikacyjnych w celu standaryzacji badania ekspresji genów indukowanej światłem przy użyciu optogenetycznego obwodu genowego o ujemnym sprzężeniu zwrotnym jako studium przypadku.

Niezawodna inżynieria i kontrola stabilnych optogenetycznych obwodów genowych w komórkach ssaków

Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małych cząsteczkach, lucyferynę - może być wykorzystane do aktywacji białek fotosensorycznych, dodając w ten sposób kolejny wymiar do stymulacji świetlnej i umożliwiając manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach w skalach czasowych i przestrzennych.

Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Optogenetyczna kontrola metabolizmu mikrobiologicznego oferuje elastyczną dynamiczną kontrolę nad procesami fermentacji. Niniejszy protokół pokazuje, jak skonfigurować fermentację regulowaną niebieskim światłem do produkcji chemicznej i białkowej w różnych skalach objętościowych.

Fermentacja kontrolowana światłem do produkcji mikrobiologicznej, chemicznej i białkowej

Ten protokół obejmuje transfekcję czujników cAMP i bPAC-nLuc, białka optogenetycznego, w celu dokładnego śledzenia jego dystrybucji komórkowej i odpowiedzi na stymulację światłem. Innowacyjne podejście polegające na stworzeniu mapy odpowiedzi cAMP przy użyciu systemu skanowania punktowego ma potencjał do przyspieszenia badań nad białkami optogenetycznymi w różnych dziedzinach.

Mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Ten protokół opisuje zastosowanie zaprojektowanej domeny przełącznika allosterycznego aktywowanego niebieskim światłem (LightR) do odwracalnej czasoprzestrzennej kontroli aktywności białek. Wykorzystując kinazę tyrozynową Src jako model, badanie to oferuje skomplikowany protokół do opracowania i scharakteryzowania regulowanego światłem Src (LightR-Src). Pokazuje to wszechstronność tego podejścia w różnych klasach enzymów.

Czasoprzestrzenna kontrola aktywności białek poprzez optogenetyczną regulację allosteryczną

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Poznaj metodę optogenetyczną do analizy oscylacyjnej komunikacji międzykomórkowej w komórkach C2C12. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę dynamiki ekspresji genów i badanie szlaku Notch.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Przeglądaj więcej filmów