Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja transferu informacji oscylacyjnej z komórki do komórki poprzez kontrolę optogenetyczną i monitorowanie ekspresji genów na żywo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób komórki komunikują się ze sobą za pośrednictwem szlaku sygnałowego Notch, a w szczególności tego, w jaki sposób komórki przekazują sobie nawzajem informacje oscylacyjne. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy kontrolować i monitorować dynamikę ekspresji genów z bardzo dużą precyzją.

Procedurę zademonstruje Akihiro Isomura, pracownik naukowy z mojego laboratorium, który opracował tę nową technologię. Aby transfekować wektory plazmidowe modułów optogenetycznych opartych na Tol2 wraz z wektorem ekspresji transpozazy do komórek C2C12, najpierw policz trypsynizowane komórki za pomocą licznika komórek. Płytkę 50 000 komórek C2C12 na basenik na płytce 12-dołkowej na dzień przed transfekcją.

Następnie należy współtransfekować 0,375 mikrograma wektorów optogenetycznych na bazie Tol2, 0,125 mikrograma wektora selekcji leków i 0,5 mikrograma wektora ekspresyjnego transpozazy za pomocą odczynnika do lipofekcji. Trypsynizuj transfekowane komórki i umieść je w 100-milimetrowych szalkach hodowlanych jeden dzień po transfekcji. Zamień pożywkę hodowlaną dla transfekowanych komórek na pożywkę hodowlaną uzupełnioną 100 miligramami na mililitr higromycyny.

Hoduj komórki przez trzy dni, aby wyeliminować nietransfekowane komórki. Należy pamiętać, że zmiana medium nie jest konieczna. Następnie trypsynizuj transfekowane komórki i oczyść populację komórek wyrażających białka fluorescencyjne do selekcji poprzez sortowanie komórek odbiorczych i światłoczułych, jak opisano w protokole tekstowym.

Skonfiguruj dwa typy inkubatorów ze źródłami światła lub bez nich, aby dostosować się do stanu wywołanego światłem lub stanu ciemności. Użyj światłomierza, aby ustawić natężenie światła transiluminatora z niebieską diodą LED. Zmierz natężenie światła po zamknięciu drzwi.

Zaprogramuj czasy i czas trwania oświetlenia świetlnego poprzez załadowanie skryptu sterującego do jednopłytkowego mikrokontrolera, który umożliwia programowalne harmonogramy oświetlenia. Policz trypsynizowane komórki za pomocą licznika komórek i umieść 100 000 światłoczułych komórek nadawczych zawierających pAI218 i pAI170 na plastikowych naczyniach hodowlanych o średnicy 35 milimetrów. Ustaw naczynia w osobnych inkubatorach na ciemne i jasne warunki.

Po ustawieniu szalek należy trzymać drzwi inkubatorów zamknięte do momentu zebrania lizatów komórkowych. Półtora dnia po poszyciu rozpocznij oświetlenie światłem. Nie wystawiaj komórek na niekontrolowane światło, aby uniknąć niepożądanej fotostymulacji.

Wykonaj więc ten krok bez otwierania drzwi. Zwróć uwagę, że otwarcie drzwi w tym miejscu służy tylko do demonstracji. Około dwa dni po posianiu należy w 30-minutowych odstępach przenieść szalki z inkubatorów do lodu i rozpocząć przygotowanie lizatów komórkowych do dalszej analizy.

Aby monitorować reakcje komórkowe na stymulację optyczną przez PMT w czasie rzeczywistym, najpierw trypsynizuj i policz liczbę komórek nadawczych i odbiorczych za pomocą standardowych metod. Przygotuj jednomililitrową zawiesinę całkowitej objętości 25 000 komórek odbiorczych i 125 000 komórek nadawczych. Płytki z mieszanymi komórkami w każdym dołku z 24-dołkowych czarnych płytek z pożywką hodowlaną zawierającą jednomilimolową lucyferynę.

Przeanalizuj komórki na czytniku płytek pod kątem testu lucyferazy, aby potwierdzić, że sygnały wyjściowe nie są zbyt wysokie dla systemu nagrywającego. Następnie ustaw płytkę w systemie nagrywającym i uruchom program nagrywający. Na przykład rozpocznij podświetlenie po 18 godzinach od ustawienia nagrywania.

Do obrazowania w czasie rzeczywistym odpowiedzi pojedynczych komórek pod kontrolą perturbacji optogenetycznej, najpierw umieść 50 000 komórek odbiorczych i 250 000 komórek nadawczych na szalkach o średnicy 27 milimetrów i szklanej podstawie o średnicy 35 milimetrów. Upewnij się, że proporcje mieszania i całkowita liczba komórek są prawidłowo dostosowane. Jednego dnia po posiewie wymienić pożywkę na dwa mililitry nośnika rejestrującego.

Ustaw czaszę ze szklaną podstawą na odwróconym mikroskopie wyposażonym w komorę środowiskową o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Skonfiguruj chłodzoną kamerę CCD. Upewnij się, że temperatura czujnika CCD jest schłodzona do wartości docelowej.

Ustaw parametry wielowymiarowego okna poklatkowego w oprogramowaniu do automatycznej akwizycji, aby rejestrować obrazy w odstępach pięciominutowych i więcej niż 288 razy. W wielowymiarowym oknie poklatkowym wybierz kanał luminescencji. Upewnij się, że tryb odczytu jest ustawiony na wolny tryb odczytu 50 kiloherców, co ma kluczowe znaczenie dla redukcji szumów odczytu w celu wykrycia słabo emitującego światła bioluminescencyjnego.

W wielowymiarowym oknie poklatkowym wybierz kanały fluorescencji. Upewnij się, że tryb odczytu jest ustawiony na szybki tryb jednego megaherca, aby skrócić czas potrzebny na obrazowanie fluorescencyjne. Na koniec ustaw binning dwa na dwa z 400-milisekundową ekspozycją.

Następnie wybierz kartę dziennika, aby ustawić harmonogramy stymulacji komórek za pomocą okresowego oświetlenia światłem niebieskim. Kliknij przycisk plusa, aby dodać nową konfigurację dziennika. Wybierz plik dziennika z pola dziennika, wybierz wiele punktów czasowych i ustaw wartości w polach punktu początkowego i interwału, aby zaplanować stymulację.

Upewnij się, że określony plik dziennika zawiera sekwencyjne protokoły wyboru oświetlenia, otwarcia migawki, opóźnienia, zamknięcia migawki i opóźnienia. Następnie ustaw harmonogramy, aby stymulować komórki za pomocą okresowego oświetlenia światłem niebieskim. Na koniec rozpocznij nagrywanie poklatkowe, klikając przycisk Uzyskaj.

Na koniec wyodrębnij jednokomórkowe ślady kanałów luminescencyjnych z filmów poklatkowych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Reprezentatywne wyniki optogenetycznych testów nadawczo-odbiorczych przedstawiono tutaj. Fotoindukowane komórki nadawcze wytwarzały oscylacyjne wzorce ekspresji liganda Delta w obecności okresowego oświetlenia światłem niebieskim, zgodnie z oczekiwaniami.

Gdy komórki odbiorcze są hodowane wspólnie z światłoczułymi komórkami nadawczymi i wystawiane na powtarzalne oświetlenie świetlne, system rejestracji bioluminescencji w czasie rzeczywistym wykrywa cykliczne reakcje komórek odbiorczych w różnych warunkach mieszania proporcji. Co więcej, mikroskopia poklatkowa z powtarzalnym oświetleniem świetlnym ujawnia również zsynchronizowane reakcje komórek odbiorczych na poziomie pojedynczej komórki. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki, którzy badali, w jaki sposób dynamiczne informacje o ekspresji genów są przenoszone w interakcjach komórka-komórka.