Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych
March 22nd, 2018
Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja transferu informacji oscylacyjnej z komórki do komórki poprzez kontrolę optogenetyczną i monitorowanie ekspresji genów na żywo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób komórki komunikują się ze sobą za pośrednictwem szlaku sygnałowego Notch, a w szczególności tego, w jaki sposób komórki przekazują sobie nawzajem informacje oscylacyjne. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy kontrolować i monitorować dynamikę ekspresji genów z bardzo dużą precyzją.
Procedurę zademonstruje Akihiro Isomura, pracownik naukowy z mojego laboratorium, który opracował tę nową technologię. Aby transfekować wektory plazmidowe modułów optogenetycznych opartych na Tol2 wraz z wektorem ekspresji transpozazy do komórek C2C12, najpierw policz trypsynizowane komórki za pomocą licznika komórek. Płytkę 50 000 komórek C2C12 na basenik na płytce 12-dołkowej na dzień przed transfekcją.
Następnie należy współtransfekować 0,375 mikrograma wektorów optogenetycznych na bazie Tol2, 0,125 mikrograma wektora selekcji leków i 0,5 mikrograma wektora ekspresyjnego transpozazy za pomocą odczynnika do lipofekcji. Trypsynizuj transfekowane komórki i umieść je w 100-milimetrowych szalkach hodowlanych jeden dzień po transfekcji. Zamień pożywkę hodowlaną dla transfekowanych komórek na pożywkę hodowlaną uzupełnioną 100 miligramami na mililitr higromycyny.
Hoduj komórki przez trzy dni, aby wyeliminować nietransfekowane komórki. Należy pamiętać, że zmiana medium nie jest konieczna. Następnie trypsynizuj transfekowane komórki i oczyść populację komórek wyrażających białka fluorescencyjne do selekcji poprzez sortowanie komórek odbiorczych i światłoczułych, jak opisano w protokole tekstowym.
Skonfiguruj dwa typy inkubatorów ze źródłami światła lub bez nich, aby dostosować się do stanu wywołanego światłem lub stanu ciemności. Użyj światłomierza, aby ustawić natężenie światła transiluminatora z niebieską diodą LED. Zmierz natężenie światła po zamknięciu drzwi.
Zaprogramuj czasy i czas trwania oświetlenia świetlnego poprzez załadowanie skryptu sterującego do jednopłytkowego mikrokontrolera, który umożliwia programowalne harmonogramy oświetlenia. Policz trypsynizowane komórki za pomocą licznika komórek i umieść 100 000 światłoczułych komórek nadawczych zawierających pAI218 i pAI170 na plastikowych naczyniach hodowlanych o średnicy 35 milimetrów. Ustaw naczynia w osobnych inkubatorach na ciemne i jasne warunki.
Po ustawieniu szalek należy trzymać drzwi inkubatorów zamknięte do momentu zebrania lizatów komórkowych. Półtora dnia po poszyciu rozpocznij oświetlenie światłem. Nie wystawiaj komórek na niekontrolowane światło, aby uniknąć niepożądanej fotostymulacji.
Wykonaj więc ten krok bez otwierania drzwi. Zwróć uwagę, że otwarcie drzwi w tym miejscu służy tylko do demonstracji. Około dwa dni po posianiu należy w 30-minutowych odstępach przenieść szalki z inkubatorów do lodu i rozpocząć przygotowanie lizatów komórkowych do dalszej analizy.
Aby monitorować reakcje komórkowe na stymulację optyczną przez PMT w czasie rzeczywistym, najpierw trypsynizuj i policz liczbę komórek nadawczych i odbiorczych za pomocą standardowych metod. Przygotuj jednomililitrową zawiesinę całkowitej objętości 25 000 komórek odbiorczych i 125 000 komórek nadawczych. Płytki z mieszanymi komórkami w każdym dołku z 24-dołkowych czarnych płytek z pożywką hodowlaną zawierającą jednomilimolową lucyferynę.
Przeanalizuj komórki na czytniku płytek pod kątem testu lucyferazy, aby potwierdzić, że sygnały wyjściowe nie są zbyt wysokie dla systemu nagrywającego. Następnie ustaw płytkę w systemie nagrywającym i uruchom program nagrywający. Na przykład rozpocznij podświetlenie po 18 godzinach od ustawienia nagrywania.
Do obrazowania w czasie rzeczywistym odpowiedzi pojedynczych komórek pod kontrolą perturbacji optogenetycznej, najpierw umieść 50 000 komórek odbiorczych i 250 000 komórek nadawczych na szalkach o średnicy 27 milimetrów i szklanej podstawie o średnicy 35 milimetrów. Upewnij się, że proporcje mieszania i całkowita liczba komórek są prawidłowo dostosowane. Jednego dnia po posiewie wymienić pożywkę na dwa mililitry nośnika rejestrującego.
Ustaw czaszę ze szklaną podstawą na odwróconym mikroskopie wyposażonym w komorę środowiskową o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Skonfiguruj chłodzoną kamerę CCD. Upewnij się, że temperatura czujnika CCD jest schłodzona do wartości docelowej.
Ustaw parametry wielowymiarowego okna poklatkowego w oprogramowaniu do automatycznej akwizycji, aby rejestrować obrazy w odstępach pięciominutowych i więcej niż 288 razy. W wielowymiarowym oknie poklatkowym wybierz kanał luminescencji. Upewnij się, że tryb odczytu jest ustawiony na wolny tryb odczytu 50 kiloherców, co ma kluczowe znaczenie dla redukcji szumów odczytu w celu wykrycia słabo emitującego światła bioluminescencyjnego.
W wielowymiarowym oknie poklatkowym wybierz kanały fluorescencji. Upewnij się, że tryb odczytu jest ustawiony na szybki tryb jednego megaherca, aby skrócić czas potrzebny na obrazowanie fluorescencyjne. Na koniec ustaw binning dwa na dwa z 400-milisekundową ekspozycją.
Następnie wybierz kartę dziennika, aby ustawić harmonogramy stymulacji komórek za pomocą okresowego oświetlenia światłem niebieskim. Kliknij przycisk plusa, aby dodać nową konfigurację dziennika. Wybierz plik dziennika z pola dziennika, wybierz wiele punktów czasowych i ustaw wartości w polach punktu początkowego i interwału, aby zaplanować stymulację.
Upewnij się, że określony plik dziennika zawiera sekwencyjne protokoły wyboru oświetlenia, otwarcia migawki, opóźnienia, zamknięcia migawki i opóźnienia. Następnie ustaw harmonogramy, aby stymulować komórki za pomocą okresowego oświetlenia światłem niebieskim. Na koniec rozpocznij nagrywanie poklatkowe, klikając przycisk Uzyskaj.
Na koniec wyodrębnij jednokomórkowe ślady kanałów luminescencyjnych z filmów poklatkowych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Reprezentatywne wyniki optogenetycznych testów nadawczo-odbiorczych przedstawiono tutaj. Fotoindukowane komórki nadawcze wytwarzały oscylacyjne wzorce ekspresji liganda Delta w obecności okresowego oświetlenia światłem niebieskim, zgodnie z oczekiwaniami.
Gdy komórki odbiorcze są hodowane wspólnie z światłoczułymi komórkami nadawczymi i wystawiane na powtarzalne oświetlenie świetlne, system rejestracji bioluminescencji w czasie rzeczywistym wykrywa cykliczne reakcje komórek odbiorczych w różnych warunkach mieszania proporcji. Co więcej, mikroskopia poklatkowa z powtarzalnym oświetleniem świetlnym ujawnia również zsynchronizowane reakcje komórek odbiorczych na poziomie pojedynczej komórki. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki, którzy badali, w jaki sposób dynamiczne informacje o ekspresji genów są przenoszone w interakcjach komórka-komórka.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół do analizy przenoszenia informacji oscylacyjnych między komórkami przy użyciu kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Metoda ta pozwala na precyzyjne sterowanie i obserwację dynamiki ekspresji genów, dostarczając wglądu w komunikację komórkową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Optogenetyka
Tło
- Zrozumienie komunikacji komórkowej jest kluczowe dla rozszyfrowania systemów wielokomórkowych.
- Ścieżka sygnałowa Notch odgrywa istotną rolę w interakcjach komórkowych.
- Przenoszenie informacji oscylacyjnych jest kluczowym aspektem dynamiki komórkowej.
- Narzędzia optogenetyczne umożliwiają precyzyjną manipulację ekspresją genów.
Cel badania
- Obserwacja, jak komórki komunikują się poprzez sygnały oscylacyjne.
- Badanie dynamiki ekspresji genów w kontekście wielokomórkowym.
- Opracowanie platformy do testowania funkcjonalnego znaczenia programów ekspresji genów.
Stosowane metody
- Transfekcja wektorów plazmidowych do komórek C2C12.
- Użycie modułów optogenetycznych opartych na Tol2.
- Monitorowanie na żywo dynamiki ekspresji genów.
- Techniki liczenia i rozsiewu komórek do transfekcji.
Główne wyniki
- Skuteczna transfekcja modułów optogenetycznych do komórek docelowych.
- Demonstracja przenoszenia informacji oscylacyjnych między komórkami.
- Wysoka precyzja w kontrolowaniu dynamiki ekspresji genów.
- Wgląd w rolę sygnałowania Notch w komunikacji komórkowej.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia cenne narzędzie do badania komunikacji komórkowej.
- Kontrola optogenetyczna poprawia nasze rozumienie dynamiki ekspresji genów.
- Wyniki mogą mieć wpływ na zrozumienie systemów wielokomórkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This optogenetic method enables precise temporal control and live monitoring of gene expression in cell-to-cell interactions, addressing a key challenge in deciphering dynamic signaling mechanisms. By revealing how oscillatory Notch signaling entrains intrinsic cellular rhythms through frequency tuning and phase shifting, the approach provides mechanistic de-risking for target validation in multicellular systems. It supports predictive confidence in early discovery by linking dynamic gene expression programs to functional intercellular communication.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing how periodic inputs of signaling pathways entrain intrinsic oscillations at single-cell resolution.
- Operational Value: Enables functional target validation through optogenetic perturbation and real-time readout of gene expression dynamics.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying how dynamic signaling features influence cellular response patterns in disease-relevant contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated sender-receiver coculture systems for downstream screening of modulators affecting oscillatory signal transfer.
- Operational Value: Standardizes light-controlled stimulation protocols and luminescent readouts for reproducible, quantitative assay outputs.
- Scalability: Facilitates platform reuse across signaling pathways by decoupling optogenetic control from specific genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects dynamic gene expression measurements in vitro to potential biomarker alignment in multicellular disease models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed oscillatory patterns are drivers or passengers in pathogenic signaling, reducing ambiguity in target selection.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating whether modulating signal dynamics alters phenotypic outcomes in receiver cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early biology to assay readiness for lead identification, particularly when dynamic signaling behavior is a key determinant of target validity.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of how oscillatory information transfer contributes to cellular decision-making in Notch and similar pathways.
- Screening: Enables assay development for compounds that disrupt or enhance frequency-specific signal transmission between cells.
- Analytics: Provides quantitative time-series data on luminescence and fluorescence readouts, enabling statistical comparison of entrainment efficacy across conditions.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies when oscillatory dynamics correlate with functional states in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular optogenetic platform applicable to multiple signaling systems beyond Notch, increasing long-term ROI.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by resolving mechanistic ambiguity in how dynamic gene expression programs influence intercellular communication.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible control over temporal stimulation and real-time monitoring, reducing variability in complex coculture systems.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of whether targeting dynamic signaling features yields measurable phenotypic effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets where signal dynamics, not just static expression, are functionally relevant.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, live-cell imaging, and luciferase-based reporter systems.
- Depends on access to programmable light sources, environmental chambers, and plate readers capable of low-light luminescence detection.
- Necessitates standardization of light intensity, timing schedules, and cell mixing ratios across teams for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the system to primary cells or in vivo models due to differences in transfection efficiency and light penetration.
- Practical limitations include potential phototoxicity from prolonged blue-light exposure and signal saturation in high-density cocultures, as noted in the protocol’s optimization steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:44
Generation of Stable Cell Lines by the Tol2 System
2:07
Evaluation of Photo-sensitivity of Engineered Cells at the Population Level
3:31
Dynamic Sender-receiver Assay at the Population Level and at the Single-cell Level
6:47
Results: Analysis of Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions
7:35
Conclusion
