Optyczna kontrola białka neuronalnego za pomocą genetycznie kodowanego nienaturalnego aminokwasu w neuronach

Ogólnym celem tej procedury jest optyczna kontrola funkcji białka neuronalnego za pomocą genetycznie zakodowanego, nienaturalnego aminokwasu w neuronach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące udziału określonego białka neuronalnego w sygnalizacji neuronalnej w funkcjonowaniu mózgu z przestrzenną rozdzielczością czasową. Główną zaletą tej techniki jest to, że może być stosowana do różnych białek neuronalnych w celu uzyskania optycznej regulacji różnych procesów neuronalnych.

Rozpocznij tę procedurę od posiewu neuronów hipokampa na szkiełkach nakrywkowych na 24-dołkowej płytce z 500 mikrolitrami pożywki wzrostowej, po przefiltrowaniu przez 40-mikrometrową siatkę nylonową. Następnie inkubuj kulturę neuronalną w temperaturze 35 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla i 95% nawilżanym powietrzem przez 2 do 3 tygodni. W dniu transfekcji przygotować świeży 2,5 molowy roztwór chlorku wapnia w podwójnie destylowanej wodzie i sterylnie przefiltrować go filtrem 0,22 mikrometra.

Następnie przygotuj świeży 2X BBS o pH 7 i sterylnie przefiltruj go filtrem 0,22 mikrometra. Następnie zastąp pożywkę hodowlaną 500 mikrolitrami świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki do transfekcji i nie wyrzucaj starych pożywek wzrostowych. Przygotuj roztwór do transfekcji bezpośrednio przed dodaniem go do kultury, łącząc chlorek wapnia i podwójnie destylowaną wodę, powoli mieszając probówkę.

Kontynuuj mieszanie probówki i powoli dodawaj DNA do roztworu. Następnie dodaj kroplami bufor 2X BBS. Przygotowanie buforu 2X BBS jest krytycznym krokiem w transfekcji fosforanu wapnia i dobrym pomysłem jest kalibracja optymalnego pH dla buforu 2X BBS w zakresie od 6,90 do 7,15 dla nowych konstruktów lub preparatów DNA.

Następnie natychmiast dodać 30 mikrolitrów roztworu do transfekcji do każdego szkiełka nakrywkowego hodowli neuronalnej. Kołysz naczyniem hodowlanym kilka razy, aby wymieszać roztwór, i inkubuj je w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez 45 minut do godziny. Po około godzinie należy zaobserwować warstwę drobnych osadów fosforanu wapnia pokrywającą neurony.

Następnie zastąp pożywkę transfekcyjną 500 mikrolitrami wstępnie podgrzanego buforu płuczącego i inkubuj w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut. Osady fosforanu wapnia powinny zniknąć po umyciu. Teraz zastąp bufor myjący 500 mikrolitrami świeżej pożywki wzrostowej.

Następnie zastąp pożywkę wzrostu zapisanym oryginalnym nośnikiem. Następnie dodaj do kultury wstępnie zmieszany, nienaturalny aminokwas Cmn w 50 mikrolitrach ciepłej pożywki wzrostowej, co daje końcowe stężenie jednego milimola. Inkubuj transfekowaną kulturę w temperaturze 35 stopni Celsjusza przez 12 do 48 godzin przed nagraniem.

W tej procedurze przygotuj roztwory zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe. W naszej konfiguracji dioda LED o emisji 385 nanometrów jest zainstalowana obok mikroskopu, aby dostarczyć światło na odległość jednego centymetra od punktu ogniskowego pod kątem 45 stopni. Następnie narysuj kilka pipet z plastrami za pomocą szklanej elektrody za pomocą ściągacza do mikropipet.

Następnie weź szkiełko nakrywkowe z kultur neuronów z inkubatora i przepłucz je raz w roztworze zewnątrzkomórkowym. Obficie zestaw roztworem zewnątrzkomórkowym. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na platformie mikroskopu elektrofizjologicznego, stosując standardowe techniki zaciskania łat.

Łatać neuron transfekowany fluorescencyjnymi M-cytrynami. Następnie rejestruj aktywność neuronalną za pomocą metody bieżącego zacisku. Najpierw dostosuj potencjał spoczynkowy do około minus 72 miliwoltów.

Następnie wstrzyknij prąd krokowy, aby indukować ciągłe wyzwalanie potencjałów czynnościowych z częstotliwością od pięciu do 15 Hz. Podczas nagrywania dostarczaj pojedyncze impulsy LED do neuronu i monitoruj zmiany jego potencjałów czynnościowych. Następnie dodaj 0,5 milimolowego chlorku baru do kąpieli, aby odzyskać potencjały czynnościowe.

W przypadku ostrego wycinka mózgu należy załatać neuron fluorescencyjnymi M-wiśniowymi GFP z obszaru kory nowej. Następnie rejestruj aktywność PIRK przy użyciu metody narastania napięcia. W szczególności monitoruj prądy wewnętrzne specyficzne dla Kir2.1 przy ujemnych 100 miliwoltach.

Następnie dostarczaj pojedyncze impulsy LED do neuronu podczas nagrywania i monitoruj, czy białka PIRK są aktywowane. Po aktywacji PIRK prądy wewnętrzne o wartości ujemnej 100 miliwoltów znacznie wzrosłyby. Na koniec dodaj 0,5 milimolowego chlorku baru do kąpieli i sprawdź, czy PIRK jest inaktywowany.

Pokazano tutaj przykładowe zdjęcia zdrowych kultur neuronalnych hipokampa szczura. I dwa zdrowe neurony wykazujące pulchne ciała komórkowe i wyraźne dendryty i aksony. Są to obrazy DIC i fluorescencyjne hodowli neuronów hipokampa szczura in vitro i transfekowane w celu ekspresji PIRK bez CMN.

W obecności jednego milimolowego CMN, transfekowane neurony są zdolne do ekspresji pełnowymiarowych białek M-cytryny PIRK, wykazując w ten sposób zieloną fluorescencję. A oto przykład pojedynczego impulsu świetlnego, tłumiącego aktywność neuronu hipokampa wyrażonego przez PIRK. Te obrazy fluescencji embrionalnych neuronów korowych myszy pokazują pomyślne włączenie CMN do białek GFP i Kir2.1 in vivo.

Na tym wykresie zależna od światła aktywacja PIRK jest wskazana w prądach zarejestrowanych przez neurony kory nowej myszy. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób mózgu spowodowanych nieprawidłowym funkcjonowaniem określonych białek neuronalnych, na przykład zmutowanego Kir2.1 w zespole Andersena, ponieważ technika ta pomaga odkryć, które obwody mózgowe są dotknięte deficytami Kir2.1. Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do kontrolowania funkcji białek neuronalnych za pomocą światła o wysokiej specyficzności w żywych neuronach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak włączyć nienaturalne aminokwasy do białek w neuronach, aby uzyskać kontrolę nad interesującymi białkami neuronalnymi.