Name: Jednoczesne rozróżnianie monospecyficznych i mieszanych wzorców DFS70 podczas badań przesiewowych ANA za pomocą nowatorskiego podłoża do nokautowania HEp-2 ELITE/DFS70 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-17T10:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę immunofluorescencji pośredniej z podłożem HEp-2 DFS70 do badania przeciwciał antyjądrowych. Nowatorskie podejście umożliwia jednoczesne rozróżnianie wzorców monospecyficznych i mieszanych DFS70, zwiększając pewność diagnostyczną w autoimmunologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Andrew Zengerowi za przeprowadzenie eksperymentów IIF i zebranie obrazów.

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komisji Etyki Badań Naukowych na Ludziach Trinity Biotech.
1. Przygotowanie próbki i substratu
<ol>
	<li>Pozwolić, aby woreczki zawierające szkiełka podstawowe (szkiełka podstawowe z 12 dołkami na każdym szkiełku zawierającym mieszaninę komórek HEp2 lub HEp-2+HEp2 KO) osiągnęły równowagę do temperatury pokojowej w celu uzyskania optymalnej wydajności i zapobiegły kondensacji wilgoci na powierzchni szkiełka przed dodaniem próbki. Powinno to zająć około 10 - 15 minut.</li>
	<li>Po wyrównaniu do temperatury pokojowej ostrożnie usuń szkiełka podłoża palcami, nie dotykając ich boków torebki.</li>
	<li>Oznaczyć szkiełka i umieścić je w komorze inkubacyjnej (w temperaturze pokojowej) wyłożonej ręcznikami papierowymi zwilżonymi wodą, aby zapobiec wysuszeniu szkiełek podczas inkubacji próbki i koniugatu. 
	UWAGA: Niespecyficzne barwienie może wynikać z suchych studni; Mokry ręcznik papierowy wewnątrz komory inkubacyjnej zapewnia wilgoć i dobrze zapobiega wysuszeniu.</li>
</ol>
2. Dodawanie kontroli i próbek
<ol>
	<li>Dozować około 50 μl kontroli ujemnej/dodatniej, kombinacji surowic DFS70-ANA dodatnich, jak opisano w tym badaniu, lub próbek surowicy pacjenta do indywidualnych studzienek szkiełkowych.</li>
	<li>Dozować kontrolę(-e) i próbki do każdego dołka na szkiełku.</li>
	<li>Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu studni, należy unikać przepełniania studni. Nie przepełniając studni, należy zapewnić pełne pokrycie powierzchni studni i unikać pęcherzyków powietrza. 
	UWAGA: Zalecana objętość to 50 μl zgodnie z krokiem 2.1.</li>
	<li>Umieścić pokrywkę na komorze inkubacyjnej i inkubować szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli w surowicy pacjenta znajduje się ANA (ANA), wiąże się ono z komórkami obecnymi w każdym dołku podczas tego okresu inkubacji.</li>
	<li>Po zakończeniu okresu inkubacji wyjąć szkiełko z komory inkubacyjnej. Przytrzymaj szkiełko na końcu wypustki i delikatnie płucz około 10 ml buforu do płukania soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) dostarczonego w zestawie, używając pipety lub w zlewce wypełnionej PBS przez 10 - 15 s. Natychmiast przenieś szkiełko do słoika Coplin z buforem do płukania PBS i myj (moczyć) przez 10 minut. Powtórz ten proces ze wszystkimi pozostałymi slajdami. 
	UWAGA: Umieszczając wiele szkiełek w słoiku Coplin, upewnij się, że strona komórki szkiełka nie styka się z innym szkiełkiem, ponieważ spowoduje to uszkodzenie komórek przyklejonych do szkiełka.</li>
</ol>
3. Dodawanie koniugatu fluorescencyjnego
<ol>
	<li>Wyjmuj tylko jedno szkiełko na raz ze słoika Coplin. Aby usunąć nadmiar buforu do płukania PBS ze szkiełka, delikatnie postukaj lub osusz szkiełko w ręcznik papierowy. Każdy zestaw jest dostarczany z koniugatem fluorescencyjnym anty-ludzkiej IgG znakowanym przez FITC. Na każdą studzienkę delikatnie nałóż 1 kroplę (około 50 μl) dołączonego koniugatu.</li>
	<li>Inkubować szkiełka w zamkniętej komorze inkubacyjnej do barwienia przez 30 min. 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie koniugatu IgG swoistego dla Fc. Jeśli w surowicy pacjenta znajduje się ANA , koniugat zwiąże się z komórkami obecnymi w każdym studzienku podczas tego okresu inkubacji, co spowoduje specyficzną fluorescencję komórek obecnych w studzienkach. Koniugat jest wrażliwy na światło. Zamknięta komora inkubacyjna pomoże zapobiec interferencji światła z reakcją sprzężoną komórek obecnych w każdym dołku.</li>
	<li>Po zakończeniu okresu inkubacji wyjąć szkiełko z komory inkubacyjnej. Trzymać szkiełko na końcu wypustki i delikatnie spłukać około 10 ml PBS buforem do płukania dostarczonym w zestawie, za pomocą pipety lub w zlewce wypełnionej PBS. Natychmiast przenieś szkiełko do słoika Coplin z buforem do płukania PBS i myj (moczyć) przez 10 minut. Powtórz ten proces ze wszystkimi pozostałymi slajdami. 
	UWAGA: Umieszczając wiele szkiełek w słoiku Coplin, upewnij się, że strona komórki szkiełka nie styka się z innym szkiełkiem, ponieważ spowoduje to uszkodzenie komórek przyklejonych do szkiełka.</li>
	<li>Umieść szkiełka nakrywkowe znajdujące się w zestawie na suchym ręczniku papierowym. Media montażowe są dostarczane z zestawem. Na dolną krawędź szkiełka nakrywkowego nałóż od 3 do 4 kropli środka montażowego w linii.</li>
	<li>Wyjmować po jednym szkiełku ze słoika Coplin zawierającego bufor do mycia. Aby usunąć nadmiar buforu do mycia, delikatnie postukaj lub osusz szkiełko w ręczniku papierowym.</li>
	<li>Delikatnie opuść szkiełko na szkiełko nakrywkowe, przykładając dolną krawędź szkiełka do krawędzi szkiełka nakrywkowego. Pozwala to na przepływ mediów montażowych znajdujących się na dolnej krawędzi szkiełka nakrywkowego do górnej krawędzi szkiełka i minimalizuje tworzenie się pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócać odczyt każdej studzienki szkiełka. 
	UWAGA: Do zamontowania prowadnicy pokrywy na prowadnicy na prowadnicy należy użyć minimalnego nacisku. Każde nadmierne ciśnienie może powodować boczne ruchy szkiełek nakrywkowych. Może to spowodować uszkodzenie jednowarstwowego przygotowania komórek i spowodować zniekształcenia.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w ciemności w temperaturze 2 - 8 °C. Sprawdzić szkiełka zaraz po ich zamontowaniu lub w ciągu 48 godzin 
	UWAGA: Dłuższe przechowywanie może spowodować pogorszenie wzoru i sygnału fluorescencyjnego.</li>
</ol>
4. Identyfikacja pozytywnych i negatywnych wyników
<ol>
	<li>Obejrzyj preparaty za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu zestawu filtrów FITC, umieszczonego w ciemnym pomieszczeniu.</li>
	<li>Zbadaj specyficzną jasnozieloną fluorescencję pod mikroskopem fluorescencyjnym przy powiększeniu 200X lub większym, aby dokonać ostatecznej interpretacji dotyczącej pozytywności i wzoru. Przestrzegać kontroli dodatniej i negatywnej. 
	UWAGA: Kontrola pozytywna będzie wykazywać jasnozieloną fluorescencję w jądrze (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A, jednorodny). Kontrola ujemna nie będzie wykazywać specyficznej zielonej fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
	<li>Zapisz wynik pozytywny/ujemny dla każdej studzienki i dołącz wzór ANA dla przypadków pozytywnych.</li>
</ol>

<ol><li>American College of Rheumatology. Position Statement. Methodology of testing for antinuclear antibodies. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf">https://www.rheumatology.org/Portals/0/Files/Methodology%20of%20Testing%20Antinuclear%20Antibodies%20Position%20Statement.pdf</a> (2011).</li>
<li>Meroni, P. L., Schur, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANA+screening%3A+an+old+test+with+new+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">ANA screening: an old test with new recommendations.</a> Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).</li>
<li>Agmon-Levin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+recommendations+for+the+assessment+of+autoantibodies+to+cellular+antigens+referred+to+as+anti-nuclear+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies.</a> Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).</li>
<li>Chan, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Report+of+the+First+International+Consensus+on+Standardized+Nomenclature+of+Antinuclear+Antibody+HEp-2+Cell+Patterns+2014-2015%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Report of the First International Consensus on Standardized Nomenclature of Antinuclear Antibody HEp-2 Cell Patterns 2014-2015.</a> Front Immunol. 6, 412(2015).</li>
<li>Malyavantham, K., Suresh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DFS70+pattern+and+impact+on+ANA+screening+using+a+novel+HEp-2+ELITE%2FDFS70+knockout+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Auto+Immun+Highlights%22%5BJournal%5D)">Analysis of DFS70 pattern and impact on ANA screening using a novel HEp-2 ELITE/DFS70 knockout substrate.</a> Auto Immun Highlights. 8 (1), 3(2017).</li>
<li>Sperotto, F., Seguso, M., Gallo, N., Plebani, M., Zulian, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-DFS70+antibodies+in+healthy+schoolchildren%3A+A+follow-up+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Anti-DFS70 antibodies in healthy schoolchildren: A follow-up analysis.</a> Autoimmun Rev. , (2017).</li>
<li>Ayaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cytotoxic+anti-LEDGF+autoantibodies+in+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Detection of cytotoxic anti-LEDGF autoantibodies in atopic dermatitis.</a> Autoimmunity. 35 (5), 319-327 (2002).</li>
<li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+DFS+70+kd%2Ftranscription+coactivator+p75+in+atopic+dermatitis+and+other+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to DFS 70 kd/transcription coactivator p75 in atopic dermatitis and other conditions.</a> J Allergy Clin Immunol. 105 (6 Pt 1), 1211-1220 (2000).</li>
<li>Watanabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-DFS70+antibodies+in+597+healthy+hospital+workers%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+immune+response+directed+against+LEDGF+in+patients+with+VKH%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Humoral immune response directed against LEDGF in patients with VKH.</a> Immunol Lett. 78 (3), 161-168 (2001).</li>
<li>Seelig, C. A., Bauer, O., Seelig, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+Against+DFS70%2FLEDGF+Exclusion+Markers+for+Systemic+Autoimmune+Rheumatic+Diseases+%28SARD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies Against DFS70/LEDGF Exclusion Markers for Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases (SARD).</a> Clin Lab. 62 (4), 499-517 (2016).</li>
<li>Ochs, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+autoantibodies+to+DFS70%2FLEDGFp75+in+health+and+disease%3A+integrating+basic+science+with+clinical+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The significance of autoantibodies to DFS70/LEDGFp75 in health and disease: integrating basic science with clinical understanding.</a> Clin Exp Med. 16 (3), 273-293 (2016).</li>
<li>Bizzaro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+chemoluminescence+and+immunoasdorption+tests+for+anti-DFS70+antibodies+avoid+false+positive+results+by+indirect+immunofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Specific chemoluminescence and immunoasdorption tests for anti-DFS70 antibodies avoid false positive results by indirect immunofluorescence.</a> Clin Chim Acta. 451 (Pt B), 271-277 (2015).</li>
<li>Bizzaro, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+lens+and+cornea+in+anti-DFS70-positive+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the lens and cornea in anti-DFS70-positive subjects.</a> Ann N Y Acad Sci. 1107, 174-183 (2007).</li>
<li>Daniels, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+autoantibodies+in+prostate+cancer%3A+immunity+to+LEDGF%2Fp75%2C+a+survival+protein+highly+expressed+in+prostate+tumors+and+cleaved+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Antinuclear autoantibodies in prostate cancer: immunity to LEDGF/p75, a survival protein highly expressed in prostate tumors and cleaved during apoptosis.</a> Prostate. 62 (1), 14-26 (2005).</li>
<li>Dellavance, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+spectrum+of+antinuclear+antibodies+associated+with+the+nuclear+dense+fine+speckled+immunofluorescence+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The clinical spectrum of antinuclear antibodies associated with the nuclear dense fine speckled immunofluorescence pattern.</a> J Rheumatol. 32 (11), 2144-2149 (2005).</li>
<li>Gundin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+anti-DFS70+antibodies+in+patients+with+ANA-associated+autoimmune+rheumatic+diseases+suspicion+is+cost-effective%5BTitle%5D)+AND+%22Auto+Immun+Highlights%22%5BJournal%5D)">Measurement of anti-DFS70 antibodies in patients with ANA-associated autoimmune rheumatic diseases suspicion is cost-effective.</a> Auto Immun Highlights. 7 (1), 10(2016).</li>
<li>Kang, S. Y., Lee, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+dense+fine+speckled+pattern+in+anti-nuclear+antibody+test+using+indirect+immunofluorescence+method%5BTitle%5D)+AND+%22Korean+J+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of dense fine speckled pattern in anti-nuclear antibody test using indirect immunofluorescence method.</a> Korean J Lab Med. 29 (2), 145-151 (2009).</li>
<li>Lee, H., Kim, Y., Han, K., Oh, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+anti-DFS70+antibody+and+specific+autoantibody+test+algorithms+to+patients+with+the+dense+fine+speckled+pattern+on+HEp-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Application of anti-DFS70 antibody and specific autoantibody test algorithms to patients with the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells.</a> Scand J Rheumatol. 45 (2), 122-128 (2016).</li>
<li>Mariz, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+on+the+antinuclear+antibody-HEp-2+test+is+a+critical+parameter+for+discriminating+antinuclear+antibody-positive+healthy+individuals+and+patients+with+autoimmune+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody-positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).</li>
<li>Marlet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombophilia+Associated+with+Anti-DFS70+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Thrombophilia Associated with Anti-DFS70 Autoantibodies.</a> PLoS One. 10 (9), e0138671(2015).</li>
<li>Mercado, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+autoantibodies+to+DSF70%2FLEDGFp75+in+Mexican+Hispanics+using+multiple+complementary+assay+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Auto+Immun+Highlights%22%5BJournal%5D)">Detection of autoantibodies to DSF70/LEDGFp75 in Mexican Hispanics using multiple complementary assay platforms.</a> Auto Immun Highlights. 8 (1), 1(2017).</li>
<li>Muro, Y., Sugiura, K., Morita, Y., Tomita, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concomitance+of+disease+marker+autoantibodies+in+anti-DFS70%2FLEDGF+autoantibody-positive+patients+with+autoimmune+rheumatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lupus%22%5BJournal%5D)">High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease.</a> Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).</li>
<li>Muro, Y., Sugiura, K., Nakashima, R., Mimori, T., Akiyama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+prevalence+of+anti-DFS70%2FLEDGF+antibodies+in+patients+with+dermatomyositis+and+other+systemic+autoimmune+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Low prevalence of anti-DFS70/LEDGF antibodies in patients with dermatomyositis and other systemic autoimmune rheumatic diseases.</a> J Rheumatol. 40 (1), 92-93 (2013).</li>
<li>Mutlu, E., Eyigor, M., Mutlu, D., Gultekin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+anti-DFS70+antibodies+is+needed+in+routine+clinical+samples+with+DFS+staining+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Cent+Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Confirmation of anti-DFS70 antibodies is needed in routine clinical samples with DFS staining pattern.</a> Cent Eur J Immunol. 41 (1), 6-11 (2016).</li>
<li>Okamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+DFS70%2FLEDGF+are+increased+in+alopecia+areata+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to DFS70/LEDGF are increased in alopecia areata patients.</a> J Autoimmun. 23 (3), 257-266 (2004).</li>
<li>Pazini, A. M., Fleck, J., dos Santos, R. S., Beck, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+relevance+and+frequency+of+cytoplasmic+and+nuclear+dense+fine+speckled+patterns+observed+in+ANA-HEp-2%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Bras+Reumatol%22%5BJournal%5D)">Clinical relevance and frequency of cytoplasmic and nuclear dense fine speckled patterns observed in ANA-HEp-2.</a> Rev Bras Reumatol. 50 (6), 655-660 (2010).</li>
<li>Schmeling, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+Dense+Fine+Speckles+in+Pediatric+Diseases+and+Controls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to Dense Fine Speckles in Pediatric Diseases and Controls.</a> J Rheumatol. 42 (12), 2419-2426 (2015).</li>
<li>Wiik, A. S., Hoier-Madsen, M., Forslid, J., Charles, P., Meyrowitsch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antinuclear+antibodies%3A+a+contemporary+nomenclature+using+HEp-2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Autoimmun%22%5BJournal%5D)">Antinuclear antibodies: a contemporary nomenclature using HEp-2 cells.</a> J Autoimmun. 35 (3), 276-290 (2010).</li>
<li>Mahler, M., Fritzler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clinical+Significance+of+the+Dense+Fine+Speckled+Immunofluorescence+Pattern+on+HEp-2+Cells+for+the+Diagnosis+of+Systemic+Autoimmune+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Clinical Significance of the Dense Fine Speckled Immunofluorescence Pattern on HEp-2 Cells for the Diagnosis of Systemic Autoimmune Diseases.</a> Clin Dev Immunol. 2012, 494356(2012).</li>
<li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-DFS70%2FLEDGF+Antibodies+Are+More+Prevalent+in+Healthy+Individuals+Compared+to+Patients+with+Systemic+Autoimmune+Rheumatic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Anti-DFS70/LEDGF Antibodies Are More Prevalent in Healthy Individuals Compared to Patients with Systemic Autoimmune Rheumatic Diseases.</a> J Rheumatol. 39 (11), 2104-2110 (2012).</li>
<li>Conrad, K., Rober, N., Andrade, L. E., Mahler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clinical+Relevance+of+Anti-DFS70+Autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Rev+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Clinical Relevance of Anti-DFS70 Autoantibodies.</a> Clin Rev Allergy Immunol. , (2016).</li>
<li>Miyara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Phenotypes+of+Patients+with+Anti-DFS70%2FLEDGF+Antibodies+in+a+Routine+ANA+Referral+Cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Dev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Clinical Phenotypes of Patients with Anti-DFS70/LEDGF Antibodies in a Routine ANA Referral Cohort.</a> Clin Dev Immunol. 2013, 703759(2013).</li>
<li>Bizzaro, N., Tonutti, E., Villalta, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+the+dense+fine+speckled%2Flens+epithelium-derived+growth+factor%2Fp75+pattern+on+HEP-2+cells%3A+not+an+easy+task%21+Comment+on+the+article+by+Mariz+et+al%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Recognizing the dense fine speckled/lens epithelium-derived growth factor/p75 pattern on HEP-2 cells: not an easy task! Comment on the article by Mariz et al.</a> Arthritis Rheum. 63 (12), 4036-4037 (2011).</li>
</ol>

Autorzy, Kishore Malyavantham i Lakshmanan Suresh, są pracownikami Trinity Biotech, USA.

Autoprzeciwciała przeciwko antygenom jądrowym i cytoplazmatycznym są bardzo rozpowszechnione w układowych chorobach autoimmunologicznych. Chociaż żaden pojedynczy test nie zapewnia najlepszej możliwej czułości i swoistości, IIF za pomocą HEp-2 jest powszechnie uważany za wysoce czułą i opłacalną metodę badań przesiewowych w kierunku układowych chorób autoimmunologicznych 2,3,4. Pomimo rozpowszechnienia protokołu IIF od ponad 50 lat, dokładność testu IIF w dużym stopniu zależy od umiejętności technika, starannego wykonania poszczególnych kroków protokołu i dokładnej interpretacji wyników przy użyciu dobrze utrzymanego mikroskopu fluorescencyjnego. Rozpoznanie układowej choroby autoimmunologicznej nie powinno opierać się na wynikach pojedynczego testu serologicznego, takiego jak IIF za pomocą HEp-2.
Odtworzenie odczynników przy użyciu wysokiej jakości wody (destylowanej/dejonizowanej), użycie znormalizowanych składników zestawu (szkiełka z monowarstwami komórek HEp-2, rozcieńczalnik do próbek, kontrole dodatnie i ujemne, wstępnie rozcieńczony zoptymalizowany koniugat FITC i podłoże montażowe) mają pozytywny wpływ na wyniki. Pominięcie dodawania próbek kontrolnych lub próbek na odwiertach może zachęcać do fałszywie negatywnych interpretacji. Wysuszenie szkiełek w dowolnym momencie po dodaniu próbki lub kontroli może spowodować fałszywe reakcje fałszywie dodatnie i/lub niewłaściwe wzorce. Zbyt duża ilość bufora do płukania pozostawiona na szkiełku lub wysuszenie wgłębień szkiełka przed dozowaniem medium montażowego może spowodować powstawanie artefaktów. Dodanie niewystarczającej ilości podłoża montażowego lub wytworzenie pęcherzyków na powierzchni szkiełka przed umieszczeniem szkiełka nakrywkowego może spowodować reakcje, które wyglądają na rozmyte lub nieostre, gdy są obserwowane pod mikroskopem. Zamontowane szkiełka muszą być przechowywane w temperaturze 2 - 8 °C i analizowane w zalecanym przedziale czasowym, aby zminimalizować wyniki fałszywie ujemne lub zniekształcone.
Korzystanie z dobrze utrzymanego mikroskopu epifluorescencyjnego, w którym znajduje się odpowiednie źródło światła LED/Hg/ksenonowe oraz czyste elementy optyczne, w tym filtry wzbudzenia i emisji, które nie są uszkodzone, ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych wyników IIF. Szkolenie użytkowników końcowych w zakresie rozróżniania intensywności reakcji pozytywnych/negatywnych i interpretacji wzorców ma kluczowe znaczenie. Testy HEp-2 IIF są podatne na brak standaryzacji procedur, konfiguracji mikroskopu oraz szkolenia lub umiejętności użytkowników końcowych. Uzgodniona nomenklatura oraz reprezentatywne wzorce i przykłady obrazów uzyskanych przy użyciu różnych producentów są udostępniane przez ICAP (<www. ANApatterns.org>) w celach edukacyjnych4. Drzewo klasyfikacji wzorców komórek HEp-2 dostarczone przez ICAP dla różnych wzorców jądrowych, cytoplazmatycznych i mitotycznych jest cennym źródłem do poznania subtelnych różnic między różnymi wzorcami, które mogą wyglądać podobnie dla niewprawnych oczu4. Jednym z głównych przykładów trudnego wzorca jest DFS70, który również nie ma wyraźnego związku ze stanem autoimmunologicznym, a jak omówiono w poprzednich sekcjach, wzorzec ten jest bardzo rozpowszechniony w zdrowych populacjach5.
W zależności od badania, częstość występowania autoprzeciwciał anty-DFS70 różni się między zdrowymi kohortami, populacjami przesiewowymi ANA i osobami z dodatnim wynikiem ANA bez dowodów na układową chorobę autoimmunologiczną 9,16,20,30,31. Doniesiono, że autoprzeciwciała DFS70 występują w izolacji, a także z innymi wzorcami ANA związanymi z chorobą. Izolowany lub monospecyficzny wzorzec DFS70 zgłasza się u 2 - 22% zdrowych osób z grupy kontrolnej, ale w mniej niż 1% przypadków z autoimmunologiczną chorobą reumatyczną32. Opierając się na tych trendach, monododatni wzór DFS70 został zaproponowany jako kryterium wykluczenia w autoimmunologicznych chorobach reumatycznych przez komitet ICAP 3,31,32. Komitet ICAP, ustanowiony w celu promowania harmonizacji nomenklatury testów na autoprzeciwciała i interpretacji wyników HEp-2 IIF, zaleca zgłaszanie dodatniego wyniku DFS70 podczas raportowania wyników badań przesiewowych ANA4.
Przed wykluczeniem ogólnoustrojowej choroby autoimmunologicznej opartej na monopozytywności DFS70, konieczne jest dokonanie przeglądu stanu obecnych metod badań przesiewowych i potwierdzenia (szczególnie tych specyficznych dla DFS70). Zgodność między dodatnim wynikiem DFS70 przez HEp-2 IIF a testami potwierdzającymi w fazie stałej, a mianowicie metodami ELISA, CLIA i testem immunologicznym linii/dot blot) różniła się znacznie między różnymi badaniami 13,22,25,33. Interpretacja IIF i parametry testu potwierdzającego, które przyczyniają się do tej rozbieżności, zostały omówione wcześniej 5,13,34. Niedawno zaproponowane podejście immunoadsorpcyjne do potwierdzania przeciwciał anty-DFS70 rozwiązuje niektóre braki w obecnych testach fazy stałej (dla DFS70), ale wymaga od laboratoriów wykonania dodatkowego kroku w procedurze IIF na podejrzanych próbkach, co zwiększa koszt i czas realizacji raportowania wyników13. Ten dodatkowy krok nie jest wymagany, gdy komórki HEp-2 ELITE/DFS70 KO są używane do rutynowych badań przesiewowych ANA. Zmniejsza to całkowity koszt, a ponadto nie ma wpływu na czas realizacji, ponieważ wzór DFS70 jest rozpoznawany w początkowym kroku27 przesiewania. Dodatkową wadą stosowania konwencjonalnej metody HEp-2 IIF jest to, że nie jest ona w stanie odróżnić wzorca DFS70 współwystępującego z innymi wzorcami ANA na etapie badań przesiewowych. Wadę tę można jednak przezwyciężyć dzięki zastosowaniu ogniw HEp-2 ELITE/DFS70 KO27.
Ocena porównawcza konwencjonalnego HEp-2 i nowego HEp-2 (HEp-2 ELITE/DFS70 KO) przy użyciu kontroli pozytywnej ANA i ich kombinacji z monododatnią kontrolą DFS70 wykazuje użyteczność zdolności nowego substratu do jednoczesnego badania przesiewowego ANA i potwierdzania wzorca DFS70 (Rysunek 1). Protokół IIF dla nowego podłoża jest identyczny z konwencjonalną metodą HEp-2 IIF. Schemat interpretacji dla wszystkich wzorców ANA związanych z chorobą jest identyczny, z wyjątkiem wzorca DFS70 (Tabela 1). Interpretacja zarówno mono-dodatnich, jak i mieszanych wzorców DFS70 była stosunkowo łatwiejsza przy użyciu nowej metody i nie wymaga dodatkowych testów (Figura 1B). Wdrożenie tej nowej metody w laboratorium klinicznym upraszcza wyzwanie związane z interpretacją wzorca DFS70 i poprawia ogólną dokładność badań przesiewowych ANA poprzez dalsze ujawnianie związanych z chorobą wzorców ANA, które wcześniej były ukryte przez DFS70 (wzorce mieszane).

ANA są znakiem rozpoznawczym autoimmunologicznych chorób tkanki łącznej o podłożu autoimmunologicznym1. Stosuje się kilka metod do badań przesiewowych i potwierdzania ANA. Technika IIF wykorzystująca podłoże HEp-2 pozostaje najczęściej stosowaną i najczęściej zalecaną metodą badania przesiewowego ANAs1,2. Pomimo postępów w metodologiach diagnostycznych w fazie stałej, takich jak test immunoenzymatyczny (ELISA), test immunoenzymatyczny (EIA), test immunologiczny chemiluminescencji (CLIA) i testy multipleksowe oparte na koralikach, IIF metodą HEp-2 jest najbardziej rozpowszechnioną metodą przesiewową ze względu na jej przydatność diagnostyczną i opłacalność1,2,3. Wyżej wymienione technologie oznaczania opierają się na ograniczonym zestawie oczyszczonych natywnych lub rekombinowanych autoantygenów, podczas gdy preparaty monowarstwowe komórek HEp-2 na szklanych zagłębieniach szkiełkowych prezentują szeroki wachlarz autoantygenów w ich naturalnej postaci, rozmieszczonych w jądrze i cytoplazmie, które reagują z autoprzeciwciałami z surowic pacjenta lub kontroli pozytywnych, co skutkuje wieloma wzorcami związanymi z różnymi chorobami autoimmunologicznymi. Wzorce te są klasyfikowane jako wzorce jądrowe, cytoplazmatyczne i mitotyczne w oparciu o lokalizację antygenu w komórkach. Każdy wzorzec i związane z nim antygeny/antygeny i stany chorobowe są dobrze scharakteryzowane4. W metodzie IIF surowice pacjenta i kontrolne są inkubowane na szklanych szkiełkach, które prezentują jednowarstwową hodowlę komórek HEp-2 odpowiednio utrwalonych, aby zachować wiele autoantygenów w ich naturalnej konfiguracji. Autoprzeciwciała w surowicy pacjenta lub kontrolach pozytywnych mogą wiązać się z autoantygenami prezentowanymi przez komórki HEp-2 na podłożu (studzienka szkiełka) podczas inkubacji. Po inkubacji niezwiązane przeciwciała są zmywane, a związane przeciwciała klasy IgG są wykrywane za pomocą sprzężonego odczynnika anty-ludzkiej IgG z izotiocyjanianem fluoresceiny/izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC). Niezwiązany koniugat raportowy jest wypłukiwany, a szkiełka nakrywkowe są montowane na szkiełkach za pomocą podłoża mocującego, które zachowuje reakcje i ułatwia obserwację pod mikroskopem fluorescencyjnym. Reakcje obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w odpowiednią kombinację filtrów wzbudzienia-emisji, która jest skonfigurowana zgodnie z zastosowanym reporterem (w przypadku reportera FITC mikroskop diagnostyczny zwykle wykorzystuje filtry o zakresie wzbudzenia 467 - 498 nm i zakresie emisji 513 - 556 nm). O obecności ANA świadczy jasnozielona fluorescencja określonych struktur w komórkach. W przeciwieństwie do zautomatyzowanych platform testowych, metodologia IIF opiera się na pracochłonnym procesie seryjnego rozcieńczania surowicy i wizualnie pozytywnym określaniu wzorów barwienia, co wymaga znacznej wiedzy użytkownika5,6. Pomimo tych ograniczeń, IIF by HEp-2 pozostaje najpowszechniej stosowaną i zalecaną metodą badania przesiewowego ANA ze względu na wysiłki standaryzacyjne w kierunku interpretacji i nomenklatury wzorców przez komitet Międzynarodowego Konsensusu w sprawie wzorców ANA (ICAP), zwiększoną dostępność rozwiązań automatyzacji do przetwarzania slajdów IIF oraz interpretację wyników3.
Wśród wielu wzorców wykrytych metodą HEp-2 IIF, autoprzeciwciała skierowane przeciwko produktowi genu psip1 (określane również jako LEDGF/p75/DFS70), zyskały w ostatnich latach znaczne zainteresowanie z kilku powodów4,5,6,7,8,9,10. Autoprzeciwciała DFS70 są obecne w wysokich mianach u zdrowych osób z grupy kontrolnej, a dotychczasowe badania nie wykazały wyraźnego klinicznego związku między obecnością autoprzeciwciał DFS707,8,9,10,11,12,13. Wskaźniki zgłoszonych pozytywnych wyników dla autoprzeciwciał DFS70 w różnych stanach chorobowych i zdrowych kohortach różniły się znacznie między badaniami6,8,9,10,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Monospecyficzny wzór DFS70 dobrze różni się od wzoru jednorodnego lub nakrapianego, ale interpretacja mieszanych jednorodnych wzorów nakrapianych i przeciwciał anty-DFS70 współwystępujących z innymi ANA jest wyzwaniem nawet dla doświadczonych czytelników. Obecna generacja metod przesiewowych IIF i testów fazy stałej specyficznych dla DFS70 nie jest w stanie odróżnić monospecyficznej reakcji DFS70 od mieszanych wzorców (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A, żółty zacieniony obszar algorytmu). Błędna interpretacja wzorca DFS70 jako wzoru jednorodnego, nakrapianego lub mieszanego lub odwrotnie, może mieć poważne konsekwencje dla opieki nad pacjentem. Obecnie powszechnie stosowany protokół jest następujący: laboratoria kliniczne stosują szereg testów potwierdzających fazę stałą dla ANA związanych z chorobą i/lub metodę immunoadsorpcji dla DFS70 / LEDGF, gdy podejrzewa się gęsty wzór drobno nakrapiany (AC-2) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)4,5.
Celem tego protokołu jest zademonstrowanie użyteczności nowatorskiego technologicznie zmodyfikowanego substratu HEp-2 IIF (HEp-2 ELITE/DFS70 knockout (KO), będzie określany jako HEp-2 ELITE), który zachowuje wszystkie zalety konwencjonalnego HEp-2 do badania przesiewowego ANA, jednocześnie wyróżniając wzór DFS70 z dużą pewnością zarówno w monospecyficznych, jak i mieszanych przypadkach ANA dodatnich (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B, Żółty zacieniony obszar algorytmu)<klasa SUP="xref">5. Substrat HEp-2 ELITE składa się w przybliżeniu z mieszaniny niemodyfikowanych konwencjonalnych komórek HEp-2 i komórek inżynieryjnych pozbawionych antygenu LEDGF/p75/DFS70 w stosunku 1:95. Procedura IIF dla HEp-2 ELITE jest identyczna z konwencjonalną metodą HEp-2. Unikalna konfiguracja podłoża HEp-2 ELITE nie tylko zachowuje wszystkie zalety konwencjonalnego HEp2, ale może różnicować jednorodne, nakrapiane i mieszane wzorce reakcji od wzorca DFS70 podczas wstępnego badania przesiewowego lub testowania próbki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)5. Surowice pacjenta, które mają być poddane reakcji na szkiełkach z substratem HEp-2 IIF, należy rozcieńczyć w stosunku 1:40 z rozcieńczeniem przesiewowym lub zgodnie z indywidualnym kryterium laboratoryjnym. Specyficzna reakcja przy mianie 1:40 lub wyższym jest uważana za pozytywną.
W tym badaniu, dodatnie surowice dla jednorodnych, nakrapianych, centromerów, jąder, cytoplazmatycznych siateczkowych/AMA i DFS70, które wytwarzały średnio pozytywny sygnał (w stosunku do kontroli negatywnej i pozytywnej kontroli ANA dostarczonej przez zestaw) przy rozcieńczeniu przesiewowym 1:40, zostały wybrane do symulacji monospecyficznych i mieszanych wzorów na podłożach HEp-2 (konwencjonalnych i HEp-2 ELITE). Rozcieńczone w stosunku 1:40 surowice DFS70 dodatnio zmieszano z rozcieńczeniami 1:40 poszczególnych kontrolnych wzorców ANA związanych z chorobą (jednorodne, nakrapiane, centromerowe, jąderkowe lub cytoplazmatyczne siatkowe AMA) w różnych proporcjach (kontrola: DFS70 w 100:0, 80:20, 50:50, 20:80 i 0:100) i oceniane na substratach konwencjonalnych i HEp-2 ELITE zgodnie ze standardową procedurą IIF opisaną poniżej.

<table><tbody><tr><td>HEp-2 ELITE / DFS70-KO 12 Zjeżdżalnia studzienna zgrzewana pojedynczo w woreczku</td><td>Trinity Biotech</td><td>część zestawu# 1108, 1108-120, 1108-240</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola pozytywna ANA</td><td>Trinity Biotech&nbsp;</td><td>część zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało DFS70 kontrola dodatnia</td><td>Trinity Biotech</td><td>część zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola ujemna</td><td>Trinity Biotech</td><td>część zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzki koniugat IgG FITC zawierający niebieski barwnik przeciwstawny Evana</td><td>Trinity Biotech</td><td>część zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik buforowy do surowicy</td><td>Trinity Biotech</td><td>część zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Trinity Biotech</td><td>część zestawu# 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe</td><td>Trinity Biotech</td><td>część zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe&nbsp;</td><td>Trinity Biotech</td><td>część zestawu # 1108, 1108-120, 1108-240, 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>ImmuGlo ANA HEp-2 Cells 12 well slide sealed indywidualnie w woreczku</td><td>Trinity Biotech</td><td>część zestawu # 1103, 1103-240</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiały użyte w badaniu, ale niedostarczone w zestawach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diagnostyczny mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Wyposażony w punktową kamerę cyfrową, model 2.2.1</td>Komora inkubacyjna Trinity Biotech przewidziana dla klientów (brak katalogu #)Słoik z kopiny nie dotyczy Ogólne wyroby laboratoryjne Ręczniki <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>papierowe <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>n/a</td><td></td><td>Ogólne materiały laboratoryjne</td></tr><tr><td>Woda destylowana/dejonizowana</td><td>nie dotyczy</td><td></td><td>Ogólne materiały laboratoryjne</td></tr></tbody></table>

jednoczesne rozróżnianie monospecyficznych i mieszanych wzorców dfs70 podczas badań przesiewowych ana za pomocą nowatorskiego podłoża do nokautowania hep-2 elite/dfs70

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Systemiczne autoimmunologiczne zaburzenia tkanki łącznej charakteryzują się krążącymi przeciwciałami przeciwjądrowymi (ANA). Chociaż dostępnych jest kilka technologii badań przesiewowych ANA, immunofluorescencja pośrednia (IIF) przy użyciu substratu ludzkich komórek nabłonkowych-2 (HEp-2) pozostaje podstawową i zalecaną metodą ze względu na jej wyższą czułość. Substraty HEp-2 mogą wykrywać wiele wzorców wynikających z wiązania autoprzeciwciał z różnymi autoantygenami białek i kwasów nukleinowych rozmieszczonych w jądrze i cytoplazmie komórek. Duża różnorodność wzorców monospecyficznych i mieszanych wynikających z pozytywnych reakcji na podłożu HEp-2 również komplikuje interpretację i dokładność raportowania. Jednym z konkretnych przykładów, któremu ostatnio poświęcono najwięcej uwagi, jest gęsty, drobno nakrapiany wzór 70 (DFS70) wynikający z autoprzeciwciał, które specyficznie wiążą się z białkiem zwanym czynnikiem wzrostu pochodzącym z nabłonka soczewki (LEDGF). Brak wyraźnego związku z konkretną ogólnoustrojową chorobą autoimmunologiczną i wysoka częstość występowania w zdrowych populacjach sprawiły, że ważna jest dokładna interpretacja wzorca DFS70. Dokładne odróżnienie wzoru DFS70 od wzorców związanych z chorobą przy użyciu konwencjonalnego substratu HEp-2 jest wyzwaniem. Co więcej, częste współwystępowanie wzorca DFS70 wraz z wzorcami związanymi z chorobą, takimi jak jednorodne, nakrapiane i mieszane jednorodne wzorce nakrapiane, komplikuje interpretację IIF. Celem tego artykułu jest wykazanie użyteczności nowatorskiego inżynieryjnego substratu HEp-2 IIF, który zachowuje wszystkie zalety konwencjonalnego podłoża HEp-2, zapewniając jednocześnie możliwość rozróżnienia wzoru DFS70 z dużą pewnością zarówno w monospecyficznych, jak i mieszanych pozytywnych przykładach ANA. Nowy substrat jest ponadto w stanie zdemaskować związane z chorobą wzorce ANA, które wcześniej były ukryte za wzorcem DFS70.

Podłoże HEp-2 ELITE/DFS70 KO zachowuje klasyczne wzory ANA i ułatwia wyraźne odróżnienie wzoru DFS70:
Komórki konwencjonalne i zmodyfikowane na podłożu HEp-2 ELITE/DFS70 KO są identyczne i zachowują wszystkie autoantygeny z wyjątkiem LEDGF/p75. Kontrola negatywna dostarczona w zestawie wyznacza bazowy sygnał fluorescencyjny. Kontrole pozytywne dla wzorców homogennego, ziarnistego, centromerowego, jaderkowego i mitochondrialnego na HEp-2 ELITE wykazują wzorzec identyczny z wzorcami oczekiwanymi na konwencjonalnym podłożu HEp-2 IIF (Rysunek 2A). Wzorce referencyjne te zostały wcześniej szczegółowo opisane wraz z przypisanym do każdego z nich antygenem oraz związkiem z chorobą4,29Krótki opis wzorców zaobserwowanych w Rycina 2A zostały przedstawione w Tabela 1.
Wzorzec DFS70 na HEp-2 ELITE:
Około 10% komórek w każdej studni wykazuje gęsty, drobnoziarnisty wzór (nomenklatura ICAP: AC-2), który można zaobserwować w jądrze w fazie interfazy, a barwienie związane z chromatyną jest widoczne w jądrach w fazie mitozy (Rysunek 2B). Na konwencjonalnym podłożu HEp-2 wszystkie komórki będą wykazywać ten wzór w reakcji z próbką dodatnią pod kątem DFS70. Pozostałe ~90% komórek HEp-2 ma znokautowany gen psip1 kodujący antygen LEDGF, w związku z czym nie będą one generować sygnału ani wzoru w reakcji z monospecyficznym surowicą dodatnią pod kątem DFS70 (Rysunek 2B). Jeśli 10% komórek HEp-2 wykazuje silniejszą fluorescencję odpowiadającą wzorowi DFS70, a reszta komórek prezentuje dodatkowe wzory (np. drobnoziarnisty lub jąderkowy), wskazuje to na obecność wzorów mieszanych. Dokładna analiza takich wzorów jest niezbędna do potwierdzenia wszystkich swoistości autoprzeciwciał obecnych obok wzoru DFS70. Aby zademonstrować możliwości podłoża HEp-2 ELITE, stworzono panel próbek surowic z różnymi stężeniami surowic kontrolnych dodatnich pod kątem DFS70 i ANA, które przetestowano zarówno na podłożach konwencjonalnych, jak i HEp-2 ELITE, stosując standardowy protokół IIF (Rysunek 3, Rysunek 4, Rysunek 5, Rysunek 6, Rysunek 7).
Interpretacja reakcji monospecyficznych i mieszanych DFS70 na konwencjonalnych podłożach oraz podłożach HEp-2 ELITE:
Dla każdego specyficznego obrazu ANA związanego z chorobą (Rycina 3, Rycina 4, Rycina 5, Rycina 6, Rycina 7), w najbardziej lewej kolumnie widoczny jest monospecyficzny obraz ANA, a w najbardziej prawej monospecyficzny obraz DFS70. Trzy środkowe kolumny reprezentują różne proporcje kontroli dodatnich dla obrazów związanych z chorobą oraz DFS70. Wynikowe obrazy mieszane są trudne do rozróżnienia na konwencjonalnym podłożu HEp-2 (Rycina 3, Rycina 4, Rycina 5, Rycina 6, Rycina 7, górny rząd). Jednak w przypadku nowego podłoża Hep-2 ELITE w większości próbek różnica w intensywności między komórkami niemodyfikowanymi a zmodyfikowanymi jest wyraźna, co nie tylko potwierdza obecność autoprzeciwciał DFS70 (gdy stosunek komórek jaśniejszych do mniej jasnych wynosi 1:9), ale także ujawnia wtórny obraz ANA. W przypadku mieszanych reakcji homogenny-DFS70 lub ziarnisty-DFS70 niemożliwe jest pewne przewidzenie prawidłowego obrazu, co prowadzi do konieczności wykonywania przez laboratoria szeregu dodatkowych testów (Rycina 1A). W przypadku mieszanych reakcji centromerowy-DFS70 i jasnocyrkulacyjny-DFS70 podejrzenie dodatniego wyniku DFS70 jest bardzo trudne (Rycina 5, Rycina 6). Przy reakcjach jąderkowych oraz siateczkowych cytoplazmatycznych/AMA obraz DFS70 nie dominuje, dopóki proporcja surowic nie osiągnie 50%. We wszystkich przykładach podłoże HEp-2 ELITE pozwala na prezentację obrazu DFS70 oraz podstawowego obrazu wtórnego w szerszym zakresie poziomów intensywności, co ułatwia bardziej precyzyjną interpretację ANA.
Aby dokładnie zaobserwować wzory mieszane, powiększono wyniki dla różnych kombinacji 50:50 kontroli dodatnich ANA i DFS70 (Rycina 8) zarówno dla konwencjonalnych, jak i podłoży HEp-2 ELITE. W celu poprawy interpretacji i dokładności raportowanego wzoru zaleca się obserwację barwienia zarówno w interfazie, jak i w mitozie dla wszystkich wzorów ANA, w tym DFS70, na podłożach HEp-2. Jednak w przypadku wzorów mieszanych różnicowy obraz prezentowany przez jądra komórek w podziale może nie być wystarczający do ułatwienia dokładnej interpretacji. Czerwone strzałki (Rycina 8) wskazują jądra mitotyczne zarówno w komórkach konwencjonalnych, jak i modyfikowanych. Można zauważyć, że mieszane reakcje DFS70 w komórkach w podziale nie są zgodne z ustalonym zestawem reguł interpretacji wzorów ANA związanych z chorobami. Żółte i niebieskie strzałki wskazują odpowiednio jądra niemodyfikowanych i modyfikowanych (DFS70 KO) komórek HEp-2. We wszystkich kombinacjach (Rycina 8) obserwuje się wyraźną różnicę w intensywności między barwieniem jądra komórki niemodyfikowanej (~10%) a wzorem jądra komórki modyfikowanej (~90%) w tym samym polu widzenia mikroskopu, co umożliwia jednoczesny screening i potwierdzenie wzoru DFS70.
<img alt="Schemat algorytmów przesiewowych ANA z wykorzystaniem metod HEp-2 i DFS70 IIF; ELISA, EIA, LIA do analizy wzorców." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Algorytmy przesiewowe ANA z wykorzystaniem konwencjonalnych metod HEp-2 oraz HEp-2 ELITE/DFS70 KO IIF. (A) Schemat przedstawia niedoskonałość konwencjonalnej metody HEp-2 IIF w identyfikacji monospecyficznych i mieszanych wzorców DFS70-dodatnich na etapie przesiewowym (obszar zaznaczony na żółto) oraz jej niezdolność do wykluczenia wtórnego wzorca ANA związanego z chorobą, który może być maskowany przez wzorzec DFS70. Ponadto obecna generacja specyficznych testów potwierdzających DFS70 w fazie stałej nie jest w stanie potwierdzić monospecyficznej dodatniości DFS70, co prowadzi do konieczności wykonania dodatkowych testów potwierdzających obecność przeciwciał ANA. (B) Schemat ukazuje możliwości metody HEp-2 ELITE w przesiewowym wykrywaniu przeciwciał ANA, jednoczesnym rozróżnianiu reakcji DFS70 monospecyficznych i mieszanych oraz eliminację potrzeby stosowania testów potwierdzających DFS70 w fazie stałej. Algorytm z wykorzystaniem HEp-2 ELITE znacząco upraszcza badanie przesiewowe ANA i redukuje wymaganą liczbę testów potwierdzających. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wzorce ANA w komórkach HEp-2; schemat przedstawia komórki DFS70 KO, analiza konwencjonalna vs zmodyfikowana." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Klasyczny wzorzec ANA i DFS70 na podłożu HEp-2 ELITE/DFS70 KO. (A) Podłoże HEp-2 ELITE/DFS70 KO zachowuje klasyczne wzorce ANA. Klasyczna reakcja homogenna oraz reakcje dodatnie dla DFS70 zostały uzyskane przy użyciu kontroli dodatnich dołączonych do zestawu. Pozostałe reakcje uzyskano przy użyciu wcześniej ustalonych surowic kontrolnych dodatnich dla reakcji plamistych, centromerowych, jąderkowatych oraz cytoplazmatycznych siateczkowatych/AMA5. (B) Podłoże HEp-2 ELITE/DFS70 KO dostarcza zarówno komórek konwencjonalnych, jak i zmodyfikowanych, co ułatwia łatwe rozróżnienie wzorca DFS70. Schemat przedstawia wynikową monospecyficzną reakcję DFS70 oraz wzorzec barwienia jąder komórek w interfazie i w trakcie podziału zarówno dla komórek konwencjonalnych, jak i zmodyfikowanych (DFS70-KO). Zmodyfikowane komórki HEp-2 są pozbawione antygenu LEDGF/p75/DFS70, co umożliwia jednoczesne wykrycie wzorców wtórnych, które są zazwyczaj maskowane przez reakcję autoprzeciwciał przeciwko DFS70 na konwencjonalnych podłożach HEp-2. Strzałki (żółte) wskazują przykłady jąder komórek w fazie mitozy. Paski skali reprezentują 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; barwienie przeciwciałami DFS70; komórki HEP-2; wyniki zmian stężeń." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Kombinacja DFS70 i surowic homogennych. Monospecyficzne surowice DFS70 połączono z dodatnią kontrolą o wzorcu homogennym w różnych proporcjach (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 i 0:100) i przetestowano na konwencjonalnych oraz zmodyfikowanych (DFS70-KO) substratach HEp-2. Paski skali reprezentują 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki testu pośredniej immunofluorescencji; wzory plamiste; komórki HEP-2; rozmieszczenie białka DFS70." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Kombinacja DFS70 i surowic z wzorem plamistym. Monoswoiste surowice DFS70 połączono z dodatnią kontrolą wzoru plamistego w różnych proporcjach (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 i 0:100) i przetestowano na konwencjonalnych oraz modyfikowanych genetycznie (DFS70-KO) podłożach HEp-2. Paski skali reprezentują 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej stosunków centromera:DFS70 w komórkach HEP-2, przedstawiający wzory jądrowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Połączenie sera DFS70 i centromerowego. Monospecyficzne sera DFS 70 łączono z pozytywną kontrolą wzoru centromerowego w różnych stosunkach (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 oraz 0:100) i testowano na konwencjonalnych oraz zmodyfikowanych genetycznie (DFS70-KO) podłożach HEp-2. Paski skali reprezentują 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek HEP-2; rozkład białek jąderka; analiza porównawcza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Połączenie przeciwciał DFS70 i surowic jądrowych. Monospecyficzne surowice DFS 70 połączono z pozytywną kontrolą wzoru jądrowego w różnych proporcjach (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 oraz 0:100) i przetestowano na konwencjonalnych oraz zmodyfikowanych genetycznie (DFS70-KO) podłożach HEp-2. Paski skali reprezentują 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek HEP-2, cytoplazmatyczne wzorce siateczkowe, analiza białka DFS70." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Połączenie DFS70 z surowicami o wzorcu cytoplazmatycznym siateczkowym/AMA. Monoswoiste surowice DFS70 połączono z dodatnią kontrolą wzorca mitochondrialnego w różnych stosunkach (100:0, 80:20, 50:50, 20:80 i 0:100) i przetestowano na konwencjonalnych oraz zmodyfikowanych (DFS70-KO) podłożach HEp-2. Paski skali reprezentują 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, porównanie barwienia komórek, HEp-2 z przeciwciałami DFS70, analiza wzorców." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56722/56722fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Wzorce mieszane (stosunek 50:50) uzyskane na konwencjonalnych podłożach oraz podłożach HEp-2 ELITE. Przedstawiono różnice między oboma podłożami. Czerwone strzałki wskazują jądra mitotyczne w komórkach konwencjonalnych i zmodyfikowanych na obu podłożach. W przypadku tych kombinacji zróżnicowany wzorzec prezentowany przez jądra komórek dzielących się na konwencjonalnym podłożu HEp-2 jest niewystarczający do dokładnej interpretacji wzorców mieszanych. Można zauważyć, że mieszane reakcje DFS70 w komórkach dzielących się mogą zaburzać ustalony zestaw reguł interpretacji wzorców ANA związanych z chorobą. Żółte i niebieskie strzałki wskazują odpowiednio jądra niezmodyfikowanych i zmodyfikowanych (DFS70 KO) komórek HEp-2. Wyniki uzyskane dla wszystkich kombinacji testowanych na podłożu zmodyfikowanym: zaobserwowano wyraźną różnicę w intensywności między wzorcem jądrowym w interfazie należącym do komórek niezmodyfikowanych (~10%) a komórek zmodyfikowanych (~90%), co umożliwiło jednoczesną detekcję i potwierdzenie wzorca DFS70. Paski skali reprezentują 20 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56722/56722fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>obraz ANA</td>
			<td colspan="2">Opis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogeniczny</td>
			<td colspan="2">Całe jądro wykazuje równomierną fluorescencję z rozproszonym wzorem barwienia.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nakrapiany</td>
			<td colspan="2">W obrębie jądra występują dyskretne, od grubych do drobnych plamki fluorescencji. Opisano wzorce drobno- i gruboplamkowate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jąderkowy</td>
			<td colspan="2">Jądra jąderkowe barwią się jako liczne ciała lite lub nakrapiane w obrębie jądra komórkowego. Podtypy zostały opisane we wcześniejszych publikacjach.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centromera</td>
			<td colspan="2">Duże plamki o skończonej liczbie. Reaktywny antygen segreguje się wraz z kondensującymi się chromosomami w komórkach przechodzących mitozę.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Siatkowata cytoplazmatyczna/AMA</td>
			<td colspan="2">Cytoplazma ma wygląd ziarnisty z pozytywnym barwieniem mitochondriów.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DFS70</td>
			<td colspan="2">•Konwencjonalne komórki HEp-2: w jądrach w fazie interfazy obserwuje się gęsty, drobnoziarnisty obraz plamisty, natomiast w jądrach w fazie mitozy widoczne jest barwienie chromatyny.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">•Zmodyfikowane komórki DFS70 KO: Przeciwciała anty-DFS70 dają negatywne barwienie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Linia HEp-2 Elite/ DFS70 KO zawiera komórki konwencjonalne oraz zmodyfikowane (DFS70 KO) w stosunku około 1:9. Komórki konwencjonalne wykazują typowy obraz DFS70, natomiast komórki zmodyfikowane dają obraz negatywny w przypadku reakcji z przeciwciałami monospecyficznymi DFS70/izolowanymi reakcjami dodatnimi.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Opis wzorów ANA.

Automatyczne przeciwciała DFS70 naśladują powszechne wzorce przeciwciał przeciwjądrowych związanych z chorobami, co utrudnia dokładną interpretację przy użyciu konwencjonalnych substratów HEp-2. Protokół opisuje zalety nowatorskiego zmodyfikowanego substratu HEp-2 w porównaniu z konwencjonalnym HEp-2 w badaniach przesiewowych ANA i rozróżnianiu wzorców DFS70 z dużą pewnością zarówno w monospecyficznych, jak i mieszanych przypadkach dodatnich ANA.

Jednoczesne rozróżnianie monospecyficznych i mieszanych wzorców DFS70 podczas badań przesiewowych ANA za pomocą nowatorskiego podłoża do nokautowania HEp-2 ELITE/DFS70

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie ulepszonego, pośredniego testu immunofluorescencyjnego, który wykorzystuje nowy HEp-2, gęsty, drobno nakrapiany substrat nokautujący 70 do badania przesiewowego autoprzeciwciał przeciwjądrowych i jednocześnie potwierdzania monospecyficznych i mieszanych gęstych drobno nakrapianych wzorów 70. Nowatorski substrat HEp-2 wykorzystuje standardową, pośrednią procedurę immunofluorescencji i kryteria interpretacji do badań przesiewowych klinicznie istotnych przeciwciał przeciwjądrowych, które są również znane jako ANA. Główną zaletą jest możliwość odróżnienia gęstego, drobno nakrapianego wzoru 70 od związanych z chorobą, jednorodnych nakrapianych lub trudnych mieszanych wzorów na etapie badań przesiewowych.Procedurę zademonstruje Sofia Badanin, technik z naszego laboratorium kontroli jakości. W przypadku szkiełek substratowych należy użyć szkiełek ze 12 dołkami na każdym szkiełku, zawierających konwencjonalne komórki HEp-2 lub mieszaninę konwencjonalnych i gęstych, drobno nakrapianych 70 komórek HEp-2 z nokautem. Przed dodaniem próbki należy pozwolić, aby woreczki zawierające szkiełka podstawowe osiągnęły temperaturę pokojową w celu uzyskania optymalnej wydajności i zapobieżenia kondensacji wilgoci na powierzchni szkiełka.Powinno to zająć od 10 do 15 minut. Po wyrównaniu do temperatury pokojowej ostrożnie zdejmij szkiełka podłoża palcami, unikając kontaktu szkiełek z bokami torebki. Oznacz szkiełka i umieść je w komorze inkubacyjnej, która została wyłożona zwilżonymi ręcznikami papierowymi, aby zapobiec wysuszeniu szkiełek podczas inkubacji próbki i koniugatu.Dozować około 50 mikrolitrów kontroli ujemnej i dodatniej, a także rozcieńczoną surowicę pacjenta do poszczególnych studzienek szkiełkowych przed umieszczeniem szkiełek w komorze inkubacyjnej. Test ANA jest pierwszym krokiem w badaniach przesiewowych w kierunku choroby autoimmunologicznej. Bardzo ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbek pacjenta na szkiełku, aby zminimalizować wyniki fałszywie dodatnie lub fałszywie ujemne.Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu studni, należy unikać przepełniania studni. Umieścić pokrywkę w komorze inkubacyjnej i inkubować szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli w surowicy pacjenta znajduje się ANA , zwiąże się ona z komórkami obecnymi w każdym testamencie w tym czasie.Po zakończeniu okresu inkubacji wyjąć szkiełko z komory inkubacyjnej. Trzymać szkiełko na końcu wypustki i delikatnie płukać przez 10 do 15 sekund około 10 mililitrami odtworzonego buforu do płukania soli fizjologicznej zbuforowanego fosforanami. Natychmiast przenieś szkiełko do słoika Coplin z buforem do płukania PBS i moczyć przez 10 minut.Powtórz ten proces ze wszystkimi pozostałymi slajdami. Wyjmuj tylko jedno szkiełko na raz ze słoika Coplin. Aby usunąć nadmiar buforu do płukania PBS ze szkiełka, delikatnie postukaj lub osusz szkiełko w ręcznik papierowy.Na każdą studzienkę delikatnie nałóż jedną kroplę izotiocyjanianu fluoresceiny, znakowanego anty-ludzkim koniugatem fluorescencyjnym IgG. Następnie inkubować szkiełka w zamkniętej komorze inkubacyjnej do barwienia przez 30 minut. Po zakończeniu okresu inkubacji wyjąć szkiełko z komory inkubacyjnej.Przytrzymaj szkiełko na końcu zakładki i delikatnie spłucz jak poprzednio, około 10 mililitrami buforu do płukania PBS. Natychmiast przenieś szkiełko do słoika Coplin z buforem do płukania PBS i moczyć przez 10 minut. Umieść szkiełka nakrywkowe znajdujące się w zestawie na suchym ręczniku papierowym.Na dolną krawędź szkiełka nakrywkowego nanieść od 3 do 4 kropli nośnika montażowego w linii. Następnie wyjmuj po jednym szkiełku ze słoika Coplin zawierającego bufor do mycia. Aby usunąć nadmiar buforu do mycia, delikatnie postukaj lub osusz szkiełko w ręczniku papierowym.Należy unikać pozostawiania nadmiaru buforu myjącego na szkiełku, wywierania zbyt dużego nacisku na szkiełko nakrywkowe lub wprowadzania pęcherzyków powietrza. Wszystko to może mieć wpływ na morfologię komórki, wynikające z niej wzory fluorescencyjne i intensywność reakcji. Delikatnie opuścić szkiełko na szkiełko nakrywkowe, przykładając dolną krawędź szkiełka do krawędzi szkiełka nakrywkowego.Pozwala to na przepływ mediów montażowych znajdujących się na szkiełku nakrywkowym do górnej krawędzi szkiełka i minimalizuje tworzenie się pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócać odczyt każdej studzienki. Obejrzyj preparaty za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, używając zestawu filtrów izotiocyjanianu fluoresceiny umieszczonego w ciemni. Zbadaj próbkę pod kątem specyficznej jasnozielonej fluorescencji pod mikroskopem przy powiększeniu 200-krotnym lub większym, aby dokonać ostatecznej interpretacji dotyczącej pozytywności i wzoru.Obserwuj kontrole pozytywne i negatywne. Kontrola pozytywna będzie wykazywać jasnozieloną fluorescencję w jądrze. Kontrola ujemna nie będzie wykazywać specyficznej zielonej fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym.Zapisz pozytywny lub negatywny wynik dla każdej studzienki i dołącz wzór ANA dla pozytywnych przypadków. Gęsty, drobno nakrapiany substrat nokautowy HEp-2 zachowuje wszystkie główne wzorce jądrowe i cytoplazmatyczne. Gęsty, drobno nakrapiany wzór charakteryzuje się obecnością równomiernie rozłożonego nakrapianego barwienia w jądrze interfazowym i chromatyny w fazie mitotycznej.Obecność zarówno konwencjonalnych komórek HEp-2, które wyrażają gęsty, drobno nakrapiany antygen 70, jak i zmodyfikowanych komórek HEp-2 pozbawionych antygenu, ułatwia dokładne rozróżnienie gęstego, drobno nakrapianego wzoru 70, przy jednoczesnym zachowaniu wszystkich zalet konwencjonalnych substratów HEp-2. Surowice dodatnie dla głównych wzorców ANA związanych z chorobą zmieszano z gęstą, drobno nakrapianą surowicą dodatnią o wzorze 70 w równych proporcjach i przetestowano zarówno na konwencjonalnych substratach HEp-2, jak i HEp-2 gęstych, drobno nakrapianych 70 substratów nokautowych. Tutaj czerwone strzałki wskazują komórki w fazie mitotycznej.Żółte strzałki wskazują konwencjonalne jądra HEp-2, a niebieskie strzałki wskazują zmodyfikowane jądra HEp-2. Dla wszystkich przedstawionych kombinacji reakcji, gęsty, drobno nakrapiany substrat z nokautem 70 wykazuje wyraźną różnicę intensywności między niezmodyfikowanymi komórkami a zmodyfikowanymi komórkami w tym samym polu widzenia. Pomaga to w rozróżnieniu monospecyficznych i mieszanych, gęstych, drobno nakrapianych 70 reakcji.Autoprzeciwciała przeciwko antygenom jądrowym i cytoplazmatycznym są bardzo rozpowszechnione w układowych chorobach autoimmunologicznych. Doniesiono, że gęsty, drobnoziarnisty wzór wynikający z automatycznych przeciwciał przeciwko DFS70, znanemu również jako białko PSIP1, jest bardzo rozpowszechniony w zdrowych populacjach. Co więcej, te autoprzeciwciała DFS70 występują zarówno w izolacji, jak i z innymi ANA związanymi z chorobą.To sprawia, że bardzo ważne jest, aby laboratoria kliniczne dokładnie odróżniły ten wzorzec od innych wzorców związanych z chorobą. Na przykład w mieszanym jednorodnym nakrapianym wzorze, który jest związany z toczniem, może być błędnie interpretowany jako wzór DFS70, wymagający wielu testów potwierdzających. Metoda immunofluorescencji pośredniej z wykorzystaniem substratów HEp-2 jest uważana za złoty standard metody przesiewowej dla ANA.Jednak dokładność w dużym stopniu zależy od umiejętności technika, starannego wykonania poszczególnych kroków i dokładnej interpretacji powstałych wzorów. I odwrotnie, ocena porównawcza konwencjonalnych podłoży z nokautem HEp-2 i DFS70 wykazuje przydatność tego nowego podłoża w rozróżnianiu wzoru DFS70 z dużą pewnością, podczas badań przesiewowych pod kątem ANA. Dalsza interpretacja zarówno monododatnich, jak i mieszanych wzorców DFS70 została stosunkowo uproszczona przy użyciu ulepszonego substratu HEp-2.Nowy substrat wykorzystuje standardowy, pośredni protokół immunofluorescencji i ustalone kryteria interpretacji dla wszystkich klinicznie istotnych wzorców ANA.

simultaneous-distinction-monospecific-mixed-dfs70-patterns-during-ana

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komary przenoszące malarię mają wiele ważnych epidemiologicznie cech, które można wykryć tylko za pomocą technik molekularnych. Wykorzystując platformę genotypowania SNP opartą na MALDI-TOF, opracowaliśmy test do jednoczesnego wykrywania wielu kluczowych cech (gatunek, odporność na insektycydy, zakażenie pasożytami i wybór żywiciela) wektorów malarii.

Test z wieloma wykrywaniami komarów przenoszących malarię

Celem tego filmu jest pokazanie, jak przeprowadzić automatyczną ekstrakcję DNA z referencyjnych linii komórkowych z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie (FFPE) oraz cyfrową analizę PCR kropelkowego (ddPCR) w celu wykrycia rzadkich mutacji w warunkach klinicznych. Wykrywanie mutacji w próbkach FFPE pokazuje kliniczną przydatność ddPCR w próbkach FFPE.

Wykorzystanie cyfrowej reakcji kropelkowej PCR do wykrywania mutacji BRAF V600E w standardowych referencyjnych liniach komórkowych zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Ten manuskrypt opisuje dupleksowy cyfrowy test PCR, który może być używany do jednoczesnego ilościowego oznaczania Enterococcus spp. i markerów genetycznych HF183 jako wskaźników ogólnego i związanego z człowiekiem zanieczyszczenia kałem w wodach rekreacyjnych.

Dupleksowy cyfrowy test PCR do jednoczesnej kwantyfikacji Enterococcus spp. i ludzkiego markera HF183 związanego z kałem w wodzie

Celem tego protokołu jest ocena specyficzności leków przeciwnowotworowych in vitro przy użyciu mieszanych kultur zawierających zarówno komórki nowotworowe, jak i nienowotworowe.

Ocena swoistości leków przeciwnowotworowych in vitro

Opisujemy wielozadaniową procedurę chromogenicznej hybrydyzacji in situ (MC-WISH) w nienaruszonych zarodkach Drosophila, pozwalającą na jednoczesne i specyficzne wykrywanie trzech różnych wzorców dystrybucji mRNA poprzez kontrastujące kolorowe osady.

Wielozadaniowa chromogenna hybrydyzacja in situ w całości do porównania domen ekspresji genów w zarodkach Drosophila

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Tutaj opisujemy wysokoprzepustową metodę kompleksowego nadzoru nad narkotykami, która pozwala na lepszą rozdzielczość i wykrywanie dużych paneli nadużywanych narkotyków i ich metabolitów, z kontrolą jakości opartą na wielosegmentowej elektroforezie kapilarnej i spektrometrii mas.

Wysokowydajny i kompleksowy nadzór nad lekami za pomocą wielosegmentowej elektroforezy kapilarnej i spektrometrii mas

Drosophila to szeroko stosowany model eksperymentalny, odpowiedni do badania przesiewowego leków o potencjalnym zastosowaniu w terapii raka. W tym miejscu opisujemy zastosowanie barwnych fenotypów oczu Drosophila jako metody badań przesiewowych związków małocząsteczkowych, które sprzyjają tworzeniu heterochromatyny.

Metoda przesiewowa do identyfikacji leków promujących heterochromatynę przy użyciu Drosophila

Protokół opisuje metodę hybrydyzacji in situ z uwzględnieniem polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP-FISH) w celu rozróżnienia transkryptów rybosomalnego RNA pochodzących z locus rybosomalnego DNA chromosomu X lub Y u Drosophila melanogaster.

Wykrywanie rybosomalnego RNA specyficznego dla polimorfizmu pojedynczego nukleotydu FISH u Drosophila melanogaster

Protokół ten przedstawia projekt podzielonych sond hybrydyzacyjnych wykorzystujących fluorescencyjny aptamer, świecący aptamer DAP-10-42 jako reporter sygnału oraz ich zastosowanie do wykrywania kwasów nukleinowych i różnicowania celów z podstawieniami pojedynczych nukleotydów.

Dzielona sonda hybrydyzacyjna wykorzystująca fluorescencyjny aptamer rozświetlający DNA jako reporter sygnału do analizy kwasów nukleinowych specyficznych dla sekwencji

Poznaj ulepszoną metodę immunofluorescencji pośredniej z podłożem HEp-2 DFS70 do badania przeciwciał antyjądrowych. Nowatorskie podejście umożliwia jednoczesne rozróżnianie wzorców monospecyficznych i mieszanych DFS70, zwiększając pewność diagnostyczną w autoimmunologii.

Jednoczesne rozróżnianie monospecyficznych i mieszanych wzorców DFS70 podczas badań przesiewowych ANA za pomocą nowatorskiego podłoża do nokautowania HEp-2 ELITE/DFS70 (Wideo) | JoVE Journal

Jednoczesne rozróżnianie monospecyficznych i mieszanych wzorców DFS70 podczas badań przesiewowych ANA za pomocą nowatorskiego podłoża do nokautowania HEp-2 ELITE/DFS70

Przeglądaj więcej filmów