Jednoczesne rozróżnianie monospecyficznych i mieszanych wzorców DFS70 podczas badań przesiewowych ANA za pomocą nowatorskiego podłoża do nokautowania HEp-2 ELITE/DFS70

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie ulepszonego, pośredniego testu immunofluorescencyjnego, który wykorzystuje nowy HEp-2, gęsty, drobno nakrapiany substrat nokautujący 70 do badania przesiewowego autoprzeciwciał przeciwjądrowych i jednocześnie potwierdzania monospecyficznych i mieszanych gęstych drobno nakrapianych wzorów 70. Nowatorski substrat HEp-2 wykorzystuje standardową, pośrednią procedurę immunofluorescencji i kryteria interpretacji do badań przesiewowych klinicznie istotnych przeciwciał przeciwjądrowych, które są również znane jako ANA. Główną zaletą jest możliwość odróżnienia gęstego, drobno nakrapianego wzoru 70 od związanych z chorobą, jednorodnych nakrapianych lub trudnych mieszanych wzorów na etapie badań przesiewowych.

Procedurę zademonstruje Sofia Badanin, technik z naszego laboratorium kontroli jakości. W przypadku szkiełek substratowych należy użyć szkiełek ze 12 dołkami na każdym szkiełku, zawierających konwencjonalne komórki HEp-2 lub mieszaninę konwencjonalnych i gęstych, drobno nakrapianych 70 komórek HEp-2 z nokautem. Przed dodaniem próbki należy pozwolić, aby woreczki zawierające szkiełka podstawowe osiągnęły temperaturę pokojową w celu uzyskania optymalnej wydajności i zapobieżenia kondensacji wilgoci na powierzchni szkiełka.

Powinno to zająć od 10 do 15 minut. Po wyrównaniu do temperatury pokojowej ostrożnie zdejmij szkiełka podłoża palcami, unikając kontaktu szkiełek z bokami torebki. Oznacz szkiełka i umieść je w komorze inkubacyjnej, która została wyłożona zwilżonymi ręcznikami papierowymi, aby zapobiec wysuszeniu szkiełek podczas inkubacji próbki i koniugatu.

Dozować około 50 mikrolitrów kontroli ujemnej i dodatniej, a także rozcieńczoną surowicę pacjenta do poszczególnych studzienek szkiełkowych przed umieszczeniem szkiełek w komorze inkubacyjnej. Test ANA jest pierwszym krokiem w badaniach przesiewowych w kierunku choroby autoimmunologicznej. Bardzo ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego próbek pacjenta na szkiełku, aby zminimalizować wyniki fałszywie dodatnie lub fałszywie ujemne.

Aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu studni, należy unikać przepełniania studni. Umieścić pokrywkę w komorze inkubacyjnej i inkubować szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Jeśli w surowicy pacjenta znajduje się ANA , zwiąże się ona z komórkami obecnymi w każdym testamencie w tym czasie.

Po zakończeniu okresu inkubacji wyjąć szkiełko z komory inkubacyjnej. Trzymać szkiełko na końcu wypustki i delikatnie płukać przez 10 do 15 sekund około 10 mililitrami odtworzonego buforu do płukania soli fizjologicznej zbuforowanego fosforanami. Natychmiast przenieś szkiełko do słoika Coplin z buforem do płukania PBS i moczyć przez 10 minut.

Powtórz ten proces ze wszystkimi pozostałymi slajdami. Wyjmuj tylko jedno szkiełko na raz ze słoika Coplin. Aby usunąć nadmiar buforu do płukania PBS ze szkiełka, delikatnie postukaj lub osusz szkiełko w ręcznik papierowy.

Na każdą studzienkę delikatnie nałóż jedną kroplę izotiocyjanianu fluoresceiny, znakowanego anty-ludzkim koniugatem fluorescencyjnym IgG. Następnie inkubować szkiełka w zamkniętej komorze inkubacyjnej do barwienia przez 30 minut. Po zakończeniu okresu inkubacji wyjąć szkiełko z komory inkubacyjnej.

Przytrzymaj szkiełko na końcu zakładki i delikatnie spłucz jak poprzednio, około 10 mililitrami buforu do płukania PBS. Natychmiast przenieś szkiełko do słoika Coplin z buforem do płukania PBS i moczyć przez 10 minut. Umieść szkiełka nakrywkowe znajdujące się w zestawie na suchym ręczniku papierowym.

Na dolną krawędź szkiełka nakrywkowego nanieść od 3 do 4 kropli nośnika montażowego w linii. Następnie wyjmuj po jednym szkiełku ze słoika Coplin zawierającego bufor do mycia. Aby usunąć nadmiar buforu do mycia, delikatnie postukaj lub osusz szkiełko w ręczniku papierowym.

Należy unikać pozostawiania nadmiaru buforu myjącego na szkiełku, wywierania zbyt dużego nacisku na szkiełko nakrywkowe lub wprowadzania pęcherzyków powietrza. Wszystko to może mieć wpływ na morfologię komórki, wynikające z niej wzory fluorescencyjne i intensywność reakcji. Delikatnie opuścić szkiełko na szkiełko nakrywkowe, przykładając dolną krawędź szkiełka do krawędzi szkiełka nakrywkowego.

Pozwala to na przepływ mediów montażowych znajdujących się na szkiełku nakrywkowym do górnej krawędzi szkiełka i minimalizuje tworzenie się pęcherzyków powietrza, które mogą zakłócać odczyt każdej studzienki. Obejrzyj preparaty za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, używając zestawu filtrów izotiocyjanianu fluoresceiny umieszczonego w ciemni. Zbadaj próbkę pod kątem specyficznej jasnozielonej fluorescencji pod mikroskopem przy powiększeniu 200-krotnym lub większym, aby dokonać ostatecznej interpretacji dotyczącej pozytywności i wzoru.

Obserwuj kontrole pozytywne i negatywne. Kontrola pozytywna będzie wykazywać jasnozieloną fluorescencję w jądrze. Kontrola ujemna nie będzie wykazywać specyficznej zielonej fluorescencji pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Zapisz pozytywny lub negatywny wynik dla każdej studzienki i dołącz wzór ANA dla pozytywnych przypadków. Gęsty, drobno nakrapiany substrat nokautowy HEp-2 zachowuje wszystkie główne wzorce jądrowe i cytoplazmatyczne. Gęsty, drobno nakrapiany wzór charakteryzuje się obecnością równomiernie rozłożonego nakrapianego barwienia w jądrze interfazowym i chromatyny w fazie mitotycznej.

Obecność zarówno konwencjonalnych komórek HEp-2, które wyrażają gęsty, drobno nakrapiany antygen 70, jak i zmodyfikowanych komórek HEp-2 pozbawionych antygenu, ułatwia dokładne rozróżnienie gęstego, drobno nakrapianego wzoru 70, przy jednoczesnym zachowaniu wszystkich zalet konwencjonalnych substratów HEp-2. Surowice dodatnie dla głównych wzorców ANA związanych z chorobą zmieszano z gęstą, drobno nakrapianą surowicą dodatnią o wzorze 70 w równych proporcjach i przetestowano zarówno na konwencjonalnych substratach HEp-2, jak i HEp-2 gęstych, drobno nakrapianych 70 substratów nokautowych. Tutaj czerwone strzałki wskazują komórki w fazie mitotycznej.

Żółte strzałki wskazują konwencjonalne jądra HEp-2, a niebieskie strzałki wskazują zmodyfikowane jądra HEp-2. Dla wszystkich przedstawionych kombinacji reakcji, gęsty, drobno nakrapiany substrat z nokautem 70 wykazuje wyraźną różnicę intensywności między niezmodyfikowanymi komórkami a zmodyfikowanymi komórkami w tym samym polu widzenia. Pomaga to w rozróżnieniu monospecyficznych i mieszanych, gęstych, drobno nakrapianych 70 reakcji.

Autoprzeciwciała przeciwko antygenom jądrowym i cytoplazmatycznym są bardzo rozpowszechnione w układowych chorobach autoimmunologicznych. Doniesiono, że gęsty, drobnoziarnisty wzór wynikający z automatycznych przeciwciał przeciwko DFS70, znanemu również jako białko PSIP1, jest bardzo rozpowszechniony w zdrowych populacjach. Co więcej, te autoprzeciwciała DFS70 występują zarówno w izolacji, jak i z innymi ANA związanymi z chorobą.

To sprawia, że bardzo ważne jest, aby laboratoria kliniczne dokładnie odróżniły ten wzorzec od innych wzorców związanych z chorobą. Na przykład w mieszanym jednorodnym nakrapianym wzorze, który jest związany z toczniem, może być błędnie interpretowany jako wzór DFS70, wymagający wielu testów potwierdzających. Metoda immunofluorescencji pośredniej z wykorzystaniem substratów HEp-2 jest uważana za złoty standard metody przesiewowej dla ANA.

Jednak dokładność w dużym stopniu zależy od umiejętności technika, starannego wykonania poszczególnych kroków i dokładnej interpretacji powstałych wzorów. I odwrotnie, ocena porównawcza konwencjonalnych podłoży z nokautem HEp-2 i DFS70 wykazuje przydatność tego nowego podłoża w rozróżnianiu wzoru DFS70 z dużą pewnością, podczas badań przesiewowych pod kątem ANA. Dalsza interpretacja zarówno monododatnich, jak i mieszanych wzorców DFS70 została stosunkowo uproszczona przy użyciu ulepszonego substratu HEp-2.

Nowy substrat wykorzystuje standardowy, pośredni protokół immunofluorescencji i ustalone kryteria interpretacji dla wszystkich klinicznie istotnych wzorców ANA.