Wykrywanie rybosomalnego RNA specyficznego dla polimorfizmu pojedynczego nukleotydu FISH u Drosophila melanogaster

Nasze badania koncentrują się na zrozumieniu, w jaki sposób komórki wyczuwają, monitorują i regulują wiele loci rybosomalnego DNA w swoim genomie. W szczególności naszym celem jest odkrycie mechanizmów, które odróżniają, które loci rDNA są aktywnie transkrybowane i w jaki sposób te loci są indywidualnie regulowane. Niedawno odkryliśmy, że ilość rDNA w komórce może zmieniać się w czasie i że ta zmiana zmienia to, które loci rDNA są transkrybowane.

Teraz rozumiemy, że komórki zmienią transkrypcję rDNA w zależności od ilości rDNA, które posiadają. To odkrycie skłania nas do pytania, w jaki sposób komórki wiedzą, ile mają RDA i w jaki sposób określają, które locus rDNA wolą wyrażać. Nasze laboratorium skupia się teraz na zrozumieniu mechanizmu wykorzystywanego przez komórki do rozróżniania różnych loci rDNA oraz wykrywania i regulowania ich aktywności.

Pod mikroskopem stereoskopowym przeprowadź sekcję Drosophila, aby wyizolować jądra w PBS wolnym od RNaz. Na początek chwyć środek brzucha jedną parą kleszczy, a koniec brzucha drugą parą, aby delikatnie rozsunąć zwierzę. Za pomocą kleszczy przenieś izolowane jądra z naczynia preparacyjnego do 1,5-mililitrowej probówki do mikrofuge zawierającej 0,5 mililitra PBS wolnego od RNaz.

Odessać PBS i dodać jeden mililitr roztworu utrwalającego. Umieścić próbkę na wytrząsarce nutującej w temperaturze pokojowej na 30 minut. Po inkubacji odessać roztwór utrwalający.

Następnie przemyj próbkę dwa razy jednym mililitrem PBS przez pięć minut na wytrząsarce nutującej. Po zassaniu PBS dodać jeden mililitr 70% etanolu wolnego od RNaz i inkubować próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc na wytrząsarce nutującej. Następnie odessać etanol i dodać jeden mililitr buforu do płukania do próbki.

Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce nutującej przez trzy minuty. Następnie pozwól rurce spoczywać pionowo przez dwie minuty. Wymieszaj sondy i maski z buforem hybrydyzacyjnym, aby przygotować całkowitą objętość 100 mikrolitrów na próbkę, jak pokazano tutaj.

Następnie dodać 100 mikrolitrów roztworu hybrydyzacyjnego do próbki po zaessaniu buforu do płukania. Nałóż przezroczystą folię, aby uszczelnić krawędzie tuby. Owiń probówkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem i inkubuj próbkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 24 godziny.

Nie zasysając roztworu hybrydyzacyjnego, dodać jeden mililitr buforu do przemywania do próbki. Inkubować próbkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w ciemności. Po zassaniu buforu do przemywania dodać jeden mililitr świeżego buforu do przemywania próbki i ponownie inkubować.

Pod koniec inkubacji odessać bufor do przemywania i dodać do próbki 50 mikrolitrów pożywki montażowej. Pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą pipety przenieś próbkę na szkiełko mikroskopowe. Za pomocą kleszczy ułóż jądra w linii na szkiełku mikroskopowym, aby ułatwić identyfikację próbki podczas obrazowania.

Przykryj próbkę szkiełkiem nakrywkowym i osusz krawędzie szkiełka nakrywkowego chusteczką higieniczną, aby usunąć nadmiar materiału montażowego. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci i pozostaw je w ciemności w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby lakier do paznokci wyschł. W jąderku wykryto sygnały rRNA, które pojawiły się jako regiony porów DAPI w jądrze, szczególnie w komórkach rozrodczych z dużymi jądrami i jąderkami.

Słabe, niespecyficzne sygnały zaobserwowano w cytoplazmie w próbkach pozbawionych loci rRNA. W większości komórek wykryto wyłącznie sygnały YrRNA, co wskazuje na transkrypcję rRNA z locus YrDNA. Jednoczesną ekspresję X i YrRNA zaobserwowano w komórkach rozrodczych, przy czym sygnały albo łączyły się w jedno jądro, albo rozdzielały się na dwa jąderka.