Badanie właściwości strukturalnych i dynamicznych transportujących nanostruktur subkomórkowych za pomocą spektroskopii fluktuacji czasoprzestrzennej

Metoda obrazowania prawego średniego kwadratu przemieszczenia jest w stanie jednocześnie wyodrębnić zarówno strukturę, jak i dynamiczne średnie właściwości docelowego obiektu biologicznego w żywej próbce. Obrazowanie przemieszczenia w prawo metodą średniokwadratową jest szybką i niezawodną procedurą, bez konieczności wyodrębniania trajektorii pojedynczych obiektów i bez konieczności skomplikowanego etykietowania. Wymaga tylko standardowej konfiguracji optycznej i fluorescencyjnie oznakowanego obiektu zainteresowania.

Metoda ta toruje drogę do wielkoskalowych, ilościowych badań przesiewowych zmian strukturalnych i dynamicznych występujących na poziomie subkomórkowych nanostruktur w kilku stanach patologicznych, takich jak rak, cukrzyca lub zaburzenia neurodegeneracyjne. Procedurę zademonstruje Fabio Azzarello, doktorant z mojego laboratorium. Aby rozpocząć subkulturację komórek, zacznij od dwukrotnego umycia 10-centymetrowego naczynia poddanego hodowli tkankowej zlewających się komórek hela 0,01 molowym PBS.

Następnie dodaj 1 mililitr 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć minut. Ponownie zawiesić oderwane komórki w 9 mililitrach kompletnej pożywki DMEM i zebrać 10 mililitrów całkowitej pożywki z trypsyną w probówce wirówkowej. Wysiewaj około 0,2 miliona komórek w każdej szalce o wymiarach 35 milimetrów na 10 milimetrów z końcową objętością pożywki 1 mililitra, a następnie inkubuj komórki.

W zależności od interesującej nas struktury subkomórkowej wymagana jest określona metoda znakowania, a gdy roztwór do znakowania jest gotowy, należy dwukrotnie przemyć komórki 0,01 molowym PBS. Po zastąpieniu PBS odczynnikiem barwiącym zawierającym pożywkę, inkubować naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zgodnie z zaleceniami producenta. Pod koniec inkubacji należy dwukrotnie przemyć komórki świeżą pożywką przed eksperymentem.

Przed wykonaniem akwizycji serii poklatkowej włącz układ sterowania inkubatorem mikroskopu i pozwól mikroskopowi osiągnąć równowagę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez około dwie godziny. Użyj 488-nanometrowego lasera argonowego do wzbudzenia EGFP w transfekowanych komórkach i makropinesomach znakowanych fluorescencją i zbierz emisję fluorescencji w zakresie od 500 do 600 nanometrów, używając standardowego detektora lampy powielającej zdjęcia. Użyj helowego lasera neonowego o długości fali 543 nanometrów, aby wzbudzić barwnik fluorescencyjny i zebrać emisję od 555 do 655 nanometrów.

Ustaw średnicę otworu detekcyjnego na rozmiar jednego Eri. Dla każdego akwizycji zbierz serię 1000 kolejnych klatek. Ustaw czas zatrzymania piksela na 2 mikrosekundy na piksel, aby czas tworzenia klatki wynosił 129 milisekund.

Aby poprawnie zainicjować parametry instrumentalne dla przejęć, otwórz iMSD. M z programowym edytorem tekstu. Ustaw parametry, wpisując wartości dla N'jako liczbę klatek w szeregu czasowym, rozmiar piksela w mikrometrach i f'jako rozdzielczość czasową w sekundach.

Ponadto ustaw wejście korekcji tła filtra na zero, aby przetworzyć surowe obrazy, lub jeden, aby wykonać odejmowanie tła na podstawie progu. Następnie ustaw próg opłaty AV w celu korekcji tła. Jeśli wartość filtra jest ustawiona jako jeden, piksele o intensywności mniejszej niż wartość progowa zostaną ustawione jako zero.

Następnie ustaw bit jako liczbę całkowitą określającą próbkowanie intensywności. Zapisz i uruchom edytowany plik iMSD. Plik skryptu M.

Sprawdź wykonanie skryptu w oknie polecenia, a jeśli wystąpią jakiekolwiek problemy, zostanie wyświetlony komunikat ostrzegawczy o przerwaniu. Po pomyślnym wykonaniu skryptu zaimportuj stos obrazów i odejmij tło, jeśli jest to wymagane. Następnie oblicz funkcję korelacji przestrzenno-czasowej za pomocą metody Fouriera.

Dopasuj funkcję korelacji czasoprzestrzennej do funkcji Gaussa 2D. Następnie sprawdź wynik graficzny z krzywą IMSD i odpowiadającymi jej krzywymi dopasowania, wyświetlanymi w trzech oddzielnych panelach dla różnych typów użytego równania dopasowania. Wartości R-kwadrat są podane w legendzie wykresu.

Następnie sprawdź dane wyjściowe tekstu. Akwizycję obrazu lizosomu jako organelli testowej przeprowadzono w żywych komórkach w odpowiedniej rozdzielczości czasowej i bardzo niskiej rozdzielczości czasowej. Sztuczna deformacja lizosomu spowodowana ruchem organelli była widoczna na obrazie o niskiej rozdzielczości.

Profil intensywności plamki został wyznaczony za pomocą narzędzia liniowego w oprogramowaniu do analizy obrazu. Następnie przeprowadzono oszacowanie średnicy plamki, wykreślając i interpolując intensywność za pomocą funkcji Gaussa. Akwizycja z dużą prędkością pozwoliła uzyskać porównywalną średnią wielkość struktury zbliżoną do ustalonej próbki.

Zamiast tego, akwizycja z małą prędkością zwiększyła rozmiar struktury, ze względu na naturalną dynamikę struktury podczas obrazowania. Strukturalne i dynamiczne właściwości makrososnomów zaobserwowano podczas transportu. Obserwacje wykazały spadek średniej wielkości makropinosomów.

Równoczesny wzrost ruchu subdyfuzyjnego był oznaczony zmniejszonymi wartościami alfa. Dla każdego pozyskania obserwowano wzrost liczby makropinesomów w czasie. W przeciwieństwie do tego, podobne pomiary przeprowadzone na ISG sugerowały bardzo różne zachowanie tych ostatnich organelli w porównaniu z makropinesomami.

W rzeczywistości granulki insuliny wykazują niezmienione, przeciętne właściwości strukturalne lub dynamiczne, co sugeruje, że były badane w stanie stacjonarnym. Metodę można łatwo zastosować w trybie dwukolorowym, jeśli dwie odrębne organelle subkomórkowe są inaczej oznaczone. W takim przypadku analiza korelacji krzyżowej uwypukli potencjalne dynamiczne interakcje dwóch obiektów w komórce.