Badanie właściwości strukturalnych i dynamicznych transportujących nanostruktur subkomórkowych za pomocą spektroskopii fluktuacji czasoprzestrzennej
August 16th, 2021
Analiza średniego kwadratu (iMSD) wyprowadzona z obrazowania jest stosowana do makropinosomów, aby podkreślić ich wewnętrzną, ewoluującą w czasie naturę pod względem właściwości strukturalnych i dynamicznych. Makropinosomy są następnie porównywane z granulkami wydzielniczymi insuliny (ISG) jako odniesienie dla struktur subkomórkowych o niezmiennych w czasie średnich właściwościach strukturalnych/dynamicznych.
Metoda obrazowania prawego średniego kwadratu przemieszczenia jest w stanie jednocześnie wyodrębnić zarówno strukturę, jak i dynamiczne średnie właściwości docelowego obiektu biologicznego w żywej próbce. Obrazowanie przemieszczenia w prawo metodą średniokwadratową jest szybką i niezawodną procedurą, bez konieczności wyodrębniania trajektorii pojedynczych obiektów i bez konieczności skomplikowanego etykietowania. Wymaga tylko standardowej konfiguracji optycznej i fluorescencyjnie oznakowanego obiektu zainteresowania.
Metoda ta toruje drogę do wielkoskalowych, ilościowych badań przesiewowych zmian strukturalnych i dynamicznych występujących na poziomie subkomórkowych nanostruktur w kilku stanach patologicznych, takich jak rak, cukrzyca lub zaburzenia neurodegeneracyjne. Procedurę zademonstruje Fabio Azzarello, doktorant z mojego laboratorium. Aby rozpocząć subkulturację komórek, zacznij od dwukrotnego umycia 10-centymetrowego naczynia poddanego hodowli tkankowej zlewających się komórek hela 0,01 molowym PBS.
Następnie dodaj 1 mililitr 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć minut. Ponownie zawiesić oderwane komórki w 9 mililitrach kompletnej pożywki DMEM i zebrać 10 mililitrów całkowitej pożywki z trypsyną w probówce wirówkowej. Wysiewaj około 0,2 miliona komórek w każdej szalce o wymiarach 35 milimetrów na 10 milimetrów z końcową objętością pożywki 1 mililitra, a następnie inkubuj komórki.
W zależności od interesującej nas struktury subkomórkowej wymagana jest określona metoda znakowania, a gdy roztwór do znakowania jest gotowy, należy dwukrotnie przemyć komórki 0,01 molowym PBS. Po zastąpieniu PBS odczynnikiem barwiącym zawierającym pożywkę, inkubować naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zgodnie z zaleceniami producenta. Pod koniec inkubacji należy dwukrotnie przemyć komórki świeżą pożywką przed eksperymentem.
Przed wykonaniem akwizycji serii poklatkowej włącz układ sterowania inkubatorem mikroskopu i pozwól mikroskopowi osiągnąć równowagę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez około dwie godziny. Użyj 488-nanometrowego lasera argonowego do wzbudzenia EGFP w transfekowanych komórkach i makropinesomach znakowanych fluorescencją i zbierz emisję fluorescencji w zakresie od 500 do 600 nanometrów, używając standardowego detektora lampy powielającej zdjęcia. Użyj helowego lasera neonowego o długości fali 543 nanometrów, aby wzbudzić barwnik fluorescencyjny i zebrać emisję od 555 do 655 nanometrów.
Ustaw średnicę otworu detekcyjnego na rozmiar jednego Eri. Dla każdego akwizycji zbierz serię 1000 kolejnych klatek. Ustaw czas zatrzymania piksela na 2 mikrosekundy na piksel, aby czas tworzenia klatki wynosił 129 milisekund.
Aby poprawnie zainicjować parametry instrumentalne dla przejęć, otwórz iMSD. M z programowym edytorem tekstu. Ustaw parametry, wpisując wartości dla N'jako liczbę klatek w szeregu czasowym, rozmiar piksela w mikrometrach i f'jako rozdzielczość czasową w sekundach.
Ponadto ustaw wejście korekcji tła filtra na zero, aby przetworzyć surowe obrazy, lub jeden, aby wykonać odejmowanie tła na podstawie progu. Następnie ustaw próg opłaty AV w celu korekcji tła. Jeśli wartość filtra jest ustawiona jako jeden, piksele o intensywności mniejszej niż wartość progowa zostaną ustawione jako zero.
Następnie ustaw bit jako liczbę całkowitą określającą próbkowanie intensywności. Zapisz i uruchom edytowany plik iMSD. Plik skryptu M.
Sprawdź wykonanie skryptu w oknie polecenia, a jeśli wystąpią jakiekolwiek problemy, zostanie wyświetlony komunikat ostrzegawczy o przerwaniu. Po pomyślnym wykonaniu skryptu zaimportuj stos obrazów i odejmij tło, jeśli jest to wymagane. Następnie oblicz funkcję korelacji przestrzenno-czasowej za pomocą metody Fouriera.
Dopasuj funkcję korelacji czasoprzestrzennej do funkcji Gaussa 2D. Następnie sprawdź wynik graficzny z krzywą IMSD i odpowiadającymi jej krzywymi dopasowania, wyświetlanymi w trzech oddzielnych panelach dla różnych typów użytego równania dopasowania. Wartości R-kwadrat są podane w legendzie wykresu.
Następnie sprawdź dane wyjściowe tekstu. Akwizycję obrazu lizosomu jako organelli testowej przeprowadzono w żywych komórkach w odpowiedniej rozdzielczości czasowej i bardzo niskiej rozdzielczości czasowej. Sztuczna deformacja lizosomu spowodowana ruchem organelli była widoczna na obrazie o niskiej rozdzielczości.
Profil intensywności plamki został wyznaczony za pomocą narzędzia liniowego w oprogramowaniu do analizy obrazu. Następnie przeprowadzono oszacowanie średnicy plamki, wykreślając i interpolując intensywność za pomocą funkcji Gaussa. Akwizycja z dużą prędkością pozwoliła uzyskać porównywalną średnią wielkość struktury zbliżoną do ustalonej próbki.
Zamiast tego, akwizycja z małą prędkością zwiększyła rozmiar struktury, ze względu na naturalną dynamikę struktury podczas obrazowania. Strukturalne i dynamiczne właściwości makrososnomów zaobserwowano podczas transportu. Obserwacje wykazały spadek średniej wielkości makropinosomów.
Równoczesny wzrost ruchu subdyfuzyjnego był oznaczony zmniejszonymi wartościami alfa. Dla każdego pozyskania obserwowano wzrost liczby makropinesomów w czasie. W przeciwieństwie do tego, podobne pomiary przeprowadzone na ISG sugerowały bardzo różne zachowanie tych ostatnich organelli w porównaniu z makropinesomami.
W rzeczywistości granulki insuliny wykazują niezmienione, przeciętne właściwości strukturalne lub dynamiczne, co sugeruje, że były badane w stanie stacjonarnym. Metodę można łatwo zastosować w trybie dwukolorowym, jeśli dwie odrębne organelle subkomórkowe są inaczej oznaczone. W takim przypadku analiza korelacji krzyżowej uwypukli potencjalne dynamiczne interakcje dwóch obiektów w komórce.
Przegląd
Niniejsze badanie wykorzystuje analizę średniego kwadratowego przemieszczenia pochodzącego z obrazowania (iMSD) do badania makropinosomu, podkreślając ich dynamiczne i strukturalne właściwości w czasie. Makropinosomy są porównywane z ziarnami wydzielania insuliny (ISG) w celu odróżnienia ich zależnych od czasu zachowań od zachowań bardziej stabilnych organelli.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Biologia komórki
- Mikroskopia
- Dynamika subkomórkowa
Tło
- Makropinosomy wykazują ewoluujące w czasie strukturalne i dynamiczne cechy.
- Ziarna wydzielania insuliny służą jako odniesienie dla obiektów o właściwościach niestale zależnych od czasu.
- Zrozumienie tych różnic jest kluczowe dla wnikliwych obserwacji różnych stanów patologicznych.
Stosowane metody
- Analiza średniego kwadratowego przemieszczenia pochodzącego z obrazowania
- Modele żywych komórek
- Standardowe konfiguracje optyczne z fluorescencyjnym znakcowaniem
Główne wyniki
- Badanie wykazuje zmniejszenie średniej wielkości makropinosomu, jak również zwiększony ruch subdyfuzyjny w czasie.
- W przeciwieństwie do tego, ISG utrzymują stabilne właściwości strukturalne i dynamiczne.
- Te wyniki podkreślają kontrastujące zachowania różnych organelli w podobnych warunkach.
Wnioski
- Niniejsze badanie wykazuje skuteczność metody iMSD w ocenie dynamicznych zmian w strukturach subkomórkowych.
- Oferuje cenne wnioski dotyczące procesów komórkowych istotnych dla chorób takich jak rak i cukrzyca.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Imaging-derived mean square displacement (iMSD) enables quantitative assessment of structural and dynamic properties of subcellular nanostructures, supporting target validation in disease-relevant systems. The method provides mechanistic de-risking by distinguishing time-varying organelles like macropinosomes from stable structures such as insulin secretory granules. This capability enhances predictive confidence in preclinical models of cancer, diabetes, and neurodegenerative disorders.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying size, diffusivity, and anomalous coefficient of trafficking nanostructures.
- Operational Value: Supports biological de-risking through label-free, trajectory-independent analysis compatible with standard optical setups.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream workflows via quantitative iMSD signatures.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through spatiotemporal fluctuation spectroscopy without single-object tracking.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Highlights disease relevance by detecting structural and dynamic alterations in subcellular nanostructures under pathological conditions.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal monitoring of organelle evolution.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing quantitative, multiplexable readouts of subcellular dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by extracting average structural and dynamic parameters from iMSD traces.
- Screening: Describes assay readiness and scalability through compatibility with any optical setup and fluorescent labeling.
- Analytics: Highlights measurements of size, local diffusivity, and anomalous coefficient that enable comparison across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking iMSD signatures to pathophysiological states in cancer and diabetes models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for large-scale screening of subcellular nano-structures across disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in subcellular trafficking studies.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across live-cell imaging platforms.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in drug discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative organelle dynamics.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in fluorescence microscopy and image analysis.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include standard optical setup and iMSD analysis software.
- Cross-team standardization requirements for consistent parameter setting and background correction.
- Adaptation considerations across model systems via appropriate fluorescent labeling of target nanostructures.
- Practical limitations include dependence on temporal resolution and potential artifactual deformation at low acquisition speeds.
