Name: Separacja bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów ze źródeł naturalnych i białek od drobnoustrojów metodą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego do izolacji bioaktywnych małych cząsteczek i peptydów z ekstraktów roślinnych. Ta technika umożliwia skuteczną separację związków o potencjale terapeutycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni za źródła finansowania z Wydziału Biologii i Centrum Badań nad Rakiem Johnsona dla nagród BRIEF i IRA, odpowiednio dla GV. Dziękujemy również za przyznanie RV nagrody podoktorskiej K-INBRE. Prace te były częściowo wspierane przez Institutional Development Award (IDeA) przyznaną przez National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health w ramach grantu nr P20 GM103418. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów Narodowego Instytutu Ogólnych Nauk Medycznych lub Narodowych Instytutów Zdrowia. Dziękujemy anonimowym recenzentom za pomocne komentarze.

1. Konfiguracja i wstępne uruchomienie standardowej jednostki IEF w fazie ciekłej
<ol>
	<li>Elektrody IEF w fazie ciekłej (przycisk anody w kolorze czerwonym i przycisk katody w kolorze czarnym) należy zmontować z odpowiednimi membranami wymiennymi zgodnie z instrukcją obsługi (patrz tabela materiałów). Zrównoważyć membrany anionowymienne z 0,1 M NaOH, a membrany kationitowe z 0,1 M H3PO4 co najmniej przez 16 godzin, gdy stosowane są nowe membrany.
	<ol>
		<li>Przechowuj membrany w elektrolitach (0,1 M NaOH lub 0,1 M H3PO4) między cyklami i nie pozwól im wyschnąć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj wewnętrzną i zewnętrzną część elektrody, ustawiając trzy podłużne otwory w uszczelkach jonowymiennych. Napełnij elektrody odpowiednimi elektrolitami (~25-30 ml), aby zapobiec wysychaniu ich membran.
	<ol>
		<li>Nie dodawaj nadmiaru (więcej niż 1/3 objętości komory elektrody) elektrolitu, który może wytworzyć ciśnienie wewnątrz elektrody i spowodować wyciek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakryj porty pobierania próbek taśmą uszczelniającą, która jest dostarczana z częściami montażowymi przyrządu (patrz Tabela materiałów). Po stronie portów do pobierania próbek można rozpoznać po dwóch pionowych metalowych kołkach wyrównujących. Alternatywnie użyj standardowej taśmy uszczelniającej, aby uszczelnić porty.</li>
	<li>Zamontuj kolejno wszystkie części zespołu komory ostrości (elektroda anodowa, rdzeń membrany nylonowej, komora ostrości i elektroda katodowa) nad ceramicznym palcem chłodzącym.</li>
	<li>Napełnij komorę ostrości wstępnie schłodzoną wodą destylowaną (całkowita objętość 60 ml dla standardowej celi IEF) za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Podłącz przyrząd IEF w fazie ciekłej do krążącej wody chłodzącej o temperaturze 4 ºC i uruchom urządzenie przy 15 W i 3,000 V przez 3-5 minut lub do momentu, gdy napięcie się ustabilizuje. 
	UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, w ciągu jednej minuty voltage osiągnie maksymalne ustawione wartości. Wstępne uruchamianie wodą destylowaną pomaga usunąć resztki jonów z komory ogniskowania i rdzenia membrany nylonowej.</li>
	<li>Wyłącz źródło zasilania i usuń wodę z ogniwa za pomocą kolektora frakcji. Ponownie uszczelnij otwory zbiorcze taśmą uszczelniającą. 
	UWAGA: Teraz przyrząd jest gotowy do użycia w kroku 2.4.</li>
</ol>
2. Separacja i oczyszczanie małych cząsteczek i peptydów z ekstraktu z Gymnema sylvestre 
<ol>
	<li>Odmierzyć 0,6 g ekstraktu roślinnego i rozpuścić w wodzie destylowanej (60 ml), mieszając w bułce przez 5 min. 
	UWAGA: Każda próbka biologiczna, która jest rozpuszczalna i wolna od soli, może być użyta do separacji i oczyszczania za pomocą tego przyrządu IEF. Próbki o stężeniu soli buforowej do 10 mM mogą być używane z nieznacznie zmniejszoną rozdzielczością. Interesuje nas rodzina saponin związków triterpenoidowych, kwasów gymnemowych, z rośliny G. sylvestre ze względu na ich unikalne właściwości przeciwgrzybicze16.</li>
	<li>Odwirować rozpuszczony ekstrakt roślinny o sile 10 000 x g przez 5 minut, aby usunąć nierozpuszczalne cząstki.</li>
	<li>Przenieść supernatant (~60 ml) do probówki wirówkowej o pojemności 80 ml i wymieszać go z 0,6 ml amholytu (pH 3-10) do 1% (v/v).</li>
	<li>Wykonaj kroki 1.1 – 1.7, aby przygotować jednostkę IEF w fazie ciekłej. Komora jest teraz gotowa do załadowania próbki.</li>
	<li>Użyj strzykawki o pojemności 50 ml z igłą o końcu 1-1/2 cala 19 G (w zestawie z instrumentem) i załaduj przygotowaną próbkę amfoliitem (łącznie 60 ml) do celi przez porty do pobierania próbek.</li>
	<li>Usuń pęcherzyki powietrza z sample cela, wyjmując celę skupiającą ze stojaka i stukając w komorę elektrody, aby usunąć pęcherzyki. Obecność pęcherzyków powietrza spowoduje wahania napięcia i prądu oraz wpłynie na przebieg.</li>
	<li>Podłączyć urządzenie do wodnego płynu chłodzącego (4 °C) i rozpocząć frakcjonowanie przy zasilaniu ze stałą mocą 15 W.</li>
	<li>Uruchom aparat na 3 godziny lub do momentu, gdy napięcie osiągnie stałą wartość. 
	UWAGA: Gdy próbka zacznie się ogniskować, napięcie zacznie stopniowo rosnąć, aż osiągnie stałą wartość.</li>
	<li>Po zakończeniu pracy przygotuj się do zebrania frakcji w skrzynce zbiorczej (zawierającej 20 plastikowych rurek o wymiarach 12 mm x 75 mm, objętości 5-6 ml) podłączonej do pompy próżniowej, naciskając przycisk zbioru ON w jednostce IEF.</li>
	<li>Dopasuj kołki zbierające 20 do portów 20 odbiorników komórki ostrości, która jest uszczelniona taśmą.</li>
	Przepchnij kołki zbierające przez taśmę uszczelniającą i jednocześnie włącz pompę próżniową (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2 B, 2C i 2D). <li>
	UWAGA: Za każdym razem do probówek będzie zbieranych około 3 ml frakcji z każdej komory. Frakcje mogą być wykorzystywane do późniejszych zastosowań (SDS-PAGE do oznaczania ilościowego peptydów, TLC i testu biologicznego dla małych cząsteczek).</li>
</ol>
3. Separacja i oczyszczanie białek z C. albicans
<ol>
	<li>Hoduj pojedynczą kolonię C. albicans w bulionie drożdżowo-peptonowo-dekstrozowym (YPD) class16 w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem (200 obr./min) przez noc.</li>
	<li>Zebrać komórki drożdży przez odwirowanie (10 000 x g przez 5 minut).</li>
	<li>Zawiesić komórki drożdży C. albicans w buforze węglanu amonu (1,89 g/l) zawierającym 1% (v/v) beta-merkaptoetanolu (β-ME) (1/10 objętości hodowli) i obracać w rurze rolkowej przez 1 godzinę w temperaturze 5 °C15.</li>
	<li>Usunąć komórki drożdży przez odwirowanie (10 000 x g przez 5 min) i przefiltrować ekstrakt białkowy przez filtr 0,45 μm. 
	UWAGA: Próbki białek z cytozolu, błony lub ściany komórkowej C. albicans można przygotować i wykorzystać do frakcjonowania IEF. Podobnie białka pochodzące z bakterii lub innych próbek biologicznych (ekstrakt z tkanek zwierzęcych) mogą być stosowane po usunięciu soli odpowiednimi metodami (np. przez dializę lub za pomocą kolumn odsalających).</li>
	<li>Dializować ekstrakt białkowy w rurze dializacyjnej (3 500 MWCO) w wodzie przez 15 godzin w temperaturze 4 °C. Oszacuj stężenie białka metodą wiązania barwnika Bradforda, używając gamma globuliny jako standardu17.</li>
	<li>Do frakcj><onowania należy użyć 500 mg białka ogółem w 60 ml wody zawierającej 1% (v/v) amfolitu (pH 5-8).
	UWAGA: Ponieważ amfoliit o szerokim zakresie (pH 3-10) nie wzbogaca dobrze niektórych białek ściany komórkowej >C. albicans przyłączonych do glukanu, należy użyć amfolitu o wąskim zakresie (pH 5-8). Można zastosować stężenie amfolitu do 2%, jeśli stężenie białka w próbce jest większe niż 2 mg/ml; Minimalizuje to agregację białek podczas ustawiania ostrości. Próbki, amfolity i wodę należy zawsze wstępnie schłodzić na lodzie.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.1-1.7, aby przygotować jednostkę IEF i użyj roztworu białkowego z kroku 3.6, aby załadować do komórki IEF.</li>
	<li>Po 4 godzinach ogniskowania przy stałym 15 W, zbierz frakcje białkowe (1-20) zgodnie z powyższym opisem (kroki 2.9-2.11) i przeanalizuj na 12,5% SDS-PAGE po redukcji i zagotowaniu próbek białka18.</li>
	<li>Uwolnione białka należy wybarwić, barwiąc żel SDS-PAGE roztworem niebieskiego barwnika Coomassie (0,01%) przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej na bujaku. Usunąć żel i zarejestrować obraz żelu za pomocą urządzenia do obrazowania żelu. 
	UWAGA: Niebieski barwnik Coomassie (0,01%) można przygotować przez zmieszanie 0,01 g niebieskiego proszku Coomassie w roztworze odbarwiającym zawierającym 40% metanolu i 10% kwasu octowego.</li>
</ol>
4. Bioaktywność oczyszczonych małych cząsteczek z ekstraktu roślinnego Gymnema sylvestre
<ol>
	<li>Hoduj C. albicans w komórkach drożdży, jak w kroku 3.1.</li>
	<li>Aby przygotować zawiesinę komórkową, należy rozcieńczyć nocną hodowlę komórek drożdży C. albicans (rozcieńczenie 1/1000) na świeżej pożywce do hodowli komórkowych RPMI uzupełnionej 50 mM glukozy. 
	UWAGA: C. albicans przekształca się ze wzrostu drożdży w strzępki w warunkach indukowania strzępek (RPMI w temperaturze 37 °C). Wykazano, że małe cząsteczki kwasu gymnemowego hamują przekształcanie komórek drożdży w strzępki w warunkach indukowania strzępek16. Naszym celem było ustalenie, czy ekstrakt z G. sylvestre oddzielony fazą ciekłą i IEF zawiera te bioaktywne cząsteczki.</li>
	<li>Z przygotowanej zawiesiny komórkowej dodać 90 μl do każdego dołka 96-dołkowej płytki.</li>
	<li>Z każdej frakcji (1-20 zebranych frakcji ekstraktu G. sylvestre uzyskanego z IEF w fazie ciekłej, <silna klasa = "xfig">Rysunek 4), dodaj 10 μl do studzienek z 90 μl powyższej zawiesiny komórek (krok 4.2). Wykonać test w trzech egzemplarzach.</li>
	<li>Dodaj 10 μl wody zawierającej amfoliten (1%) do oddzielnych studzienek z 90 μl zawiesiny komórek drożdży C. albicans jako kontroli ujemnej. 
	UWAGA: Amfolity mają potencjał bioaktywny, dlatego ważne jest, aby uwzględnić kontrolę amfolitu podczas wykonywania dowolnego testu biologicznego19.</li>
	<li>Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C przez 12 godzin i obserwować hamowanie konwersji drożdży C. albicans do strzępek pod mikroskopem16. Określ również procent zahamowania konwersji drożdży na strzępki.</li>
</ol>

<ol><li>Jankowska, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedure+of+extraction%2C+purification+and+proteomic+analysis+of+nuclear+proteins+from+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized procedure of extraction, purification and proteomic analysis of nuclear proteins from mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 261, 1-9 (2016).</li>
<li>Pergande, M. R., Cologna, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+Point+Separations+of+Peptides+and+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomes%22%5BJournal%5D)">Isoelectric Point Separations of Peptides and Proteins.</a> Proteomes. 5 (1), (2017).</li>
<li>Stoyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IEF-based+multidimensional+applications+in+proteomics%3A+toward+higher+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">IEF-based multidimensional applications in proteomics: toward higher resolution.</a> Electrophoresis. 33 (22), 3281-3290 (2012).</li>
<li>Vesterberg, O. A. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVesterberg%2C+OAY+%22Method+of+Isoelectric+Fractionation%22">Method of Isoelectric Fractionation</a>. , US3485736A (1964).</li>
<li>Vesterberg, O., Svensson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoelectric+fractionation%2C+analysis%2C+and+characterization+of+ampholytes+in+natural+pH+gradients.+IV.+Further+studies+on+the+resolving+power+in+connection+with+separation+of+myoglobins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chemica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Isoelectric fractionation, analysis, and characterization of ampholytes in natural pH gradients. IV. Further studies on the resolving power in connection with separation of myoglobins.</a> Acta Chemica Scandinavica. 20 (3), 820-834 (1966).</li>
<li>Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRighetti%2C+PG+%22Isoelectric+Focusing%3A+Theory%2C+Methodology+and+Applications%22">Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications</a>. , Elsevier Science. 1(1983).</li>
<li>Vesterberg, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+Isoelectric+Fractionation+of+Carrier+Ampholytes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Chemica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Synthesis and Isoelectric Fractionation of Carrier Ampholytes.</a> Acta Chemica Scandinavica. 23, 2653-2666 (1969).</li>
<li>Bier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recycling+isoelectric+focusing+and+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Recycling isoelectric focusing and isotachophoresis.</a> Electrophoresis. 19 (7), 1057-1063 (1998).</li>
<li>Bier, M., Palusinski, O. A., Mosher, R. A., Saville, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis%3A+mathematical+modeling+and+computer+simulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis: mathematical modeling and computer simulation.</a> Science. 219 (4590), 1281-1287 (1983).</li>
<li>Ayala, A., Parrado, J., Machado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Rotofor+preparative+isoelectrofocusing+cell+in+protein+purification+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Use of Rotofor preparative isoelectrofocusing cell in protein purification procedure.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. 69 (1), 11-16 (1998).</li>
<li>Wagner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+dipeptidyl+peptidase+IV+%28DP+4%29+isoforms+from+porcine+kidney+by+preparative+isoelectric+focusing+to+improve+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of dipeptidyl peptidase IV (DP 4) isoforms from porcine kidney by preparative isoelectric focusing to improve crystallization.</a> Biological Chemistry. 392 (7), 665-677 (2011).</li>
<li>Hosken, B. D., Li, C., Mullappally, B., Co, C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Monoclonal+Antibody+Charge+Variants+by+Free+Flow+Isoelectric+Focusing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing.</a> Analytical Chemistry. 88 (11), 5662-5669 (2016).</li>
<li>Yu, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Francisella+tularensis+T-cell+antigen+identification+using+humanized+HLA-DR4+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Francisella tularensis T-cell antigen identification using humanized HLA-DR4 transgenic mice.</a> Clinical Vaccine Immunology. 17 (2), 215-222 (2010).</li>
<li>Riyong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+and+charge+antigens+of+Dirofilaria+immitis+adult+worm+for+IgG-ELISA+diagnosis+of+bancroftian+filariasis%5BTitle%5D)+AND+%22Southeast+Asian+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Size and charge antigens of Dirofilaria immitis adult worm for IgG-ELISA diagnosis of bancroftian filariasis.</a> Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health. 41 (2), 285-297 (2010).</li>
<li>Vediyappan, G., Bikandi, J., Braley, R., Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+proteins+of+Candida+albicans%3A+preparation+of+extracts+and+improved+detection+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Cell surface proteins of Candida albicans: preparation of extracts and improved detection of proteins.</a> Electrophoresis. 21 (5), 956-961 (2000).</li>
<li>Vediyappan, G., Dumontet, V., Pelissier, F., d'Enfert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gymnemic+acids+inhibit+hyphal+growth+and+virulence+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gymnemic acids inhibit hyphal growth and virulence in Candida albicans.</a> PLoS One. 8 (9), 74189(2013).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Riazi, S., Dover, S., Turovskiy, Y., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercial+ampholytes+used+for+isoelectric+focusing+may+interfere+with+bioactivity+based+purification+of+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Commercial ampholytes used for isoelectric focusing may interfere with bioactivity based purification of antimicrobial peptides.</a> Journal of Microbiological Methods. 71 (1), 87-89 (2007).</li>
<li>Kamei, K., Takano, R., Miyasaka, A., Imoto, T., Hara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino-Acid-Sequence+of+Sweet-Taste-Suppressing+Peptide+%28Gurmarin%29+from+the+Leaves+of+Gymnema-Sylvestre%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Amino-Acid-Sequence of Sweet-Taste-Suppressing Peptide (Gurmarin) from the Leaves of Gymnema-Sylvestre.</a> Journal of Biochemistry. 111 (1), 109-112 (1992).</li>
<li>Craik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry.+Seamless+proteins+tie+up+their+loose+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemistry. Seamless proteins tie up their loose ends.</a> Science. 311 (5767), 1563-1564 (2006).</li>
<li>Craik, D. J., Daly, N. L., Bond, T., Waine, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cyclotides%3A+A+unique+family+of+cyclic+and+knotted+proteins+that+defines+the+cyclic+cystine+knot+structural+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant cyclotides: A unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif.</a> Journal of Molecular Biology. 294 (5), 1327-1336 (1999).</li>
<li>Stoecklin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+physiological+properties+of+gymnemic+acid%2C+the+antisaccharine+principle+of+the+leaves+of+Gymnema+sylvestre%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemistry and physiological properties of gymnemic acid, the antisaccharine principle of the leaves of Gymnema sylvestre.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 17 (4), 704-708 (1969).</li>
<li>Liu, H. M., Kiuchi, F., Tsuda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+structure+elucidation+of+gymnemic+acids%2C+antisweet+principles+of+Gymnema+sylvestre%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+%26+Pharmaceutical+Bulletin+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Isolation and structure elucidation of gymnemic acids, antisweet principles of Gymnema sylvestre.</a> Chemical & Pharmaceutical Bulletin (Tokyo). 40 (6), 1366-1375 (1992).</li>
<li>Veerapandian, R., Vediyappan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gymnemic+Acids+Inhibit+Adhesive+Nanofibrillar+Mediated+Streptococcus+gordonii-Candida+albicans+Mono-Species+and+Dual-Species+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Gymnemic Acids Inhibit Adhesive Nanofibrillar Mediated Streptococcus gordonii-Candida albicans Mono-Species and Dual-Species Biofilms.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 2328(2019).</li>
<li>Chaffin, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+cell+wall+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Candida albicans cell wall proteins.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 72 (3), 495-544 (2008).</li>
</ol>

Autorzy pragną zadeklarować brak sprzecznych interesów finansowych.

Małe cząsteczki pochodzące z naturalnych źródeł produktów (np. roślin) zawierają złożone metabolity wtórne, które są bardzo zróżnicowane pod względem struktury chemicznej. Uważa się, że biorą udział w mechanizmach obronnych roślin. Ponadto polipeptydy są również obecne w tkankach roślinnych22. Te małe cząsteczki produktów naturalnych są bogatym źródłem cząsteczek testowych do odkrywania i opracowywania leków. Jednak trudne i żmudne metody wymagane do ich izolacji i oczyszczenia ograniczają ich zas...

Oczyszczanie biomolekuł ze złożonych próbek biologicznych jest niezbędnym i często trudnym krokiem w eksperymentach biologicznych1. Ogniskowanie izoelektryczne (IEF) dobrze nadaje się do separacji złożonych biomolekuł w wysokiej rozdzielczości, w których amfolity nośnikowe przemieszczają się zgodnie ze swoim ładunkiem i ustalają gradient pH w polu elektrycznym3. Pierwszy komercyjny amfolit dla IEF został opracowany przez Olofa Vesterberga w 1964 roku i opatentowany4,5. Amfolity nośne to alifatyczne cząsteczki kwasu oligo-aminooligokarboksylowego o różnej długości i rozgałęzieniu6. Następnie Vesterberg i inni udoskonalili amfolity nośnikowe w celu ich rozszerzonego zastosowania w rozdzielaniu biomolekuł6,7.
Metody rozdzielania biomolekuł obejmują elektroforezę w żelu agarozowym i poliakrylamidowym, dwuwymiarową elektroforezę żelową (2-DE), ogniskowanie izoelektryczne, elektroforezę kapilarną, izotachotezę i inne techniki chromatograficzne (np. TLC, FPLC, HPLC)2. IEF w fazie ciekłej wykonywany w instrumencie zwanym "Rotofor" został wynaleziony przez Milana Bier8. Był pionierem koncepcji i konstrukcji tego instrumentu i wniósł duży wkład w teorię migracji elektroforetycznej. Jego zespół opracował również matematyczny model procesu separacji elektroforetycznej na potrzeby symulacji komputerowych9.
Aparat IEF w fazie ciekłej to poziomo obracająca się cylindryczna komórka składająca się z nylonowego rdzenia podzielonego na 20 porowatych komór i ceramicznego pręta chłodzącego wodę w obiegu. Porowate komory umożliwiają cząsteczkom migrację przez fazę wodną między elektrodami i umożliwiają pobieranie oczyszczonych próbek w próżni w postaci frakcji. Ten system oczyszczania może zapewnić do 1000-krotnego oczyszczenia określonej cząsteczki w ciągu <4 godzin. Cenną cechą tego instrumentu jest to, że może być stosowany jako pierwszy krok do oczyszczania ze złożonej mieszaniny lub jako ostatni krok do osiągnięcia czystości10. Jeśli cząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest białkiem, kolejną zaletą jest to, że jej natywna konformacja zostanie zachowana podczas separacji.
Szeroko opisywane stosowanie IEF w fazie ciekłej do oczyszczania białek, enzymów i przeciwciał6,10,11,12,13,14. Tutaj opisujemy zastosowanie tego podejścia do oddzielania i oczyszczania małych cząsteczek i peptydów z rośliny leczniczej Gymnema sylvestre. Protokół ten pomoże naukowcom skoncentrować i oczyścić aktywne małe cząsteczki z ekstraktu roślinnego do dalszych zastosowań przy niskich kosztach. Ponadto pokazujemy również, że wzbogacenie białek ze złożonego ekstraktu białkowego z Candida albicans fungus15 w tym systemie opartym na IEF jako drugi przykład.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mikro; m filtr strzykawkowy</td><td>Fisher scientfic</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Węglan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207861-500</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Lyte 3/10 Amfolite</td><td>Bio-Rad</td><td>163-1113</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Lyte 5/8 Ampholyte</td><td>Bio-Rad</td><td>163-1192</td><td></td></tr><tr><td>Kompaktowy termostat niskotemperaturowy</td><td>Lauda - Brinkmann</td><td>RM 6T</td><td>Ustaw chłodzenie wodne na 4 oC i może pracować nawet w 0 oC, ponieważ gdy przechodzi przez rdzeń chłodzący Rotofor, temperatura wody obiegowej będzie wynosić około 5 lub więcej w zależności od napięcia.</td></tr>Rurki do dializy <tr><td>Coomassie Brilliant Blue R</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>(3,500 MWCO)</td><td>Spectrum Spectra/Por</td><td>132112T</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z liści roślin Gymnema w proszku (>25% kwasów gymnemowych)</td><td>Suan Farma, NJ USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Towarzysz laboratoryjny</td><td>SI 300R</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DM 6B</td><td></td></tr><tr><td>Mini protean elektroforeza</td><td>Bio-Rad pH-metr</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>S20</td><td>Przydatny do oznaczania pH frakcji Rotofor (IEF w fazie ciekłej)</td></tr><tr><td>Rotofor</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2972</td><td>http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702950E.pdf (Rotofor Instrukcja obsługi montażu urządzenia)</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Średni</td><td>HyClone</td><td>DH30255.01</td><td></td></tr><tr>Można również zastosować <td>taśmę uszczelniającą</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2960</td><td>Taśma klejąca.</td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall legend micro 17</td><td>Thermo scientific</td><td>75002432</td><td></td></tr><tr><td>płytka do hodowli tkankowej TPP -96 dołków płaskie dno</td><td>TP92696</td><td></td> <td>TPP</td></tr></tbody></table>

separacja bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów ze źródeł naturalnych i białek od drobnoustrojów metodą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (ief)

Separation of Bioactive Small Molecules, Peptides from Natural Sources and Proteins from Microbes by Preparative Isoelectric Focusing (IEF) Method

Naturalne produkty pochodzące z roślin i mikrobów są bogatym źródłem bioaktywnych molekuł. Przed ich użyciem aktywne cząsteczki z ekstraktów złożonych muszą zostać oczyszczone do dalszych zastosowań. W tym celu dostępne są różne metody chromatograficzne, jednak nie wszystkie laboratoria mogą sobie pozwolić na metody o wysokiej wydajności, a izolacja od złożonych próbek biologicznych może być trudna. Tutaj pokazujemy, że preparatywne ogniskowanie izoelektryczne w fazie ciekłej (IEF) może oddzielać cząsteczki, w tym małe cząsteczki i peptydy, od złożonych ekstraktów roślinnych, na podstawie ich punktów izoelektrycznych (pI). Zastosowaliśmy tę metodę do złożonego frakcjonowania i charakterystyki próbek biologicznych. Jako dowód słuszności koncepcji, frakcjonowaliśmy ekstrakt roślinny Gymnema sylvestre, izolując rodzinę małych cząsteczek saponin terpenoidowych i peptyd. Wykazaliśmy również skuteczną separację białek mikrobiologicznych przy użyciu grzyba Candida albicans jako systemu modelowego.

Separacja i oczyszczanie małych cząsteczek i peptydów z ekstraktu rośliny Gymnema sylvestre 
Stosując preparatywną metodę izoelektrycznego ogniskowania (IEF) w fazie ciekłej, rozdzielono ekstrakty z roślin leczniczych oraz białka powierzchniowe komórek ludzkiego grzyba patogennego, C. albicans. Schemat tych protokołów frakcjonowania przedstawiono na Rysunku 1.
Z 20 frakcji ekstraktu z G. sylvestre uzyskanych w procesi...

Celem jest frakcjonowanie i izolowanie bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów z złożonego ekstraktu roślinnego oraz białek z drobnoustrojów chorobotwórczych za pomocą metody ogniskowania izoelektrycznego w fazie ciekłej (IEF). Ponadto zidentyfikowano oddzielone cząsteczki i potwierdzono ich bioaktywność.

Separacja bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów ze źródeł naturalnych i białek od drobnoustrojów metodą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF)

Natural products derived from plants and microbes are a rich source of bioactive molecules. Prior to their use, the active molecules from complex extracts ...

Nasz protokół opisuje nowe odkrycia dotyczące separacji i oczyszczania aktywnych cząsteczek z ekstraktu roślinnego. Naukowcy mogą wykorzystać te metody do izolowania małych cząsteczek i peptydów z naturalnych źródeł produktów dla użytkowników terapeutycznych. Zapoznaj się z elementami przyrządu i metodami ich montażu.Ważne jest, aby mieć pewność, że próbka, która ma zostać oddzielona, jest przygotowana zgodnie z sugerowanymi wytycznymi. Metoda ta obejmuje wiele procesów montażu instrumentu. A wizualna demonstracja pomoże użytkownikom śledzić i skutecznie zastosować je w badaniach.Po zmontowaniu fazy ciekłej, jednostki IEF zgodnie z opisem w instrukcji obsługi, zrównoważyć membrany anionowymienne 0,1 molowym wodorotlenkiem sodu, a membrany kationitowe 0,1 molowym kwasem fosforowym. Dopasuj gumowe uszczelki tak, aby trzy duże podłużne otwory pozostały odblokowane przez gumę. Pomoże to w wymianie jonów między elektrodą a komorami próbki za pośrednictwem membrany podczas elektroforezy.Zamontuj wewnętrzną i zewnętrzną część elektrody, wyrównując trzy podłużne otwory w uszczelkach jonowymiennych. Następnie napełnij elektrody odpowiednimi elektrolitami, aby zapobiec wysychaniu ich membran. Następnie dokręć plastikowy uchwyt, aby zapewnić szczelny montaż.Przykryj tablice do pobierania próbek taśmą uszczelniającą. Następnie zmontuj części komory ogniskowania nad ceramicznym palcem chłodzącym w następującej kolejności: elektroda anodowa, rdzeń membrany nylonowej, komora ogniskowania i elektroda katodowa. Za pomocą strzykawki o pojemności 50 mililitrów napełnij komorę ostrości wstępnie schłodzoną wodą destylowaną.W przypadku standardowego ogniwa IEF dodaj 60 mililitrów wody. Podłącz jednostkę IEF do cyrkulującej wody chłodzącej o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Uruchom urządzenie przy 15 watach i 3000 woltach, aż voltage ustabilizuje się, około trzech do pięciu minut.Następnie wyłącz źródło zasilania. Za pomocą kolektora frakcji usuń wodę z komórki. Ponownie uszczelnij deski zbiorcze taśmą uszczelniającą.Dodaj 0,6 grama ekstraktu roślinnego Gymnema sylvestre do 60 mililitrów wody destylowanej. Rozpuść ekstrakt roślinny, mieszając w rurce rolkowej przez pięć minut. Aby usunąć nierozpuszczalne cząstki, odwirować ten roztwór w temperaturze 10 000 razy G przez pięć minut.Przenieść supernatant do szklanej zlewki o pojemności 150 mililitrów i dodać amfolit, aby uzyskać 1% roztwór objętościowy, około 0,6 mililitra. Za pomocą 50-mililitrowej strzykawki z igłą o końcu 1,5 cala i rozmiarze 19 załaduj ten roztwór do komórki IEF przez płytki do pobierania próbek. Następnie wyjmij ogniwo ze stojaka i postukaj w komorę elektrody, aby usunąć i usunąć wszelkie pęcherzyki.Podłącz urządzenie do wody chłodzącej. Przy stałym zasilaniu 15 watów rozpocznij frakcjonowanie. Uruchom jednostkę IEF, aż voltage osiągnie stałą wartość, około trzech godzin.Po naciśnięciu przycisku włączania należy wyrównać kołki kolektora frakcji z płytami zbiorczymi. Przepchnij szpilki przez taśmę uszczelniającą, aby rozpocząć zbieranie frakcji Gymnema sylvestre. Wyhoduj pojedynczą kolonię C.albicans i drożdży pepiton dekstroza bulion przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając.Przenieść kulturę do probówki wirówkowej i zebrać komórki drożdży przez odwirowanie w temperaturze 10 000 razy G przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu zawiesić komórki drożdży w buforze i obracać zawiesinę w rurze rolkowej przez godzinę w temperaturze pięciu stopni Celsjusza. Aby usunąć komórki drożdży, odwirować zawiesinę w temperaturze 10 000 razy G przez pięć minut.Następnie przefiltruj ekstrakt białkowy przez filtr o wielkości 0,45 mikrometra. Przenieś ekstrakt białkowy do rurki dializacyjnej i dializuj w wodzie przez 15 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po oszacowaniu stężenia białka należy zebrać objętość ekstraktu białkowego zawierającego 500 miligramów białka całkowitego.Rozcieńczyć 500 miligramów białka w 60 mililitrach wody zawierającej 1% objętości amfolitu. Za pomocą strzykawki załaduj rozcieńczony ekstrakt białkowy do ogniwa IEF i pracuj z mocą 15 watów przez cztery godziny. Ponieważ ten przyrząd wykorzystuje zasilanie elektryczne pod wysokim napięciem, użytkownik musi podjąć wszelkie środki ostrożności, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z elektrodami pod napięciem.Kolektor frakcji zawiera 20 plastikowych rurek, każda o wymiarach 12 milimetrów na 75 milimetrów. I jest podłączony do pompy próżniowej. Przygotuj się do zebrania frakcji, naciskając przycisk zbioru.Następnie wyrównaj 20 kołków zbierających na kolektorze frakcji z płytą zbiorczą 20, tak aby uszczelniona komórka skupiająca. Przepchnij kołki zbierające przez taśmę uszczelniającą i jednocześnie włącz pompę próżniową. Każda probówka zbierze frakcję białkową o wielkości około trzech mililitrów.Po zredukowaniu i zagotowaniu frakcji białkowych przeanalizuj je na żelu 12,5% SDS. Odbarwić żel barwnikiem Coomassie Blue i umieścić go na bujaku w temperaturze pokojowej. Po dwóch do trzech godzinach odplamić żel.Następnie nagraj obraz żelu za pomocą imagera żelowego. Przygotować zawiesinę komórek drożdży, rozcieńczając przez noc kulturę C.albicans w stosunku 1:1000 w pożywce do hodowli komórkowych RPMI uzupełnionej 50 milimolową glukozą. Dodać 90 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.Następnie dodaj 10 mikrolitrów każdej frakcji G.sylvestre do oddzielnych studzienek. Jako kontrolę ujemną dodaj 10 mikrolitrów wody z 1% amfolitem do oddzielnych studzienek. Po inkubacji 96-dołkowej płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin, obserwuj płytkę pod mikroskopem.Brak nitkowatego wzrostu wskazuje na zahamowanie konwersji drożdży C.albicans do strzępek. Dwadzieścia frakcji ekstraktu z G.sylvestre otrzymano w fazie ciekłej IEF. Ciemne cząsteczki, kwasy gymnemowe, migrowały do anody i były wzbogacane na końcu jednostki.Na końcu katody zaobserwowano półprzezroczyste jasnożółte frakcje. Podwielokrotności z każdej refrakcji G.sylvestre zostały zredukowane, zagotowane i rozwiązane przez stronę SDS. Barwienie Coomassie Blue wykazało inne pasmo polipeptydowe o grubości około pięciu kilodaltonów, wzbogacone we frakcje od 16 do 19.Kwasy gymnemowe we frakcji pierwszej i kilku następnych frakcjach nie zostały wykryte, ponieważ nie są białkowe. Jednak cząsteczki te można oddzielić za pomocą TLC i wykryć w świetle UV. Frakcja 10 nie zawierała wykrywalnej ilości tych małych cząsteczek, co sugeruje, że większość małych cząsteczek organicznych była wzbogacona we frakcje od pierwszej do trzeciej.Wszystkie 20 frakcji G.sylvestre oznaczono pod kątem hamowania konwersji drożdży do strzępek i wzrostu strzępek u C. albicans. Największe zahamowanie zaobserwowano we frakcji pierwszej, a niewielkie lub żadne zahamowanie zaobserwowano we frakcjach 10 i wyższych. Białka powierzchniowe komórek C. albicans frakcjonowano przy użyciu IEF w fazie ciekłej.A porcje z 18 frakcji zostały przeanalizowane przez stronę SDS. Wzbogacone białka były widoczne w kilku frakcjach. Początkowo małe cząsteczki nie mogły być oddzielone przez ogniskowanie izoelektryczne, ponieważ uważa się, że nie są one ambulatoryjne.Nasze badania pokazują, że są one ambulatoryjne, co najmniej raz w tygodniu, a ta metoda może być dalej badana w przypadku innych małych cząsteczek.

separation-bioactive-small-molecules-peptides-from-natural-sources

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Ten film opisuje technikę oddzielania złożonych cząsteczek od ekstraktów roślinnych za pomocą ogniskowania izoelektrycznego w fazie ciekłej. Technika ta pomaga oczyścić złożone biomolekuły w ich stanie naturalnym, które mogą być wykorzystywane do różnych dalszych zastosowań.

Ogniskowanie izoelektryczne w fazie ciekłej: technika elektroforezy oddzielająca cząsteczki bioaktywne od surowego ekstraktu Gymnema sylvestre

Przedstawiono metodę analizy spektrometrycznej endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Dzięki zastosowaniu filtracji odcięcia masy cząsteczkowej, wstępnego frakcjonowania chromatograficznego, analizy spektrometrii mas i późniejszej kombinacji strategii identyfikacji peptydów, możliwe było prawie dziesięciokrotne rozszerzenie znanego peptydomu płynu mózgowo-rdzeniowego w porównaniu z poprzednimi badaniami.

Przygotowanie próbki do analizy endopeptydomicznej w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym

Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.

Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Szczegółowy protokół jest opisany do separacji, identyfikacji i charakterystyki proteoform w próbkach białek za pomocą elektroforezy strefy kapilarnej-elektrorozpylania jonizacji-tandemowej spektrometrii mas (CZE-ESI-MS/MS). Protokół może być wykorzystany do charakterystyki proteoform w prostych próbkach białkowych w wysokiej rozdzielczości oraz do identyfikacji proteoform na dużą skalę w złożonych próbkach proteomów.

Proteomika na dużą skalę z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas z elektroforezą strefy kapilarnej

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół trawienia na filtrze ze szczegółowymi informacjami na temat: trawienie białek, oczyszczanie peptydów i analiza pozyskiwania niezależnie od danych. Strategia ta jest stosowana do analizy ekspresji wydzielin gruczołu krokowego - próbek moczu i umożliwia wysokie pokrycie proteomem oraz profilowanie proteomu moczu bez znaczników o niskiej brakującej wartości.

Profil proteomiczny EPS-moczu poprzez trawienie FASP i analizę niezależną od danych

Ten protokół opisuje procedurę izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od makrofagów za pomocą różnicowego ultrawirowania i ekstrakcji peptydomu do identyfikacji za pomocą spektrometrii mas.

Identyfikacja peptydów małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Protokół ten opisuje hodowlę, zbiór i koncentrację wydzielanych białek Mycobacterium tuberculosis. Białka filtratu kulturowego (CFP) są oznaczane ilościowo, rozdzielane na 20 frakcji przez ogniskowanie izoelektryczne, a następnie rozdzielane na 30 frakcji za pomocą preparatywnego SDS-PAGE i systemu elektroelucji.

Rozdzielanie i frakcjonowanie białek filtratu kulturowego (CFP) z Mycobacterium tuberculosis

Protokół ten rozdziela nierozpuszczalne białka ściany komórkowej i błony na proste frakcje (1-5 białek) za pomocą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF) opartego na punkcie izoelektrycznym, a następnie rozdzielania według masy cząsteczkowej. Otrzymane frakcje można wykorzystać bezpośrednio do analizy immunologicznej i proteomicznej bez dalszego oczyszczania.

Separacja i frakcjonowanie białek ściany komórkowej i błony komórkowej z Mycobacterium tuberculosis do dalszej analizy białek

Poznaj metodę preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego do izolacji bioaktywnych małych cząsteczek i peptydów z ekstraktów roślinnych. Ta technika umożliwia skuteczną separację związków o potencjale terapeutycznym.

Separacja bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów ze źródeł naturalnych i białek od drobnoustrojów metodą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF) (Wideo) | JoVE Journal

Separacja bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów ze źródeł naturalnych i białek od drobnoustrojów metodą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF)

Przeglądaj więcej filmów