Separacja bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów ze źródeł naturalnych i białek od drobnoustrojów metodą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF)

Nasz protokół opisuje nowe odkrycia dotyczące separacji i oczyszczania aktywnych cząsteczek z ekstraktu roślinnego. Naukowcy mogą wykorzystać te metody do izolowania małych cząsteczek i peptydów z naturalnych źródeł produktów dla użytkowników terapeutycznych. Zapoznaj się z elementami przyrządu i metodami ich montażu.

Ważne jest, aby mieć pewność, że próbka, która ma zostać oddzielona, jest przygotowana zgodnie z sugerowanymi wytycznymi. Metoda ta obejmuje wiele procesów montażu instrumentu. A wizualna demonstracja pomoże użytkownikom śledzić i skutecznie zastosować je w badaniach.

Po zmontowaniu fazy ciekłej, jednostki IEF zgodnie z opisem w instrukcji obsługi, zrównoważyć membrany anionowymienne 0,1 molowym wodorotlenkiem sodu, a membrany kationitowe 0,1 molowym kwasem fosforowym. Dopasuj gumowe uszczelki tak, aby trzy duże podłużne otwory pozostały odblokowane przez gumę. Pomoże to w wymianie jonów między elektrodą a komorami próbki za pośrednictwem membrany podczas elektroforezy.

Zamontuj wewnętrzną i zewnętrzną część elektrody, wyrównując trzy podłużne otwory w uszczelkach jonowymiennych. Następnie napełnij elektrody odpowiednimi elektrolitami, aby zapobiec wysychaniu ich membran. Następnie dokręć plastikowy uchwyt, aby zapewnić szczelny montaż.

Przykryj tablice do pobierania próbek taśmą uszczelniającą. Następnie zmontuj części komory ogniskowania nad ceramicznym palcem chłodzącym w następującej kolejności: elektroda anodowa, rdzeń membrany nylonowej, komora ogniskowania i elektroda katodowa. Za pomocą strzykawki o pojemności 50 mililitrów napełnij komorę ostrości wstępnie schłodzoną wodą destylowaną.

W przypadku standardowego ogniwa IEF dodaj 60 mililitrów wody. Podłącz jednostkę IEF do cyrkulującej wody chłodzącej o temperaturze czterech stopni Celsjusza. Uruchom urządzenie przy 15 watach i 3000 woltach, aż voltage ustabilizuje się, około trzech do pięciu minut.

Następnie wyłącz źródło zasilania. Za pomocą kolektora frakcji usuń wodę z komórki. Ponownie uszczelnij deski zbiorcze taśmą uszczelniającą.

Dodaj 0,6 grama ekstraktu roślinnego Gymnema sylvestre do 60 mililitrów wody destylowanej. Rozpuść ekstrakt roślinny, mieszając w rurce rolkowej przez pięć minut. Aby usunąć nierozpuszczalne cząstki, odwirować ten roztwór w temperaturze 10 000 razy G przez pięć minut.

Przenieść supernatant do szklanej zlewki o pojemności 150 mililitrów i dodać amfolit, aby uzyskać 1% roztwór objętościowy, około 0,6 mililitra. Za pomocą 50-mililitrowej strzykawki z igłą o końcu 1,5 cala i rozmiarze 19 załaduj ten roztwór do komórki IEF przez płytki do pobierania próbek. Następnie wyjmij ogniwo ze stojaka i postukaj w komorę elektrody, aby usunąć i usunąć wszelkie pęcherzyki.

Podłącz urządzenie do wody chłodzącej. Przy stałym zasilaniu 15 watów rozpocznij frakcjonowanie. Uruchom jednostkę IEF, aż voltage osiągnie stałą wartość, około trzech godzin.

Po naciśnięciu przycisku włączania należy wyrównać kołki kolektora frakcji z płytami zbiorczymi. Przepchnij szpilki przez taśmę uszczelniającą, aby rozpocząć zbieranie frakcji Gymnema sylvestre. Wyhoduj pojedynczą kolonię C.albicans i drożdży pepiton dekstroza bulion przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, wstrząsając.

Przenieść kulturę do probówki wirówkowej i zebrać komórki drożdży przez odwirowanie w temperaturze 10 000 razy G przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu zawiesić komórki drożdży w buforze i obracać zawiesinę w rurze rolkowej przez godzinę w temperaturze pięciu stopni Celsjusza. Aby usunąć komórki drożdży, odwirować zawiesinę w temperaturze 10 000 razy G przez pięć minut.

Następnie przefiltruj ekstrakt białkowy przez filtr o wielkości 0,45 mikrometra. Przenieś ekstrakt białkowy do rurki dializacyjnej i dializuj w wodzie przez 15 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po oszacowaniu stężenia białka należy zebrać objętość ekstraktu białkowego zawierającego 500 miligramów białka całkowitego.

Rozcieńczyć 500 miligramów białka w 60 mililitrach wody zawierającej 1% objętości amfolitu. Za pomocą strzykawki załaduj rozcieńczony ekstrakt białkowy do ogniwa IEF i pracuj z mocą 15 watów przez cztery godziny. Ponieważ ten przyrząd wykorzystuje zasilanie elektryczne pod wysokim napięciem, użytkownik musi podjąć wszelkie środki ostrożności, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu z elektrodami pod napięciem.

Kolektor frakcji zawiera 20 plastikowych rurek, każda o wymiarach 12 milimetrów na 75 milimetrów. I jest podłączony do pompy próżniowej. Przygotuj się do zebrania frakcji, naciskając przycisk zbioru.

Następnie wyrównaj 20 kołków zbierających na kolektorze frakcji z płytą zbiorczą 20, tak aby uszczelniona komórka skupiająca. Przepchnij kołki zbierające przez taśmę uszczelniającą i jednocześnie włącz pompę próżniową. Każda probówka zbierze frakcję białkową o wielkości około trzech mililitrów.

Po zredukowaniu i zagotowaniu frakcji białkowych przeanalizuj je na żelu 12,5% SDS. Odbarwić żel barwnikiem Coomassie Blue i umieścić go na bujaku w temperaturze pokojowej. Po dwóch do trzech godzinach odplamić żel.

Następnie nagraj obraz żelu za pomocą imagera żelowego. Przygotować zawiesinę komórek drożdży, rozcieńczając przez noc kulturę C.albicans w stosunku 1:1000 w pożywce do hodowli komórkowych RPMI uzupełnionej 50 milimolową glukozą. Dodać 90 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów każdej frakcji G.sylvestre do oddzielnych studzienek. Jako kontrolę ujemną dodaj 10 mikrolitrów wody z 1% amfolitem do oddzielnych studzienek. Po inkubacji 96-dołkowej płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin, obserwuj płytkę pod mikroskopem.

Brak nitkowatego wzrostu wskazuje na zahamowanie konwersji drożdży C.albicans do strzępek. Dwadzieścia frakcji ekstraktu z G.sylvestre otrzymano w fazie ciekłej IEF. Ciemne cząsteczki, kwasy gymnemowe, migrowały do anody i były wzbogacane na końcu jednostki.

Na końcu katody zaobserwowano półprzezroczyste jasnożółte frakcje. Podwielokrotności z każdej refrakcji G.sylvestre zostały zredukowane, zagotowane i rozwiązane przez stronę SDS. Barwienie Coomassie Blue wykazało inne pasmo polipeptydowe o grubości około pięciu kilodaltonów, wzbogacone we frakcje od 16 do 19.

Kwasy gymnemowe we frakcji pierwszej i kilku następnych frakcjach nie zostały wykryte, ponieważ nie są białkowe. Jednak cząsteczki te można oddzielić za pomocą TLC i wykryć w świetle UV. Frakcja 10 nie zawierała wykrywalnej ilości tych małych cząsteczek, co sugeruje, że większość małych cząsteczek organicznych była wzbogacona we frakcje od pierwszej do trzeciej.

Wszystkie 20 frakcji G.sylvestre oznaczono pod kątem hamowania konwersji drożdży do strzępek i wzrostu strzępek u C. albicans. Największe zahamowanie zaobserwowano we frakcji pierwszej, a niewielkie lub żadne zahamowanie zaobserwowano we frakcjach 10 i wyższych. Białka powierzchniowe komórek C. albicans frakcjonowano przy użyciu IEF w fazie ciekłej.

A porcje z 18 frakcji zostały przeanalizowane przez stronę SDS. Wzbogacone białka były widoczne w kilku frakcjach. Początkowo małe cząsteczki nie mogły być oddzielone przez ogniskowanie izoelektryczne, ponieważ uważa się, że nie są one ambulatoryjne.

Nasze badania pokazują, że są one ambulatoryjne, co najmniej raz w tygodniu, a ta metoda może być dalej badana w przypadku innych małych cząsteczek.