Inżynieria powierzchni wysp trzustkowych z heparynizowaną nanopowłoką StarPEG
23 czerwca 2018
Ten protokół ma na celu osiągnięcie inżynierii powierzchni wysp trzustkowych za pomocą nanopowłoki starPEG z włączoną heparyną poprzez pseudo-bioortogonalną chemię pomiędzy grupami N-hydroksysukcynimidowymi nanopowłoki a grupami aminowymi błony komórkowej wysp trzustkowych.
Ta metoda może pomóc w rozwiązaniu głównych wyzwań związanych z przeszczepem wysp trzustkowych, takich jak odrzucenie immunologiczne, rewaskularyzacja wysp trzustkowych po przeszczepie i przeżycie. Główną zaletą tej techniki jest to, że to łatwe do przyjęcia podejście umożliwia inżynierię powierzchni żywych komórek poprzez przekształcenie krajobrazu komórkowego wyspy trzustkowej, co poprawi funkcję przeszczepu, przeżycie i ostatecznie skuteczność terapeutyczną przeszczepu wysp trzustkowych. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapie komórkowe, ponieważ wyniki terapeutyczne terapii komórkowych są również ograniczone przez niską retencję komórek i słabą przeżywalność.
Tę procedurę demonstruje Jingyi Yang, doktorant z mojego laboratorium. Najpierw odważ 6,9 grama heparyny i rozpuść ją w 2 mililitrach lodowatej wody dejonizowanej w probówce Eppendorfa. Rozpuść 0,23 grama NHS w 0,5 mililitra lodowatej wody dejonizowanej w probówce Eppendorfa.
Następnie rozpuść 0,77 grama EDC w 0,5 mililitra lodowatej wody dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Wymieszaj roztwory NHS i EDC w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Po pozostawieniu zmieszanego roztworu w temperaturze pokojowej na 30 minut, odwirować go z prędkością 12 000 obr./min przez 10 minut, aby usunąć nadmiar EDC i NHS.
Następnie dodaj 30 mililitrów zimnego etanolu do roztworu i odwiruj z prędkością 12 000 obr./min przez 10 minut. Teraz dodaj 1 mililitr 10% starPEG MI aid do 50-mililitrowej stożkowej tuby. Następnie dodaj 0,67 mililitra 10% roztworu heparyny NHS do tej samej 50-mililitrowej stożkowej probówki.
Umieść zmieszany roztwór w inkubatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 20 minut, aby uzyskać lepki, klarowny roztwór. Ręcznie wybierz 200 wcześniej wyekstrahowanych wysepek myszy pod mikroskopem preparacyjnym i przenieś do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodać 500 mikrolitrów PBS do wysepek i odwirować z prędkością 1 200 obr./min przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Usuń supernatant, dodaj 250 mikrolitrów roztworu Heparyny PEG i umieść mieszaninę na lodzie na 10 minut. Pipetować w górę i w dół, aby wysepki dobrze wymieszały się z roztworem Heparyny PEG. Następnie odwirować mieszaninę z prędkością 1 200 obr./min przez jedną minutę.
Następnie usuń supernatant i dodaj 500 mikrolitrów PBS. Pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Po odwirowaniu z prędkością 1 200 obr./min przez jedną minutę, usunąć supernatant i zachować wysepki do dalszego wykorzystania.
Następnie dodaj od jednego do dwóch mililitrów RPM I 1640, uzupełnionych 10% FBS do powlekanych wysepek. I przenieś te wysepki do nienaładowanego sterylnego naczynia do hodowli bakterii. Na koniec obserwuj morfologię i sygnały fluorescencyjne wysepek pokrytych FAM-Heparyną-PEG pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.
Charakterystyczne piki heparyny, odpowiadające grupom HYDROXAL, zaobserwowano w widmie FTIR nanopowłoki Heparyna-PEG. Spadek amplitudy tych pików reprezentuje koniugację między grupami amidowymi pomocy gwiazda-PEG MI a grupą węglanową heparyny. Pik odpowiadający amidowym drganiom rozciągania węglanowego został również zmniejszony, co wskazuje na wystarczającą reakcję między grupami karboksylanu heparyny z sukcyniminianem sukcynimidem i aminą pomocową star-PEG MI.
Dane z mikroskopii elektronowej pokazują wysoce połączoną porowatą strukturę nanopowłoki Heparin-PEG, co sugeruje, że może ona być odpowiednia dla przetrwania komórek podczas dostarczania in vivo. Cienka warstwa nanopowłoki, uwidoczniona przez zieloną fluorescencję, została równomiernie osadzona na powierzchni pokrytych wysepek, nie powodując widocznych zmian w objętości lub rozmiarze wysepek. Mysia wyspa trzustkowa pokryta heparyną PEG wykazywała solidną żywotność wysepek w hodowli.
Znacznie bardziej zaawansowane tworzenie naczyń było widoczne w komórkach śródbłonka wysp trzustkowych, które były hodowane wspólnie z wyspami trzustkowymi pokrytymi heparyną-PEG, na co wskazują wydłużone struktury przypominające mikronaczynia i sieciowe struktury naczyniowe. Niski poziom wydzielania insuliny zaobserwowano we wszystkich leczonych grupach, gdy wyspy trzustkowe były perfundowane fizjologicznym roztworem soli, uzupełnionym substymulującym poziomem glukozy. Gdy wyspy trzustkowe zostały pobudzone superfizjologicznym poziomem glukozy, zaobserwowano wzrost wydzielania insuliny.
Po opanowaniu powłoki można ją wykonać w ciągu minuty, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, aby zachować żywotność wysepek.
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę inżynierii powierzchni wysp trzustkowych z wykorzystaniem nanopowłoki starPEG zawierającej heparynę. Technologia ta ma na celu poprawę wyników przeszczepów wysp trzustkowych poprzez zwiększenie funkcji i przeżywalności przeszczepu.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Terapie oparte na komórkach
- Biologia przeszczepów
- Inżynieria powierzchni
Tło
- Przeszczep wysp trzustkowych stoi przed wyzwaniami takimi jak odrzucenie immunologiczne i słaba przeżywalność wysp.
- Poprawa środowiska komórkowego wysp może zwiększyć skuteczność terapeutyczną.
- Nanopowłoka heparynowo-PEG oferuje potencjalne rozwiązanie tych wyzwań.
- Ta metoda jest łatwa do przyjęcia i może być przeprowadzona szybko.
Cel badania
- Rozwój techniki powlekania, która poprawia przeżywalność i funkcję wysp trzustkowych.
- Rozwiązanie problemów związanych z niską retencją komórek w terapiach opartych na komórkach.
- Wykazanie skuteczności nanopowłoki heparynowo-PEG w poprawie wyników przeszczepów wysp trzustkowych.
Stosowane metody
- Przygotowanie roztworów heparyny i NHS.
- Mieszanie roztworów NHS i EDC do nanopowłoki.
- Powlekanie wysp mysich za pomocą roztworu heparyny-PEG.
- Obserwacja morfologii i żywotności wysp pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Główne wyniki
- Wyspy pokryte heparyną-PEG wykazywały lepszą żywotność w kulturze.
- Zaobserwowano zwiększoną formowanie naczyń wwspółkulturach komórek śródbłonkowych wysp.
- Wydzielanie insuliny było reaktywne na stymulację glukozą w pokrytych wyspach.
- Powłoka nie zmieniała znacząco objętości ani wielkości wysp.
Wnioski
- Nanopowłoka heparynowo-PEG jest obiecującą metodą poprawy przeszczepów wysp trzustkowych.
- Ta technika może zwiększyć skuteczność terapii opartych na komórkach.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować inne typy komórek wymagające inżynierii powierzchni.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starPEG nanocoating addresses critical barriers in cell-based therapies, including immuno-rejection and poor graft survival. This platform enables functional modification of living cell surfaces, supporting improved transplantation outcomes and translational continuity. The approach offers a scalable, mild, and adaptable solution for enhancing cell viability and therapeutic efficacy in preclinical and discovery-stage R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of immune-modulatory strategies for cell-based therapy targets.
- Supports biological de-risking by preserving islet viability and function post-coating.
- Facilitates predictive confidence in cell survival and engraftment for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, surface-engineered islets for downstream functional assays.
- Ensures reproducibility and quantitative assessment of islet viability and insulin secretion.
- Enables reliable evaluation of immune protection and vascularization in screening workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for islet transplantation and immune response studies.
- Supports continuity from in vitro engineering to in vivo transplantation validation.
- Provides mechanistic de-risking for cell retention and survival in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanocoating method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting early-stage hypothesis testing and enabling robust preclinical validation of cell-based therapies.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing for immune evasion and graft survival mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantifiable outputs for islet viability and function.
- Analytics: Provides measurable readouts such as insulin secretion and vascularization metrics.
- Translational Research: Bridges in vitro engineering with in vivo transplantation studies for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various cell types and functional mediators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell survival and immune protection.
- Operational Value: Standardizes cell surface engineering with minimal impact on cell viability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions for cell therapy candidates and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of cell-based therapeutic programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, surface chemistry, and nanocoating techniques.
- Needs access to fluorescence microscopy and analytical instrumentation for validation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility in islet preparation and coating.
- Adaptable to different cell types and functional mediators as supported by platform design.
- Practical limitations include maintaining cell viability and ensuring uniform coating coverage.
