Inżynieria powierzchni wysp trzustkowych z heparynizowaną nanopowłoką StarPEG

Ta metoda może pomóc w rozwiązaniu głównych wyzwań związanych z przeszczepem wysp trzustkowych, takich jak odrzucenie immunologiczne, rewaskularyzacja wysp trzustkowych po przeszczepie i przeżycie. Główną zaletą tej techniki jest to, że to łatwe do przyjęcia podejście umożliwia inżynierię powierzchni żywych komórek poprzez przekształcenie krajobrazu komórkowego wyspy trzustkowej, co poprawi funkcję przeszczepu, przeżycie i ostatecznie skuteczność terapeutyczną przeszczepu wysp trzustkowych. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapie komórkowe, ponieważ wyniki terapeutyczne terapii komórkowych są również ograniczone przez niską retencję komórek i słabą przeżywalność.

Tę procedurę demonstruje Jingyi Yang, doktorant z mojego laboratorium. Najpierw odważ 6,9 grama heparyny i rozpuść ją w 2 mililitrach lodowatej wody dejonizowanej w probówce Eppendorfa. Rozpuść 0,23 grama NHS w 0,5 mililitra lodowatej wody dejonizowanej w probówce Eppendorfa.

Następnie rozpuść 0,77 grama EDC w 0,5 mililitra lodowatej wody dejonizowanej w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Wymieszaj roztwory NHS i EDC w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Po pozostawieniu zmieszanego roztworu w temperaturze pokojowej na 30 minut, odwirować go z prędkością 12 000 obr./min przez 10 minut, aby usunąć nadmiar EDC i NHS.

Następnie dodaj 30 mililitrów zimnego etanolu do roztworu i odwiruj z prędkością 12 000 obr./min przez 10 minut. Teraz dodaj 1 mililitr 10% starPEG MI aid do 50-mililitrowej stożkowej tuby. Następnie dodaj 0,67 mililitra 10% roztworu heparyny NHS do tej samej 50-mililitrowej stożkowej probówki.

Umieść zmieszany roztwór w inkubatorze w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 20 minut, aby uzyskać lepki, klarowny roztwór. Ręcznie wybierz 200 wcześniej wyekstrahowanych wysepek myszy pod mikroskopem preparacyjnym i przenieś do probówki o pojemności 1,5 mililitra. Dodać 500 mikrolitrów PBS do wysepek i odwirować z prędkością 1 200 obr./min przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usuń supernatant, dodaj 250 mikrolitrów roztworu Heparyny PEG i umieść mieszaninę na lodzie na 10 minut. Pipetować w górę i w dół, aby wysepki dobrze wymieszały się z roztworem Heparyny PEG. Następnie odwirować mieszaninę z prędkością 1 200 obr./min przez jedną minutę.

Następnie usuń supernatant i dodaj 500 mikrolitrów PBS. Pipetuj w górę iw dół, aby dobrze wymieszać. Po odwirowaniu z prędkością 1 200 obr./min przez jedną minutę, usunąć supernatant i zachować wysepki do dalszego wykorzystania.

Następnie dodaj od jednego do dwóch mililitrów RPM I 1640, uzupełnionych 10% FBS do powlekanych wysepek. I przenieś te wysepki do nienaładowanego sterylnego naczynia do hodowli bakterii. Na koniec obserwuj morfologię i sygnały fluorescencyjne wysepek pokrytych FAM-Heparyną-PEG pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym.

Charakterystyczne piki heparyny, odpowiadające grupom HYDROXAL, zaobserwowano w widmie FTIR nanopowłoki Heparyna-PEG. Spadek amplitudy tych pików reprezentuje koniugację między grupami amidowymi pomocy gwiazda-PEG MI a grupą węglanową heparyny. Pik odpowiadający amidowym drganiom rozciągania węglanowego został również zmniejszony, co wskazuje na wystarczającą reakcję między grupami karboksylanu heparyny z sukcyniminianem sukcynimidem i aminą pomocową star-PEG MI.

Dane z mikroskopii elektronowej pokazują wysoce połączoną porowatą strukturę nanopowłoki Heparin-PEG, co sugeruje, że może ona być odpowiednia dla przetrwania komórek podczas dostarczania in vivo. Cienka warstwa nanopowłoki, uwidoczniona przez zieloną fluorescencję, została równomiernie osadzona na powierzchni pokrytych wysepek, nie powodując widocznych zmian w objętości lub rozmiarze wysepek. Mysia wyspa trzustkowa pokryta heparyną PEG wykazywała solidną żywotność wysepek w hodowli.

Znacznie bardziej zaawansowane tworzenie naczyń było widoczne w komórkach śródbłonka wysp trzustkowych, które były hodowane wspólnie z wyspami trzustkowymi pokrytymi heparyną-PEG, na co wskazują wydłużone struktury przypominające mikronaczynia i sieciowe struktury naczyniowe. Niski poziom wydzielania insuliny zaobserwowano we wszystkich leczonych grupach, gdy wyspy trzustkowe były perfundowane fizjologicznym roztworem soli, uzupełnionym substymulującym poziomem glukozy. Gdy wyspy trzustkowe zostały pobudzone superfizjologicznym poziomem glukozy, zaobserwowano wzrost wydzielania insuliny.

Po opanowaniu powłoki można ją wykonać w ciągu minuty, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, aby zachować żywotność wysepek.