Wysoka przepustowość, bezwzględne oznaczanie zawartości wybranego białka na poziomie tkankowym za pomocą ilościowej analizy igłowej (QDB)

Metodę tę można nazwać ELISA na poziomie tkankowym, aby zdystansować się od tradycyjnego względnego, półilościowego oznaczania zawartości białka na poziomie komórkowym i tkankowym, co jest obecnie normą w laboratorium badawczym i w diagnostyce klinicznej. Główne zalety tej techniki można opisać w trzech słowach: wysoka przepustowość, ilościowa i bezwzględna. Gdybyśmy mieli dodać jeszcze jedno słowo, byłoby to proste.

Implikacje tej techniki rozciągają się na dziedzinę proteomiki, podczas gdy weryfikacja biomarkerów może być realizowana w formacie wysokoprzepustowym. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w dziedzinie badań i klinicznych. Kwantyfikacja ilości białka na poziomie komórkowym i tkankowym jest obecnie nadal prymitywna.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, nie będą miały problemu z nauczeniem się tej techniki, jest ona dość podstawowa i wymaga minimalnych umiejętności laboratoryjnych. Cieszymy się, że możemy zademonstrować jego niezawodność, prostotę i dokładność techniki przy użyciu modelu zwierzęcego. Próbki można przygotować dowolną tradycyjną metodą przygotowania próbki przy użyciu dowolnych do lizy powszechnie stosowanych w laboratorium badawczym z detergentem lub bez, takiego jak MP40 lub Triton X.In naszym przypadku używamy buforu do lizy Triton X.

Umieść plasterek tkanki o wielkości od pięciu do 100 miligramów w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu do lizy uzupełnionego inhibitorami proteazy i fosfatazy. Następnie homogenizuj tkankę za pomocą homogenizatora przez jedną minutę na lodzie.

Następnie odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 8 000 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant do nowych probówek i wyjąć jeden mikrolitr w celu zmierzenia całkowitej ilości białka w lizacie białkowym za pomocą zestawu do oznaczania białka, takiego jak test BCA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie zmierzyć absorbancję przy 562 nanometrach na czytniku mikropłytek.

Na tym etapie, używając rekombinowanego białka o znanym stężeniu jako wzorca, rozcieńczyć białko do stężenia 12 000 pikogramów na mikrolitr jako roztwór podstawowy. W międzyczasie rozcieńczyć lizaty przygotowanej próbki do czterech mikrogramów na mikrolitr. Aby uzyskać bardziej wiarygodne wyniki, zalecamy użycie mieszaniny lizatów próbek, aby uniknąć jakichkolwiek różnic między poszczególnymi próbkami.

Równomiernie rozcieńczyć zarówno białko wzorcowe, jak i przygotowane próbki do typowego badania dawki. BSA uzupełniono, aby zapewnić mniej więcej równe ilości białka załadowanego dla każdej próbki. Następnie wymieszaj 10 mikrolitrów seryjnie rozcieńczanego standardowego białka lub lizatów próbki z 10 mikrolitrami buforu ładującego 2X.

Następnie podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez pięć minut. W tej procedurze należy umieścić puste pudełko z końcówkami do pipet pod płytką QDB, aby spód płytki nie dotykał powierzchni stołu. Załaduj do dwóch mikrolitrów próbki do środka membrany na dnie pojedynczej jednostki płytki QDB.

Nigdy nie pozwól, aby spód płyty QDB dotykał jakiejkolwiek powierzchni podczas ładowania i nie obciążaj zbyt mocno dla poszczególnych studni. Z naszego doświadczenia wynika, że nie więcej niż cztery mikrolitry na studzienkę. Następnie pozostaw załadowaną płytkę QDB na godzinę w temperaturze pokojowej lub pozostaw załadowaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.

Aby zablokować płytkę, zanurz płytkę QDB w buforze transferowym i delikatnie potrząsaj nią przez 10 sekund. Następnie delikatnie opłucz płytkę QDB trzykrotnie TBST, a następnie myj płytkę przez pięć minut w TBST pod ciągłym wstrząsaniem. Następnie zablokuj płytkę QDB buforem blokującym na jedną godzinę pod ciągłym potrząsaniem.

Teraz rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze blokującym w wybranym stężeniu i dodać 100 mikrolitrów do każdego pojedynczego dołka zwykłej 96-dołkowej płytki. Włożyć płytkę QDB do płytki 96-dołkowej i inkubować połączone płytki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod ciągłym wstrząsaniem. Następnie delikatnie spłucz płytkę TBST trzy razy, a następnie umyj ją TBST trzy razy za każdym razem przez pięć minut pod ciągłym wstrząsaniem.

Następnie rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym o wybranym stężeniu i podsycić 100 mikrolitrów do każdej studzienki 96-dołkowej płytki. Następnie inkubować płytkę QDB wewnątrz załadowanej płytki 96-dołkowej przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej pod ciągłym wstrząsaniem. Delikatnie opłucz płytkę QDB trzy razy za pomocą TBST, a następnie umyj płytkę trzy razy po pięć minut, każdy z TBST pod ciągłym potrząsaniem.

W celu oceny ilościowej należy przygotować substrat ECL i podzielić go na 96-dołkową płytkę w ilości 100 mikrolitrów na studzienkę. Następnie włóż płytkę QDB do płytki 96-dołkowej na dwie minuty pod ciągłym potrząsaniem. Następnie wyjmij płytkę QDB z płytki 96-dołkowej i krótko wstrząśnij, aby usunąć nadmiar płynu.

Następnie umieścić płytkę na białej płytce do mikromiareczkowania. Następnie włącz czytnik mikropłytek i wybierz płytkę z pokrywą na interfejsie użytkownika przed umieszczeniem połączonych płytek w czytniku mikropłytek w celu określenia ilościowego. Upewnij się, że wybierasz płytę z pokrywą, aby uniknąć błędów.

Rysunek ten przedstawia swoistość króliczego przeciwciała anty-CAPG przy użyciu lizatów tkanek myszy przygotowanych ze śledziony, serca, mięśni, nerek, wątroby i prostaty z analizą western blot. Zdefiniowano liniowy zakres analizy QDB króliczego przeciwciała anty-CAPG przy użyciu lizatów przygotowanych z prostaty, nerek, śledziony oraz przy użyciu oczyszczonego rekombinowanego wzorca białka CAPG. Wyniki były średnią z trzech powtórzeń.

Pokazane jest tutaj bezwzględne wyznaczenie poziomów CAPG w lizatach przygotowanych z mysich nerek, śledziony i prostaty. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech do 24 godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o użyciu z góry określonego specyficznego przeciwciała dla całej procedury.

Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza biostatystyczna, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, które można uzyskać tylko poprzez bezwzględny pomiar zawartości poszczególnych białek na poziomie komórkowym lub tkankowym. Od czasu jej opracowania, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami proteomicznymi do zbadania przypuszczalnego związku biomarkerów białkowych z różnymi chorobami na poziomie populacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić analizę QDB w formacie o wysokiej przepustowości.

Nie zapominaj, że praca z tkankami ludzkimi lub zwierzęcymi może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak używanie rękawiczek.