Name: Wysoka przepustowość, bezwzględne oznaczanie zawartości wybranego białka na poziomie tkankowym za pomocą ilościowej analizy igłowej (QDB) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy igłowej (QDB) do bezwzględnego oznaczania białek w tkankach myszy. Technika ta umożliwia szybką, niezawodną walidację biomarkerów w badaniach proteomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez Taishan Scholars Construction Engineering (G.T.), The Shandong Excellent Young Scientist Award (ZR2016JL026 dla G. T.), National Natural Science Foundation of China (31771284, 3167070448 i 81641108), Shandong provincial Natural Science Foundation (ZR2016JL026, 2017GSF18103), Shandong provincial science and technology Plan (J14LE01 i J15LK03), Yantai Science and Technology Plan (2015ZH083) oraz Fundusze Badań Naukowych Uniwersytetu Medycznego w Binzhou (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), grant Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych 621-2011-4423 i 2015-4870. Ta praca jest również sponsorowana przez "Yantai Double Hundred Talent Plan" i "Yantai Hi-Tech Zone Blue Ocean Talent Plan".

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Dyrektywą Uniwersytetu Medycznego w Binzhou i zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu Medycznego w Binzhou.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Weź 50 mg tkanki myszy do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 200 μl buforu do lizy (50 mM Hepes, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7, 1% Triton X-100, 10% glicerol), uzupełniony inhibitorami proteazy i fosfatazy (100 mM NaF, 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu, 5 μg/ml pepstatyny, 10 μg/ml leupeptyny, 5 μg/ml aprotyniny).</li>
	<li>Homogenizować tkankę za pomocą homogenizatora przez 1 minutę na lodzie.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut w temperaturze 8 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zebrać supernatant do nowych probówek (1,5 ml) i wyjąć 1 μl do testu stężenia białka za pomocą zestawu BCA. 
	nuta: Wszystkie powszechnie stosowane lizy do analizy western blot i analizy Dot blot mogą być używane do analizy QDB.</li>
</ol>
2. Określanie swoistości przeciwciała
<ol>
	<li>Przygotować lizaty próbki (20 μg) w sekcji 1.4, BSA wolne od IgG (20 μg), białko wzorcowe (600 pg), do analizy western blot. 
	nuta: BSA wolne od IgG stosuje się jako kontrolę ujemną, a standardowe białko stosuje się jako kontrolę pozytywną. Swoistość przeciwciała wykazuje się poprzez pokazanie jednego pasma o odpowiedniej wielkości za pomocą analizy western blot.</li>
</ol>
3. Definiowanie zakresu liniowego analizy QDB
<ol>
	<li>Rozpuścić białko wzorcowe za pomocą ddH2O. Rozcieńczyć białko do stężenia 1 200 pg/μL.</li>
	<li>Rozcieńczyć skoncentrowane białko z przygotowanych próbek w sekcji 1,4-4 μg/μl.</li>
	<li>Rozpuścić BSA za pomocąddH2O. Rozcieńczyć białko do stężenia 1,200 pg/μL i 4 μg/μL.</li>
	<li>Serię rozcieńczeń białka wzorcowego i przygotowanych próbek przygotowano zgodnie z wytycznymi zawartymi w Tabelach 1 i 2.</li>
	<li>Wymieszać ze sobą 10 μl rozcieńczonego białka wzorcowego lub przygotowanych do rozcieńczenia próbek i 10 μl 2x bufor ładujący (120 mM Tris-HCl pH 6,8, 20% glicerol, 4% SDS, 0,2% błękit bromfenolowy, 200 mM DTT).</li>
</ol>
<tabela dla:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>S1 
			(0pg/μl)</td>
			<td>S2 (33,3 pg/μl)</td>
			<td>S3 
			(100pg/μl)</td>
			<td>S3 
			(300 pg/μl)</td>
			<td>S5 
			(600 pg/μl)</td>
			<td>S6 
			(1200 pg/μl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standardowe białko (1200 pg / μl)</td>
			<td>0</td>
			<td>Pytanie 1,39</td>
			<td>Rozdział 4.17</td>
			<td>Rozdział 12,5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td> Rozdział
		</tr>
		<tr>
			<td>Wolne od IgG BSA 
			(4pg/μl)</td>
			<td>50</td> Rozdział
			<td>Lokal mieszkalny 48,61</td> pkt.
			<td>Z numerem 45,83</td> pkt.
			<td>37,5</td> pkt.
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>łączny</td>
			<td>50</td> Rozdział
			<td>50</td> Rozdział
			<td>50</td> Rozdział
			<td>50</td> Rozdział
			<td>50</td> Rozdział
			<td>50</td> Rozdział
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Schemat rozcieńczania dla krzywej białka standardowego.
<tabela dla:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>X1 
			(0μg/μl)</td>
			<td>X2 
			(0,25 μg/μl)</td>
			<td>X3 
			(0,5 μg/μl)</td>
			<td>X4 
			(1μg/μl)</td>
			<td>X5 
			(2μg/μl)</td>
			<td>X6 
			(4 μg/μl)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Próbka (4 μg / μl)</td>
			<td>0</td>
			<td>Pytanie 3,125</td>
			<td>Godzina 6,25</td>
			<td>Rozdział 12,5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td> Rozdział
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA wolne od IgG (4 μg / μl)</td>
			<td>50</td> Rozdział
			<td>46.875</td> TGL
			<td>Lokal z numerem 43,75</td>
			<td>37,5</td> pkt.
			<td>25</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>łączny</td>
			<td>50</td> Rozdział
			<td>50</td> Rozdział
			<td>50</td> Rozdział
			<td>50</td> Rozdział
			<td>50</td> Rozdział
			<td>50</td> Rozdział
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. Schemat rozcieńczania dla przygotowanych próbek
<ol start="6">
	<li>Podgrzewać mieszaniny w temperaturze 85 °C przez 5 minut.</li>
</ol>
4. Proces analizy QDB
<ol>
	<li>Przykładowa aplikacja
	<ol>
		<li>Podeprzyj płytkę QDB, aby spód płyty nie dotykał powierzchni stołu. Na przykład użyj pustego pudełka na końcówki do pipet jako podpory.</li>
		<li>Załadować do 2 μl próbki do środka membrany na dnie pojedynczej jednostki płytki QDB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Suszenie talerza
	<ol>
		<li>Pozostawić załadowaną płytkę QDB na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) lub alternatywnie pozostawić załadowaną płytkę w temperaturze 37 °C na 15 minut w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie płyty
	<ol>
		<li>Zanurz płytkę QDB w buforze transferowym (0,039 M glicyna, 0,048 M Tris, 0,37% SDS, 20% alkohol metylowy) i delikatnie potrząsaj płytką przez 10 s.</li>
		<li>Delikatnie opłucz płytkę QDB trzykrotnie TBST (sól fizjologiczna buforowana trisem, 0,1% Tween 20), a następnie myj płytkę przez 5 minut w TBST pod ciągłym wstrząsaniem.</li>
		<li>Zablokować płytkę QDB buforem blokującym (5% mleka beztłuszczowego w TBST (100 μL/basenik) na 1 godzinę przy ciągłym wstrząsaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał pierwotnych
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze blokującym w wybranym stężeniu (od 1:500 do 1:5 000) i dodać 100 μl do każdego pojedynczego dołka zwykłej płytki 96-dołkowej. Włożyć płytkę QDB do płytki 96-dołkowej i inkubować połączone płytki przez 2 godziny w temperaturze suchej lub przez noc w temperaturze 4 °C przy ciągłym wstrząsaniu.</li>
		<li>Alternatywnie, należy umieścić płytkę QDB w pudełku i wypełnić pudełko buforem blokującym 2 do 3 mm powyżej części membranowej płytki, jeśli to samo przeciwciało jest używane na całej płytce. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe o wybranym stężeniu i inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C, stale wstrząsając.</li>
		<li>Delikatnie opłucz płytkę TBST trzy razy, a następnie umyj ją TBST trzy razy, za każdym razem przez 5 minut pod ciągłym wstrząsaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubacja przeciwciał wtórnych
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym w wybranym stężeniu (od 1:1 000 do 1:50 000) i podwielokrotnie 100 μl/basenik na płytkę 96-dołkową lub w pudełku opisanym w sekcji 4.4.2, a następnie inkubować płytkę QDB wewnątrz załadowanej płytki 96-dołkowej lub pudełka przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej pod ciągłym wytrząsaniem.</li>
		<li>Delikatnie opłucz płytkę QDB 3 razy za pomocą TBST, a następnie umyj płytkę 3 razy, po 5 minut za pomocą TBST pod ciągłym wstrząsaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacji
	<ol>
		<li>Przygotuj ulepszony substrat chemiluminescencyjny (ECL), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Podwielokrotny substrat ECL umieścić na płytce 96-dołkowej (100 μl/studzienkę) i włożyć płytkę QDB do płytki 96-dołkowej na 2 minuty pod ciągłym wstrząsaniem.</li>
		<li>Wyjmij płytkę QDB z płytki 96-dołkowej i krótko wstrząśnij, aby usunąć nadmiar płynu. Umieścić płytkę na białej płytce do mikromiareczkowania.</li>
		<li>Włącz czytnik mikropłytek i wybierz "płytkę z pokrywą" w interfejsie użytkownika przed umieszczeniem połączonych płytek (płytka QDB + adapter białej płytki) w czytniku mikropłytek w celu ilościowego określenia. 
		nuta: Upewnij się, że używasz białej, nieprzezroczystej płytki do mikromiareczkowania jako adaptera, aby uniknąć jakichkolwiek zakłóceń ze strony płytki. Upewnij się, że wybrałeś "płytkę z pokrywą", aby uniknąć zakleszczenia maszyny, gdy połączone płytki (płytka QDB + adapter płytki 96-dołkowej) są umieszczone w czytniku mikropłytek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+proteins+from+gels+to+diazobenzyloxymethyl-paper+and+detection+with+antisera%3A+a+method+for+studying+antibody+specificity+and+antigen+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).</li>
<li>Burnette, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Western+blotting%22%3A+electrophoretic+transfer+of+proteins+from+sodium+dodecyl+sulfate--polyacrylamide+gels+to+unmodified+nitrocellulose+and+radiographic+detection+with+antibody+and+radioiodinated+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">"Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A.</a> Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Uhlen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proposal+for+validation+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A proposal for validation of antibodies.</a> Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).</li>
<li>Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dot-immunobinding+assay+for+monoclonal+and+other+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies.</a> Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).</li>
<li>Engvall, E., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay+%28ELISA%29.+Quantitative+assay+of+immunoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22G.+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin.</a> G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).</li>
<li>Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-linked+immunosorbent+assay.+II.+Quantitative+assay+of+protein+antigen%2C+immunoglobulin+G%2C+by+means+of+enzyme-labelled+antigen+and+antibody-coated+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes.</a> Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).</li>
<li>Paweletz, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+phase+protein+microarrays+which+capture+disease+progression+show+activation+of+pro-survival+pathways+at+the+cancer+invasion+front%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front.</a> Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).</li>
<li>Tibes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+phase+protein+array%3A+validation+of+a+novel+proteomic+technology+and+utility+for+analysis+of+primary+leukemia+specimens+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).</li>
<li>Solier, C., Langen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-based+proteomics+and+biomarker+research+-+current+status+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations.</a> Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).</li>
<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+dot+blot+analysis+%28QDB%29%2C+a+versatile+high+throughput+immunoblot+method%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method.</a> Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).</li>
</ol>

Autorzy Yunyun Zhang, Wenfeng Zhang i Jiandi Zhang są pracownikami firmy Zestern Biotechniques, która produkuje płytki QDB używane w tym artykule. Wenfeng Zhang i Yunyun Zhang deklarują konflikt interesów, a Jiandi Zhang złożył wnioski patentowe. Pozostali twierdzą, że nie mają sprzecznych interesów.

Spośród wszystkich obecnie dostępnych technik analizy immunologicznej białek, z wyjątkiem ELISA, analiza QDB jest jedyną metodą pozwalającą osiągnąć bezwzględną zawartość określonego białka na poziomie komórkowym i tkankowym w formacie o wysokiej przepustowości. Chociaż spektrometria mas ze stabilnym izotopem jest w stanie osiągnąć bezwzględną kwantyfikację kilku białek, metoda ta nie jest jeszcze zaprojektowana z myślą o wysokiej przepustowości. W tym badaniu pokazaliśmy proces analizy QDB w celu uzyskania bezwzględnego określenia poziomu białka CAPG w tkankach myszy, w tym nerkach, śledzionie i prostacie. Stwierdzono, że poziomy CAPG wynoszą od 200 do 360 pg/g w tkankach nerkowych myszy, od 460 do 650 pg/g w śledzionie myszy i od 330 do 390 pg/g w tkankach prostaty myszy.
W porównaniu z ELISA, analiza QDB wymaga minimalnego wysiłku, aby została opracowana w zwykłym laboratorium. Po pierwsze, płytka QDB jest oparta na membranie nitrocelulozowej w celu wyeliminowania etapu powlekania w ELISA. Po drugie, analiza QDB wymaga tylko jednego zamiast dwóch specyficznych przeciwciał w teście ELISA typu sandwich. Po trzecie, wysoka zdolność wiązania membrany nitrocelulozowej w porównaniu z powierzchnią płytki ELISA pozwala również membranie wytrzymać rygorystyczne etapy mycia, zwykle stosowane w analizie immunoblot w celu zmniejszenia zakłóceń tła. Ta funkcja jest bardzo przydatna w analizie skomplikowanych lizatów przygotowanych z komórek i tkanek. Natomiast ze względu na stosunkowo niską zdolność wiązania płytek ELISA, redukcja tła podczas analizy skomplikowanych lizatów komórkowych i tkankowych staje się prawdziwym wyzwaniem w procesie rozwojowym.
Analizę QDB można łatwo zastosować w dowolnym laboratorium z dostępem do określonego przeciwciała. Należy jednak wspomnieć, że specyficzność przeciwciała jest terminem względnym, ograniczonym przez czynniki, w tym gatunek, typy tkanek i typy komórek. Jak pokazano na rysunku 1A, przeciwciało CAPG jest specyficzne podczas analizy lizatu z nerki, śledziony i prostaty myszy, a mimo to staje się niespecyficzne podczas analizy wątroby myszy. W rzeczywistości rutynowo stwierdzaliśmy, że jedno przeciwciało jest specyficzne dla jednego typu tkanki, ale nie zawsze jest specyficzne dla innego typu tkanki tego samego gatunku. W związku z tym konieczna jest wcześniejsza analiza western blot, aby zapewnić specyficzność analizy QDB. W rzeczywistości względna swoistość przeciwciała może być przyczyną fałszywych wyników często związanych z analizą ELISA, ponieważ bez względu na to, ile wysiłku firma produkcyjna mogła włożyć, aby zapewnić specyficzność testu, nie może wyczerpać wszystkich możliwych typów próbek, które użytkownicy mogą zdecydować się na analizę przy użyciu swoich produktów ELISA.
Podobnie jak w przypadku wszystkich testów immunologicznych, potencjalnym problemem związanym z metodą analizy QDB jest brak spójności jakości komercyjnego przeciwciała. Nawet jeśli używana jest pozorna jakość przeciwciała tej samej firmy (ten sam numer katalogowy itp.), mogą wystąpić duże różnice między zakupami ze względu na zmienność między partiami. W związku z tym, o ile nie zostanie osiągnięte pełne zaufanie do jakości dostępnego przeciwciała, ważne jest, aby przy każdym zakupie ponownie scharakteryzować przeciwciało.
Podsumowując, podajemy tutaj szczegółowy protokół i przykład użycia metody analizy QDB w celu uzyskania bezwzględnego ilościowego określenia określonego białka na poziomie tkankowym. Pokazujemy, że metoda analizy QDB jest wygodnym narzędziem dla każdego, kto jest zainteresowany wysokoprzepustową, ilościową analizą immunoblotów. Jej zdolność do osiągnięcia bezwzględnego określenia zawartości określonego białka na poziomie komórkowym i tkankowym również odróżnia tę technikę od tradycyjnych technik immunoblot. Cecha ta pozwala na łączenie i porównywanie wyników z wielu analiz, co jest niezbędne zwłaszcza w badaniach populacyjnych większych populacji, oraz realizację odpowiednich badań asocjacyjnych na poziomie białek w najbliższej przyszłości.

Wraz z ekscytującymi postępami w badaniach genomicznych w ostatnich latach, w dziedzinie badań biomedycznych obserwuje się również znaczący postęp w badaniach proteomicznych. Wraz z rosnącą akumulacją danych biologicznych zarówno na poziomie genomicznym, jak i proteomicznym, wykorzystanie narzędzi bioinformatycznych do analizy tych danych stało się przedmiotem badań biomedycznych w dającej się przewidzieć przyszłości. W związku z tym sukces badań bioinformatycznych zwiększa zapotrzebowanie na większą i lepszą jakość danych ze strony społeczności badaczy biologicznych i biomedycznych, a zadanie to można osiągnąć tylko dzięki postępowi technologicznemu na poziomie genomicznym i proteomicznym.
Spektrometria mas (MS) i analiza immunoblot to obecnie dwie dominujące techniki analizy białek. Stwardnienie rozsiane zdominowało badania proteomiczne w ostatnich latach, umożliwiając jednoczesną analizę tysięcy pojedynczych białek. Z drugiej strony techniki oparte na immunoblocie, w tym western blot i dot blot, również odegrały znaczącą rolę w badaniach nad białkami nawet od czasu ich wynalezienia1,2,3,4,5. Test immunoenzymatyczny (ELISA)5,6,7 i mikromacierz białek z odwróconą fazą (RPPM)8,9 można uznać za wysokoprzepustowy format analizy immunoblot. Jednak wszystkie te metody testów immunologicznych, z wyjątkiem ELISA, mierzą względny poziom ekspresji określonego białka. Względny charakter tych metod stanie się prawdziwym problemem dla badań populacyjnych, ponieważ analiza musi być wykonywana w tym samym czasie, co uniemożliwia jakiekolwiek wysiłki zmierzające do zwiększenia wielkości puli poprzez wielokrotne analizy. Co więcej, wyniki tych badań są tylko częściowo ilościowe, co komplikuje wszelkie wysiłki bioinformatyczne w zakresie analizy danych. Tymczasem, mimo że test ELISA doskonale nadaje się do wysokoprzepustowej analizy bezwzględnej próbek białek, technika ta wydaje się spełniać wyzwania w złożonych środowiskach, takich jak komórki lub tkanki, ze względu na niską zdolność wiązania i multipleksowanie10.
Opracowaliśmy metodę immunoblot odpowiednią do badań populacyjnych o kluczowych cechach wygody, wysokiej przepustowości, ilościowej i odpowiedniej do bezwzględnego oznaczania zawartości białka, i nazwaliśmy tę technikę ilościową analizą punktową (QDB)11. W tym badaniu przedstawiamy szczegółowy protokół analizy QDB i demonstrujemy metodę, określając bezwzględną zawartość białka w określonym białku, CAPG, w trzech różnych tkankach myszy, w tym nerkach, śledzionie i prostacie. Uważamy, że ten szczegółowy protokół dobrze ilustruje wykonalność i wygodę tej metody oraz dostarcza wskazówek, jak uniknąć potencjalnych pułapek w praktyce tej metody.

<table><tbody><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Tecan</td><td>Tecan Infinite 200 PRO</td><td></td></tr><tr><td>QDB płytka</td><td>Yantai Zestern Co.Ltd</td><td></td><td>Płytki są dostępne na żądanie w celu weryfikacji za pośrednictwem poczty elektronicznej lub odwiedzając www.zestern.net.</td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min x bov, ck, gt, GP, sy hms, hrs, hu, ms, rat, shp sr prot)</td><td>jackson</td><td>&nbsp; 711-035-152</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże o podwyższonej chemiluminescencji</td><td>Thermo</td><td>32134</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-CAPG&nbsp;</td><td>Sino Biologic Inc</td><td>14213-T52</td><td></td></tr><tr><td>Białko CAPG</td><td>Sino Biologic Inc</td><td>14213-HNAE</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Tianjin Ruiji Jin Special Chemical Co., Ltd</td><td>10461220</td><td></td></tr><tr><td>Mgcl2</td><td>Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>20120802</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884-500G</td><td></td></tr><tr><td>Test medycyny chińskiej EGTA</td><td>Sigma BNN1913</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2P2O7</td><td>Haituo</td><td>20160914</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G7757</td><td></td></tr><tr><td>fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>pepstatyna Sigma</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>Z290033</td><td></td></tr><tr><td>leupeptyna</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>aprotynina</td><td>Sigma</td><td>A3428</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T6455</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L5750-500G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B-0126</td><td></td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>S7920</td><td></td></tr></tbody></table>

wysoka przepustowość, bezwzględne oznaczanie zawartości wybranego białka na poziomie tkankowym za pomocą ilościowej analizy igłowej (qdb)

High Throughput, Absolute Determination of the Content of a Selected Protein at Tissue Levels Using Quantitative Dot Blot Analysis (QDB)

Brak wygodnej, ilościowej, wysokoprzepustowej metody immunoblot do bezwzględnego określania zawartości określonego białka na poziomie komórkowym i tkankowym znacznie hamuje postęp w badaniach proteomicznych. Wyniki uzyskane za pomocą obecnie dostępnych technik immunoblot są również względne, co uniemożliwia jakiekolwiek próby łączenia niezależnych badań z analizą próbek białek na dużą skalę. W tym badaniu demonstrujemy proces ilościowej analizy igłowej (QDB) w celu uzyskania bezwzględnej kwantyfikacji w formacie o wysokiej przepustowości. Korzystając z dostępnego na rynku wzorca białkowego, jesteśmy w stanie określić bezwzględną zawartość białka aktynowego capping, żelsolinopodobnego (CAPG) w próbkach białkowych przygotowanych z trzech różnych tkanek myszy (nerki, śledziony i prostaty) wraz ze szczegółowym wyjaśnieniem szczegółów eksperymentalnych. Proponujemy analizę QDB jako wygodną, ilościową, wysokoprzepustową metodę immunoblot bezwzględnej kwantyfikacji poszczególnych białek na poziomie komórkowym i tkankowym. Metoda ta znacząco pomoże w walidacji biomarkerów i weryfikacji ścieżek w różnych obszarach badań biologicznych i biomedycznych.

Oznaczenie bezwzględnej ilości dowolnego białka, w tym białka CAPG w tkance mysiej, wymaga zastosowania zarówno specyficznego przeciwciała, jak i oczyszczonego białka jako standardu. Przed przeprowadzeniem jakiejkolwiek analizy na szeroką skalę należy również ustalić zakres liniowy analiz zarówno dla standardu białka, jak i dla lizatów. Zakres liniowy przeciwciała jest silnie uzależniony od samego przeciwciała, a odpowiedni zakres rozcieńczeń specyficznego przeciwciała musi zostać zweryfikowany przez każdego użytkownika indywidualnie.
W pierwszej kolejności określono swoistość przeciwciała przeciwko CAPG w tkankach nerki, śledziony i prostaty myszy, wykorzystując analizę western blot z kontrolą negatywną (BSA wolne od IgG) oraz kontrolą pozytywną (komercyjnie dostępnego białka CAPG) (Rycina 1A). Przeciwciało anty-CAPG wykazało swoistość wobec lizatów śledziony, serca, mięśni i prostaty myszy (wykryto jeden prążek). W lizatach nerki i wątroby zaobserwowano prążki nieswoiste. Jednak w lizacie nerki prążki nieswoiste były znacznie słabsze od prążka swoistego, co sugeruje, że przeciwciało nadaje się do analizy tkanki nerkowej. Następnie, za pomocą dwóch równoległych krzywych dawkowej, wyznaczono zakres liniowy standardu białka oraz ilość lizatów do analizy. Komercyjnie dostępne białko CAPG poddano rozcieńczeniom seryjnym zgodnie z Tabelą 1, opierając się na wcześniejszych doświadczeniach, a lizaty tkanek nerki, śledziony i prostaty myszy rozcieńczono w zależności od ilości całkowitego białka w lizatach, określonej za pomocą zestawu do oznaczania całkowitego białka BCA. Dwa badania dawkowe przeprowadzono równolegle i przedstawiono wspólnie na Rycini 1B. Odpowiednią ilość lizatów nerki, śledziony i prostaty myszy wybrano na podstawie sygnałów QDB zmierzonych czytnikiem mikropłytek w jednostkach arbitralnych. Oryginalne odczyty dla tego eksperymentu przedstawiono w Tabeli 3.
W ostatnim kroku seryjnie rozcieńczony standard białka CAPG oraz lizaty z nerki, śledziony i prostaty myszy zostały naniesione na płytkę QDB. W tym przypadku zdecydowaliśmy się na naniesienie 0,3 µg/próbkę dla lizatów z nerki i śledziony myszy oraz 1 µg/próbkę dla analizy lizatów z prostaty myszy, ponieważ przy tych poziomach odczyt QDB był co najmniej 20-krotnie wyższy od tła, pozostając jednocześnie w zakresie liniowym analizy opartej na krzywej dawka-odpowiedź dla obu lizatów oraz standardu białka. Płytka została poddana opisanemu protokołowi QDB, a następnie poddana bezpośredniej kwantyfikacji za pomocą czytnika mikropłytek. Wykorzystując seryjnie rozcieńczone oczyszczone białko CAPG, mogliśmy wyznaczyć krzywą dawka-odpowiedź, równanie oraz R2 za pomocą prostej analizy regresji z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania (np. Microsoft Office Excel). Sygnały QDB z lizatów nerek, śledzion i prostat myszy przeliczono na bezwzględną ilość białka CAPG w tych lizatach, korzystając z wyznaczonego równania, a wyniki skorygowano o całkowitą ilość białka (w tym przypadku 0,3 µg dla lizatów ze śledzion i nerek myszy oraz 1 µg dla lizatów z prostaty myszy), aby uzyskać końcowe stężenie białka CAPG w tych tkankach wyrażone jako pg/µg. Wyniki przedstawiono na Rysunku 1C, a oryginalne odczyty podano w Tabeli 4.
<img alt="Analiza białka CAPG; Western blot, wykres testu luminescencyjnego, wykres stężeń w tkankach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56885/56885fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Reprezentatywny wynik analizy QDB w celu oznaczenia bezwzględnych poziomów CAPG w trzech tkankach myszy (nerce, śledzionie i prostacie). A. Badanie specyficzności przeciwciała króliczego anty-CAPG z wykorzystaniem lizatów tkanek mysich przygotowanych ze śledziony, serca, mięśnia, nerki, wątroby i prostaty za pomocą analizy western blot z kontrolą negatywną (BSA wolna od IgG) i kontrolą pozytywną (komercyjnie dostępnym białkiem CAPG). B. Wyznaczenie zakresu liniowego analiz QDB przeciwciała króliczego anty-CAPG z wykorzystaniem lizatów przygotowanych z prostaty, nerki, śledziony oraz oczyszczonego standardu rekombinowanego białka CAPG. Wyniki stanowią średnią z trzech powtórzeń. C. Bezwzględne oznaczenie poziomów CAPG w lizatach przygotowanych z nerek, śledzion i prostat myszy. Każdy słupek reprezentuje jedną tkankę od poszczególnej myszy. Wyniki stanowią średnią z trzech powtórzeń. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/56885/56885fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela z wynikami oznaczania ilości białka; poziomy CAPG w różnych lizatach, wraz z analizą statystyczną." src="/files/ftp_upload/56885/56885table3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Tabela 3"> 
Tabela 3: Wyniki z czytnika mikropłytek z badań zależności dawka-odpowiedź z wykorzystaniem seryjnie rozcieńczonych, połączonych lizatów z śledzion, nerek i prostat myszy oraz oczyszczonego rekombinowanego białka CAPG.
<img alt="Tabela stężeń białka CAPG, porównująca próbki z nerki, śledziony i prostaty; zawiera średnią, odchylenie standardowe i zmianę krotności." src="/files/ftp_upload/56885/56885table4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Tabela 4">
Tabela 4: Wyniki z czytnika mikropłytek z analizy QDB bezwzględnego poziomu CAPG w nerkach myszy (8), śledzionach (4) i prostatach (5) z użyciem rekombinowanego białka CAPG jako standardu.

Tutaj demonstrujemy szczegółowy proces ilościowej analizy punktowej (QDB) poprzez określenie bezwzględnej zawartości docelowego białka, białka aktynowego capping, gelsolin-like (CAPG), w trzech różnych tkankach myszy. Demonstrujemy wysokoprzepustową, wygodną, ilościową technikę immunoblot do walidacji biomarkerów na poziomie komórkowym i tkankowym.

Wysoka przepustowość, bezwzględne oznaczanie zawartości wybranego białka na poziomie tkankowym za pomocą ilościowej analizy igłowej (QDB)

Lacking a convenient, quantitative, high throughput immunoblot method for absolute determination of the content of a specific protein at cellular and ...

Metodę tę można nazwać ELISA na poziomie tkankowym, aby zdystansować się od tradycyjnego względnego, półilościowego oznaczania zawartości białka na poziomie komórkowym i tkankowym, co jest obecnie normą w laboratorium badawczym i w diagnostyce klinicznej. Główne zalety tej techniki można opisać w trzech słowach: wysoka przepustowość, ilościowa i bezwzględna. Gdybyśmy mieli dodać jeszcze jedno słowo, byłoby to proste.Implikacje tej techniki rozciągają się na dziedzinę proteomiki, podczas gdy weryfikacja biomarkerów może być realizowana w formacie wysokoprzepustowym. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w dziedzinie badań i klinicznych. Kwantyfikacja ilości białka na poziomie komórkowym i tkankowym jest obecnie nadal prymitywna.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, nie będą miały problemu z nauczeniem się tej techniki, jest ona dość podstawowa i wymaga minimalnych umiejętności laboratoryjnych. Cieszymy się, że możemy zademonstrować jego niezawodność, prostotę i dokładność techniki przy użyciu modelu zwierzęcego. Próbki można przygotować dowolną tradycyjną metodą przygotowania próbki przy użyciu dowolnych do lizy powszechnie stosowanych w laboratorium badawczym z detergentem lub bez, takiego jak MP40 lub Triton X.In naszym przypadku używamy buforu do lizy Triton X.Umieść plasterek tkanki o wielkości od pięciu do 100 miligramów w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj 200 mikrolitrów buforu do lizy uzupełnionego inhibitorami proteazy i fosfatazy. Następnie homogenizuj tkankę za pomocą homogenizatora przez jedną minutę na lodzie.Następnie odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 8 000 razy g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zebrać supernatant do nowych probówek i wyjąć jeden mikrolitr w celu zmierzenia całkowitej ilości białka w lizacie białkowym za pomocą zestawu do oznaczania białka, takiego jak test BCA. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie zmierzyć absorbancję przy 562 nanometrach na czytniku mikropłytek.Na tym etapie, używając rekombinowanego białka o znanym stężeniu jako wzorca, rozcieńczyć białko do stężenia 12 000 pikogramów na mikrolitr jako roztwór podstawowy. W międzyczasie rozcieńczyć lizaty przygotowanej próbki do czterech mikrogramów na mikrolitr. Aby uzyskać bardziej wiarygodne wyniki, zalecamy użycie mieszaniny lizatów próbek, aby uniknąć jakichkolwiek różnic między poszczególnymi próbkami.Równomiernie rozcieńczyć zarówno białko wzorcowe, jak i przygotowane próbki do typowego badania dawki. BSA uzupełniono, aby zapewnić mniej więcej równe ilości białka załadowanego dla każdej próbki. Następnie wymieszaj 10 mikrolitrów seryjnie rozcieńczanego standardowego białka lub lizatów próbki z 10 mikrolitrami buforu ładującego 2X.Następnie podgrzewaj mieszaninę w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez pięć minut. W tej procedurze należy umieścić puste pudełko z końcówkami do pipet pod płytką QDB, aby spód płytki nie dotykał powierzchni stołu. Załaduj do dwóch mikrolitrów próbki do środka membrany na dnie pojedynczej jednostki płytki QDB.Nigdy nie pozwól, aby spód płyty QDB dotykał jakiejkolwiek powierzchni podczas ładowania i nie obciążaj zbyt mocno dla poszczególnych studni. Z naszego doświadczenia wynika, że nie więcej niż cztery mikrolitry na studzienkę. Następnie pozostaw załadowaną płytkę QDB na godzinę w temperaturze pokojowej lub pozostaw załadowaną w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 15 minut w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.Aby zablokować płytkę, zanurz płytkę QDB w buforze transferowym i delikatnie potrząsaj nią przez 10 sekund. Następnie delikatnie opłucz płytkę QDB trzykrotnie TBST, a następnie myj płytkę przez pięć minut w TBST pod ciągłym wstrząsaniem. Następnie zablokuj płytkę QDB buforem blokującym na jedną godzinę pod ciągłym potrząsaniem.Teraz rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w buforze blokującym w wybranym stężeniu i dodać 100 mikrolitrów do każdego pojedynczego dołka zwykłej 96-dołkowej płytki. Włożyć płytkę QDB do płytki 96-dołkowej i inkubować połączone płytki przez dwie godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod ciągłym wstrząsaniem. Następnie delikatnie spłucz płytkę TBST trzy razy, a następnie umyj ją TBST trzy razy za każdym razem przez pięć minut pod ciągłym wstrząsaniem.Następnie rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w buforze blokującym o wybranym stężeniu i podsycić 100 mikrolitrów do każdej studzienki 96-dołkowej płytki. Następnie inkubować płytkę QDB wewnątrz załadowanej płytki 96-dołkowej przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej pod ciągłym wstrząsaniem. Delikatnie opłucz płytkę QDB trzy razy za pomocą TBST, a następnie umyj płytkę trzy razy po pięć minut, każdy z TBST pod ciągłym potrząsaniem.W celu oceny ilościowej należy przygotować substrat ECL i podzielić go na 96-dołkową płytkę w ilości 100 mikrolitrów na studzienkę. Następnie włóż płytkę QDB do płytki 96-dołkowej na dwie minuty pod ciągłym potrząsaniem. Następnie wyjmij płytkę QDB z płytki 96-dołkowej i krótko wstrząśnij, aby usunąć nadmiar płynu.Następnie umieścić płytkę na białej płytce do mikromiareczkowania. Następnie włącz czytnik mikropłytek i wybierz płytkę z pokrywą na interfejsie użytkownika przed umieszczeniem połączonych płytek w czytniku mikropłytek w celu określenia ilościowego. Upewnij się, że wybierasz płytę z pokrywą, aby uniknąć błędów.Rysunek ten przedstawia swoistość króliczego przeciwciała anty-CAPG przy użyciu lizatów tkanek myszy przygotowanych ze śledziony, serca, mięśni, nerek, wątroby i prostaty z analizą western blot. Zdefiniowano liniowy zakres analizy QDB króliczego przeciwciała anty-CAPG przy użyciu lizatów przygotowanych z prostaty, nerek, śledziony oraz przy użyciu oczyszczonego rekombinowanego wzorca białka CAPG. Wyniki były średnią z trzech powtórzeń.Pokazane jest tutaj bezwzględne wyznaczenie poziomów CAPG w lizatach przygotowanych z mysich nerek, śledziony i prostaty. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech do 24 godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o użyciu z góry określonego specyficznego przeciwciała dla całej procedury.Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza biostatystyczna, w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, które można uzyskać tylko poprzez bezwzględny pomiar zawartości poszczególnych białek na poziomie komórkowym lub tkankowym. Od czasu jej opracowania, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami proteomicznymi do zbadania przypuszczalnego związku biomarkerów białkowych z różnymi chorobami na poziomie populacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić analizę QDB w formacie o wysokiej przepustowości.Nie zapominaj, że praca z tkankami ludzkimi lub zwierzęcymi może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak używanie rękawiczek.

high-throughput-absolute-determination-content-selected-protein-at

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Ten film demonstruje ilościową technikę punktowej plamy (QDB) do bezwzględnej kwantyfikacji interesujących białek w próbce tkanki. Białka w próbce są unieruchomione na membranie nitrocelulozowej wewnątrz studzienek płytki QDB. Wykorzystując przeciwciała specyficzne dla białka docelowego znakowane enzymem peroksydazy, substrat chemiluminescencyjny jest utleniany w celu wytworzenia światła, które jest mierzone w celu określenia stężenia białka w próbce.

Ilościowa plama punktowa w celu oszacowania docelowych białek w lizacie tkankowym

Film demonstruje technikę western blottingu opartą na normalizacji całkowitego białka do ilościowego określania docelowej ekspresji białka w próbce. Wykorzystując całkowite barwienie białka w próbce, przeprowadza się analizę ratiometryczną w celu określenia względnego poziomu ekspresji białka docelowego.

Ilościowe Western Blot w celu oszacowania poziomów ekspresji białka

Postęp western blottingu za pomocą fluorescencji pozwolił na wykrycie subtelnych zmian w ekspresji białek, umożliwiając analizy ilościowe. W tym miejscu opisujemy solidną metodologię wykrywania szeregu białek w różnych gatunkach i typach tkanek. Zapewniona jest również strategia przezwyciężania typowych problemów technicznych.

Przewodnik po nowoczesnym ilościowym fluorescencyjnym Western Blotting ze strategiami rozwiązywania problemów

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

Przedstawiamy protokół do dokładnego oznaczania ilościowego białek za pomocą znakowania izobarycznego, intensywnego frakcjonowania, narzędzi bioinformatycznych i etapów kontroli jakości w połączeniu z chromatografią cieczową połączoną ze spektrometrem masowym o wysokiej rozdzielczości.

Głębokie profilowanie proteomu za pomocą znakowania izobarycznego, rozległej chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i kwantyfikacji wspomaganej programowo

Ogniskowanie izoelektryczne kapilarne to oparta na przeciwciałach, ultraczuła, wysokoprzepustowa technika, umożliwiająca szczegółową charakterystykę białek i ich izoform z bardzo małych próbek biologicznych. Poniżej opisano protokół wykrywania i oznaczania ilościowego określonych białek i ich izoform w sposób zautomatyzowany i zrobotyzowany.

Wysoce czułe i ilościowe wykrywanie białek i ich izoform metodą kapilarnego ogniskowania izoelektrycznego

Ta metoda opisuje solidne i powtarzalne podejście do porównywania poziomów białek w różnych tkankach i w różnych punktach czasowych rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego podejścia western blotting.

Solidne porównanie poziomów białka w tkankach i podczas całego rozwoju przy użyciu standaryzowanego ilościowego Western blotting

Opisujemy niedawno opracowaną platformę testów immunologicznych opartą na zasadach bezkomórkowej biologii syntetycznej i technice dot-blot do konfigurowalnego wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych.

Bezkomórkowa plama punktowa jako praktyczna i elastyczna platforma testów immunologicznych do wykrywania odpowiedzi przeciwciał w surowicach ludzkich i zwierzęcych

Interakcja między kanałami HCN a ich podjednostką pomocniczą została zidentyfikowana jako cel terapeutyczny w dużym zaburzeniu depresyjnym. W tym artykule przedstawiono opartą na polaryzacji fluorescencyjnej metodę identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów tej interakcji białko-białko.

Metoda identyfikacji małocząsteczkowych inhibitorów oddziaływania białko-białko między HCN1 i TRIP8b

Poznaj metodę ilościowej analizy igłowej (QDB) do bezwzględnego oznaczania białek w tkankach myszy. Technika ta umożliwia szybką, niezawodną walidację biomarkerów w badaniach proteomicznych.

Wysoka przepustowość, bezwzględne oznaczanie zawartości wybranego białka na poziomie tkankowym za pomocą ilościowej analizy igłowej (QDB) (Wideo) | JoVE Journal

Wysoka przepustowość, bezwzględne oznaczanie zawartości wybranego białka na poziomie tkankowym za pomocą ilościowej analizy igłowej (QDB)

Przeglądaj więcej filmów