Name: Usprawniony protokół różnicowania móżdżku 3D z opcjonalną modyfikacją 2D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj uproszczony protokół różnicowania móżdżku 3D z komórek macierzystych hPSC. Ta metoda umożliwia generowanie linii komórkowych móżdżku w układach 2D i 3D do badań nad chorobami mózgu u dzieci.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni Gerbren Jacobs i Jurjen Broeke za ich fachową pomoc techniczną, Prisce Leferink za przyczynienie się do stworzenia i scharakteryzowania dwóch linii kontrolnych iPSC, oraz Lisie Gasparotto za demonstrację naszych procedur.

<ol><li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells Dev. 19, 1745-1756 (2010).</li>
<li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. , Chapter 1, Unit 1H 5 (2012).</li>
<li>Su, H. L., Muguruma, K., Matsuo-Takasaki, M., Kengaku, M., Watanabe, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebellar+neuron+precursors+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebellar neuron precursors from embryonic stem cells.</a> Dev Biol. 290, 287-296 (2006).</li>
<li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2997-3002 (2007).</li>
<li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed%2C+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain--hindbrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain--hindbrain development.</a> Trends Genet. 12, 15-20 (1996).</li>
<li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otx2%2C+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Curr Opin Cell Biol. 12, 736-741 (2000).</li>
<li>Tam, E. W. Y., Benders, M. J. N. L., Heine, V. M. Cerebellar Development-The Impact of Preterm Birth and Comorbidities. <a target="_blank" href="https://elsevier.ca/product.jsp?isbn=9780323352147">Fetal and Neonatal Physiology</a>. , 5th ed, (2017).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Rep. 10, 537-550 (2015).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12, 671-678 (2015).</li>
<li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6, 402-406 (2017).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Cooper, M. K., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Hedgehog+signaling+by+direct+binding+of+cyclopamine+to+Smoothened%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Hedgehog signaling by direct binding of cyclopamine to Smoothened.</a> Genes Dev. 16, 2743-2748 (2002).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14071-14076 (2002).</li>
<li>Dahmane, N., Ruiz-i-Altaba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+regulates+the+growth+and+patterning+of+the+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum.</a> Development. 126, 3089-3100 (1999).</li>
<li>Borghesani, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+stimulates+migration+of+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BDNF stimulates migration of cerebellar granule cells.</a> Development. 129, 1435-1442 (2002).</li>
<li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18, 736-748 (2016).</li>
<li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+axial+polarity%2C+inside-out+layer+pattern%2C+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 20284-20289 (2013).</li>
<li>Englund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax6%2C+Tbr2%2C+and+Tbr1+are+expressed+sequentially+by+radial+glia%2C+intermediate+progenitor+cells%2C+and+postmitotic+neurons+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pax6, Tbr2, and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex.</a> J Neurosci. 25, 247-251 (2005).</li>
<li>Warlich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vector+design+and+imaging+approaches+to+visualize+the+early+stages+of+cellular+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming.</a> Mol Ther. 19, 782-789 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Złożoność i koszty są istotnymi czynnikami dla badaczy komórek macierzystych przy wyborze lub opracowywaniu protokołów różnicowania. Jest to szczególnie prawdziwe, ponieważ otwartym pytaniem jest, jak duża zewnętrzna kontrola jest wymagana do wytworzenia pożądanych typów komórek lub – ujmując to inaczej – jak kompetentne są hPSC w wytwarzaniu własnego środowiska rozwojowego, jeśli pozostawi się je samym sobie z wystarczającą ilością składników odżywczych. Wprowadzenie czynników zewnętrznych in vitro może z powodzeniem doprowadzić do powstania pożądanych produktów komórkowych, ale może również zakłócać wewnętrzne zdolności rozwojowe, które komórki wykazywałyby in vivo. Takie rozważania są ważne, zwłaszcza jeśli celem jest wykorzystanie iPSC pochodzących od pacjentów do modelowania choroby. Szerokie stosowanie wzorców i/lub czynników wzrostu może maskować fenotypy choroby. Protokoły wyszczególnione w tym raporcie są zgodne z trendem poprzednich badań w celu zmniejszenia złożoności, kosztów i/lub wykorzystania zewnętrznych czynników wzorcowych 8,9.
Opierając się na wynikach przedstawionych przez Mugurumę i wsp., oraz na naszym niedawnym badaniu, wydaje się, że możliwe jest osiągnięcie różnicowania w kierunku losów móżdżku bez wspólnych wysiłków w celu rozmnażania się w warunkach in vivo, jak to miało miejsce we wcześniejszych badaniach 1,2,3,4,8,10 . Intrygujące jest to, że w obu badaniach stosowano różne zestawy czynników wzrostu, co sugeruje, że żaden z nich nie był konieczny, chociaż oba wykorzystywały FGF2. Przeprowadziliśmy dodatkowe testy, w których FGF zostały selektywnie wykluczone z protokołu i wykazaliśmy, że komórki były zdolne do wytwarzania tych samych produktów bez zewnętrznych FGF10. Różnice między naszymi badaniami zostały sprecyzowane przez fakt, że zastosowaliśmy różne linie hPSC i metody hodowli, indukowaliśmy różnicowanie neuronalne za pomocą RZS oraz włączyliśmy składniki wspomagające przeżycie i dojrzewanie komórek ziarnistych (BDNF, GDNF, SAG i KCL)11-14. Ponadto zastosowano mniej złożoną metodę uruchamiania w porównaniu z Mugurumą i wsp. Ich protokół rozpoczął się od wygenerowania jednolitych EB w 96WP, które odizolowały je fizycznie i chemicznie od siebie. W tym przypadku protokół zakładał, że wszystkie PSC są stosunkowo stłoczone razem w 6WP podczas tworzenia EB, co pozwalało im na swobodną interakcję. W jaki sposób mogło to w różny sposób wpłynąć na fizyczne i chemiczne środowisko EB i późniejszych organoidów (w tym na wewnętrzną produkcję związków sygnałowych), nie jest znane i można je zbadać. Ponadto, chociaż wykazujemy ekspresję genów związanych z pochodzeniem móżdżkowym, a więc sugerujących ich pochodzenie, zlokalizowanych w strukturach morfologicznie podobnych do tych opisanych przez Mugurumę i wsp., nie możemy wykluczyć generowania struktur podobnych do neuronów, które są identyczne niż móżdżek. Przyszłe badania, wykorzystujące duży panel przeciwciał, takich jak te zgłoszone przez Mugurumę i wsp. (tj. ATOH1, CALB, itp.) sprawi, że takie przypisania i porównanie między iloczynami obu protokołów będą bardziej przekonujące.
W ramach protokołu 3D ważne jest, aby rozpocząć i utrzymać wystarczającą liczbę komórek w hodowli, aby zapewnić wystarczającą liczbę produktów końcowych do analizy. Biorąc pod uwagę znaczne wymieranie na wczesnym etapie protokołu, zalecamy rozpoczęcie od ponad 500 EB / studzienkę w ciągu pierwszych 3 dni w hodowli (ryc. 1). Nie powinno to być trudne do osiągnięcia, biorąc pod uwagę rozmiary kolonii hPSC w hodowli wolnej od karmienia, ale może nie być tak łatwe dla tych, którzy nadal stosują metody zależne od karmienia. Biorąc pod uwagę dużą liczbę komórek, ważne jest, aby zwracać uwagę na zmianę koloru podłoża (wskazującą na zmiany pH) i nagromadzenie martwych komórek. Oba muszą zostać skorygowane, aby zapobiec upadkowi kultury. Może również dojść do zlepiania się komórek i agregatów w masywne struktury. Chociaż nadal może to skutkować agregatami, które można analizować, ilość produktu zostanie znacznie zmniejszona, więc podzielenie ich na mniejsze agregaty z delikatnym rozcieraniem może być przydatne. Należy jednak unikać zakłócania normalnych agregatów, które same mogą urosnąć do dużych rozmiarów (rysunek 4). Jeśli kruszywa stają się zbyt rzadkie, zaleca się łączenie studni, aby kruszywa nie były całkowicie odizolowane. Zmienność produktu (pod względem liczby, wielkości i morfologii) jest dobrze znanym problemem w hodowli komórkowej 3D, w tym w przypadku protokołów rozpoczynających się od izolowanych, jednolitych etapów tworzenia EB, co sugeruje, że mniej złożona procedura uruchamiania (taka jak protokół opisany tutaj) może być bardziej praktyczna 8,15. Chociaż ta heterogeniczność jest czymś, o czym naukowcy muszą pamiętać, szczególnie podczas analizy, zgłoszony protokół wygenerował produkty zgodne z tymi, które można znaleźć w innych protokołach 3D 8,9,15. Opierając się na wielkości i morfologii, mieszczą się w zakresie rozety nerwowej do organoidu mózgowego, jak opisano w niedawnym przeglądzie Kelava i Lancaster15, z najbardziej odpowiednią klasyfikacją sferoidy. Szczególnie godna uwagi jest obecność struktur 3D sugerujących rozety nerwowe ze światłem, strefami (pod)komorowymi i cechami rombowo-wargowymi (ryc. 5 i ryc. 6), zidentyfikowanymi przez inne grupy 8,15,16,17. Ponieważ w każdym eksperymencie uzyskano co najmniej jeden agregat z przypuszczalnymi VZ/SVZ i markerami związanymi z móżdżkiem (ZIC1, KIRREL2), są to przydatne kryteria do określenia sukcesu różnicowania 3D przy użyciu naszego protokołu, z funkcjami podobnymi do RL zapewniającymi dodatkowe wsparcie. Wydłużenie długości hodowli powyżej 35 dni nie zostało przetestowane, ale można je było kontynuować w celu określenia maksymalnego zakresu wzrostu, złożoności i dojrzałości dozwolonego przez tę technikę.
Protokół 2D wykorzystuje ten sam proces tworzenia i indukcji neuronalnej, co protokół 3D, a więc powyższe uwagi również mają zastosowanie. Po platerowaniu należy wziąć pod uwagę inny zestaw rozważań. EB powinny szybko przylegać, aby komórki mogły rozprzestrzeniać się na zewnątrz na płytkę. W przypadku problemów z przestrzeganiem zaleceń lekarskich można zastosować dodanie RI (jeśli nie zostało już użyte), zmniejszenie objętości pożywki lub eksperymentalne zmiany w stężeniu PLO/LAM. Ważne jest, aby komórki nie rosły zbyt gęsto lub rzadko (najlepiej hodowane między 20-80% zbieżności) w studzienkach; Ważne jest codzienne monitorowanie i terminowe przechodzenie, aby uniknąć nadmiernej konfluencji lub pływających komórek. W przeciwieństwie do protokołu 3D, podczas hodowli nie powinno dojść do znacznego wymierania, chociaż mogą istnieć obszary o słabym wzroście lub spowolnieniu tempa proliferacji. Pasażowanie wpływa na stan dojrzewania komórek (na przykład usuwanie procesów komórkowych i rozwiniętych sieci między komórkami) i należy o nim pamiętać podczas zbliżania się do punktów, w których komórki będą w jakiś sposób zbierane lub analizowane. Na przykład w przypadku obrazowania wapnia bardzo ważne jest, aby komórki przeszły między 2-6 dniami przed analizą. Przejście zbyt blisko analizy może oznaczać, że komórki nie miały czasu na połączenie i/lub dojrzewanie, a zbyt daleko może spowodować przepełnienie komórek, co utrudni obrazowanie. Chociaż mogą istnieć różnice między eksperymentami, wyniki są zgodne z tymi zgłoszonymi w początkowych protokołach móżdżku 2D 1,2. Barwienie ICC i analiza ekspresji genów potwierdzają obecność komórek dodatnich dla markera komórek ziarnistych ZIC1, jednocześnie identyfikując markery związane z innymi tożsamościami neuronalnymi i móżdżkowymi (Figura 7 i Figura 8). Obrazowanie wapnia, które polega na elektrycznej stymulacji komórek inkubowanych z barwnikiem fluor5, wykazało funkcjonalną aktywność neuronalną (ryc. 9, ryc. uzupełniająca 1 i ryc. uzupełniająca 2), chociaż nie potwierdzono, czy były to komórki ziarniste. Można się spierać, czy dając komórkom więcej czasu na dojrzewanie poprzez wydłużenie czasu trwania hodowli powyżej 35 dni, ilość funkcjonalnej aktywności neuronalnej powinna wzrosnąć. Potencjał ten może zostać wykorzystany w przyszłości.
Oprócz kierunków badań zasugerowanych powyżej, interesujące byłoby określenie różnic w tożsamości produktów (ilości i jakości) między protokołami 2D i 3D. Znaczenie zewnętrznych FGF nie zostało przetestowane w protokole 2D i warto byłoby wiedzieć, czy brak struktury 3D po posiewaniu, a więc związane z tym szlaki sygnałowe, sprawi, że kultury 2D będą mniej lub bardziej zależne od tych wczesnych związków wzorcowych. Bardziej uproszczone protokoły (np. brak RA, BDNF, SAG) są równie prawdopodobnymi liniami do dalszych badań. Wreszcie, przyszłe badania mogą skorzystać z nowych narzędzi badawczych, aby lepiej scharakteryzować (i ocenić wydajność generowania) specyficznych dla człowieka podtypów neuronów móżdżku.
Mając na uwadze podane zastrzeżenia, oba zgłoszone protokoły mogą być stosowane do różnicowania móżdżku, z produktami dostosowanymi do różnych celów. Mogą one służyć jako praktyczne punkty wyjścia dla badaczy prowadzących badania pilotażowe, testujące żywotność linii komórkowych pod kątem takich różnicowań, lub jako podstawowy model dla innych typów ukierunkowanego różnicowania neuronalnego.

Protokoły in vitro do różnicowania hPSC w kierunku linii móżdżku początkowo działały na zasadzie naśladowania rozwoju móżdżku in vivo1,2,3,4. W związku z tym wymagały one szeregu czynników wprowadzanych w określonym czasie, aby napędzać wzorce pro-móżdżku i dojrzewanie. Najważniejsze z nich to WNT, białka morfogenetyczne kości (BMP) i czynniki wzrostu fibroblastów (FGF) o znanych rolach w rozwoju środkowej części tyłomózgowia i tworzeniu organizatora przesmyku5,6,7. Oczywiście, każdy dodatkowy krok i czynnik oznacza wzrost pracochłonnych manipulacji i większe koszty dla badacza, a więc opracowanie prostszych protokołów zdolnych do osiągnięcia równych wyników jest interesujące. Ta praktyczna kwestia dobrze zazębia się z hipotetycznym pytaniem, czy komórki wymagają tak ścisłej, zewnętrznej kontroli nad swoim rozwojem in vitro.
Dla różnicowania móżdżku, protokół opublikowany w 2015 roku dotyczył konieczności użycia dużej liczby czynników wzrostu przy użyciu tylko FGF2, FGF19 i czynnika 1 pochodzącego z komórek zrębu (SDF1) do celów modelowania8. Badanie to różniło się również od wcześniejszych protokołów móżdżku, wykorzystując swobodnie unoszący się system hodowli 3D. Oprócz wytwarzania komórek dodatnich dla markerów móżdżku, wykazano, że "organoidy" mózgowe wygenerowane przez ich technikę wykazują odpowiednią morfologię, niedostępną w tradycyjnych kulturach jednowarstwowych 2D, takich jak rombowe struktury przypominające wargi. Chociaż jest to mniej skomplikowane i kosztowne w odniesieniu do czynników wzrostu, inne cechy, takie jak tworzenie jednolitych ciał zarodkowych (EB) i hodowla na 96-dołkowych płytkach (96WP), sprawiły, że na początkowych etapach było to skomplikowane proceduralnie. Inny protokół 3D, opublikowany w tym samym roku, donosił o udanym różnicowaniu do linii nerwowych przy użyciu powszechnych i niedrogich technik hodowli komórkowych9. Chociaż grupa ta badała różnicowanie kory mózgowej, a nie móżdżku, nie można było wykluczyć zastosowania ich koncepcji różnicowania móżdżku.
Niedawno opisaliśmy protokół różnicowania móżdżku 3D przy użyciu zmniejszonej liczby czynników wzorcowych (mianowicie FGF2, 4 i 8), a także uproszczoną konfigurację poprzez utrzymywanie komórek na płytkach 6-dołkowych (6WP) przez cały czas, aby zminimalizować wymagania dotyczące podłoża10. Aby wspomóc produkcję komórek ziarnistych, podczas końcowego etapu dojrzewania zastosowano wygładzonego agonistę (SAG). SAG jest tańszą chemiczną alternatywą dla sonic hedgehog (SHH), która była stosowana we wcześniejszych protokołach móżdżku, ze względu na jej rolę w promowaniu wzrostu prekursorów komórek ziarnistych (GCP) in vivo1,2,11,12,13. Produkty różnicowania były zgodne z tymi z innych protokołów 3D, w tym z obecnością markerów związanych z móżdżkiem w morfologicznie istotnych strukturach8,9. Takie wyniki wzmacniają wcześniejszą wiadomość, że szczegółowa mimikra środowiska in vivo może nie być konieczna w przypadku złożonych protokołów różnicowania 3D in vitro.
Oprócz protokołu 3D, ten raport opisuje protokół 2D, zaprojektowany z tą samą szybką konfiguracją, podstawowymi materiałami i zmniejszoną liczbą czynników wzrostu. Jest zdolny do wytwarzania komórek z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), dodatnich dla markerów związanych z wczesną tożsamością komórek nerwowych, móżdżku i ziarnistości. Ponadto obrazowanie wapnia wskazuje na obecność funkcjonalnych neuronów ludzkich. Możliwość wyboru między protokołami zwiększa poziom elastyczności dla badaczy, dla osób zainteresowanych: (1) generowaniem określonych typów komórek, (2) modelowaniem rozwoju ludzkiego mózgu i powiązanych struktur, (3) analizą zoptymalizowaną w ustawieniach jednowarstwowych (np. nagrania patch-clamp) lub (4) interakcjami komórka-komórka w mieszanych kulturach neuronowych. Ich prosty i tani charakter sprawia, że są one dostępne dla badaczy, którzy są nowicjuszami w dziedzinie hPSC lub potrzebują podstawowych procedur hPSC, na podstawie których mogliby zbadać dalsze opcje różnicowania.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12+Glutamax</td><td>Gibco</td><td>31331-028</td><td>wzmocniony glutaminą DMEM/F12</td></tr><tr><td>Pożywka neurobazalna</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>pożywka neuronowa</td></tr><tr><td>Podłoże N2 suplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplement</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Imgen</td><td>PT468-B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>beta-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Ornityna</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Poly (2-hydroksyetylometakrylan)</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td>aka Poly-Hema</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>E8 pożywka i suplement</td><td>Gibco</td><td>A1517001</td><td>hPSC pożywka i suplement</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>y-27632 (inhibitor ROCK)</td><td>SelleckChem</td><td>S1049-10mg</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Gibco</td><td>A1413302</td><td>Powłoka adherentna odpowiednia dla hPSC (PAAC)</td></tr><tr><td>0,5M EDTA</td><td>Gibco</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 0,2 um</td><td>VWR</td><td>28145-77</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL rurka Eppendorf</td><td>VWR</td><td>525-0130</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>83804360</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>PM996</td><td>owijka do </td></tr><tr>płytki<td>hodowlane krioprobówki</td><td>ThermoFisher</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12563-029</td><td>środek dysocjacyjny na bazie trypsyny</td></tr><tr><td>Zdefiniowany inhibitor trypsyny (DTI)</td><td>Gibco</td><td>R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>FGF-4</td><td>R& D Systems</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>FGF-8B</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>Neurotroficzny czynnik glejowy</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Neurotroficzny Czynnik 3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>Wygładzony agonista (SAG)</td><td>Cayman</td><td>11914</td><td>CAS 912545-86-9</td></tr><tr><td>Mikroskop Axiovert 40C</td> Mikroskop obrazowania <td>Zeiss</td><td></td><td>Brightfield</td></tr><tr><td>Axiocam</td><td>Obrazowanie Zeiss</td><td></td><td>Brightfield - akwizycja obrazu</td></tr><tr><td>Wirówka Eppendorf 5810</td><td>Eppendorf</td><td>521-0996</td><td>wirówka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>PBS (gebufferde natrium oplossing)</td><td>Braun Medical</td><td>3623140</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipety serologiczne</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipety serologiczne</td><td>VWR</td><td>612-4951</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki hodowlane</td><td>VWR</td><td>734-2323</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki</td> hodowlane <td>VWR</td><td>734-2324</td><td></td></tr><tr><td>hESC</td><td>WiCELL</td><td></td><td>linia H01</td></tr></tbody></table>

usprawniony protokół różnicowania móżdżku 3d z opcjonalną modyfikacją 2d

Streamlined 3D Cerebellar Differentiation Protocol with Optional 2D Modification

Zmniejszenie złożoności i kosztów protokołów różnicowania jest ważne dla badaczy. Zainteresowanie to wpisuje się w obawy dotyczące możliwych niezamierzonych skutków, jakie czynniki zewnętrznego wzorca mogą wprowadzić do modeli rozwoju mózgu lub patofizjologii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), takich jak maskowanie fenotypu choroby. W tym miejscu przedstawiamy dwa protokoły różnicowania móżdżku dla hPSC, zaprojektowane przy użyciu prostszej metody uruchamiania, mniejszej liczby czynników wzorcowych i mniejszych wymagań materiałowych niż poprzednie protokoły. Niedawno opracowaliśmy procedury hodowlane, które generują swobodnie unoszące się w powietrzu produkty trójwymiarowe (3D) zgodne z innymi protokołami "organoidowymi" mózgu, w tym morfologiami istotnymi dla modelowania rozwoju mózgu, takimi jak struktury podkomorowe i rombowe wargowe. Drugi wykorzystuje przylegającą, jednowarstwową procedurę 2D w celu całkowitego różnicowania, która jest zdolna do generowania funkcjonalnych neuronów móżdżku, ponieważ produkty są dodatnie dla markerów związanych z móżdżkiem i wykazują napływ wapnia podobny do neuronów. Razem protokoły te oferują naukowcom wybór opcji dostosowanych do różnych celów badawczych, a także podstawowy model do testowania innych rodzajów usprawnionych różnicowań neuronalnych.

Przegląd wizualny protokołów różnicowania móżdżku w 2D i 3D z ograniczoną ilością czynników wzrostu 
Rycina 1 przedstawia ogólną oś czasu dla protokołów różnicowania móżdżku w 2D i 3D, wskazując czynniki zewnętrzne oraz czas wysiewania. Typowy przebieg różnicowania móżdżku w 3D dla hPSC przedstawiono na Rycynie 2: linia hESC H01 rozpoczyna jako kolonie w hodowli bez karmideł w dniu 0 (lewa górna część ryciny); przechodzi w formację ciał embroidalnych (EB) do dnia 2 (środek u góry); przerasta w większe agregaty komórkowe z widocznym światłem po indukcji neuralnej z użyciem RA i FGF8 w dniu 14 (prawa górna część); tworzy agregaty o różnej wielkości i kształcie w dniu 28 (lewa dolna część); wykazuje wzrost złożoności z zaznaczonymi różnymi strukturami pojedynczego agregatu w dniu 28 (środek u dołu); oraz dalsze zmiany morfologiczne tych samych struktur w dniu 35 (prawa dolna część). Typowy przebieg różnicowania móżdżku w 2D dla hPSC przedstawiono na Rycynie 3: linia hESC H01 jako kolonie w hodowli bez karmideł w dniu 0 (lewa górna część ryciny, gdzie okrąg wskazuje obszar zróżnicowanych komórek wśród kolonii hESC); przechodzi w formację EB do dnia 2 (środek u góry); przerasta w większe agregaty komórkowe z widocznym światłem po indukcji neuralnej z użyciem RA i FGF8 w dniu 13 (prawa górna część); proliferuje jako komórki adherentne po wysiewaniu w dniu 14 (lewa dolna część); a następnie jako monowarstwa komórek o bardziej złożonej/dojrzałej morfologii w dniu 35 przy małym (środek u dołu) i dużym powiększeniu (prawa dolna część).
Produkty 3D wykazują markery i struktury wczesnego neuroepithelium 
Rycina 2 (obraz w dolnym lewym rogu) oraz Rycina 4 pokazują heterogeniczność morfologii agregatów 3D obserwowaną podczas hodowli, wynikającą z zróżnicowanego tempa wzrostu i/lub dojrzewania, a także stochastycznego łączenia się lub rozpadu agregatów. Pomimo heterogeniczności, każda różnicowanie prowadzi do powstania agregatów wykazujących wczesne markery neuralne i neuronalne, w tym marker ziarnistych komórek móżdżku ZIC1, co wskazują zabarwienia immunocytochemiczne (ICC) na Rycynie 5. Co ważniejsze, Rycina 5 oraz Rycina 6 sugerują, że prosta hodowla 3D, z ograniczoną ilością czynników wzrostu, jest w stanie generować agregaty o złożonych strukturach związanych z rozwojem mózgu, takich jak wczesne neuroepithelium i warga rombowa.
Produkty 2D wykazują markery móżdżkowe i funkcjonalną aktywność neuronalną 
Choć hodowle 2D nie mogą odtworzyć złożonych struktur 3D, są one zdolne do generowania komórek wykazujących wczesne markery neuralne i neuronalne, w tym marker komórek ziarnistych móżdżku ZIC1, co wykazano w barwieniu ICC na Rysunku 7. Analiza ekspresji genów za pomocą RT-PCR, przedstawiona na Rysunku 8, potwierdza wyniki barwienia ICC, choć obecność wczesnego markera komórek ziarnistych ATOH1 jest zmienna w zależności od eksperymentu i linii komórkowej. Obrazowanie wapnia jest łatwiejsze do przeprowadzenia w hodowli 2D. Jak pokazano na Rysunku 9, w Supplemental Video 1 oraz Supplemental Video 2, komórki stymulowane elektrycznie wykazują napływy wapnia typowe dla wzorców wyładowań neuronalnych, co sugeruje powstanie funkcjonalnych neuronów.
<img alt="Schemat osi czasu rozwoju neurologicznego; traktowania FGF2, FGF8; podłoża poly-HEMA, PLO/LAM." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Oś czasu protokołu różnicowania (począwszy od dnia 0 różnicowania). Ramki z linią ciągłą wskazują momenty dodawania konkretnych czynników do pożywki hodowlanej, a ramki z linią przerywaną wskazują powlekanie płytek w ramach opcjonalnej modyfikacji 2D. W przypadku FGF2 strzałka w dół odnosi się do niższych stężeń (4 ng/mL), a strzałka w górę do wyższych stężeń (20 ng/mL). Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Holmesa i Heine10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, obrazy mikroskopowe z okresu 35 dni, etapy rozwoju komórkowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy w światle przechodzącym z protokołu 3D. Kolonie hESC w d0, ciałka embryoidalne (EB) w d2, agregaty po indukcji w d14, agregaty o różnej wielkości i morfologii (oznaczone numerami 1-5) w d28, pojedynczy agregat z unikalnymi, identyfikowalnymi cechami (oznaczonymi literami a-c) w d28 oraz widoczne zmiany w tych samych cechach w d35. Pasek skali = 100 µm. Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Holmes i Heine10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, dni 0 do 35, obrazy mikroskopowe, etapy rozwoju komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy w jasnym polu dla protokołu 2D. Kolonie hESC w d0, ciała embroidalne (EBs) w d2, agregaty po indukcji w d13, po wysianiu agregatów w d14, po dojrzewaniu w d35, widoczne przy powiększeniu 5x oraz powiększeniu 20x. Białe koło na panelu w lewym górnym rogu wskazuje obszar zróżnicowanych komórek wśród kolonii hESC. Pasek skali = 50 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Kolonie hESC vs hiPSC w czasie; obraz mikroskopowy pokazujący wzrost komórek w d8 i d35 do celów badawczych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obrazy w polu jasnym pokazujące różnice w wielkości i złożoności w hodowli 3D. Agregaty w dniu (A) 8 (hESCs) oraz (B) d35 (hiPSCs). Ten drugi obraz składa się z trzech oddzielnych zdjęć, aby ukazać cały agregat. Oba agregaty mogły zostać objęte procesem łączenia się mniejszych agregatów lub utratą (odłamaniem) struktur. Pasek skali = 200 µm. Rycina została przedrukowana z pracy Holmes i Heine10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencja tkanki nerwowej, markery DAPI, PAX6, TBR2, DCX, NeuN, KIRREL2, ZIC1, mikroskopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Obrazy ICC produktów 3D ukazują istotne markery i struktury. W 35. dniu hodowli produkty 3D wykazują: PAX6 (zielony) i TBR2 (czerwony) w świetle formacji przypominających rozetki neuralne (pierwszy rząd); DCX (zielony) i NeuN (czerwony) rozprzestrzeniające się z zewnętrznej krawędzi struktury przypominającej strefę komorową (VZ) (drugi rząd); KIRREL2, marker związany z neuroepitelium móżdżku (trzeci rząd, lewo); oraz ZIC1, marker związany z komórkami ziarnistymi móżdżku (trzeci rząd, prawo). Eksperyment przeprowadzono wielokrotnie przy użyciu czterech różnych linii hPSC: linii hESC H01 (n = 5) oraz linii iPSC hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3) i hvs51 (n = 1). Strzałki wskazują strukturę przypominającą wargę rombową (RL). Pasek skali = 100 µm. Rycina ta została ponownie opublikowana z pracy Holmes i Heine10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Immunofluorescencja organoidu mózgu, markery PAX6/TBR2/DAPI, obraz mikroskopowy, badania nad komórkami macierzystymi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Wielkoskalowa struktura przypominająca strefę komorową w produkcie 3D. W 35. dniu hodowli agregat pochodzący z hESC wykazuje pozytywną reakcję na PAX6 (zielony) i TBR2 (czerwony), które są powszechnie kojarzone z wczesnymi neuronami występującymi in vivo w strefach komorowych (VZ) i podkomorowych (SVZ). (Góra) Gwiazdka (*) oznacza stronę apikalną regionu przypominającego VZ, przebiegającego wzdłuż krawędzi agregatu, a nawiasy wskazują głębokość/podział VZ/SVZ. (Środek) Nałożone sygnały pokazują rozproszone sekcje komórek PAX6+/TBR2-, których wielkość zwiększa się w kierunku górnego prawego końca VZ. (Dół) Obraz o większym powiększeniu sekcji zaznaczonej prostokątem na środkowym panelu. Pasek skali = 100 µm. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Holmesa i Heine10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna różnicowania neuronalnego; hESC, hiPSC; markery ZIC1, TAG1; analiza komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Obrazy ICC produktów 2D wykazujące odpowiednie markery. W 35. dniu hodowli (d35) produkty 2D pochodzące z hESC (górny rząd) oraz hiPSC (dolny rząd) wykazują komórki pozytywne pod kątem: markera komórek ziarnistych ZIC1 i markera migrujących neuronów móżdżku TAG1 (lewa kolumna) oraz markera neuronalnego neurofilamentu (NF) i TAG1 (prawa kolumna). Pasek skali = 50 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig7large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza ekspresji białek, wyniki Western blot, porównanie hESC i hiPSC, markery ZIC1, ATOH1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: RT-PCR produktów 2D. Analiza ekspresji mRNA linii hESC H01 (górny rząd) oraz linii hiPSC hvs60 (dolny rząd) pod koniec protokołu 2D przedstawia produkty elektroforezy żelowej dla: markera komórek ziarnistych ZIC1, markera komórek ziarnistych ATOH1, markera migrujących neuronów móżdżku TAG1, markera komórek Purkinjego Calbindin (CALB), napięciowo zależnego kanału wapniowego CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), receptora GABA-B 1 (G-Br1) oraz genu pomocniczego EIF4G2).
<img alt="Napływ wapnia do hESC przy stymulacji 10 Hz; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej i wyniki na wykresie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56888/56888fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Obrazowanie/analiza wapnia w produktach 2D. W 35. dniu hodowli produkty różnicowania hPSC rejestrowano pod mikroskopem przez 2 min po inkubacji z barwnikiem fluor5. W 30. sekundzie komórki stymulowano elektrycznie przez 10 s z częstotliwością 10 Hz. (A) Statyczne obrazy przedstawiają hESC w 0 s (po lewej) oraz po rozpoczęciu stymulacji elektrycznej w 30. sekundzie (po prawej). Strzałki wskazują obszar zainteresowania (ROI) do analizy napływu wapnia. (B) Analiza graficzna pokazująca zmianę względnej fluorescencji w czasie dla ROI (zmiana fluorescencji = (F-F0)/F0, gdzie F0 = (∑F1-n)/n), z pikami o charakterze neuronalnym występującymi przed, w trakcie i po stymulacji. Czarny pasek oznacza czas trwania stymulacji elektrycznej. Pasek skali (biały) = 50 µm. Pełne nagrania dla hESC (widoczne tutaj) oraz linii hiPSC (niepokazane) są dostępne odpowiednio w Supplementary Video 1 oraz Supplementary Video 2. Nagrania są w formacie AVI, w 4-krotnym przyspieszeniu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56888/56888fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Wideo uzupełniające 1: Obrazowanie wapnia w produkcie 2D z linii hESC H01. W 35. dniu hodowli produkty różnicowania z linii hESC H01 rejestrowano przez 2 min pod mikroskopem, po inkubacji z barwnikiem fluor5. W 30 s komórki stymulowano elektrycznie przez 10 s z częstotliwością 10 Hz. Rejestrację prowadzono w tempie 2 klatek/s, a następnie przetworzono materiał do pliku wideo AVI z prędkością ~7 klatek/s, uzyskując film trwający ~30 s, przyspieszony około 4-krotnie. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS1_hESC_stim@10Hz.avi">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Wideo uzupełniające 2: Obrazowanie wapnia w produkcie 2D z linii hiPSC hvs51.W 35. dniu hodowli produkty różnicowania z linii hiPSC hvs51 rejestrowano przez 2 min pod mikroskopem, po inkubacji z barwnikiem fluor5. W 30. sekundzie komórki stymulowano elektrycznie przez 10 s z częstotliwością 10 Hz. Nagrania wykonano w tempie 2 klatek/s, a następnie przetworzono do formatu wideo AVI z prędkością ~7 klatek/s, co dało film o długości ~30 s, przyspieszony około 4-krotnie. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56888/figS2_hiPSC_stim@10Hz.avi">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Opisujemy uproszczony protokół różnicowania 3D dla hPSC, wykorzystujący zdefiniowane czynniki wzrostu pożywki i zredukowanej, zdolny do generowania agregatów komórkowych z wczesnymi strukturami neuroepitelicznymi i dodatni dla markerów związanych z móżdżkiem, a także opcjonalną modyfikację 2D do różnicowania komórek jako monowarstwę do generowania funkcjonalnych neuronów.

Usprawniony protokół różnicowania móżdżku 3D z opcjonalną modyfikacją 2D

Reducing the complexity and cost of differentiation protocols is important for researchers. This interest fits with concerns about possible unintended ...

Ogólnym celem tych kultur różnicujących jest wygenerowanie linii komórek móżdżku w środowiskach 2D lub 3D. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na podstawowe pytania dotyczące nowych osiągnięć lub mechanizmów chorobowych leżących u podstaw zaburzeń mózgu u dzieci przy użyciu komórek macierzystych pochodzących od pacjenta. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma proste uruchamianie i konserwację z niewielką liczbą czynników oraz że może być używana jako podstawa do testowania bardziej złożonych protokołów neuronowych. Procedurę zademonstruje Lisa, technik z mojego laboratorium. Aby ustawić różnicowanie za pomocą zmodyfikowanej metody G-metoda przechodzenia hPSC, przenieś wymaganą objętość pożywki podtrzymującej neurony do sterylnej probówki i uzupełnij 4 nanogramami na mililitr FGF2 i dziesięcioma inhibitorami skał mikromolowych. Następnie utrzymuj probówkę z pożywką w temperaturze pokojowej lub w łaźni wodnej o temperaturze 37

streamlined-3d-cerebellar-differentiation-protocol-with-optional-2d

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film opisuje metodę generowania wycinków tkanek z móżdżku myszy. Wycinki móżdżku mogą być używane do hodowli organotypowej, która zapewnia wgląd w mechanizmy neurorozwojowe, w tym dynamikę mielinizacji.

Rozwarstwienie móżdżku i przygotowanie plastrów: metoda generowania wycinków tkanek z móżdżku myszy

Ten film demonstruje protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w progenitorach móżdżku. Polega ona na przeniesieniu kolonii komórek macierzystych na bardzo niską płytkę przyczepową w celu utworzenia ciał zarodkowych, promowaniu różnicowania za pomocą czynników wzrostu, a następnie przeniesieniu ciał zarodkowych na płytkę pokrytą matrycą w celu adhezji. Kolejne kroki obejmują indukcję migracji komórek i dodanie pożywki do dojrzewania, aby kierować...

Technika generowania monowarstwy 2D komórek móżdżku z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Progenitorzy wyrażający nestynę to nowo zidentyfikowana populacja neuronalnych komórek progenitorowych w rozwijającym się móżdżku. Korzystając z przedstawionej tutaj techniki mikrodysekcji w połączeniu z sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencyjnie, ta populacja komórek może zostać oczyszczona bez zanieczyszczenia innymi obszarami móżdżku i może być hodowana do dalszych badań.

Izolacja odrębnych populacji komórek od rozwijającego się móżdżku za pomocą mikrodysekcji

Podczas rozwoju móżdżku po urodzeniu, niedojrzałe komórki ziarniste pochodzące ze strefy zarodkowej wykazują różne sposoby migracji, aby dotrzeć do miejsca docelowego i ustanowić sieci neuronowe. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków móżdżku i konfokalne podejście makroskopowe stosowane do badania czynników regulujących migrację neuronów.

Ex vivo Obrazowanie pourodzeniowej migracji komórek ziarnistych móżdżku za pomocą makroskopii konfokalnej

Białka otoczki jądrowej odgrywają kluczową rolę w wielu podstawowych procesach biologicznych i są związane z różnymi chorobami ludzkimi.  Protokół ten opisuje nowy model myszy oparty na Cre/Lox, który pozwala na czasoprzestrzenną kontrolę zakłóceń kompleksów LINC.

Walidacja modelu mysiego w celu rozbicia kompleksów LINC w sposób specyficzny dla komórki

Tutaj prezentujemy metodę przygotowania organotypowych kultur warstwowych z barwienia móżdżku myszy i osłonki mielinowej za pomocą immunohistochemii, odpowiednią do badania mechanizmów mielinizacji i remielinizacji w ośrodkowym układzie nerwowym.

Przygotowanie i barwienie immunologiczne mielinizujących organotypowych kultur warstwowych móżdżku

Ten protokół opisuje dynamiczny system hodowli do produkcji kontrolowanych agregatów ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i dalszego stymulowania różnicowania w organoidach móżdżku w chemicznie zdefiniowanych warunkach i bez karmienia za pomocą jednorazowego bioreaktora.

Skalowalne generowanie dojrzałych organoidów móżdżku z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i charakterystyka za pomocą barwienia immunologicznego

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Obecny protokół wyjaśnia tworzenie monowarstwy 2D komórek móżdżku z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu zbadania wczesnych etapów rozwoju móżdżku.

Modelowanie rozwoju móżdżku człowieka in vitro w strukturze 2D

Prezentujemy trójwymiarowy (3D) protokół różnicowania in vitro, generujący neurosfery o powtarzalnych rozmiarach do produkcji komórek grzebienia nerwowego czaszki z embrionalnych komórek macierzystych myszy. Pokazujemy, że ta metodologia zmniejsza zmienność w porównaniu z poprzednimi protokołami i jak można ją wykorzystać do testu multipleksowego do badania rozwoju komórek grzebienia nerwowego czaszki.

Komórki grzebienia nerwowego czaszki Trójwymiarowy protokół różnicowania in vitro do testu multipleksowego

Poznaj uproszczony protokół różnicowania móżdżku 3D z komórek macierzystych hPSC. Ta metoda umożliwia generowanie linii komórkowych móżdżku w układach 2D i 3D do badań nad chorobami mózgu u dzieci.

Usprawniony protokół różnicowania móżdżku 3D z opcjonalną modyfikacją 2D

Przeglądaj więcej filmów