Komórki grzebienia nerwowego czaszki Trójwymiarowy protokół różnicowania in vitro do testu multipleksowego

Interesuje nas, w jaki sposób dana decyzja jest regulowana podczas tworzenia gry. Modele organoidowe i technologie jednocelomiczne pozwalają nam zadawać pytania, które wcześniej nie były możliwe. Wykorzystanie modeli organoidowych in vitro pozwala nam na wygenerowanie większej ilości danych, zwłaszcza w przypadku przejściowych populacji komórek, takich jak grzebień nerwowy.

Wyniki modelu znaczącej zmienności pozostają głównym wyzwaniem eksperymentalnym. Wykazaliśmy, że komórki grzebienia czaszki ponownie wyrażają geny prepotencji, aby rozszerzyć potencjał różnicowania. Na początek przygotuj świeży roztwór kolagenazy w stężeniu dwóch miligramów na mililitr w pożywce do nokautowania DMEM.

Odessać pożywkę ESC z płytki studzienkowej zawierającej od 70 do 80% zlewającego się mESC. Teraz delikatnie dodaj jeden mililitr PBS z boku studzienki. Rozbujaj talerz, aby zapewnić równomierne mycie.

Odpipetować PBS i zastąpić go dwoma mililitrami roztworu kolagenazy. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 do 45 minut. Sprawdź płytkę pod mikroskopem świetlnym w 10-krotnym powiększeniu po 20 minutach inkubacji, a następnie co pięć minut.

Gdy kolonie mają zwinięte krawędzie, mocno postukaj w stronę talerza, aby oderwać kolonie. Za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej zbierz oderwane kolonie i przenieś je do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów. Odwirować kolonie w temperaturze 16 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej.

Odessać jak najwięcej pożywki ze stożkowej rurki, nie naruszając kolonii na dnie. Następnie dodaj jeden mililitr 0,05% roztworu trypsyny do osadu i inkubuj. Za pomocą mikropipet P1000 i P200 energicznie pipetować zawiesinę w górę iw dół, aby dysocjować kolonie, a następnie dodać dwa mililitry pożywki hodowlanej mESC, aby zablokować trypsynę.

Odwirować probówkę o stężeniu 160 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Odpipetować supernatant, a następnie dodać jeden mililitr pożywki różnicującej CNCC. Policz komórki za pomocą automatycznego urządzenia do liczenia komórek lub pod mikroskopem, a następnie rozcieńcz komórki w pożywce różnicującej CNCC, aby osiągnąć stężenie 3 000 żywych komórek na 50 mikrolitrów.

Za pomocą mikropipety P200 wysiew 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdego dołka 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U bez TC. Uzupełnij każdą studzienkę do 200 mikrolitrów pożywką różnicującą CNC i inkubuj. Obserwuj płytkę zawierającą 24-godzinną hodowlę zróżnicowanych komórek pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że na dnie każdej studzienki widoczne są małe skupiska z wyraźnymi obwódkami.

Włóż płytkę z powrotem do inkubatora na noc. Drugiego dnia powoli usuń 100 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki. Następnie użyj mikropipety P200 z końcówką ściętą od trzech do czterech milimetrów od końca, aby zassać neurosfery wraz z pozostałym podłożem.

Przenieś neurosfery i pozostałą pożywkę na 96-dołkową płytkę płaskodenną bez TC. Sprawdź transfer pod mikroskopem świetlnym. Uzupełnij każdą studzienkę do 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża różnicującego CNCC.

Czwartego dnia odessać 100 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki. Zastąp go 100 mikrolitrami wstępnie podgrzanej pożywki różnicującej CNCC, a następnie ponownie inkubuj. W piątym i szóstym dniu sprawdź przyczepienie neurosfer pod mikroskopem świetlnym.

Upewnij się, że jaśniejsze komórki rozwarstwiające się z neurosfer zaczynają otaczać jego główne ciało. Przygotować pożywkę konserwacyjną CNC zgodnie z podanym składem. Przefiltrować albuminę surowicy bydlęcej przez filtr 0,22 mikrometra przed dodaniem jej do pożywki.

Po dodaniu czynników wzrostu przechowuj pożywkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do trzech tygodni, upewniając się, że jest chroniona przed światłem. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu fibronektyny do każdej studzienki 96-dołkowej płytki niepoddanej działaniu TC. Podczas gdy płytka spoczywa, należy zassać jak najwięcej pożywki różnicującej CNC z dołków płaskodennej 96-dołkowej płytki bez TC.

Zastąp pożywkę 50 mikrolitrami Accutase. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki konserwacyjnej CNCC do każdej studzienki, aby ugasić Accutase.

Usunąć fibronektynę z powlekanych studzienek płytki odbiorczej, a następnie przefiltrować odłączony pomigracyjny CNCC przez filtr 40 mikrometrów do dołków płytki odbiorczej. W żądanym momencie użyj mikropipety P200 z odciętą końcówką, aby przenieść neurosfery z 96-dołkowej płytki do nisko wiążącej DNA dwumililitrowej probówki.

Po pozostawieniu neurosfer w probówce na trzy minuty w temperaturze pokojowej, odpipetuj jak najwięcej pożywki, a następnie spłucz jednym mililitrem zimnego PBS. Aby przygotować komory montażowe, należy umieścić trzy warstwy dwustronnej przezroczystej taśmy bezwłóknistej na szkiełku mikroskopowym. Za pomocą brzytwy wytnij okienko o wymiarach trzy milimetry na osiem milimetrów w taśmie dwustronnej.

Pod stereoskopem, z końcówką naciętą P200, ostrożnie odpipetuj neurosfery w środku czyszczącym do komory montażowej. Użyj powiększeń od 2X do 4X, aby zapewnić pole widzenia całej komory i zidentyfikować neurosfery. Umieść szkiełko nakrywkowe na powierzchni komory i lekko dociśnij jego boki, aby go przykleić.

Kultury neurosfery na płytkach nietkankowych wykazywały jednolite przyczepy począwszy od piątego dnia, podczas gdy kultury na szalce Petriego wykazywały zmienne przyłączanie i fuzję neurosfer, szczególnie widoczne w czwartym dniu. Zmienność wielkości neurosfer była znacznie zmniejszona w 96-dołkowych kulturach płytkowych w porównaniu z kulturami na szalkach Petriego w czwartym i siódmym dniu. Średnica neurosfer w 96-dołkowych płytkach wahała się od 139 mikrometrów do 295 mikrometrów w czwartym dniu i od 383 mikrometrów do 552 mikrometrów w siódmym dniu, podczas gdy kultury na szalkach Petriego wykazywały szerszy zakres.

Wzrost neurosfery był wykładniczy pod względem liczby komórek, zwiększając się ze średnio 1082 komórek w drugim dniu do 48 352 komórek w dziewiątym dniu. Wzrost średnicy był liniowy, wzrastając ze średnio 136 mikrometrów w drugim dniu do 570 mikrometrów w dziewiątym dniu. Analiza immunofluorescencyjna potwierdziła, że neurosfery i komórki dewarstwujące wykazują ekspresję markerów CNCC AP2 alfa i SOX9 oraz markera EMT TWIST1 w dziewiątym i trzynastym dniu.

PAX7 był obecny tylko w neurosferach.