Funkcjonalizowana izolacja komórek docelowych na bazie drutów: technika ex vivo izolowania komórek rakowych z wzbogaconej krwi obwodowej

Cząsteczki adhezyjne komórek nabłonkowych lub EpCAM to powierzchniowe glikoproteiny transbłonowe, których nadmierna ekspresja występuje w szybko proliferujących komórkach nabłonkowych w rakach prostaty. Aby wyizolować komórki wykazujące ekspresję EpCAM, zacznij od drutu klasy medycznej z funkcjonalizowaną końcówką pokrytą złotem. Funkcjonalizacja polega na warstwach polimerowego żelu zawierającego kowalencyjnie związane przeciwciała specyficzne dla EpCAM.

Zanurz drut w obwodowej zawiesinie krwi zawierającej fluorescencyjnie znakowane komórki rakowe. Upewnij się, że funkcjonalizowana część pozostaje zanurzona w zawiesinie krwi. EpCAMy na komórkach nowotworowych rozpoznają i wiążą się z ich specyficznymi przeciwciałami funkcjonalizowanymi na przewodzie.

Umyj buforem, aby usunąć wszelkie niezwiązane komórki z powierzchni drutu. Zegnij drut i zamontuj go na szklanym szkiełku zawierającym bufor, z funkcjonalizowaną częścią zanurzoną w buforze. Użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby sprawdzić jasną fluorescencję z cytoplazmy i jąder komórkowych oraz potwierdzić obecność przechwyconych komórek na przewodzie.

Potraktuj drut buforem zwalniającym. Enzymy proteolityczne w buforze rozszczepiają żel polimerowy, uwalniając kompleksy przeciwciało-komórki rakowe do buforu. Odwirować zespół drutów, aby zebrać uwolnione kompleksy przeciwciało-komórki w osadzie. Usunąć drut i supernatant zawierający enzym. Zawiesić osad zawierający komórkę docelową w odpowiednim podłożu.

W 5 mililitrach krwi obwodowej dodaj około 500 do 500 000 komórek, a następnie wymieszaj, odwracając probówkę. Po wyjęciu drutu ze schowka zdejmij gumową nasadkę, która przytrzymuje drut i umyj drut w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem i zamontuj go w nasadce rurki. Następnie inkubować probówkę na przechylonym mieszadle rolkowym z prędkością 5 obrotów na minutę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji trzykrotnie przepłukać drut w 1x buforowanym fosforanem roztworze soli fizjologicznej. Następnie przechowuj drut w 15-mililitrowej probówce zawierającej 1x sól fizjologiczną buforowaną fosforanami w ciemności.

Narysuj prostokątny obszar na szkiełku za pomocą pisaka do smaru i dodaj do niego 500 mikrolitrów 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Aby zanurzyć funkcjonalną część drutu w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, zegnij niedziałającą część drutu i umieść ją na szklanym szkiełku. Aby policzyć liczbę przechwyconych komórek, sprawdź wzrokowo obie strony drutu. Po sprawdzeniu przenieś drut z powrotem do 15-mililitrowej probówki z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem i trzymaj w ciemności.

W 1 mililitrze 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem rozpuść 4 miligramy składnika buforowego o uwalnianiu. Następnie przefiltruj roztwór przez sterylny filtr o średnicy 0,2 mikrometra, aby uzyskać gotowy do użycia bufor. Następnie podgrzej bufor uwalniający w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 5 minut. Po podgrzaniu przenieś 1,6 mililitra buforu uwalniającego, aby całkowicie napełnić 1,5-mililitrową probówkę reakcyjną. Następnie inkubuj funkcjonalną część drutu w buforze uwalniającym w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 20 minut.

Po inkubacji umieść drut na wytrząsarce z prędkością 500 obrotów na minutę przez 15 minut. Następnie odwiruj drut o masie 300 x g przez 10 minut. Po zakończeniu wirowania należy wysunąć drut z probówki, zamknąć nakrętkę i ponownie odwirować probówkę o masie 300 x g przez 10 minut.

• Epithelial Cell Adhesion Molecules (EpCAMs) – Overexpressed in rapidly proliferating cells in prostate cancers.
• Free Floating Cancer Cells – Malignant cells in blood that have detached from a primary tumor.
• Cytocentrifugation Method – A procedure used to concentrate cells from a fluid sample.
• Functionalization – Process of equipping the wire with EpCAM-specific antibodies.
• Mccoy's 5a Medium Modified – A commercially available solution for culturing human cells.

• The EpCAMs are surface transmembrane glycoproteins overexpressed in rapidly proliferating epithelial cells (e.g., prostate cancer).
• These molecules bind to specific antibodies bound to a functionalized wire in a fluid suspension (e.g., cytocentrifugation method).
• A washing step removes unattached cells, leaving only the target cells bound to the wire (e.g., free floating cancer cells).
• The immersing and release process allows for the focus on the captured cells on the wire, and their subsequent collection.

• What is an EpCAM and how does it relate to prostate cancer and the isolation process?
• How does cytocentrifugation assist in concentrating the target cells?
• How does the wire's functionalization and release process work in terms of capturing and collecting cells?

• Isolating EpCAM-expressing cells for study can lead to advancements in cancer research (e.g., free floating cancer cells).
• Techniques like cytocentrifugation have numerous applications in cell biology and medical diagnostics (e.g., cytocentrifugation method).
• The process provides greater insights into the nature and behavior of cancers cells, potentially leading to more effective treatments (e.g., EpCAMs).
• Focused studies of such nature often lead to significant scientific advancements in cancer research and treatment.