Metoda optycznego obrazowania zgodna z mikroskopią skaningową do mezoskopowego mapowania mózgu w całych komórkach

Nasze badania koncentrują się na konektomice. Opracowujemy metody wysokoprzepustowego optycznego lub elektronowego pozyskiwania obrazów, umożliwiające analizę układów neurologicznych oraz cech łączności synaptycznych w celu rozszyfrowania podstawowej logiki połączeń obwodów neurologicznych. Oryginalna konektomika o wysokiej rewolucji ogranicza się do małych objętości mózgu ze względu na kosztowne pozyskiwanie danych, podczas gdy szybka analiza mikroskopowa i ukierunkowane badania mikroskopowe oferują potencjał dla konektomiki całego mózgu.

W porównaniu z innymi mikroskopowymi podejściami, takimi jak różne mikroskopy Larsena, OMLIT rejestruje obrazy wszystkich neuronów z informacją o dendrycie i aksonach. Poza kompatybilnością z mikroskopem elektronowym, istnieje także obrazowanie w nanoskali w zakresie EF. OMLIT pomaga budować kompleksowe modele mózgu, mapując wszystkie projekcje dalekiego zasięgu, w tym ich kierunek, siłę i typ, wraz z lokalnymi mikroobwodami w połączeniu z tematyką szeregową. Daje wgląd w strukturę architektury i przepływ informacji w całym mózgu.

Rozwijamy zautomatyzowane obrazowanie OMLIT oraz pozyskiwanie danych EM, kierowane przez RI definiowane przez OMLIT, umożliwiając efektywne zbieranie i analizę danych konektomicznych w dużych lub całych objętościach mózgu. Na początek wybierz albo film capton, albo D50 o grubości 50 mikrometrów, zamontowany na zmotoryzowanym systemie uzwojenia. Stosując podwójny system rozpylania magnetronu, naniesiemy na powierzchnię taśmy jednolitą, cienką warstwę chromu lub innych metali, takich jak aluminium, srebro czy miedź.

Ustaw taśmę w odległości 80 milimetrów od celu, który się wydziela. Proces wykonuj pod prądem stałym i przy ciśnieniu jednego paskala regulowanym przez 99,99% gazu argonowego. Teraz ustaw prędkość nawijania taśmy na 0,6 milimetra na sekundę, aby uzyskać grubość powłoki metalowej 50 nanometrów.

Po osadzeniu usuń taśmę z systemu, gdy ostygnie do temperatury pokojowej. Oceń grubość i jednolitość powłoki, używając profilera igłowego, mikroskopii siły atomowej lub skaningowej mikroskopii elektronowej. Dla strategii niskiej refleksyjności czyść i uczynić taśmę hydrofilową za pomocą filtra plazmowego o mocy 80 watów, poruszając taśmą z prędkością siedmiu milimetrów na sekundę.

Po zabiegu umieść krople wody na powierzchni taśmy, aby upewnić się, że szybko rozprzestrzeniają się w cienką warstwę. Używając małej szlifierki lub podobnego narzędzia tnącego, surowo przycinasz żywicę po stronie próbki, aby usunąć otaczającą żywicę i odsłonić obszar próbki. Umieść blok osadzony w żywicy w uchwycie próbki i dokręć go, aby mocno zabezpieczyć blok.

Zamontuj uchwyt próbki na ruchomym ramieniu mikrotomu. Zamontuj nóż szklany lub diamentowy nóż do przycinania pod kątem 45 stopni na uchwytie noża. Pod mikroskopem przytnij powierzchnię próbki do kształtu piramidy i wygładź ją, a następnie przytnij i wygładz cztery boki bloku próbki, aby usunąć nadmiar żywicy.

Obróć pokrętło, aby ustawić przednią i tylną krawędź bloku w pozycji poziomej. Wyjmij nóż do przycinania i załóż na nóż diamentowy, ustawiony pod kątem 45 stopni. Ustaw kąt nachylenia podstawy mikrotomu na sześć stopni i powoli przesuwaj uchwyt noża za pomocą pokrętła, aż przednia krawędź noża będzie o jeden do dwóch milimetrów od powierzchni próbki.

Obserwuj jasny pas między powierzchnią próbki a krawędzią noża i dostosuj kąt nachylenia tak, aby pas był równy od góry do dołu i na boki. Następnie wstrzyknij wodę destylowaną do rowka noża diamentowego, aby zwilżyć ostrze. Wyjmij trochę wody strzykawką, aż poziom płynu spadnie i odbicie stanie się srebrzyste.

Następnie ustaw grubość przekroju, prędkość cięcia i okno cięcia w jednostce sterującej. Dostosuj prędkość sekcjonowania do 0,6 milimetra na sekundę oraz grubość przekroju do 60 nanometrów, w zależności od jakości próbki. Zacznij sekcjonowanie mikrotomem.

Gdy zostaną uzyskane stabilne i jednolite przekroje, proces należy wstrzymać. Następnie użyj cienkiego pędzla, aby usunąć przecięte fragmenty i zanieczyszczenia. Teraz zamontuj zarówno szpulę taśmy powlekanej, jak i pustą szpulę nawijającą na automatycznym, ultracienkim systemie zbierania przekroju.

Zabezpiecz mechanizm blokujący i wykonaj próbny przebieg, aby potwierdzić płynny ruch taśmy przy stałej prędkości i prawidłowe zebranie na szpulę nawijającą. Zanurz głowicę zbiorczą urządzenia do zbierania taśmą w kąpieli wodnej noża diamentowego i ustaw głowicę tak, aby była równoległa do krawędzi noża, przy długości 1,5 długości fragmentu próbki. Zabezpiecz urządzenie do zbierania i wznowij sekcjonowanie, jednocześnie uruchamiając urządzenie do zbierania taśmy.

Po zebraniu wystarczającej liczby ciągłych przekrojów, należy wstrzymać sekcjonowanie. Przetnij taśmę w miejscu bez przekrojów. Uruchamiaj urządzenie do zbierania taśmy, aż cała taśma zostanie nawinięta na szpulę.

Następnie zdejmij szpulę i umieść ją w elektronicznym suszarniku. Wyczyść urządzenie do zbierania taśmy i mikrotom, a wszystkie akcesoria odłóż na właściwe miejsce. Aby zamontować na płytkach krzemowych, odklej przezroczystą folię ochronną z dwustronnej taśmy przewodzącej.

Taśmę należy nałożyć równolegle do dwustronnej taśmy przewodzącej, umieszczając do trzech segmentów taśmy na każdym kawałku. Umieść płytkę krzemową na scenie mikroskopu optycznego i zabezpiecz ją taśmą klejącą bez resztek. Użyj obiektywu z pięcioma X obiektywów, aby uzyskać obraz podsumowujący płytkę krzemową, taśmę i próbkę.

Na obrazie podglądowym zarysuj każdą sekcję i posortuj je, a następnie dodaj punkty ostrości i ekspozycji, aby wykonać automatyczne obrazowanie z powiększeniem 20 lub 50 X na całej wafli. Po zdjęciu zapisz zdjęcia i sprawdź ich jakość, ponownie ustawiając ostrość i ponownie obrazując, jeśli jakieś są nieostre lub słabej jakości. Zaimportuj stos obrazów TIFF do VAST 22, wybierając import, a następnie importuj volume obrazu z obrazów do pliku VSV.

Podłącz zewnętrzny tablet i użyj narzędzia pędzel oraz trybu rysowania segmentów, aby ręcznie segmentować i śledzić struktury. Użyj skrótów A i Z, aby nawigować między fragmentami obrazu. Teraz zwizualizuj fragmentowaną konstrukcję w trzech wymiarach, wybierając okno, następnie przegląd 3D, widok i aktualizację.

Na koniec zapisz wyniki segmentacji po wybraniu pliku i zapisz segmentację. W obrazach o wysokiej refleksyjności obszary lumenu cytoplazmatycznego i naczyniowego wykazywały wyższą intensywność w porównaniu z otaczającymi obszarami, podczas gdy w obrazach o niskiej refleksyjności obszary lumenu cytoplazmatycznego i naczyniowego wykazywały niższą intensywność. Ilościowe wyniki wykazały, że strategie o wysokiej i niskiej refleksyjności.

Każdy z nich miał zalety pod względem kontrastu i entropii informacji. Obrazowanie mikroskopem optycznym OMLIT umożliwiało identyfikację aksonów, naczyń krwionośnych, ciał komórkowych i dendrytów. Ręczna segmentacja obrazów omletowych z użyciem VAST pokazała liczne ściśle ułożone ciała komórek, dendryty i aksony.

Wyniki segmentowane zostały połączone z oryginalnym obrazem, aby uzyskać trójwymiarową wizualizację. Powiększone obrazy OMLIT wykazały niewystarczającą rozdzielczość, by odsłonić drobniejsze struktury. Obrazy mikroskopii elektronowej tego samego obszaru ujawniły synapsy, mitochondria, jądra komórkowe i pęcherzyki.