Name: Optymalizacja testu ekspresji opartego na multipleksowym RNA z wykorzystaniem materiału archiwalnego raka piersi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj zoptymalizowany test ekspresji RNA z wykorzystaniem multipleksowej analizy koralików magnetycznych do klasyfikacji raka piersi z materiału archiwalnego FFPE. Ta metoda umożliwia badanie próbek o wysokim stopniu degradacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca była wspierana przez (1) stypendium Breast Cancer Project (2014-2016) ufundowane przez Fundację Action for Breast Cancer oraz ALIVE 2013 przez Research, Innovation & Development Trust (RIDT) Uniwersytetu Maltańskiego, (2) Faculty of Medicine & Surgery, University of Malta oraz (3) Project ACT finansowany przez Malta Council for Science & Technology poprzez FUSION: Program Rozwoju Technologii Badań Naukowych i Innowacji 2016. Publikacja tego manuskryptu jest wspierana przez grant Jove-Luminex.

Etyczna zgoda na użycie materiału tkanki piersi w tym badaniu została uzyskana od Uniwersyteckiej Komisji Etyki Badań (UREC) Uniwersytetu Maltańskiego (Ref: 22/2012).
1. Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Korzystając z odpowiednich procedur H&E14, przygotuj barwione skrawki tkanek referencyjnych i zeskanuj cyfrowo szkiełka w poszukiwaniu odniesienia podczas mikrosekcji.</li>
	<li>Za pomocą mikrotomu wyciąć skrawki tkanek o grubości 20 μm w łaźni wodnej wolnej od RNAzy w temperaturze 40 °C. Zebrać skrawki na szkiełkach membranowych do mikrodysekcji laserowej przy użyciu czystego, odkażonego RNaz sprzętu i materiałów.</li>
	<li>Szkiełka membranowe suszyć w temperaturze 37 °C w inkubatorze suszącym przez noc. Wybarwić przy użyciu odpowiedniej procedury H&E15 roztworami klasy biologii molekularnej i wydłużając czas barwienia Hematoxyliny do 6 min. W razie potrzeby wybarwić szkiełka membranowe odpowiednimi protokołami immunohistochemicznymi16.</li>
</ol>
2. Mikrodysekcja laserowa
<ol>
	<li>Ustaw limity suwaka i skalibruj ruch sceny.
	<ol>
		<li>Przesuń widok lasera na pusty obszar szkiełka membranowego. Skalibruj ogniskowanie lasera, wystrzeliwując strzał laserowy w rosnących odstępach czasu (5%), aż laser zacznie przebijać się przez membranę. Narysuj i mikropreparuj dowolny kształt i dostosuj ostrość lasera, aby zmaksymalizować wydajność lasera podczas sekcji laserowej.</li>
		<li>Zwiększ prędkość ruchu sceny do punktu, w którym wydajność sekcji laserowej nie jest zagrożona. Skalibruj laser na wybranej soczewce obiektywu i ponownie skalibruj w przypadku zmiany obiektywu (prędkość lasera 1–15%, ostrość 70–75% i moc 90–100% w przypadku korzystania z obiektywu 4X).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zeskanuj poplamione szkiełka membranowe za pomocą obiektywu 4X.</li>
	<li>Wybierz i okrąż obszary docelowe do mikrodysekcji na szkiełku membranowym. Wypreparuj laserowo minimalną powierzchnię 42 mm2. Zanotować obszar poddany preparacji w celu określenia objętości buforu homogenizującego próbkę, który ma być użyty.</li>
	<li>Użyj mechanizmu podnoszenia nasadki, aby pobrać wypreparowaną część na nasadki dyfuzora oznakowanych rurek przymocowanych do odpowiedniego wyrostka. Jeśli wypreparowany fragment nie zostanie pobrany na nasadkę, powtórz laserową sekcję obszaru.</li>
</ol>
3. Liza tkanek
Uwaga: Kilka rozwiązań i materiałów jest dostarczanych wraz z zestawami wymienionymi w Tabeli Materiałów.
<ol>
	<li>Przygotować wymaganą objętość mieszaniny homogenizującej do lizy próbki, używając roztworu homogenizującego i proteinazy K w stosunku 60:1.</li>
	<li>Pobrać pipetą 2,4 μl roztworu homogenizującego do każdej probówki na każdy 1mm2 powierzchni tkanki, wirować przez 10 s z maksymalną prędkością i wirować w temperaturze pokojowej przez 5 s przy 2 500 x g.</li>
	<li>Inkubować w bloku grzewczym w temperaturze 65 °C przez 12–18 godzin z wytrząsaniem przy 600 obr./min.</li>
	<li>Odwirować lizaty przy 21 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą pipety ostrożnie odessać przezroczysty supernatant i przelać go do oznaczonej świeżej probówki. Należy unikać zasysania fragmentów tkanki/błony, ponieważ może to obniżyć jakość wyników.</li>
	<li>Klarowny supernatant należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4. Test oparty na hybrydyzacji
<ol>
	<li>Wykonaj następujące przygotowania.
	<ol>
		<li>Mieszaninę do lizy należy wstępnie ogrzać, umieszczając butelkę z odczynnikiem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut i delikatnie wymieszać przez odwrócenie.</li>
		<li>Jeżeli homogenaty tkankowe są zamrożone, rozmrozić je w temperaturze pokojowej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji próbki</li> należy przetrząsnąć z maksymalną prędkością.
		<li>Ustawić inkubator z wytrząsaniem na temperaturę 54 °C i umieścić sondę zestawu do walidacji temperatury w pustej studzience na 96-dołkowej płytce. Po 2 godzinach sprawdź temperaturę na termometrze cyfrowym i ustaw temperaturę delta inkubatora z wytrząsaniem, aby skorygować różnicę temperatur.</li>
		<li>Rozmrażać i wirować zestaw sondy i odczynnik blokujący przez 10 s, odwirować w temperaturze pokojowej przez 5 s przy 2,500 x g i trzymać na lodzie.</li>
		<li>Podczas użycia fiolkę z proteinazą K należy przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Wykonaj sonikę kulek wychwytujących o częstotliwości 46 kHz przez 3 minuty, a następnie wiruj z maksymalną prędkością przez kolejne 3 minuty.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 25 μl roboczej mieszanki kulek na studzienkę, odpowiednio zwiększając następujące odczynniki: 4,25 μl wody wolnej od nukleaz, 16,65 μl mieszaniny do lizy, 1,00 μl odczynnika blokującego, 0,10 μl proteinazy K, 0,50 μl kulek wychwytujących, 2,50 μl zestawu sond.</li>
	<li>Wirować roboczą mieszankę kulek przez 10 s z maksymalną prędkością, a następnie pipetować 25 μl/studzienkę do magnetycznej płytki separacyjnej.</li>
	<li>Odpipetować 25 μl homogenatu tkankowego do rozdzielającej magnetycznie płytki 96-dołkowej i 25 μl roztworu homogenizującego do 3 dołków jako ślepe próby.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę separacji magnetycznej za pomocą przezroczystej plastikowej uszczelki ciśnieniowej i umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 54 ± 1 °C na 18–22 godzin, wytrząsając z prędkością 600 obr./min.</li>
	<li>Przygotuj 1X roztwór buforowy do płukania dla 24 studzienek, mieszając 31,5 ml wody wolnej od RNaz z 0,1 ml składnika buforu płuczącego 1 i 1,67 ml składnika buforu płuczącego 2.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z inkubatora. Ustawić temperaturę inkubatora z wytrząsaniem na 50 ± 1 °C.</li>
	<li>Zamontuj magnetyczną płytkę separacyjną na ręcznej magnetycznej podkładce do płyt i zablokuj na miejscu. Zdejmij uszczelkę ciśnieniową i odczekaj 1 minutę, aż kulki magnetyczne osiądą.</li>
	<li>Etap mycia: Odwróć magnetyczną płytkę separacyjną zamontowaną na płycie nad zlewem i delikatnie osusz bibułkę, aby usunąć resztki roztworu. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 μl 1X roztworu buforowego do każdej studzienki i odczekaj 15 sekund. Powtórz ten krok, aby umyć płytkę 3 razy.</li>
	<li>Odpipetować 50 μl odczynnika przedwzmacniacza do każdej studzienki. Uszczelnij płytkę aluminiową uszczelką płytową i potrząsaj płytką z prędkością 800 obr./min przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 ± 1 °C, wytrząsając z prędkością 600 obr./min.</li>
	<li>Powtórz krok 4.9 (Krok prania).</li>
	<li>Odpipetować 50 μl odczynnika wzmacniacza do każdego dołka. Uszczelnij płytkę aluminiową uszczelką płytową i potrząśnij płytką jak w kroku 4.10.</li>
	<li>Powtórz krok 4.9 (Krok prania).</li>
	<li>Obracaj sondę etykiety przez 10 sekund z maksymalną prędkością. Dodać 50 μl sondy do etykietowania do każdej studzienki. Uszczelnić i wstrząsnąć płytką (krok 4.10).</li>
	<li>Powtórz krok 4.9 (Krok prania).</li>
	<li>Wirować fikoerytrynę streptawidyny (SAPE) przez 10 s z maksymalną prędkością. Dodać 50 μl SAPE do każdej studzienki. Uszczelnić i wstrząsnąć płytką (krok 4.10).</li>
	<li>Powtórz krok 4.9 (Krok mycia), z wyjątkiem użycia buforu do płukania SAPE zamiast roztworu buforu do mycia.</li>
	<li>Dodać 130 μl buforu płuczącego SAPE do każdej studzienki i uszczelnić płytkę aluminiową uszczelką. Potrząsaj płytką z prędkością 800 obr./min w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.</li>
	<li>Uruchom analizator kulek magnetycznych. Wykonaj procedurę kalibracji i weryfikacji, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Skonfiguruj protokół w analizatorze kulek magnetycznych, używając następujących parametrów: Wielkość próbki: 100 μL; Brama DD: 5 000–25 000; Limit czasu: 90 s; Zdarzenie koralika/region koralika: 100; i kliknij Dalej. Wybierz odpowiednie numery koralików w panelu i zdefiniuj regiony koralików z odpowiednimi genami docelowymi, zgodnie ze wskazaniami producenta.</li>
	<li>Dodaj nową analizę, wybierając opcję "Utwórz partię przy użyciu istniejącego protokołu" na karcie Partie. W układzie płyt oznacz studzienki odpowiednio jako nieznane lub puste i podaj etykietę dla każdej próbki w panelu Próbki.</li>
	<li>Zdejmij aluminiową uszczelkę płytki z 96-dołkowej płytki reakcyjnej. Wysuń tackę na płytki, klikając przycisk Wysuń, załaduj płytkę do analizatora kulek magnetycznych. Kliknij przycisk Wycofaj| Uruchom usługę Batch, aby zainicjować analizator. Po odczytaniu wysuń i wyjmij płytkę 96-dołkową. Wyczyść i wyłącz analizator kulek magnetycznych zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>W wsadzie | Wyniki, wybierz odpowiedni plik analizy i kliknij przycisk eksportuj to.csv. Otwórz plik the.csv za pomocą arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Obserwuj liczbę ściegów i pomiń wszelkie wyniki, mając < 40 koralików/region.</li>
	<li>Uśrednić wartości studzienek ślepej próby i obliczyć odchylenie standardowe (SD) i granicę wykrywalności (LOD) (średnia ślepej próby + (3xSD)) dla każdego genu docelowego. Ustaw wartości niższe niż poziom szczegółu jako niewykryte. 
	Uwaga: Jeśli którakolwiek z wartości wyrażenia normalizującego nie zostanie wykryta, należy uznać przykładowe dane za nieodpowiednie. Wartości wyrażeń powyżej 20 000 należy uznać za przekroczenie górnego limitu poufności. Lizaty tych próbek należy rozcieńczyć i ponownie przeanalizować.</li>
	<li>Odejmij ślepą średnią od surowych danych dla każdego genu.</li>
	<li>Oblicz średnią geometryczną wybranych genów normalizujących na próbkę. Znormalizuj dane poszczególnych próbek do odpowiedniej średniej geometrycznej.</li>
	<li>Analizuj dane na platformach data science lub przy użyciu zdefiniowanych algorytmów.
	<ol>
		<li>Zaimportuj dane do platformy nauki o danych, klikając pozycję Dodaj dane. Przeciągnij plik danych do obszaru roboczego procesu i połącz się z operatorem [Wybierz atrybuty], następnie z operatorem analizy głównych składowych (PCA), a następnie z portem pomocniczym.</li>
		<li>W operatorze Wybierz atrybut wybierz podzbiór znormalizowanych danych genów i zmienną nominalną, taką jak podtyp raka piersi. Uruchom proces, klikając przycisk Odtwórz. Na karcie Wykresy wybierz opcję "Scatter 3D Color" w stylu wykresu i zmienną nominalną w polu Color. Oceń zmienność danych PCA na wykresie 3-wymiarowym.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+quantitative+mRNA+analysis+in+paraffin-embedded+tissues+using+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction%3A+a+methodological+study+on+lymph+nodes+from+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients.</a> J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).</li>
<li>Macabeo-Ong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+duration+of+fixation+on+quantitative+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses.</a> Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).</li>
<li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+quantification+of+gene+expression+in+homogenates+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).</li>
<li>Flagella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+branched+DNA+assay+for+parallel+quantitative+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling.</a> Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).</li>
<li>Goldhirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+subtypes--dealing+with+the+diversity+of+breast+cancer%3A+highlights+of+the+St.+Gallen+International+Expert+Consensus+on+the+Primary+Therapy+of+Early+Breast+Cancer+2011%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011.</a> Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).</li>
<li>Schnitt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+and+prognosis+of+invasive+breast+cancer%3A+from+morphology+to+molecular+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy.</a> Mod Pathol. 23, Suppl 2. S60-S64 (2010).</li>
<li>Bae, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+expression+in+carcinoma+cells+correlates+with+tumor+aggressiveness+and+poor+clinical+outcome+in+patients+with+invasive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).</li>
<li>Park, J., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+epithelial+cell+interactions+with+fibronectin+stimulate+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition.</a> Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+detection+of+breast+cancer+micrometastases+with+a+fibronectin-targeting+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent.</a> Nat Commun. 6, 7984(2015).</li>
<li>Antonyak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell-derived+microvesicles+induce+transformation+by+transferring+tissue+transglutaminase+and+fibronectin+to+recipient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).</li>
<li>Moon, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+on+circulating+extracellular+vesicles+as+a+liquid+biopsy+to+detect+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer.</a> Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).</li>
<li>Parker, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supervised+risk+predictor+of+breast+cancer+based+on+intrinsic+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes.</a> J Clin Oncol. 27, (2009).</li>
<li>Nielsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+validation+of+the+PAM50-based+Prosigna+Breast+Cancer+Prognostic+Gene+Signature+Assay+and+nCounter+Analysis+System+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens.</a> BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+Eosin+Staining+of+Tissue+and+Cell+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).</li>
<li>Molecular Machines and Industries. H&E Staining Kit Plus for Laser Microdissection and more, Prod. No 70302. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.molecular-machines.com/single_cell_sorting_products/consumables/mmi_he_staining_kit_plus">http://www.molecular-machines.com/single_cell_sorting_products/consumables/mmi_he_staining_kit_plus</a> (2018).</li>
<li>Lin, F., Prichard, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLin%2C+F+%22Handbook+of+Practical+Immunohistochemistry%3A+Frequently+asked+questions%22">Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions</a>. , Springer. (2011).</li>
<li>Grech, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/open-access/molecular-classification-of-breast-cancer-patients-using-formalinfixedparaffinembedded-derived-rna-samples-2155-9929-S8-016.php?aid=67638">Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples.</a> Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis. 7 (S8), (2016).</li>
</ol>

Test Invitrogen™ QuantiGene™ Plex jest własnością firmy Thermo Fisher Scientific. Produkcja i publikacja tego artykułu w otwartym dostępie była sponsorowana przez Luminex Corporation

Test multipleksowego bDNA oparty na koralikach został zoptymalizowany w celu ilościowego określenia ekspresji genów na zdegradowanym RNA pochodzącym z tkanki raka piersi FFPE i prawidłowych przewodów piersi. Optymalizacja testu polegała na opracowaniu algorytmu klasyfikacji guzów raka piersi w podtypach luminalnych i podstawnych, wykorzystując 8 dobrze znanych biomarkerów i 5 potencjalnych genów normalizujących. Normalizacji danych dokonano przy użyciu permutacji genów normalizujących. Wybór genów normalizujących opierał się na najlepszym przewidywaniu statusu receptora przy użyciu genów klasyfikatora Luminal/Basal. Aby sklasyfikować podtypy Luminal/Basal z tkanek FFPE, wybrano geny normalizujące Beta-aktyna (ACTB), dehydrogenaza 3-fosforanowa aldehydu glicerynowego (GAPDH) i fosforybozylotransferaza hipoksantynowa 1 (HPRT1).
Metoda może być zaadaptowana do stosowania w innych obszarach diagnostycznych i badawczych po odpowiednim doborze zestawu genów normalizujących. Jednym z ważnych zastosowań tej metody w sektorze badawczym jest pomiar biomarkerów w materiałach archiwalnych, które są dobrze oznaczone wynikami klinicznymi. Mogłoby to szybko i dokładnie zweryfikować potencjalne markery predykcyjne w badaniach retrospektywnych oraz uniknąć długoterminowych badań prospektywnych w oczekiwaniu na dane dotyczące przeżycia wolnego od choroby i przeżycia całkowitego. Obecnie nasza grupa bada zastosowanie testu do wykrywania egzosomów receptorowo-dodatnich, co wymaga opracowania nowego algorytmu wykorzystującego alternatywne geny normalizujące do normalizacji danych. Zastosowanie płynnych biopsji i solidnych testów ekspresji genów pozwoli na wysokoprzepustowe testy multipleksowe dostosowane do postępowania z pacjentem podczas leczenia i zapewnią środki do śledzenia skuteczności leczenia, potencjalnego nawrotu z powodu oporności na terapię oraz zdolności guzaka do przerzutów.
Metoda ta ma również szeroki zakres możliwych zastosowań w diagnostyce nowotworów i jest dostosowana do obecnego przebiegu diagnostyki. Do głównych zalet tej metody w diagnostyce należą: (1) implementacja testów o wysokiej przepustowości, (2) wykluczenie subiektywności i niejednoznacznych wyników pochodzących z pomiarów obrazowych, (3) dokładne wykrywanie wielu celów jednocześnie, co zwiększa dokładność i minimalizuje użycie cennych próbek pacjentów, oraz (4) brak konieczności stosowania wysoce wyspecjalizowanych obiektów i zasobów ludzkich. Zoptymalizowany proces pobierania próbek, wraz z niskim wkładem materiału wymaganego do testu multipleksowego opartego na koralikach, pozwala na dalsze badanie niejednorodności guza; dzięki zastosowaniu mikrodysekcji laserowej do dokładnego oddzielenia wielu ognisk tkanki złośliwej od tego samego wycinka pacjenta, możliwe jest porównanie ekspresji wielu genów między nimi, a także z dopasowaną normalną tkanką (ryc. 4). Niski wkład materiału ma kluczowe znaczenie dla zastosowań diagnostycznych w biopsjach guza, które zapewniają ograniczoną tkankę nowotworową. Zdolność testu do pomiaru ekspresji genów ze zdegradowanych próbek RNA pozwala na łatwy transport próbek do analizy w instytucji lub do laboratoriów serwisowych. Ponadto możliwa była również analiza całego przekroju przy użyciu materiału barwionego H&E (rysunek 1).
Aby ten protokół zakończył się sukcesem, konieczne jest: (1) zapewnienie prawidłowego pobierania próbek z miejsca lub miejsc guza, które są poddawane lizie do testu oraz (2) opracowanie dobrze zoptymalizowanych i zwalidowanych algorytmów normalizacji danych dla każdego panelu ekspresji genów i/lub indywidualnych biomarkerów prognostycznych lub predykcyjnych. Pierwsza z tych czynności zależy od doświadczenia technicznego technika/naukowca dokonującego pobierania próbek. Zaleca się pobranie dodatkowego rdzenia i przygotowanie mikromacierzy tkankowej (TMA) w tym samym formacie, co multipleksowy test kulek magnetycznych (format 96-dołkowy). Zapewni to archiwum miejsc nowotworowych jako replikę próbek używanych do testu opartego na RNA. TMA mogą być również oceniane za pomocą innych technik w celu przeprowadzenia badań uzupełniających lub walidacji wyników. Rozwój algorytmów normalizacyjnych jest zależny od badanego materiału i genów normalizujących wybranych do normalizacji. Różne panele genów normalizujących są wybierane na podstawie poziomu i zmienności ekspresji w analizowanej próbce, a to różni się w zależności od tkanek rakowych o różnym pochodzeniu, egzosomów z osocza lub krążących komórek nowotworowych. Walidacja testu obejmuje przetwarzanie próbki, ponieważ różne preparaty będą również skutkować różnymi algorytmami normalizacji.
Podsumowując, zastosowanie technologii bDNA w połączeniu z technologią kulek magnetycznych i dobór odpowiedniego panelu genów docelowych zapewni dodatkową zaletę pomiaru ekspresji genów bezpośrednio w lizatach tkankowych pochodzących z niewielkich ilości materiału pacjenta, w tym materiału mikropreparowanego, egzosomów i krążących komórek nowotworowych. Oprócz wykrywania niejednorodności guza, właściwe stosowanie paneli może potencjalnie wykrywać egzosomy pochodzące z guza w celu wczesnej diagnostyki i wczesnego wykrywania nawrotów. Ponieważ nie ma potrzeby przeprowadzania etapu amplifikacji kwasu nukleinowego, amplifikacja sygnału przy użyciu technologii bDNA, w połączeniu z multipleksem opartym na koralikach, mierzy ekspresję wielu genów w klinicznie anotowanym materiale archiwalnym i stanowi źródło do walidacji biomarkerów.

Optymalizacja testów opartych na RNA przy użyciu archiwalnego materiału zatopionego w parafinie (FFPE) jest wyzwaniem ze względu na zmienność w przetwarzaniu tkanek chirurgicznych i degradację RNA spowodowaną przez formalinę używaną do zachowania integralności tkanki1,2. Aby przezwyciężyć ograniczenia związane z wykonywaniem dokładnych badań ekspresji genów z materiału archiwalnego, nasza grupa wykorzystała test kulek magnetycznych bDNA multiplex. Zamiast enzymatycznej amplifikacji matrycy docelowej, technologia bDNA wykorzystuje hybrydyzację określonych sond i amplifikację sygnału reporterowego3. Krótkie sekwencje rozpoznawania sond przechwytujących i detekcyjnych są zaprojektowane tak, aby hybrydyzować się z krótkimi fragmentami docelowego RNA4. Ponadto zastosowanie homogenatów tkankowych jako bezpośredniego materiału wyjściowego w tym teście pozwala przezwyciężyć nieuniknioną utratę RNA, która wynika z testów wymagających wcześniejszej ekstrakcji i oczyszczenia RNA. Wzmocnienie sygnału, zastosowanie krótkich sekwencji rozpoznawania i wykluczenie etapu oczyszczania przyczyniają się do zmniejszenia zmienności technicznej testu. Technologia ta daje możliwość multipleksowania testu (do 80 celów RNA) i pomiaru ekspresji panelu celów przy niskim wkładzie materiału. Protokół ten opisuje przygotowanie i barwienie próbek tkanek do mikrodysekcji laserowej. Barwienie na szkiełkach błonowych ułatwia obrazowanie guza i architektury histologicznej, aby zapewnić dokładną selekcję i profilowanie: (1) guza i prawidłowych przewodów w tkance piersi oraz (2) klonów komórek nowotworowych w heterogennych guzach.
Klasyfikacja molekularna raka piersi to proces, który bada markery molekularne w celu kategoryzacji guzów pacjentów do trzech klas molekularnych, tj. luminalnego, wzbogaconego w receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2) i podtypu podstawowego. Podtyp wzbogacony w HER2 jest dobrze zdefiniowany, z wysoką ekspresją receptora HER2, ze względu na amplifikację genu ERBB2, w połączeniu z niskim lub brakiem receptora estrogenowego (ER) i receptora progesteronowego (PgR). Podtyp luminalny jest na ogół dodatni dla ER, a podtyp podstawowy jest na ogół ujemny dla trzech receptorów (HER2, ER, PgR) i znacząco pokrywa się z podtypem diagnostycznym potrójnie ujemnego raka piersi (TNBC)5,6. Inne markery służą do określania cech nabłonkowych i mezenchymalnych. Fibronektyna (FN1) jest głównym składnikiem mezenchymalnego przedziału tkanki piersi. Zwiększonej ekspresji FN1 towarzyszy wysokie barwienie Ki67 i wskazuje na bardziej inwazyjny nowotwór7,8 i jest związane z przerzutami9. Co ciekawe, stwierdzono, że FN1 jest obecny w mikropęcherzykach pochodzących z komórek nowotworowych, które indukowały aktywację sygnałów mitogennych w fibroblastach biorcy10. W związku z tym krążące mikropęcherzyki, takie jak egzosomy, są potencjalnym markerem wczesnego wykrycia lub przerzutów i nawrotu11.
Wybór obszaru guza dla subtypowania transkrypcyjnego raka piersi był regularnie wykonywany przez makrodissection12,13. Aby przezwyciężyć niejednorodność tkanek i zwiększyć czułość, niezawodnie połączyliśmy klasyczne barwienie tkanek z metodami multipleksowego profilowania molekularnego. Jako dowód słuszności, dwa odrębne klony raka piersi zostały zdefiniowane na podstawie ich nabłonkowej sygnatury mezenchymalnej i potencjału przerzutowego. Przebieg opisanego protokołu można łatwo przełożyć na obecną konfigurację kliniczną i wykorzystać do selektywnej izolacji i charakterystyki podtypów tkanek za pomocą ukierunkowanego profilowania mRNA.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Heamatoxylin Mayer's</td><td>Sigma</td><td>MHS16-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y Wodny roztwór</td><td>Sigma</td><td>HT110216-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica królicza</td><td>Monosan</td><td>MONX10963</td><td>Rozcieńczenie robocze: 1/40</td></tr><tr><td>Biotynylowany królik anty-mysz</td><td>Dako</td><td>E0354</td><td>Rozcieńczenie robocze: 1/200</td></tr><tr><td>Przeciwciało ER (6F11)</td><td>Vector Laboratories</td><td>VPE614</td><td>Rozcieńczenie robocze: 1/45</td></tr><tr><td>Przeciwciało HER2 (CB11)</td><td>Novocastra</td><td>CB11-L-CE</td><td>Rozcieńczenie robocze: 1/325</td></tr><tr><td>Przeciwciało Ki67 (MIB-1)</td><td>Dako</td><td>M7240</td><td>Rozcieńczenie robocze: 1/500</td></tr><tr><td>Zestaw Avidin Biotyna Complex</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E Mikroskop</td> <td>odwróconyObiektywy Nikon</td><td>Ti-E</td><td>4x, 10x, 20x i 40x</td></tr><tr><td>Laserowe membrany do mikrodysekcji</td><td>Maszyny molekularne i Branże</td><td>S0103</td><td></td></tr><tr><td>mmi CellCamera 1.4</td><td>Maszyny molekularne i Branże</td><td>MX4285c-ACK07</td><td></td></tr><tr><td>mmi Cellcut Plus</td><td>Maszyny molekularne i Branże</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nasadki dyfuzorów</td><td>Maszyny molekularne i Branże</td><td>50210</td><td></td></tr><tr><td>mmi Oprogramowanie Celltools v.4.01rcl</td><td>Maszyny molekularne i Branże</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355000038</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml blok grzewczy do Eppendorf Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>22670522</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy płytowy blok grzewczy do Eppendorf Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>22670565</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Vortemp 56 Inkubator z wytrząsaniem</td><td>Labnet</td><td>52056A-220</td><td></td></tr><tr><td>LX200 Analizator magnetyczny 100/200</td><td>Luminex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przetwarzania próbek Invitrogen QuantiGene - Chusteczki FFPE</td> Zestaw testowy <td>ThermoFisher Scientific</td><td>QS0109</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 (separacja magnetyczna)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>QP1011</td><td></td></tr><tr><td>Folia uszczelniająca Thermaseal RTS</td><td></td><td>Ręczna</td> magnetyczna podkładka do płyt Thermaseal 765246 <td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>QP1011</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen QuantiGene Inkubator Zestaw do walidacji temperatury</td><td>Affymetrix/Panomics</td><td>QS0517</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K (50&mikro; g/&mikro; L)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>14622</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Zestawy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Multi Speed Vortex</td><td>Kisker Biotech</td><td>MSV-3500</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Silvercrest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNASEZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowa 96-dołkowa uszczelka</td><td>płytkowa Sigma</td><td>Zestaw do walidacji temperatury Z721549-100EA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>QS0517</td><td></td></tr><tr><td>Społeczność RapidMiner Studio 7.1.001</td><td>Platforma nauki o danych</td><td>RapidMiner</td><td></td></tr><tr><td>Piec hybrydyzacyjny</td><td>Hybaid (Thermo Scientific)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optymalizacja testu ekspresji opartego na multipleksowym rna z wykorzystaniem materiału archiwalnego raka piersi

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Degradacja kwasów nukleinowych w tkance archiwalnej, niejednorodność guzów i brak świeżo zamrożonych próbek tkanek mogą negatywnie wpłynąć na usługi diagnostyczne raka w laboratoriach patologicznych na całym świecie. Testy diagnostyczne amplifikacji i ekspresji genów z wykorzystaniem materiałów archiwalnych lub materiałów, które wymagają transportu do laboratoriów serwisowych, wymagają bardziej solidnego i dokładnego testu dostosowanego do obecnych przepływów pracy klinicznej. Nasz zespół badawczy zoptymalizował wykorzystanie testu Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) do ilościowego oznaczania RNA w materiale archiwalnym przy użyciu technologii rozgałęzionego DNA (bDNA) na kulkach magnetycznych Luminex xMAP®. Test ekspresji genów opisany w tym manuskrypsie jest nowatorską, szybką i multipleksową metodą, która może dokładnie sklasyfikować raka piersi do różnych podtypów molekularnych, pomijając subiektywność interpretacji nieodłącznie związaną z technikami obrazowania. Ponadto, ze względu na niewielki wymagany wkład materiału, heterogenne guzy mogą być mikropreparowane laserowo przy użyciu skrawków barwionych hematoksyliną i eozyną (H&E). Metoda ta ma szeroki zakres możliwych zastosowań, w tym klasyfikację nowotworów z potencjałem diagnostycznym oraz pomiar biomarkerów w płynnych biopsjach, co pozwoliłoby na lepsze zarządzanie pacjentem i monitorowanie choroby. Ponadto ilościowy pomiar biomarkerów w materiale archiwalnym jest przydatny w badaniach onkologicznych z dostępem do bibliotek materiałów z adnotacjami klinicznymi, w których badania retrospektywne mogą walidować potencjalne biomarkery i korelację ich wyników klinicznych.

Opisana metoda została zastosowana do jednoczesnego pomiaru 40 transkrypty w silnie zdegradowanym materiale FFPE barwionym H&amp;E (Ryc. 1) oraz mikrodissekcyjnym (Ryc. 2). Wykorzystując tę metodę, wykazaliśmy dokładną charakterystykę statusu receptorów (Ryc. 3A), klasyfikację guzów do luminalnych i basalnych podtypów molekularnych17, a także różnicową ekspresję markera mezenchymalnego FN1 przy porównaniu guza z dopasowaną tkanką kontrolną (Ryc. 3B) w różnych podtypach receptorowo dodatnich i ujemnych.
<img alt="Wykres analizy korelacji lizatu guza barwionego i niebarwionego, dopasowanie liniowe R²=0,987." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ekspresja genów z użyciem H&amp;Materiał zabarwiony E. Korelacja między profilem ekspresji uzyskanym z niebarwionego przekroju guza a profilem uzyskanym z barwionego przekroju guza. [Korelacja Persona pwartość p = 5,34E-26]. Powtórzone za zgodą17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza histologiczna próbek tkanek; obrazy mikroskopowe przedstawiające struktury komórkowe, skala 10 μm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Mikrosekcja laserowa tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE). (A) H&amp;barwiony preparat E; (B) barwienie immunohistochemiczne w celu oceny ekspresji ER; (C) barwienie immunohistochemiczne HER2; (D) Niebarwione 20 µm sekcja na szkiełkach membranowych do mikrosekcji laserowej. Żółta strzałka wskazuje obszar naciekającego guza, który nie jest wyraźnie odgraniczony z powodu braku barwienia. (E) A 20 µm przekrój barwiony H&E&amp;E dla lepszego wyznaczenia obszarów zainteresowania. Białe strzałki wskazują ścieżkę dyssekcji laserowej, natomiast czerwona strzałka pokazuje ognisko laserowe podczas dyssekcji. Wszystkie ilustracje zostały wykonane przy powiększeniu 10x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Status receptorów HER2/ER/TNBC, wykresy pudełkowe ekspresji markera FN1, porównanie pochodzenia tkanek, dane statystyczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3: Ekspresja (A) statusu receptora oraz (B) mezenchymalnego markera FN1 w guzie piersi w porównaniu z dopasowaną tkanką prawidłową. Klasyczne diagnostyczne podtypy raka piersi definiuje się na podstawie wyniku diagnostycznego z zastosowaniem immunohistochemii oraz fluorescencji in situ hybrydyzacja in situ fluorescencyjna (FISH) w przypadku wątpliwego wyniku barwienia immunohistochemicznego HER2. Znormalizowana ekspresja (A) HER2 i ER, (B) Poziom FN1 zmierzony za pomocą analizy opartej na hybrydyzacji przedstawiono dla przypadków HER2-dodatnich, ER-dodatnich oraz TNBC w porównaniu z dopasowaną do pacjenta prawidłową tkanką piersi. Statystyka testu Kruskala-Wallisa (K-W χ2) wykazuje, że ekspresja HER2 jest znacząco (p &lt; 0,05) wyższa w tkance nowotworowej w porównaniu z odpowiadającą jej tkanką prawidłową w kohorcie HER2-dodatniej i znacznie niższa w kohorcie TNBC. Nie stwierdzono, aby ekspresja ER była istotnie wyższa w tkance nowotworowej w porównaniu z odpowiadającą jej tkanką prawidłową w kohortach ER-dodatniej i TNBC. Poziom FN1 jest istotnie wyższy w tkance nowotworowej w podtypach HER2- i ER-dodatnich oraz wykazuje tendencję do istotnego podwyższenia w tkance nowotworowej również w kohorcie TNBC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Analiza histologiczna guza; obrazy mikroskopowe, wykresy przedstawiające ekspresję genów w różnych guzach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Studium przypadku: heterogenność guza. Guzy o odmiennej morfologii poddano mikrodysekcji i potraktowano jako odrębne próbki.A) Skan główny H&amp;Sekcja E. (B, C) Powiększenie 10x oraz 40x odpowiednio dla każdej zidentyfikowanej morfologii guza. (D) Barwienie immunohistochemiczne na ER przy powiększeniu 10x. (E) Barwienie immunohistochemiczne Ki67 przy powiększeniu 10x wykazujące wyższą aktywność mitotyczną w guzie 1. (F) Znormalizowane poziomy ekspresji genu ESR1 w każdym guzie, wykazujące stosunkowo wysoką i równą ekspresję między guzami, zgodnie z oczekiwaniami wynikającymi z wyniku immunohistochemicznego. (G) Znormalizowane poziomy ekspresji FN1, markeru mezenchymalnego; zwiększona ekspresja FN1 współwystępuje z silnym barwieniem Ki67, co wskazuje na cechy bardziej inwazyjnego nowotworu. Odwrotną zależność obserwuje się w przypadku nowotworu 2, który wydaje się być nowotworem o wolniejszej proliferacji i niższym potencjale złośliwości, co przejawia się obniżoną ekspresją FN1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig4large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Degradacja kwasów nukleinowych w tkance archiwalnej, niejednorodność guzów i brak świeżo zamrożonych próbek tkanek mogą negatywnie wpłynąć na usługi diagnostyczne raka w laboratoriach patologicznych na całym świecie. Niniejszy manuskrypt opisuje optymalizację panelu biomarkerów przy użyciu multipleksowego testu kulek magnetycznych do klasyfikacji raka piersi.

Optymalizacja testu ekspresji opartego na multipleksowym RNA z wykorzystaniem materiału archiwalnego raka piersi

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Metoda ta jest z powodzeniem optymalizowana pod kątem klasyfikacji pacjentek z rakiem piersi na znane i nieznane grupy terapeutyczne. Wysoka czułość tego testu pozwala zidentyfikować niejednorodne próbki, które można dalej badać za pomocą mikrodysekcji laserowej. Główną zaletą testu multipleksowego opartego na RNA jest powtarzalność wyników przy użyciu materiału archiwalnego zatopionego w parafinie barwionym hematoksyliną i eozyną, utrwalonego w formalinie, co pozwala na uzyskanie wyników w wysokiej rozdzielczości i walidację biomarkerów.Przygotuj tkankę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby rozpocząć preparację, ustaw granice szkiełka i skalibruj ruch stolika mikroskopu. Teraz zeskanuj zabarwione szkiełka membranowe za pomocą obiektywu 4X.Wybierz i okrąż obszary docelowe do mikrodysekcji na szkiełku membranowym. Śledź całkowitą powierzchnię. Do odpowiedniej analizy RNA potrzebne są co najmniej 42 milimetry kwadratowe.Następnie rozpocznij cięcie laserowe przy zdefiniowanych parametrach. Następnie użyj mechanizmu podnoszenia nasadki, aby odzyskać wypreparowaną sekcję i umieść sekcję na nasadce dyfuzora oznakowanej rurki przymocowanej do mechanicznego wyrostka. Jeśli wypreparowany fragment nie zostanie wyjęty na nasadkę, powtórz sekcję obszaru docelowego.Dokładność mikrodysekcji jest krytycznym krokiem i zawsze należy upewnić się, że obszar mikrodysekcji obecny na nasadce pokrywa się z zaznaczonym, zeskanowanym obrazem. Zbierz tyle skrawków tkanki, ile chcesz, każdy w osobnej probówce, a następnie przystąp do lizy próbek tkanek. Do lizy nanieść 2,4 mikrolitra roztworu homogenizującego na milimetr kwadratowy powierzchni tkanki w każdej próbce, a następnie wirować próbki przez 10 sekund z maksymalną prędkością.Następnie odwirowywać próbki przez pięć sekund w temperaturze 2 500 g. Następnie w razie potrzeby przenieś próbki do 1,5-mililitrowych probówek i umieść w wstrząsającym bloku grzewczym w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Potrząsaj nimi z prędkością 600 obr./min przez 12 do 18 godzin.Następnie odwirować lizaty w stężeniu 21 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zebrać przezroczysty supernatant do nowej, oznakowanej probówki. Unikaj przenoszenia jakichkolwiek fragmentów tkanki.Supernatanty mogą być przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po przygotowaniu wszystkich odczynników do testu opartego na hybrydyzacji, załaduj do 90 dołków 96-dołkowej płytki do separacji magnetycznej z 25 mikrolitrami homogenatu tkankowego. Załaduj 25 mikrolitrów próbek kontrolnych do trzech wyznaczonych studzienek i załaduj 25-mikrolitrowy roztwór homogenizujący do trzech studzienek jako ślepe próby.Następnie uszczelnij magnetyczną płytkę separacyjną za pomocą przezroczystej plastikowej uszczelki ciśnieniowej i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 54 stopni Celsjusza na 18 do 22 godzin z potrząsaniem. Następnego dnia zamontuj i zablokuj płytkę na ręcznej magnetycznej podkładce do płyt, a następnie zdejmij uszczelkę ciśnieniową i odczekaj minutę, aż kulki magnetyczne osiądą. Teraz wykonaj pranie.Odcedź talerz nad zlewem i delikatnie osusz go bibułą, a następnie załaduj wszystkie studzienki 100 mikrolitrami buforu do mycia 1X i odczekaj 15 sekund. Powtórz ten proces trzy razy, aby zakończyć etap prania. Po wyjęciu ostatniego płukania ponownie załaduj studzienki 50 mikrolitrami odczynnika przedwzmacniacza, a następnie uszczelnij płytkę aluminiowym uszczelniaczem do płyt i potrząsaj płytką z prędkością 800 obr./min przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Następnie kontynuuj potrząsanie płytką w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę. Po zakończeniu wykonaj kolejny krok prania. Następnie ponownie załaduj studzienki 50 mikrolitrami odczynnika wzmacniacza, uszczelnij płytkę aluminiową uszczelką płytową i powtórz inkubację z wytrząsaniem trwającą jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie godzinę w temperaturze 50 stopni Celsjusza, a następnie kolejny etap mycia.Teraz wiruj sondę etykiety przez 10 sekund z maksymalną prędkością, a następnie dodaj 50 mikrolitrów sondy etykietowej do każdej studzienki. Następnie ponownie zamknąć płytkę i powtórzyć inkubację z wytrząsaniem jak poprzednio, po czym następuje kolejny etap mycia. Następnie załadować studzienki 50 mikrolitrami świeżo zmieszanej fikoerytryny streptawidyny, następnie przeprowadzić inkubację z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej przy 600 obr./min, a następnie etap płukania za pomocą buforu do płukania streptawidyny.Po zakończeniu etapu mycia załaduj każdą studzienkę 100 mikrolitrami buforu do płukania Streptawidyny i uszczelnij płytkę aluminiową uszczelką, a następnie potrząśnij płytką z prędkością 800 obr./min w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Podczas ostatniego etapu inkubacji uruchom analizator kulek magnetycznych i upewnij się, że przyrząd jest skalibrowany i zostały wykonane protokoły walidacji. W oprogramowaniu dodaj nową analizę, wybierając opcję Utwórz partię przy użyciu istniejącego protokołu na karcie Partie.Następnie w układzie płyty oznacz studzienki jako nieznane lub puste i podaj etykietę dla każdego z nich w panelu Próbka. Teraz zdejmij aluminiową uszczelkę z płyty reakcyjnej, wysuń tacę podajnika płyt i załaduj płytkę do analizatora. Następnie kliknij Wycofaj, a następnie Uruchom wsad, aby zainicjować analizator.Po odczycie wysuń płytkę i wyczyść magnetyczny analizator kulek zgodnie z zaleceniami producenta. W celu analizy należy przejść do zakładki Wyniki partii. Wybierz odpowiedni plik analizy i skorzystaj z opcji, aby wyeksportować go jako plik csv, a następnie utwórz średnie i surowe wyniki za pomocą oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.Upewnij się, że elementy sterujące pokazują oczekiwane sygnały. Znormalizuj przykładowe dane pierwotne i przeanalizuj rozkład danych przy użyciu platformy do nauki o danych lub zdefiniowanych algorytmów w celu wykonania analizy składników podstawowych. Wydajność czytnika i testu multipleksowego ma kluczowe znaczenie, a seryjne rozcieńczanie dobrze opisanych próbek kontrolnych przed cennymi próbkami pacjentów zapewnia prawidłowe wyniki.W polu atrybuty wybierz podzbiór znormalizowanych danych genów i zmienną nominalną, taką jak podtyp raka piersi. Zastosuj wytrenowany i zweryfikowany algorytm klasyfikacji, aby scharakteryzować nieznane próbki. Opisana metoda została zastosowana do jednoczesnego pomiaru 40 transkryptów w barwionym H&E, mikrorozwarstwionym, wysoce zdegradowanym materiale FFPE.Za pomocą tej metody możliwe jest przedstawienie dokładnej charakterystyki statusu receptora i zróżnicowanej ekspresji mezenchymalnego markera FN1 podczas porównywania guza i dopasowanej tkanki kontrolnej w różnych podtypach receptora dodatniego i ujemnego. Za pomocą tej metody można scharakteryzować heterogeniczność w obrębie nowotworów. Guz ER dodatni wykazuje przestrzenną różnicową ekspresję FN1 w obszarach wykazujących wyraźną morfologię guza i aktywność mitotyczną.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć wiele genów bezpośrednio z lizatów tkankowych po hybrydyzacji docelowego RNA do kulek, amplifikacji sygnału i kwantyfikacji. Czułość testu pozwala na użycie materiału poddanego mikrodyparacji laserowej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o kalibracji sprzętu przed każdym testem i określeniu zakresu czułości przy użyciu materiału do kontroli jakości przed uruchomieniem cennych próbek pacjenta.Przebieg pracy testu można łatwo dostosować do laboratoriów klinicznych. Profilowanie RNA do 90 próbek można przeprowadzić w ciągu 12 godzin w ciągu dwóch dni. Pomiar statusu receptora raka piersi w laboratorium patomorfologicznym jest czasochłonny i wymaga doświadczonych patologów.Korzystanie z tego zdigitalizowanego, multipleksowego testu opartego na kulkach dokładnie określa ilościowo ekspresję RNA. Analiza biomarkerów frakcyjnych w biopsjach w diagnostyce pierwotnej polega na przedstawieniu guza. Stosując tę metodologię z szerszym panelem biomarkerów, a także wykorzystując całe sekcje, identyfikuje się próbki heterogeniczne.Opracowywanie testów z wykorzystaniem tej metodologii jest wszechstronne i wymaga niewielkiego wkładu próbki. Próbka obejmuje próbki z adnotacjami klinicznymi ważne dla walidacji biomarkerów, a także płynne biopsje, które są ważne dla nadzoru pacjenta i wczesnej diagnozy.

optimization-multiplex-rna-based-expression-assay-using-breast-cancer

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Tutaj opisujemy uproszczony protokół analiz ekspresji mikroRNA (miRNA) w archiwalnych tkankach klinicznych z utrwalonym formaliną, parafiną (FFPE) lub świeżo mrożonym rakiem prostaty (PCa) z wykorzystaniem ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) i hybrydyzacji in situ (ISH).

Analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego

Tutaj prezentujemy protokół do wykrywania ekspresji miRNA w próbkach pobranych od pacjentów z rakiem piersi za pomocą hybrydyzacji miRNA in situ.

Kliniczno-patologiczna analiza ekspresji miRNA w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji miRNA in situ

Fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ (FISH) jest często wymagana w połączeniu z histopatologią i diagnostyką molekularną w celu wyboru terapii w medycynie spersonalizowanej. Nowatorski, niesieciowany, wolny od formaliny utrwalacz tkankowy, który umożliwia wysokiej jakości analizy morfologiczne, molekularne i FISH z tej samej próbki poprzez dodanie etapu po utrwaleniu przed przedstawieniem FISH.

Protokół dla HER2 FISH z wykorzystaniem niesieciowanego, wolnego od formaliny utrwalacza tkankowego, aby połączyć zalety kriokonserwacji i utrwalania formaliny

Próbki zatopione w parafinie w formalinie stanowią cenne źródło molekularnych biomarkerów chorób ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy laboratoryjny protokół przygotowania biblioteki cDNA, początkowo zaprojektowany ze świeżo mrożonym RNA i zoptymalizowany do analizy zarchiwizowanych mikroRNA z tkanek przechowywanych do 35 lat.

Retrospektywne sekwencjonowanie mikroRNA: protokół przygotowania komplementarnej biblioteki DNA przy użyciu próbek RNA zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Użycie podejścia opartego na RNA do określenia ilościowych profili immunologicznych tkanek guza litego i wykorzystania kohort klinicznych do odkrycia biomarkerów immunologicznych onkologicznych jest opisane za pomocą protokołów molekularnych i informatycznych.

Predykcyjne modelowanie immunologiczne guzów litych

Ten raport opisuje zautomatyzowany protokół do multipleksowych testów immunofluorescencyjnych (mIF) na automatycznym barwniku do szkiełek. Wykazano wysoką odtwarzalność proteomiki przestrzennej na standardowych autostainerach tkankowych o wysokiej przepustowości i obrazach fluorescencyjnych na całych szkiełkach, co jest idealne do niestandardowych testów mIF na dużej liczbie szkiełek tkankowych w badaniach translacyjnych.

Wysokowydajne zautomatyzowane multipleksowe testy immunofluorescencyjne do badań translacyjnych

Protokół ten opisuje metodologię wykrywania multipleksowego mRNA za pomocą obrazowania białek w tkankach tkanek osadzonych formaliną w parafinie.

Kartografia molekularna z podwójną modalnością: Integracja detekcji multipleksowego mRNA z obrazowaniem białek z cytometrią masową

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj zoptymalizowany test ekspresji RNA z wykorzystaniem multipleksowej analizy koralików magnetycznych do klasyfikacji raka piersi z materiału archiwalnego FFPE. Ta metoda umożliwia badanie próbek o wysokim stopniu degradacji.

Optymalizacja testu ekspresji opartego na multipleksowym RNA z wykorzystaniem materiału archiwalnego raka piersi

Przeglądaj więcej filmów