Optymalizacja testu ekspresji opartego na multipleksowym RNA z wykorzystaniem materiału archiwalnego raka piersi

Metoda ta jest z powodzeniem optymalizowana pod kątem klasyfikacji pacjentek z rakiem piersi na znane i nieznane grupy terapeutyczne. Wysoka czułość tego testu pozwala zidentyfikować niejednorodne próbki, które można dalej badać za pomocą mikrodysekcji laserowej. Główną zaletą testu multipleksowego opartego na RNA jest powtarzalność wyników przy użyciu materiału archiwalnego zatopionego w parafinie barwionym hematoksyliną i eozyną, utrwalonego w formalinie, co pozwala na uzyskanie wyników w wysokiej rozdzielczości i walidację biomarkerów.

Przygotuj tkankę zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby rozpocząć preparację, ustaw granice szkiełka i skalibruj ruch stolika mikroskopu. Teraz zeskanuj zabarwione szkiełka membranowe za pomocą obiektywu 4X.

Wybierz i okrąż obszary docelowe do mikrodysekcji na szkiełku membranowym. Śledź całkowitą powierzchnię. Do odpowiedniej analizy RNA potrzebne są co najmniej 42 milimetry kwadratowe.

Następnie rozpocznij cięcie laserowe przy zdefiniowanych parametrach. Następnie użyj mechanizmu podnoszenia nasadki, aby odzyskać wypreparowaną sekcję i umieść sekcję na nasadce dyfuzora oznakowanej rurki przymocowanej do mechanicznego wyrostka. Jeśli wypreparowany fragment nie zostanie wyjęty na nasadkę, powtórz sekcję obszaru docelowego.

Dokładność mikrodysekcji jest krytycznym krokiem i zawsze należy upewnić się, że obszar mikrodysekcji obecny na nasadce pokrywa się z zaznaczonym, zeskanowanym obrazem. Zbierz tyle skrawków tkanki, ile chcesz, każdy w osobnej probówce, a następnie przystąp do lizy próbek tkanek. Do lizy nanieść 2,4 mikrolitra roztworu homogenizującego na milimetr kwadratowy powierzchni tkanki w każdej próbce, a następnie wirować próbki przez 10 sekund z maksymalną prędkością.

Następnie odwirowywać próbki przez pięć sekund w temperaturze 2 500 g. Następnie w razie potrzeby przenieś próbki do 1,5-mililitrowych probówek i umieść w wstrząsającym bloku grzewczym w temperaturze 65 stopni Celsjusza. Potrząsaj nimi z prędkością 600 obr./min przez 12 do 18 godzin.

Następnie odwirować lizaty w stężeniu 21 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie zebrać przezroczysty supernatant do nowej, oznakowanej probówki. Unikaj przenoszenia jakichkolwiek fragmentów tkanki.

Supernatanty mogą być przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po przygotowaniu wszystkich odczynników do testu opartego na hybrydyzacji, załaduj do 90 dołków 96-dołkowej płytki do separacji magnetycznej z 25 mikrolitrami homogenatu tkankowego. Załaduj 25 mikrolitrów próbek kontrolnych do trzech wyznaczonych studzienek i załaduj 25-mikrolitrowy roztwór homogenizujący do trzech studzienek jako ślepe próby.

Następnie uszczelnij magnetyczną płytkę separacyjną za pomocą przezroczystej plastikowej uszczelki ciśnieniowej i umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 54 stopni Celsjusza na 18 do 22 godzin z potrząsaniem. Następnego dnia zamontuj i zablokuj płytkę na ręcznej magnetycznej podkładce do płyt, a następnie zdejmij uszczelkę ciśnieniową i odczekaj minutę, aż kulki magnetyczne osiądą. Teraz wykonaj pranie.

Odcedź talerz nad zlewem i delikatnie osusz go bibułą, a następnie załaduj wszystkie studzienki 100 mikrolitrami buforu do mycia 1X i odczekaj 15 sekund. Powtórz ten proces trzy razy, aby zakończyć etap prania. Po wyjęciu ostatniego płukania ponownie załaduj studzienki 50 mikrolitrami odczynnika przedwzmacniacza, a następnie uszczelnij płytkę aluminiowym uszczelniaczem do płyt i potrząsaj płytką z prędkością 800 obr./min przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.

Następnie kontynuuj potrząsanie płytką w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez godzinę. Po zakończeniu wykonaj kolejny krok prania. Następnie ponownie załaduj studzienki 50 mikrolitrami odczynnika wzmacniacza, uszczelnij płytkę aluminiową uszczelką płytową i powtórz inkubację z wytrząsaniem trwającą jedną minutę w temperaturze pokojowej, a następnie godzinę w temperaturze 50 stopni Celsjusza, a następnie kolejny etap mycia.

Teraz wiruj sondę etykiety przez 10 sekund z maksymalną prędkością, a następnie dodaj 50 mikrolitrów sondy etykietowej do każdej studzienki. Następnie ponownie zamknąć płytkę i powtórzyć inkubację z wytrząsaniem jak poprzednio, po czym następuje kolejny etap mycia. Następnie załadować studzienki 50 mikrolitrami świeżo zmieszanej fikoerytryny streptawidyny, następnie przeprowadzić inkubację z wytrząsaniem w temperaturze pokojowej przy 600 obr./min, a następnie etap płukania za pomocą buforu do płukania streptawidyny.

Po zakończeniu etapu mycia załaduj każdą studzienkę 100 mikrolitrami buforu do płukania Streptawidyny i uszczelnij płytkę aluminiową uszczelką, a następnie potrząśnij płytką z prędkością 800 obr./min w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Podczas ostatniego etapu inkubacji uruchom analizator kulek magnetycznych i upewnij się, że przyrząd jest skalibrowany i zostały wykonane protokoły walidacji. W oprogramowaniu dodaj nową analizę, wybierając opcję Utwórz partię przy użyciu istniejącego protokołu na karcie Partie.

Następnie w układzie płyty oznacz studzienki jako nieznane lub puste i podaj etykietę dla każdego z nich w panelu Próbka. Teraz zdejmij aluminiową uszczelkę z płyty reakcyjnej, wysuń tacę podajnika płyt i załaduj płytkę do analizatora. Następnie kliknij Wycofaj, a następnie Uruchom wsad, aby zainicjować analizator.

Po odczycie wysuń płytkę i wyczyść magnetyczny analizator kulek zgodnie z zaleceniami producenta. W celu analizy należy przejść do zakładki Wyniki partii. Wybierz odpowiedni plik analizy i skorzystaj z opcji, aby wyeksportować go jako plik csv, a następnie utwórz średnie i surowe wyniki za pomocą oprogramowania do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.

Upewnij się, że elementy sterujące pokazują oczekiwane sygnały. Znormalizuj przykładowe dane pierwotne i przeanalizuj rozkład danych przy użyciu platformy do nauki o danych lub zdefiniowanych algorytmów w celu wykonania analizy składników podstawowych. Wydajność czytnika i testu multipleksowego ma kluczowe znaczenie, a seryjne rozcieńczanie dobrze opisanych próbek kontrolnych przed cennymi próbkami pacjentów zapewnia prawidłowe wyniki.

W polu atrybuty wybierz podzbiór znormalizowanych danych genów i zmienną nominalną, taką jak podtyp raka piersi. Zastosuj wytrenowany i zweryfikowany algorytm klasyfikacji, aby scharakteryzować nieznane próbki. Opisana metoda została zastosowana do jednoczesnego pomiaru 40 transkryptów w barwionym H&E, mikrorozwarstwionym, wysoce zdegradowanym materiale FFPE.

Za pomocą tej metody możliwe jest przedstawienie dokładnej charakterystyki statusu receptora i zróżnicowanej ekspresji mezenchymalnego markera FN1 podczas porównywania guza i dopasowanej tkanki kontrolnej w różnych podtypach receptora dodatniego i ujemnego. Za pomocą tej metody można scharakteryzować heterogeniczność w obrębie nowotworów. Guz ER dodatni wykazuje przestrzenną różnicową ekspresję FN1 w obszarach wykazujących wyraźną morfologię guza i aktywność mitotyczną.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć wiele genów bezpośrednio z lizatów tkankowych po hybrydyzacji docelowego RNA do kulek, amplifikacji sygnału i kwantyfikacji. Czułość testu pozwala na użycie materiału poddanego mikrodyparacji laserowej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o kalibracji sprzętu przed każdym testem i określeniu zakresu czułości przy użyciu materiału do kontroli jakości przed uruchomieniem cennych próbek pacjenta.

Przebieg pracy testu można łatwo dostosować do laboratoriów klinicznych. Profilowanie RNA do 90 próbek można przeprowadzić w ciągu 12 godzin w ciągu dwóch dni. Pomiar statusu receptora raka piersi w laboratorium patomorfologicznym jest czasochłonny i wymaga doświadczonych patologów.

Korzystanie z tego zdigitalizowanego, multipleksowego testu opartego na kulkach dokładnie określa ilościowo ekspresję RNA. Analiza biomarkerów frakcyjnych w biopsjach w diagnostyce pierwotnej polega na przedstawieniu guza. Stosując tę metodologię z szerszym panelem biomarkerów, a także wykorzystując całe sekcje, identyfikuje się próbki heterogeniczne.

Opracowywanie testów z wykorzystaniem tej metodologii jest wszechstronne i wymaga niewielkiego wkładu próbki. Próbka obejmuje próbki z adnotacjami klinicznymi ważne dla walidacji biomarkerów, a także płynne biopsje, które są ważne dla nadzoru pacjenta i wczesnej diagnozy.