Name: Retrospektywne sekwencjonowanie mikroRNA: protokół przygotowania komplementarnej biblioteki DNA przy użyciu próbek RNA zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Poznaj protokół przygotowania biblioteki cDNA do retrospektywnego sekwencjonowania mikroRNA z próbek RNA zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie. Metoda umożliwia analizę archiwalnych tkanek nawet do 35 lat.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Thomasowi Tuschlowi, szefowi laboratorium biologii molekularnej RNA, a także członkom jego laboratorium za wsparcie i dzielenie się technologią opracowaną w jego laboratorium oraz za udostępnienie rurociągu RNAworld. Dziękujemy również dr Markusowi Hafnerowi za podzielenie się swoim protokołem i dostarczenie szczegółowych opisów wszystkich etapów biochemicznych i enzymatycznych zastosowanych w jego początkowej procedurze.

<ol><li>Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows.+Arch%22%5BJournal%5D)">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li>
<li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues%3A+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).</li>
<li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li>
<li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li>
<li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517(2013).</li>
<li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393(2013).</li>
<li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li>
<li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR%3A+the+strengths+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li>
<li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li>
<li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144(2011).</li>
<li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li>
<li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%3A+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li>
<li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671346/">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li>
<li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+targets+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li>
<li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500(2011).</li>
<li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li>
<li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627(2017).</li>
<li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+DNA%2FRNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs%2C+mRNAs%2C+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683(2012).</li>
<li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li>
<li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing%2C+selection%2C+extension+and+ligation+platform%3A+assessing+its+performance+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li>
</ol>

Autorzy pragną ujawnić, że publikacja zawierająca niektóre z danych przedstawionych w tym manuskrypcie została opublikowana w International Journal of Molecular Sciences przez Loudiga i wsp.Lokal mieszkalny 21.

W niniejszym protokole przedstawiono wysoce powtarzalny i solidny protokół przygotowania biblioteki cDNA dla NGS małych RNA zarchiwizowanych w próbkach RNA FFPE, który jest zmodyfikowaną i zoptymalizowaną wersją procedury opisanej przez Hafnera i wsp.22 Rozdział 22
Wszystkie kroki tego protokołu zostały zoptymalizowane do użytku ze starszymi, zarchiwizowanymi i naruszonymi całkowitymi RNA odzyskanymi z próbek FFPE. Kluczowym etapem tego protokołu, służącym do p...

miRNA są wyjątkowo dobrze zachowane w próbkach z parafiną (FFPE) utrwaloną w formalinie1,2,3. Wcześniejsze prace wykazały, że ekspresja tych krótkich, niekodujących jednoniciowych cząsteczek RNA może być z powodzeniem oceniona przy użyciu całkowitego RNA z próbek FFPE i dostarczyć odpowiednich danych dotyczących ekspresji genów w porównaniu z oryginalnymi świeżymi tkankami4,5,6,7,8. W porównaniu z dużymi rozmiarami informacyjnymi RNA, które, jak wykazano, są krytycznie dotknięte przetwarzaniem tkanek FFPE (formaldehyd, ciepło, wysuszenie itp.), endogennymi RNazami i wiekiem próbek, mały rozmiar miRNA (~18-24 nukleotydy) wydaje się czynić je odpornymi na degradację i odpornymi na długotrwałe przechowywanie, co wykazano również w badaniach ekspresji miRNA, które przewyższają wysokoprzepustowe badania mRNA w zarchiwizowanych próbkach9. Badania ekspresji miRNA z wykorzystaniem archiwalnych próbek klinicznych, które w większości zostały przeprowadzone w analizach na małą skalę, wykazały, że pojedyncze lub multipleksowane ilościowe testy PCR, różne rodzaje technologii mikromacierzy, a ostatnio NGS mogą być wykorzystywane do oceny ekspresji zachowanych miRNA po optymalizacji tych testów10,11,12,13,14.
Biorąc pod uwagę, że dysregulacja ekspresji miRNA jest związana z rozwojem różnych nowotworów złośliwych u ludzi i że istnieje potencjalnie ogromna ilość klinicznie opisanych próbek archiwizowanych, stało się oczywiste, że te małe cząsteczki RNA stanowią obiecujące źródło potencjalnych biomarkerów raka15,16,17,18. Zastosowanie wysokoprzepustowej technologii ekspresji genów, takiej jak NGS, ma tę zaletę, że zapewnia globalną ocenę wszystkich transkryptów miRNA w porównaniu z technologiami celowanymi, takimi jak PCR i/lub mikromacierze19. Z tego powodu zoptymalizowany, niedrogi i łatwy w zastosowaniu protokół przygotowania biblioteki cDNA małych RNA ze starszych zarchiwizowanych próbek dla NGS został zoptymalizowany, aby umożliwić zakrojone na szeroką skalę badania retrospektywne20.
Wcześniej ustaliliśmy protokół jednoczesnej ekstrakcji RNA/DNA do oddzielnego odzyskiwania RNA i DNA ze starszych zarchiwizowanych próbek, który okazał się lepszy od współczesnych komercyjnych zestawów21. Korzystając z tego protokołu ekstrakcji, w celu uzyskania całkowitego RNA z tkanek FFPE archiwizowanych przez dłuższy czas, zoptymalizowaliśmy przygotowanie bibliotek cDNA dla NGS miRNA zachowanych w próbkach klinicznych przez okres do 35 lat. Ponadto w niedawno opublikowanym badaniu, w którym przygotowaliśmy biblioteki cDNA z klinicznie sklasyfikowanych próbek raka przewodowego in situ (DCIS), zidentyfikowaliśmy miRNA o zróżnicowanej ekspresji, które zostały zwalidowane przez ilościowy PCR, co wskazało, że specyficzne zmiany ekspresji miRNA mogą być wykrywalne w zmianach DCIS u pacjentów, u których rozwija się rak piersi, w porównaniu ze zmianami DCIS u pacjentów, u których nie rozwija się rak piersi.
Biorąc pod uwagę koszt komercyjnych zestawów do przygotowania małych bibliotek cDNA RNA, możliwość ich wycofania, a także użycie odczynników chronionych prawem autorskim/patentowym, które nie mogą być zoptymalizowane, zdecydowaliśmy się dostosować wcześniej opublikowany laboratoryjny i wolny od zestawów protokół przygotowania biblioteki cDNA z kodami kreskowymi 3' dla NGS małych RNA zarchiwizowanych w próbkach FFPE, Umożliwia jednoczesną analizę 18 próbek<klasa SUP="xref">22. Protokół ten zapewnia idealną i solidną procedurę krok po kroku z wizualnymi i technicznymi punktami kontrolnymi, które miały kluczowe znaczenie dla adaptacji do próbek RNA FFPE i mają duży potencjał do zastosowania w innych źródłach uszkodzonego lub trudnego do użycia materiału RNA. Możliwość zastosowania pierwotnego protokołu została poprawiona poprzez zastąpienie znakowanych radioaktywnie markerów wielkości fluorescencyjnymi (np. SYBR Gold) wykrywalnymi markerami wielkości RNA, stosowanymi podczas selekcji ligowanych bibliotek na dużych żelach poliakrylamidowych. Ten zoptymalizowany protokół opiera się na ligacji adapterów z kodem kreskowym 3' do 18 pojedynczych próbek RNA FFPE, które są następnie łączone w celu poddania się ligacji adaptera 5', odwrotnej transkrypcji i pilotażowej analizie PCR w celu dostosowanej amplifikacji końcowej biblioteki cDNA przed amplifikacją PCR na dużą skalę, oczyszczaniem i NGS na sekwenatorze o wysokiej przepustowości.

<table><tbody><tr><td>1% Triton x-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>10mM ATP</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10X dNTPs</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>14M Merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>O3445I-100</td><td></td></tr><tr><td>20 nt drabinka</td><td>Jena Bioscience</td><td>M-232S</td><td></td></tr><tr><td>20 mg / ml Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>B8894-5ML</td><td></td></tr><tr><td>50X Tytan Taq</td><td>Clontech Laboratories</td><td>639208</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Fisher Scientific</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>BRL Pionowy system elektroforezy żelowej ze szklanymi płytkami i grzebieniami</td><td>GIBCO</td><td>V16</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D9170-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka Eppendorf 5424R</td><td>USA scientific</td><td>4054-4537Q</td><td></td></tr><tr><td>Eppndorf Thermomixer</td><td>USA scientific</td><td>4053-8223Q</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; Silikonowane probówki wirówkowe o niskiej retencji 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Rurka do łamania żelu 0,5 ml</td><td>IST Engineering Inc,3388-100</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Aparat do elektroforezy żelowej 7 cm x 10 cm - Mini-sub Cell GT z tackami żelowymi i grzebieniami</td><td>Biorad</td><td>1704446</td><td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Jersey-Cote</td><td>LabScientific, Inc</td><td>1188</td><td></td></tr><tr><td>KcL 2M</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge Wirówka osobista dwuwirnikowa</td><td>USA scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Model V16 aparatura do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym, okulary, grzebienie i przekładki</td><td>Ciore Life Science</td><td>21070010</td><td></td></tr><tr><td>Oligonukleotydy</td><td>zdefiniowane IDT</td><td> podczas zamówienia</td><td></td></tr><tr><td>Owl EasyCast B2 mini system do elektroforezy - z tackami żelowymi i grzebieniami</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel Extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Enzym restrykcyjny PmeI</td><td>NEB</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNaz</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Nadajnik światła niebieskiego Safe Imager 2.0</td><td>Thermofisher</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE agaroza</td><td>Lonza</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny III zestaw do odwrotnej transkrypcji</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza RNA 1</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza RNA 2 Skrócony K227Q</td><td>NEB</td><td>0351L</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Themocykler z podgrzewaną pokrywą</td><td>Applied Biosystem</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH 7,5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sequagel system koncentrat, rozcieńczalnik i bufor Krajowy</td><td> Diagnostyka</td><td>EC-833</td><td></td></tr></tbody></table>

retrospektywne sekwencjonowanie mikrorna: protokół przygotowania komplementarnej biblioteki dna przy użyciu próbek rna zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

–Zarchiwizowane, klinicznie sklasyfikowane tkanki zatopione w parafinie (FFPE) mogą dostarczyć kwasów nukleinowych do retrospektywnych badań molekularnych rozwoju raka. Wykorzystując nieinwazyjne lub przednowotworowe zmiany u pacjentów, u których później rozwija się choroba inwazyjna, analizy ekspresji genów mogą pomóc w identyfikacji wczesnych zmian molekularnych, które predysponują do ryzyka zachorowania na raka. Zostało dobrze opisane, że kwasy nukleinowe odzyskane z tkanek FFPE uległy poważnym uszkodzeniom fizycznym i modyfikacjom chemicznym, co utrudnia ich analizę i generalnie wymaga dostosowanych testów. Jednak wykazano, że mikroRNA (miRNA), które reprezentują niewielką klasę cząsteczek RNA obejmujących tylko do ~18-24 nukleotydów, wytrzymują długotrwałe przechowywanie i zostały z powodzeniem przeanalizowane w próbkach FFPE. Poniżej przedstawiamy protokół przygotowania biblioteki 3' komplementarnego DNA z kodem kreskowym (cDNA) specjalnie zoptymalizowany do analizy małych RNA wyekstrahowanych z archiwalnych tkanek, który niedawno okazał się solidny i wysoce odtwarzalny przy użyciu zarchiwizowanych próbek klinicznych przechowywanych przez okres do 35 lat. To przygotowanie biblioteki jest dobrze przystosowane do analizy multipleksowej uszkodzonego/zdegradowanego materiału, w którym próbki RNA (do 18) są ligowane za pomocą pojedynczych adapterów z kodami kreskowymi 3', a następnie łączone razem w celu kolejnych preparatów enzymatycznych i biochemicznych przed analizą. Wszystkie oczyszczania są przeprowadzane za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), która umożliwia selekcję i wzbogacanie małych gatunków RNA oznaczonych kodami kreskowymi w zależności od wielkości. Ten preparat biblioteki cDNA jest dobrze przystosowany do drobnych wejść RNA, ponieważ pilotażowa reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) umożliwia określenie określonego cyklu amplifikacji w celu wytworzenia optymalnych ilości materiału do sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Podejście to zostało zoptymalizowane pod kątem wykorzystania zdegradowanego RNA FFPE z próbek archiwizowanych przez okres do 35 lat i zapewnia wysoce powtarzalne dane NGS.

Zgodnie z opisaną tutaj metodą, łącznie 18 oddzielnych próbek RNA z FFPE (po 100 ng każda) przygotowano w osobnych probówkach w celu przeprowadzenia nocnej ligacji T4 z adenylowanymi oligonukleotydami z kodem kreskowym na końcu 3'. Następnego dnia reakcje enzymatyczne zostają dezaktywowane termicznie, połączone i wytrącone w jednej probówce. Osad RNA zostaje resuspensowany, a ligowane cząsteczki RNA rozdzielone na 15% denaturującym żelu poliakrylamidowym (PAGE), gdzie markery wielkości ol...

Próbki zatopione w parafinie w formalinie stanowią cenne źródło molekularnych biomarkerów chorób ludzkich. W tym miejscu przedstawiamy laboratoryjny protokół przygotowania biblioteki cDNA, początkowo zaprojektowany ze świeżo mrożonym RNA i zoptymalizowany do analizy zarchiwizowanych mikroRNA z tkanek przechowywanych do 35 lat.

Retrospektywne sekwencjonowanie mikroRNA: protokół przygotowania komplementarnej biblioteki DNA przy użyciu próbek RNA zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Ogólnym celem tego przygotowania biblioteki CDNA jest umożliwienie pomyślnego sekwencjonowania małych RNA, które były przechowywane w formalnych i utrwalonych tkankach zatopionych w parafinie. Metoda ta jest bardzo przydatna do analizy formalnych i utrwalonych próbek zatopionych w parafinie. Ekstrahuje się RNA z maksymalnie 18 próbek, analizuje się zawartość wszystkich z nich i uzyskuje się profil wszystkich mikroRNaz dla wszystkich próbek.Aby rozpocząć protokół, dodaj 8,5 mikrolitra wcześniej przygotowanej mieszanki wzorcowej ligacji do każdej z 18 indywidualnie porcjowanych próbek FFPERNA. Delikatnie strzepnij probówki i wiruj przez dwie sekundy. Po odwirowaniu przechowuj probówki na lodzie.Za pomocą pipety o pojemności trzech mikrolitrów przenieś jeden mikrolitr każdego adaptera do odpowiednich próbek FFPERNA zawierających RNA i główną mieszankę ligacji. Nie pipetować w górę i w dół i wymieniać końcówki między próbkami FFPERNA. Zamknij każdą probówkę, przesuń je do wymieszania i odwiruj przez dwie sekundy.Ustaw probówki na lodzie. Denaturuj reakcje, umieszczając probówki na bloku grzewczym w temperaturze 90 stopni Celsjusza na jedną minutę, a następnie natychmiast umieść je na lodzie. Następnie za pomocą pipety o pojemności trzech mikrolitrów przenieś jeden mikrolitr rozcieńczonego enzymu ligacyjnego do każdej z 18 próbek RNA.Ustaw podwiązania na lodzie i umieść je w chłodnym pomieszczeniu o temperaturze czterech stopni Celsjusza na 18-godzinną inkubację przez noc. Umieść probówki na bloku grzewczym na jedną minutę w temperaturze 90 stopni Celsjusza, aby dezaktywować reakcję ligacji, a następnie umieść je z powrotem w lodzie na co najmniej dwie minuty, aby ostygły. Przenieś 1,2 mikrolitra głównej mieszanki opadów do każdej probówki.Dodaj 63 mikrolitry 100% etanolu. Zamknij każdą probówkę, przesuń probówki, aby się wymieszały, i odwiruj je przez dwie sekundy. Umieść probówki na lodzie.Połącz zawartość wszystkich 18 probówek w jedną silikonowaną probówkę o pojemności 1,5 mililitra i odwróć trzy razy, aby wymieszać. Odwiruj probówki przez dwie sekundy i umieść je na lodzie na 60 minut, aby się wytrąciły. Po wytrąceniu odwirować 1,5-mililitrową probówkę z połączonymi ligacjami.Następnie usuń supernatant za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety, ale pozostaw trochę płynu na dnie. Przechylić probówkę i użyć pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby usunąć pozostały supernatant. Odsysanie próżniowe supernatantu za pomocą pipety Pasteura z końcówką o pojemności 10 mikrolitrów, a następnie ponowne zawieś osad RNA w 20 mikrolitrach wody wolnej od RNaz, przesuwając rurkę.Dodaj 20 mikrolitrów roztworu ładującego żel PAA, aby ponownie zawiesić RNA. Przesuń probówkę, odwiruj probówkę przez dwie sekundy w temperaturze pokojowej i umieść probówkę na lodzie. Zastąp wcześniej przygotowane 0,5 XTBE aparatu żelowego świeżym 0,5 XTBE i załaduj ten ostatni, znaczniki wielkości i podwiązaną RNazę do środka żelu, pozostawiając dwie puste studzienki po obu stronach.Następnie uruchom żel. Po uruchomieniu żelu odrzuć stronę 15%, usuwając jedną ze szklanych płytek. Lekko spryskaj żel znajdujący się na szklanej płytce 10 mikrolitrami fluorescencyjnego roztworu barwnika i 25 mililitrami 0,5 XTBE i pozostaw płasko na pięć minut w ciemności.Połóż szklankę z żelem na transiluminatorze światła niebieskiego i wyrównaj zarówno 19 nukleotydów, jak i 24 znaczniki wielkości nukleotydów za pomocą linijki, aby skierować wycięcie ligowanych małych RNA. Następnie wyciąć żel. Umieść wycięty żel w 0,5-mililitrowej probówce przeznaczonej do fragmentacji plastrów żelu, bezpiecznie umieszczonej w 1,5 mililitrowej silikonowanej probówce do mikrowirówki.Odwirować żel w temperaturze 16 tysięcy razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Zawiesić rozdrobniony żel w 300 mikrolitrach 400-milimolowego roztworu chlorku sodu. Zamknij rurkę i uszczelnij ją folią parafinową.Wymieszaj zawartość w mikserze termicznym z prędkością 11 setek obr./min w chłodni o czterech stopniach Celsjusza w celu inkubacji przez noc. Następnego dnia wyjmij probówkę z termomiksera i za pomocą mililitrowej pipety przenieś roztwór na pięciomikrometrową rurkę filtracyjną, włożoną do 1,5 mililitrowej silikonowanej probówki zbiorczej wolnej od RNaz. Wirować probówkę przez trzy minuty w temperaturze 23 sto razy G w temperaturze pokojowej.Wyrzuć probówkę filtrującą, dodaj 950 mikrolitrów 100% etanolu do probówki zbiorczej zawierającej przefiltrowany roztwór i odwróć probówkę do wymieszania. Wiruj probówkę przez dwie sekundy i umieść ją na lodzie na 60 minut. Następnie wytrącić osad RNA.Następnie wysusz osad RNA, otwierając nakrętkę i ostrożnie usuwając supernatant za pomocą jednomililitrowej pipety, pozostawiając trochę płynu na dnie. Użyj pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby usunąć cały pozostały supernatant bez dotykania osadu. Przechyl rurkę tak, aby pozostały roztwór przesunął się na przeciwną stronę osadu.Za pomocą pipety Pasteura odessać supernatant i wysuszyć osad za pomocą próżni. Ponownie zawiesić osad RNA w 5,6 mikrolitrach wody wolnej od RNaz. Rozmrażaj odczynniki do odwrotnej transkrypcji na lodzie przez 15 minut.Ustaw reakcję odwrotnej transkrypcji, dodając trzy mikrolitry buforu 5X, 4,2 mikrolitrów trifosforanu dioksynukleotydu 10X lub DNTP i 1,5 mikrolitra ditiotreitolu lub DTT. Delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać reakcję i odwiruj przez dwie sekundy, aby zebrać roztwór. Po reakcji na bloku grzewczym w temperaturze 90 stopni Celsjusza dokładnie przez 30 sekund, przenieś ją bezpośrednio do miksera termicznego w temperaturze 50 stopni Celsjusza na dwie minuty, aby wyrównać temperaturę.Dodaj 0,75 mikrolitra enzymu odwrotnej transkrypcji bezpośrednio do roztworu. Delikatnie stuknij, aby wymieszać, i natychmiast umieść rurkę z powrotem na termomikserze w temperaturze 50 stopni Celsjusza na 30 minut. Po 30 minutach przenieś probówkę do bloku grzewczego o temperaturze 95 stopni Celsjusza na jedną minutę, aby zatrzymać odwrotną transkrypcję.Dodaj 95 mikrolitrów wody wolnej od RNaz bezpośrednio do odwrotnej transkrypcji. Przesuń probówkę, aby wymieszać i połóż ją bezpośrednio na lodzie na dwie minuty. Zmontuj pilotażową reakcję PCR i ustaw dwa cykle PCR na termocyklerze.Ustaw pilotażową reakcję PCR na termocyklerze i uruchom plik pierwszy. Na końcu pierwszego pliku użyj pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby przenieść 12 mikrolitrów z pilotażowej reakcji PCR do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówki zawierającej trzy mikrolitry barwnika ładującego żel 5X. Mieszać, pipetując w górę i w dół.I oznacz to jako 10 cykli. Zamknij probówkę pilotową do PCR i uruchom file drugi na termocyklerze. Na końcu pliku drugiego użyj pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby przenieść 12 mikrolitrów roztworu do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej z trzema mikrolitrami barwnika ładującego żel 5X i oznacz ją jako 12 cykli.Powtórz powyższe kroki, aby zebrać 12 mikrolitrów produktów PCR z pilotażowej reakcji PCR w cyklach PCR 14, 16, 18 i 20. Następnie dodaj trzy mikrolitry barwnika ładującego żel 5X do każdej z 12 mikrolitrowych podwielokrotności PCR oraz do 20 drabinek nukleotydowych zawierających trzy mikrolitry drabinki i dziewięć mikrolitrów wody wolnej od RNaz. Po umieszczeniu próbek w żelu agarozowym z 0,5 XTBE, należy ocenić żel w pudełku UV, aby określić optymalny cykl PCR.Następnie skonfiguruj reakcje PCR na dużą skalę do oczyszczania biblioteki żelu agarozowego. Po amplifikacji PCR przenieś dziewięć mikrolitrów z każdej probówki PCR do sześciu 1,5 mililitrowych probówek mikrowirówek, zawierających trzy mikrolitry barwnika 5X ładującego żel. Przygotuj drabinę 20 nukleotydów.Załaduj drabinę, ujemną kontrolę PCR i sześć produktów PCR na żel agarozowy i uruchom żel na 30 minut przy napięciu 120 woltów. Sprawdź jednorodność implizacji PCR między liniami na pudełku UV i zrób zdjęcie. Połącz trzy reakcje PCR w dwóch 1,5-mililitrowych silikonowanych probówkach do mikrowirówek, dodaj 27 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i 950 mikrolitrów 100% etanolu.Odwróć probówki do wymieszania i ustaw je na 20 stopni Celsjusza na noc, aby wytrącić produkty PCR. Korzystając z protokołu, ustalono korelację ekspresji mikro RNA między dwoma świeżo mrożonymi RNA guza a ich specyficznymi odpowiednikami w próbkach FFPERNA. Wykresy między dopasowanymi świeżo mrożonymi i FFPE mikro RNA wskazują, że przygotowanie biblioteki CDNA zapewnia dobrą odtwarzalność, ponieważ istnieje wysoka korelacja między mikroRNA wykrytymi w próbkach przetwarzanych w różny sposób.Aby ustalić, czy zoptymalizowany protokół przygotowania biblioteki CNDA ma zastosowanie i jest odtwarzalny z coraz starszymi próbkami FFPE, uzyskano profile ekspresji mikro RNA z tkanek FFPE zarchiwizowanych przez 18, 20, 22, 27, 30 i 35 lat. Współczynnik korelacji utrzymywał się powyżej 0,96 niezależnie od wieku okazu czy tygodnia przygotowań bibliotecznych. W związku z tym zoptymalizowany protokół przygotowania biblioteki CDNA zapewnia solidne narzędzie do powtarzalnej analizy próbek FFPE, niezależnie od czasu ich archiwizacji.Tak więc po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować swoje małe biblioteki RNA i uzyskać pełny profil mikroekspresji wszystkich swoich cennych formalnych i utrwalonych próbek zatopionych w parafinie.

retrospective-microrna-sequencing-complementary-dna-library

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Ten zmodyfikowany protokół ekstrakcji poprawia wydajność RNA i DNA z bardziej precyzyjnie wybranych obszarów zainteresowania w histopatologicznych blokach tkankowych.

Przygotowanie utrwalonych w formalinie rdzeni tkankowych zatopionych w parafinie do ekstrakcji RNA i DNA

Ten protokół zawiera przegląd procedur izolacji RNA do transkryptomicznego profilowania tkanek węzłów chłonnych od dużych zwierząt, w tym etapy identyfikacji i wycinania węzłów chłonnych od zwierząt gospodarskich i dzikich, podejścia do pobierania próbek w celu zapewnienia spójności wśród wielu zwierząt, oraz rozważania oraz reprezentatywne wyniki dotyczące konserwacji i przetwarzania po pobraniu do analizy RNA.

Pobieranie i przetwarzanie węzłów chłonnych od dużych zwierząt do analizy RNA: przygotowanie do badań transkryptomicznych węzłów chłonnych dużych gatunków zwierząt

Ten protokół dostarcza badaczom nowego narzędzia do monitorowania wierności transkrypcji w wielu organizmach modelowych.

Nadzór całego genomu nad błędami transkrypcji w organizmach eukariotycznych

Koliste RNA (circRNA) to niekodujące RNA, które mogą odgrywać rolę w regulacji transkrypcji i pośredniczeniu w interakcjach między białkami. Po dokonaniu oceny różnych parametrów budowy bibliotek sekwencjonowania circRNA, opracowano protokół wykorzystujący przygotowanie biblioteki nici całkowitego RNA ze wstępną obróbką RNazy R i przedstawiono go tutaj.

Identyfikacja kolistych RNA za pomocą sekwencjonowania RNA

Prezentujemy szczegółowy protokół naprawy małej biblioteki RNA z mniejszym odchyleniem niż standardowe metody i zwiększoną czułością dla 2'-O-metylowych RNA. Protokół ten można przestrzegać, używając domowych odczynników w celu zaoszczędzenia kosztów lub używając zestawów dla wygody.

Poprawa sekwencji małych RNA: mniej błędów systematycznych i lepsze wykrywanie 2'-O-metylowych RNA

Oporność na terapię często rozwija się u pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty, a w niektórych przypadkach rak rozwija się do śmiertelnego podtypu zwanego neuroendokrynnym rakiem prostaty. Ocena niewielkich zmian molekularnych za pośrednictwem niekodującego RNA, które ułatwiają to przejście, pozwoliłaby na lepszą stratyfikację choroby i identyfikację mechanizmów przyczynowych, które prowadzą do rozwoju neuroendokrynnego raka gruczołu krokowego.

Sekwencjonowanie małego niekodującego RNA z tkanek utrwalonych formaliną i egzosomów pochodzących z surowicy od pacjentów z opornym na kastrację rakiem prostaty

Opisujemy technikę profilowania mikroRNA we wczesnych zarodkach myszy. Protokół ten pozwala przezwyciężyć wyzwanie związane z niskim wkładem komórek i wzbogaceniem małego RNA. Test ten można wykorzystać do analizy zmian w ekspresji miRNA w czasie w różnych liniach komórkowych wczesnego zarodka myszy.

Przygotowanie małych bibliotek RNA do sekwencjonowania z wczesnych zarodków myszy

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

W tym miejscu przedstawiamy protokół badania metylacji DNA w całym genomie w klinicznych badaniach przesiewowych pacjentów na dużą skalę przy użyciu technologii sekwencjonowania Methyl-Binding DNA Capture (MBDCap-seq lub MBD-seq) i późniejszej analizy bioinformatycznej.

Wychwytywanie DNA wiążącego metyl Sekwencjonowanie tkanek pacjenta

Poznaj protokół przygotowania biblioteki cDNA do retrospektywnego sekwencjonowania mikroRNA z próbek RNA zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie. Metoda umożliwia analizę archiwalnych tkanek nawet do 35 lat.

Retrospektywne sekwencjonowanie mikroRNA: protokół przygotowania komplementarnej biblioteki DNA przy użyciu próbek RNA zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie (Wideo) | JoVE Journal

Retrospektywne sekwencjonowanie mikroRNA: protokół przygotowania komplementarnej biblioteki DNA przy użyciu próbek RNA zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Przeglądaj więcej filmów