Retrospektywne sekwencjonowanie mikroRNA: protokół przygotowania komplementarnej biblioteki DNA przy użyciu próbek RNA zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie

Ogólnym celem tego przygotowania biblioteki CDNA jest umożliwienie pomyślnego sekwencjonowania małych RNA, które były przechowywane w formalnych i utrwalonych tkankach zatopionych w parafinie. Metoda ta jest bardzo przydatna do analizy formalnych i utrwalonych próbek zatopionych w parafinie. Ekstrahuje się RNA z maksymalnie 18 próbek, analizuje się zawartość wszystkich z nich i uzyskuje się profil wszystkich mikroRNaz dla wszystkich próbek.

Aby rozpocząć protokół, dodaj 8,5 mikrolitra wcześniej przygotowanej mieszanki wzorcowej ligacji do każdej z 18 indywidualnie porcjowanych próbek FFPERNA. Delikatnie strzepnij probówki i wiruj przez dwie sekundy. Po odwirowaniu przechowuj probówki na lodzie.

Za pomocą pipety o pojemności trzech mikrolitrów przenieś jeden mikrolitr każdego adaptera do odpowiednich próbek FFPERNA zawierających RNA i główną mieszankę ligacji. Nie pipetować w górę i w dół i wymieniać końcówki między próbkami FFPERNA. Zamknij każdą probówkę, przesuń je do wymieszania i odwiruj przez dwie sekundy.

Ustaw probówki na lodzie. Denaturuj reakcje, umieszczając probówki na bloku grzewczym w temperaturze 90 stopni Celsjusza na jedną minutę, a następnie natychmiast umieść je na lodzie. Następnie za pomocą pipety o pojemności trzech mikrolitrów przenieś jeden mikrolitr rozcieńczonego enzymu ligacyjnego do każdej z 18 próbek RNA.

Ustaw podwiązania na lodzie i umieść je w chłodnym pomieszczeniu o temperaturze czterech stopni Celsjusza na 18-godzinną inkubację przez noc. Umieść probówki na bloku grzewczym na jedną minutę w temperaturze 90 stopni Celsjusza, aby dezaktywować reakcję ligacji, a następnie umieść je z powrotem w lodzie na co najmniej dwie minuty, aby ostygły. Przenieś 1,2 mikrolitra głównej mieszanki opadów do każdej probówki.

Dodaj 63 mikrolitry 100% etanolu. Zamknij każdą probówkę, przesuń probówki, aby się wymieszały, i odwiruj je przez dwie sekundy. Umieść probówki na lodzie.

Połącz zawartość wszystkich 18 probówek w jedną silikonowaną probówkę o pojemności 1,5 mililitra i odwróć trzy razy, aby wymieszać. Odwiruj probówki przez dwie sekundy i umieść je na lodzie na 60 minut, aby się wytrąciły. Po wytrąceniu odwirować 1,5-mililitrową probówkę z połączonymi ligacjami.

Następnie usuń supernatant za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety, ale pozostaw trochę płynu na dnie. Przechylić probówkę i użyć pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby usunąć pozostały supernatant. Odsysanie próżniowe supernatantu za pomocą pipety Pasteura z końcówką o pojemności 10 mikrolitrów, a następnie ponowne zawieś osad RNA w 20 mikrolitrach wody wolnej od RNaz, przesuwając rurkę.

Dodaj 20 mikrolitrów roztworu ładującego żel PAA, aby ponownie zawiesić RNA. Przesuń probówkę, odwiruj probówkę przez dwie sekundy w temperaturze pokojowej i umieść probówkę na lodzie. Zastąp wcześniej przygotowane 0,5 XTBE aparatu żelowego świeżym 0,5 XTBE i załaduj ten ostatni, znaczniki wielkości i podwiązaną RNazę do środka żelu, pozostawiając dwie puste studzienki po obu stronach.

Następnie uruchom żel. Po uruchomieniu żelu odrzuć stronę 15%, usuwając jedną ze szklanych płytek. Lekko spryskaj żel znajdujący się na szklanej płytce 10 mikrolitrami fluorescencyjnego roztworu barwnika i 25 mililitrami 0,5 XTBE i pozostaw płasko na pięć minut w ciemności.

Połóż szklankę z żelem na transiluminatorze światła niebieskiego i wyrównaj zarówno 19 nukleotydów, jak i 24 znaczniki wielkości nukleotydów za pomocą linijki, aby skierować wycięcie ligowanych małych RNA. Następnie wyciąć żel. Umieść wycięty żel w 0,5-mililitrowej probówce przeznaczonej do fragmentacji plastrów żelu, bezpiecznie umieszczonej w 1,5 mililitrowej silikonowanej probówce do mikrowirówki.

Odwirować żel w temperaturze 16 tysięcy razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Zawiesić rozdrobniony żel w 300 mikrolitrach 400-milimolowego roztworu chlorku sodu. Zamknij rurkę i uszczelnij ją folią parafinową.

Wymieszaj zawartość w mikserze termicznym z prędkością 11 setek obr./min w chłodni o czterech stopniach Celsjusza w celu inkubacji przez noc. Następnego dnia wyjmij probówkę z termomiksera i za pomocą mililitrowej pipety przenieś roztwór na pięciomikrometrową rurkę filtracyjną, włożoną do 1,5 mililitrowej silikonowanej probówki zbiorczej wolnej od RNaz. Wirować probówkę przez trzy minuty w temperaturze 23 sto razy G w temperaturze pokojowej.

Wyrzuć probówkę filtrującą, dodaj 950 mikrolitrów 100% etanolu do probówki zbiorczej zawierającej przefiltrowany roztwór i odwróć probówkę do wymieszania. Wiruj probówkę przez dwie sekundy i umieść ją na lodzie na 60 minut. Następnie wytrącić osad RNA.

Następnie wysusz osad RNA, otwierając nakrętkę i ostrożnie usuwając supernatant za pomocą jednomililitrowej pipety, pozostawiając trochę płynu na dnie. Użyj pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby usunąć cały pozostały supernatant bez dotykania osadu. Przechyl rurkę tak, aby pozostały roztwór przesunął się na przeciwną stronę osadu.

Za pomocą pipety Pasteura odessać supernatant i wysuszyć osad za pomocą próżni. Ponownie zawiesić osad RNA w 5,6 mikrolitrach wody wolnej od RNaz. Rozmrażaj odczynniki do odwrotnej transkrypcji na lodzie przez 15 minut.

Ustaw reakcję odwrotnej transkrypcji, dodając trzy mikrolitry buforu 5X, 4,2 mikrolitrów trifosforanu dioksynukleotydu 10X lub DNTP i 1,5 mikrolitra ditiotreitolu lub DTT. Delikatnie przesuń probówkę, aby wymieszać reakcję i odwiruj przez dwie sekundy, aby zebrać roztwór. Po reakcji na bloku grzewczym w temperaturze 90 stopni Celsjusza dokładnie przez 30 sekund, przenieś ją bezpośrednio do miksera termicznego w temperaturze 50 stopni Celsjusza na dwie minuty, aby wyrównać temperaturę.

Dodaj 0,75 mikrolitra enzymu odwrotnej transkrypcji bezpośrednio do roztworu. Delikatnie stuknij, aby wymieszać, i natychmiast umieść rurkę z powrotem na termomikserze w temperaturze 50 stopni Celsjusza na 30 minut. Po 30 minutach przenieś probówkę do bloku grzewczego o temperaturze 95 stopni Celsjusza na jedną minutę, aby zatrzymać odwrotną transkrypcję.

Dodaj 95 mikrolitrów wody wolnej od RNaz bezpośrednio do odwrotnej transkrypcji. Przesuń probówkę, aby wymieszać i połóż ją bezpośrednio na lodzie na dwie minuty. Zmontuj pilotażową reakcję PCR i ustaw dwa cykle PCR na termocyklerze.

Ustaw pilotażową reakcję PCR na termocyklerze i uruchom plik pierwszy. Na końcu pierwszego pliku użyj pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby przenieść 12 mikrolitrów z pilotażowej reakcji PCR do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówki zawierającej trzy mikrolitry barwnika ładującego żel 5X. Mieszać, pipetując w górę i w dół.

I oznacz to jako 10 cykli. Zamknij probówkę pilotową do PCR i uruchom file drugi na termocyklerze. Na końcu pliku drugiego użyj pipety o pojemności 20 mikrolitrów, aby przenieść 12 mikrolitrów roztworu do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej z trzema mikrolitrami barwnika ładującego żel 5X i oznacz ją jako 12 cykli.

Powtórz powyższe kroki, aby zebrać 12 mikrolitrów produktów PCR z pilotażowej reakcji PCR w cyklach PCR 14, 16, 18 i 20. Następnie dodaj trzy mikrolitry barwnika ładującego żel 5X do każdej z 12 mikrolitrowych podwielokrotności PCR oraz do 20 drabinek nukleotydowych zawierających trzy mikrolitry drabinki i dziewięć mikrolitrów wody wolnej od RNaz. Po umieszczeniu próbek w żelu agarozowym z 0,5 XTBE, należy ocenić żel w pudełku UV, aby określić optymalny cykl PCR.

Następnie skonfiguruj reakcje PCR na dużą skalę do oczyszczania biblioteki żelu agarozowego. Po amplifikacji PCR przenieś dziewięć mikrolitrów z każdej probówki PCR do sześciu 1,5 mililitrowych probówek mikrowirówek, zawierających trzy mikrolitry barwnika 5X ładującego żel. Przygotuj drabinę 20 nukleotydów.

Załaduj drabinę, ujemną kontrolę PCR i sześć produktów PCR na żel agarozowy i uruchom żel na 30 minut przy napięciu 120 woltów. Sprawdź jednorodność implizacji PCR między liniami na pudełku UV i zrób zdjęcie. Połącz trzy reakcje PCR w dwóch 1,5-mililitrowych silikonowanych probówkach do mikrowirówek, dodaj 27 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i 950 mikrolitrów 100% etanolu.

Odwróć probówki do wymieszania i ustaw je na 20 stopni Celsjusza na noc, aby wytrącić produkty PCR. Korzystając z protokołu, ustalono korelację ekspresji mikro RNA między dwoma świeżo mrożonymi RNA guza a ich specyficznymi odpowiednikami w próbkach FFPERNA. Wykresy między dopasowanymi świeżo mrożonymi i FFPE mikro RNA wskazują, że przygotowanie biblioteki CDNA zapewnia dobrą odtwarzalność, ponieważ istnieje wysoka korelacja między mikroRNA wykrytymi w próbkach przetwarzanych w różny sposób.

Aby ustalić, czy zoptymalizowany protokół przygotowania biblioteki CNDA ma zastosowanie i jest odtwarzalny z coraz starszymi próbkami FFPE, uzyskano profile ekspresji mikro RNA z tkanek FFPE zarchiwizowanych przez 18, 20, 22, 27, 30 i 35 lat. Współczynnik korelacji utrzymywał się powyżej 0,96 niezależnie od wieku okazu czy tygodnia przygotowań bibliotecznych. W związku z tym zoptymalizowany protokół przygotowania biblioteki CDNA zapewnia solidne narzędzie do powtarzalnej analizy próbek FFPE, niezależnie od czasu ich archiwizacji.

Tak więc po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować swoje małe biblioteki RNA i uzyskać pełny profil mikroekspresji wszystkich swoich cennych formalnych i utrwalonych próbek zatopionych w parafinie.