Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu
2 sierpnia 2018
Przeciwciała, które wiążą się z docelowymi receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany konformacji i grupowania. Te dynamiczne zmiany mają implikacje dla charakterystyki rozwoju leków w komórkach docelowych. Protokół ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną i spektroskopię korelacji obrazów za pomocą ImageJ/FIJI w celu ilościowego określenia zakresu grupowania receptorów na powierzchni komórki.
Ogólnym celem tego protokołu spektroskopii korelacji obrazów jest zapewnienie dostępnej metodologii kwantyfikacji zdarzeń grupowania zachodzących na powierzchni komórki. Przeciwciała, które wiążą się z receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany potwierdzające i grupujące. Analizy tych dynamicznych procesów są ważne dla charakterystyki celów leków.
Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia dostępną metodologię kwantyfikacji zdarzeń grupowania na powierzchni komórki przy użyciu łatwo dostępnej aparatury do obrazowania. Aby rozpocząć, zasiej 10 000 komórek raka naskórka A431 do każdej studzienki ośmiokomorowego szkiełka obrazowego. Następnego dnia natychmiast dodaj 100 nanogramów na mililitr liganda EGF do komórek, aby stymulować agregację receptora EGF.
Inkubować komórki z ligandem w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed ich utrwaleniem. Następnie postępuj zgodnie z protokołem immunocytochemii i obrazowania konfokalnego zawartym w dołączonym protokole tekstowym, zwracając szczególną uwagę na ustawienia używane podczas zbierania, i załaduj uzyskane zestawy danych na Fidżi. Należy unikać nadmiernego nasycenia.
Końcowe obrazy muszą zawierać piksele o rozmiarach mniejszych niż 1 mikron do kwadratu. Dodatkowo uchwyć płaską powierzchnię na powierzchni wierzchołkowej lub podstawnej, a także obszar wolny od komórek w celu późniejszej normalizacji próbki. Zacznij od zidentyfikowania obszaru błony wierzchołkowej lub podstawnej powierzchni komórki, który jest przedmiotem zainteresowania na pierwszym obrazie.
Wybierz rozmiar piksela od 2 do n w zakresie 256 na 256, 128 na 128 lub 64 na 64. Następnie przejdź do menu obrazu i wybierz duplikat. Następnie przejdź do analizy i w dół do pomiarów.
Oblicz średnią intensywność przyciętego obszaru zainteresowania. Teraz zidentyfikuj obszar tła o tym samym rozmiarze co oryginalny obraz. Zduplikuj go jak poprzednio.
I oblicz średnią intensywność przyciętego obszaru zainteresowania w tle. Po zmierzeniu zarówno obszaru zainteresowania, jak i tła, przejdź do procesu i wybierz kalkulator obrazu. Umieść obszar zainteresowania jako Obraz 1, a obraz tła jako Obraz 2, a następnie wybierz opcję Odejmij jako operację.
Następnie przejdź do menu procesu. Zejdź do FFT i wybierz FD Math. W oknie dialogowym matematyki FFT wybierz opcję wprowadź obrazy, jak pokazano tutaj, i ustaw operację na korelacyjną.
Upewnij się, że transformacja odwrotna jest włączona. Znormalizuj wynikowy obraz, wybierając proces, przewijając w dół do pozycji matematycznej, wybierając opcję dzielenia i wprowadzając całkowitą liczbę pikseli w oknie dialogowym. Następnie ponownie znormalizuj, dzieląc przez średnią intensywność znormalizowanego przyciętego obszaru podniesionego do kwadratu.
Następnie narysuj linię przechodzącą przez funkcję rozrzutu punktowego. Wykreśl profil tej linii, aby obliczyć wartość szczytową, przechodząc do sekcji Analiza i wybierając opcję Kreśl profil. Oblicz klastry na obszar belki, przenosząc wartość szczytową do arkusza kalkulacyjnego.
Następnie ustaw klastry na obszar wiązki równe jeden powyżej wartości szczytowej minus jeden. W celu przetwarzania wsadowego obrazów zaleca się utworzenie makra Fidżi. Pozwala to na spójną i szybką analizę wielu obrazów konfokalnych w celu analizy spektroskopii korelacji obrazu.
Aby ustanowić makro dla przepływu pracy spektroskopii korelacji obrazu, należy skonfigurować program do rejestrowania każdego polecenia menu w protokole. W tym celu przejdź do wtyczek, w dół do marcos i wybierz nagrywanie. Następnie wróć do głównego okna i uruchom protokół opisany w poprzedniej sekcji tego filmu.
Po zakończeniu wróć do okna makra i wybierz pozycję Utwórz, aby wygenerować makro. Następnie w oknie edycji makr należy wybrać język jako makro LJ1. Jeśli ta opcja nie zostanie wybrana, nie będzie można uruchomić programu.
Na koniec zapisz makro. Funkcja transferu optycznego mikroskopu zapewnia, że nawet obiekty o rozmiarach molekularnych pojawiają się jako obrazy w skali od 200 do 300 nanometrów w płaszczyźnie XY. Obrazując podrozdzielcze kulki frezyny w taki sam sposób jak komórki, jak opisano w tym protokole, można obliczyć obszar funkcji rozrzutu punktowego mikroskopu.
Obrazy te reprezentują stymulowane EGF i niesymulowane przylegające komórki raka naskórka A431 znakowane pierwotnym przeciwciałem cetuksymabu skierowanym do receptora EGF na powierzchni komórki. Żółte pola reprezentują błonę komórkową zawierającą obszary przycięcia o wymiarach pikseli 64 na 64. Obrazy te wykorzystano do przeprowadzenia analizy spektroskopii korelacji obrazów.
Po normalizacji funkcji autokorelacji, funkcję rozrzutu punktowego można zmierzyć za pomocą narzędzia linii. Profil tej funkcji liniowej jest wykreślany w celu wykrycia wartości szczytowej. Stosując te metody, zaobserwowano, że stymulacja EGF indukuje 2,56-krotny spadek wykrywanych klastrów EGFR na obszar wiązki w porównaniu z komórkami niestymulowanymi.
Po opanowaniu analiza obrazów konfokalnych zajmie tylko kilka minut na obraz. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby zebrać wiele powtórzeń każdego warunku eksperymentalnego przy użyciu ustawień opisanych w tym protokole. Zgodnie z tą procedurą, spektroskopia korelacji obrazów może zostać rozszerzona w celu zbadania czasowych zmian zdarzeń grupowania w żywych komórkach za pomocą mikroskopii poklatkowej.
Po opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do badania stanów agregacji wyższego rzędu przy użyciu ICS do wybielania fotograficznego oraz kolokalizacji dwóch białek błonowych przy użyciu metodologii spektroskopii korelacji krzyżowej obrazu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obliczyć stan skupienia interesującej Cię cząsteczki na powierzchni komórki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodologię ilościowego określania skupień receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazów. Technika ta jest kluczowa dla zrozumienia charakteryzacji celów leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Farmakologia
Tło
- Przeciwciała mogą wywoływać zmiany konformacyjne w receptorach na powierzchni komórki.
- Skupienia receptorów są istotne dla rozwoju leków.
- Spektroskopia korelacji obrazów umożliwia szczegółową analizę tych procesów.
- Dostępne techniki obrazowania ułatwiają szersze zastosowania badań.
Cel badania
- Ilościowe określenie zdarzeń skupiania na powierzchni komórki.
- Dostarczenie niezawodnego protokołu dla badaczy.
- Poprawa rozumienia dynamiki receptorów w celowaniach leków.
Zastosowanie metod
- Mikroskopia konfokalna
- Spektroskopia korelacji obrazów
- Zastosowanie oprogramowania ImageJ/FIJI
- Sianie komórek i stymulacja ligandem EGF
Główne wyniki
- Uzyskano ilościowe określenie skupień receptorów.
- Wykazano wpływ EGF na agregację receptorów.
- Podano jasną metodologię dla przyszłych badań.
- Podkreślono znaczenie dynamiki receptorów w rozwoju leków.
Wnioski
- Protokół jest skuteczny w badaniu skupień receptorów.
- Dostępne metody obrazowania mogą rozwijać badania nad celami leków.
- Rozumienie dynamiki receptorów jest kluczowe dla zastosowań farmakologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying receptor aggregation on the cell surface provides critical insights into target engagement and mechanism of action for antibody-based therapeutics. This methodology enables preclinical assessment of receptor dynamics, supporting target validation and lead optimization by linking ligand-induced clustering to functional outcomes. Accessible confocal-based image correlation spectroscopy offers a scalable approach to de-risk therapeutic candidates through quantitative, reproducible measurements of membrane protein organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypothesis by quantifying ligand-induced receptor clustering as a functional readout of target engagement.
- Operational Value: Supports biological de-risking through standardized, reproducible assessment of receptor aggregation states using widely available confocal microscopy.
- Predictive Value: Provides quantitative data on receptor clustering that informs target confidence and portfolio triage decisions in early discovery.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline receptor clustering metrics under controlled conditions.
- Reproducibility: Delivers quantitative, normalized outputs suitable for assay standardization and cross-laboratory comparability in target validation workflows.
- Scalability: Enables high-throughput analysis via Fiji macro automation, supporting consistent evaluation of compound effects on receptor dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses EGFR in A431 cells as a disease-relevant system to model receptor aggregation mechanisms applicable to oncology targets.
- Translational Continuity: Bridges discovery observations with preclinical validation by quantifying receptor dynamics that correlate with internalization and signaling outcomes.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypic effects stem from receptor aggregation, reducing ambiguity in mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead identification, providing quantitative receptor clustering data that informs hit-to-lead progression and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring ligand-induced changes in receptor organization as a direct functional output of target modulation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts on receptor clustering that enable reliable comparison across experimental conditions and compound treatments.
- Analytics: Generates normalized cluster density measurements per beam area, enabling statistical comparison of aggregation states under stimulated vs. basal conditions.
- Translational Research: Connects in vitro receptor dynamics to preclinical relevance by modeling EGFR aggregation mechanisms observed in tumorigenic cell lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline via Fiji macros, allowing consistent application across multiple targets and experimental settings.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct quantification of receptor clustering events.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined imaging parameters, normalization protocols, and automated macro-based analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking target engagement metrics to functional receptor aggregation, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on receptor dynamics that inform advancement decisions in preclinical pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, fluorescent immunocytochemistry, and image analysis using Fiji/ImageJ.
- Dependent on access to confocal laser scanning microscopes with appropriate laser lines and detectors for fluorophore excitation.
- Necessitates standardization of cell seeding density, ligand stimulation timing, and imaging settings across experimental replicates.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different receptor systems, cell types, or fluorescent labels beyond EGFR and cetuximab.
- Limited to fixed-cell analysis in this protocol; temporal dynamics in live cells would require additional validation and optimization for time-lapse applications.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:39
Calculation of Image Correlation Spectroscopy
3:43
Batch Processing of ICS Datasets and Calculation of the Microscope s Beam Area
4:59
Results: Image Correlation Spectroscopy Detects Clusters on the Cell Surface of Adherent Cancer Cells
5:55
Conclusion
