Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu

Ogólnym celem tego protokołu spektroskopii korelacji obrazów jest zapewnienie dostępnej metodologii kwantyfikacji zdarzeń grupowania zachodzących na powierzchni komórki. Przeciwciała, które wiążą się z receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany potwierdzające i grupujące. Analizy tych dynamicznych procesów są ważne dla charakterystyki celów leków.

Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia dostępną metodologię kwantyfikacji zdarzeń grupowania na powierzchni komórki przy użyciu łatwo dostępnej aparatury do obrazowania. Aby rozpocząć, zasiej 10 000 komórek raka naskórka A431 do każdej studzienki ośmiokomorowego szkiełka obrazowego. Następnego dnia natychmiast dodaj 100 nanogramów na mililitr liganda EGF do komórek, aby stymulować agregację receptora EGF.

Inkubować komórki z ligandem w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed ich utrwaleniem. Następnie postępuj zgodnie z protokołem immunocytochemii i obrazowania konfokalnego zawartym w dołączonym protokole tekstowym, zwracając szczególną uwagę na ustawienia używane podczas zbierania, i załaduj uzyskane zestawy danych na Fidżi. Należy unikać nadmiernego nasycenia.

Końcowe obrazy muszą zawierać piksele o rozmiarach mniejszych niż 1 mikron do kwadratu. Dodatkowo uchwyć płaską powierzchnię na powierzchni wierzchołkowej lub podstawnej, a także obszar wolny od komórek w celu późniejszej normalizacji próbki. Zacznij od zidentyfikowania obszaru błony wierzchołkowej lub podstawnej powierzchni komórki, który jest przedmiotem zainteresowania na pierwszym obrazie.

Wybierz rozmiar piksela od 2 do n w zakresie 256 na 256, 128 na 128 lub 64 na 64. Następnie przejdź do menu obrazu i wybierz duplikat. Następnie przejdź do analizy i w dół do pomiarów.

Oblicz średnią intensywność przyciętego obszaru zainteresowania. Teraz zidentyfikuj obszar tła o tym samym rozmiarze co oryginalny obraz. Zduplikuj go jak poprzednio.

I oblicz średnią intensywność przyciętego obszaru zainteresowania w tle. Po zmierzeniu zarówno obszaru zainteresowania, jak i tła, przejdź do procesu i wybierz kalkulator obrazu. Umieść obszar zainteresowania jako Obraz 1, a obraz tła jako Obraz 2, a następnie wybierz opcję Odejmij jako operację.

Następnie przejdź do menu procesu. Zejdź do FFT i wybierz FD Math. W oknie dialogowym matematyki FFT wybierz opcję wprowadź obrazy, jak pokazano tutaj, i ustaw operację na korelacyjną.

Upewnij się, że transformacja odwrotna jest włączona. Znormalizuj wynikowy obraz, wybierając proces, przewijając w dół do pozycji matematycznej, wybierając opcję dzielenia i wprowadzając całkowitą liczbę pikseli w oknie dialogowym. Następnie ponownie znormalizuj, dzieląc przez średnią intensywność znormalizowanego przyciętego obszaru podniesionego do kwadratu.

Następnie narysuj linię przechodzącą przez funkcję rozrzutu punktowego. Wykreśl profil tej linii, aby obliczyć wartość szczytową, przechodząc do sekcji Analiza i wybierając opcję Kreśl profil. Oblicz klastry na obszar belki, przenosząc wartość szczytową do arkusza kalkulacyjnego.

Następnie ustaw klastry na obszar wiązki równe jeden powyżej wartości szczytowej minus jeden. W celu przetwarzania wsadowego obrazów zaleca się utworzenie makra Fidżi. Pozwala to na spójną i szybką analizę wielu obrazów konfokalnych w celu analizy spektroskopii korelacji obrazu.

Aby ustanowić makro dla przepływu pracy spektroskopii korelacji obrazu, należy skonfigurować program do rejestrowania każdego polecenia menu w protokole. W tym celu przejdź do wtyczek, w dół do marcos i wybierz nagrywanie. Następnie wróć do głównego okna i uruchom protokół opisany w poprzedniej sekcji tego filmu.

Po zakończeniu wróć do okna makra i wybierz pozycję Utwórz, aby wygenerować makro. Następnie w oknie edycji makr należy wybrać język jako makro LJ1. Jeśli ta opcja nie zostanie wybrana, nie będzie można uruchomić programu.

Na koniec zapisz makro. Funkcja transferu optycznego mikroskopu zapewnia, że nawet obiekty o rozmiarach molekularnych pojawiają się jako obrazy w skali od 200 do 300 nanometrów w płaszczyźnie XY. Obrazując podrozdzielcze kulki frezyny w taki sam sposób jak komórki, jak opisano w tym protokole, można obliczyć obszar funkcji rozrzutu punktowego mikroskopu.

Obrazy te reprezentują stymulowane EGF i niesymulowane przylegające komórki raka naskórka A431 znakowane pierwotnym przeciwciałem cetuksymabu skierowanym do receptora EGF na powierzchni komórki. Żółte pola reprezentują błonę komórkową zawierającą obszary przycięcia o wymiarach pikseli 64 na 64. Obrazy te wykorzystano do przeprowadzenia analizy spektroskopii korelacji obrazów.

Po normalizacji funkcji autokorelacji, funkcję rozrzutu punktowego można zmierzyć za pomocą narzędzia linii. Profil tej funkcji liniowej jest wykreślany w celu wykrycia wartości szczytowej. Stosując te metody, zaobserwowano, że stymulacja EGF indukuje 2,56-krotny spadek wykrywanych klastrów EGFR na obszar wiązki w porównaniu z komórkami niestymulowanymi.

Po opanowaniu analiza obrazów konfokalnych zajmie tylko kilka minut na obraz. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby zebrać wiele powtórzeń każdego warunku eksperymentalnego przy użyciu ustawień opisanych w tym protokole. Zgodnie z tą procedurą, spektroskopia korelacji obrazów może zostać rozszerzona w celu zbadania czasowych zmian zdarzeń grupowania w żywych komórkach za pomocą mikroskopii poklatkowej.

Po opracowaniu technika ta utorowała naukowcom drogę do badania stanów agregacji wyższego rzędu przy użyciu ICS do wybielania fotograficznego oraz kolokalizacji dwóch białek błonowych przy użyciu metodologii spektroskopii korelacji krzyżowej obrazu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obliczyć stan skupienia interesującej Cię cząsteczki na powierzchni komórki.