Name: Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Poznaj metodę spektroskopii korelacji obrazu do ilościowej analizy agregacji receptorów na powierzchni komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki receptorów w badaniach nad celami leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują za wsparcie finansowe od NHMRC (Fellowship 1084178 and Grants 1087850, 1030469, 1075898 (AMS)), Cancer Australia, Ludwig Cancer Research, John T Reid Trusts, Cure Brain Cancer Foundation, La Trobe University i Victoria Cancer Agency. Docenia się również finansowanie z Programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej zapewnionego przez rząd stanu Wiktoria w Australii.

1. Wysiew adhezyjnych linii komórkowych do eksperymentu obrazowania
<ol>
	<li>Wysiać 10 000 komórek raka naskórkowego A431 na studnię, inkubując je przez noc (O/N) w 300 µL pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) zawierającej 10% płatkowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% penicyliny-streptomycyny i 1% GlutaMAX, na 8-komorowym szkiełku do obrazowania odpowiednim dla obiektywów imersyjnych o wysokiej rozdzielczości (np. NuncTM Lab-TekTM chambered coverglass).</li>
	<li>Stymulować agregację receptorów w komórkach A431 poprzez dodanie 100 ng/mL liganda EGF do pożywki na 10 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
</ol>
2. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym
<ol>
	<li>Usunąć medium i dwukrotnie przemyć komórki 300 µL soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej (RT) (1x PBS).</li>
	<li>Utrwalić komórki, stosując 200 µL 4% paraformaldehydu w PBS przez 10 min w RT. 
	UWAGA: Aby zbadać zmiany czasowe agregacji celu, należy pominąć ten etap utrwalania.</li>
	<li>Usunąć PFA i dwukrotnie przemyć komórki 300 µL PBS w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować komórki z 200 µL PBS zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe w stężeniu 10 µg/mL przez co najmniej 2 h w 4 °C. 
	UWAGA: Aby obliczenia ICS były poprawne, wszystkie receptory obecne na powierzchni komórek muszą zostać znakowane przeciwciałem pierwszorzędowym. Wymaga to przeprowadzenia wstępnych eksperymentów z szeregiem rozcieńczeń każdego przeciwciała pierwszorzędowego (1:10, 1:50, 1:100, 1:200, 1:500, 1:1 000, itd.). Optymalne stężenie przeciwciała pierwszorzędowego określa się poprzez analizę intensywności fluorescencji w stosunku do gęstości klastrów. Wybrane stężenie przeciwciała pierwszorzędowego to takie, przy którym gęstość klastrów osiąga plateau wraz ze wzrostem stężenia przeciwciała pierwszorzędowego, zanim nastąpi dalszy wzrost gęstości klastrów w wyniku niespecyficznego wiązania przeciwciał. Przeciwciało pierwszorzędowe można rozcieńczać w medium bezsurowiczym w przypadku wykonywania eksperymentu obrazowania w funkcji czasu.</li>
	<li>Po upływie żądanego czasu inkubacji dwukrotnie przemyć komórki 300 µL PBS w RT.</li>
	<li>Zablokować próbkę 5% albuminą wołową (BSA) w PBS przez co najmniej 2 h w 4 °C. 
	UWAGA: Próbki utrwalone są rutynowo blokowane przez noc (O/N) w 4 °C.</li>
</ol>
3. Inkubacja z przeciwciałem wtórnym
<ol>
	<li>Przygotować w PBS roztwór stokowy przeciwciała wtórnego znakowanego fluorescencyjnie (np. Alexa Fluor 488 IgG*) o stężeniu 10 µg/mL. W celu ułatwienia lokalizacji próbek pod mikroskopem w tym rozcieńczeniu można zawrzeć Hoechst 33342 w stężeniu 2 µg/mL. 
	UWAGA: W przypadku eksperymentów time-lapse PBS można zastąpić pożywką beztrawkową.</li>
	<li>Usunąć 5% BSA/PBS z komórek i inkubować z roztworem przeciwciał wtórnych przez 2 h w temperaturze 4 °C, chroniąc próbki przed światłem zewnętrznym.</li>
	<li>Po zakończeniu czasu inkubacji z przeciwciałami wtórnymi przemyć komórki 300 µL PBS (dwukrotnie) i przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem zewnętrznym.</li>
	<li>Aby zapobiec odparowaniu, okleić krawędzie szkiełka komorowego parafilmem.</li>
</ol>
4. Mikroskopia konfokalna próbek
UWAGA: Ustawienia stosowane podczas analizy konfokalnej będą się różnić w zależności od sprzętu i fluoroforów użytych w poszczególnym eksperymencie. Nowoczesne urządzenia do mikroskopii konfokalnej oferują mechanizmy zapisywania wszystkich parametrów obrazowania użytych w eksperymencie w natywnym formacie plików obrazu danego urządzenia. Ważne jest, aby ustawienia te zostały zapisane, co zapewni odpowiednią replikację warunków eksperymentalnych w różnych okresach akwizycji danych.
<ol>
	<li>Podczas obrazowania sygnałów fluorescencyjnych należy unikać przesycenia. Należy użyć tabeli przeglądowej obrazu (look up table), która zapewnia pseudokolorową reprezentację nasycenia pikseli, a następnie odpowiednio zmniejszyć wzmocnienie detektora i moc lasera. Większość instrumentów konfokalnych posiada w oprogramowaniu do akwizycji ustawienie „wskaźnika zakresu” (range indicator) lub opcję analogiczną.</li>
	<li>Należy zminimalizować ekspozycję interesującego fluoroforu na moc lasera. Zastosowanie barwnika do znakowania DNA, takiego jak Hoechst 33342, umożliwia łatwe wykrycie i ustawienie próbki w polu widzenia przed rozpoczęciem zbierania danych.</li>
	<li>Pierwsze skany próbki należy przeprowadzić przy niskiej rozdzielczości i, jeśli oprogramowanie na to pozwala, przy dużej prędkości skanowania. Ograniczy to możliwość fotowyblaknięcia próbki.</li>
	<li>Należy zwiększyć rozdzielczość przechwytywania i zmniejszyć prędkość skanowania w momencie przejścia do zbierania danych obrazowych.</li>
	<li>Jeśli instrument konfokalny na to pozwala, należy zbierać dane w trybie zliczania fotonów. 
	UWAGA: Jeśli zliczanie fotonów nie jest dostępne w danym urządzeniu, należy upewnić się, że poziomy szarości są liniowe podczas akwizycji obrazu.</li>
	<li>Otwór pinhole dla każdej użytej linii laserowej należy ustawić na 1 jednostkę Airy (AU).</li>
	<li>Podczas akwizycji obrazu należy zastosować uśrednianie linii lub klatek (x4), aby zredukować szum związany z detektorem. 
	UWAGA: W tym wariancie ICS, ponieważ rejestrowany jest tylko jeden punkt czasowy, czas akwizycji nie stanowi czynnika ograniczającego eksperyment.</li>
	<li>Do zbierania obrazów należy wybrać obiektyw o dużym powiększeniu i wysokiej aperturze numerycznej, taki jak obiektyw Plan-Apochromat, aby zapewnić maksymalną rozdzielczość oraz korekcję aberracji sferycznych i chromatycznych (przykłady obejmują obiektywy Plan-Apochromat 100X lub 63X /1.40 Oil).</li>
	<li>Należy zastosować nadpróbkowanie rozmiaru przechwyconych pikseli w obrazie. Zaleca się, aby każdy piksel obejmował obszar 50 x 50 nm. Dla skutecznego ICS rozmiar piksela musi być mniejszy niż 0.1 x 0.1 µm2 na piksel. Osiąga się to poprzez połączenie przybliżenia w celu zeskanowania stosunkowo małego obszaru oraz wybrania stosunkowo dużego formatu obrazu (np. 1024 x 1024 lub 2048 x 2048 pikseli).</li>
	<li>Należy ustawić ostrość na powierzchni szczytowej lub podstawnej komórki w regionie jak najbardziej płaskim. W jednym obrazie można zarejestrować wiele komórek, a interesujące obszary przetwarzać indywidualnie podczas analizy ICS.</li>
	<li>Należy zarejestrować obszar tła wolny od komórek, używając tych samych ustawień instrumentu, aby posłużył on do normalizacji próbki.</li>
</ol>
5. Obliczanie spektroskopii korelacyjnej obrazu
UWAGA: Do przeprowadzenia autokorelacji oraz funkcji matematycznych niezbędnych dla ICS wymagana jest otwarta platforma do przetwarzania obrazów Fiji, będąca dystrybucją programu ImageJ. Zaleca się korzystanie z tej dystrybucji ImageJ, ponieważ zawiera ona liczne preinstalowane wtyczki oraz łatwiejszy system aktualizacji, co umożliwia wykonywanie operacji na wielu eksperymentach obrazowych.
<ol>
	<li>Zainstaluj program Fiji (http://fiji.sc/Downloads).</li>
	<li>Wczytaj pozyskane zestawy danych.</li>
	<li>Zidentyfikuj interesujący obszar błony komórkowej powierzchni apikalnej lub bazalnej i powiel go do rozmiaru piksela 2n (256 x 256, 128 x 128, 64 x 64). &#34;Menu: Obraz &#62; Duplikat&#8230;&#34;</li>
	<li>Oblicz średnią intensywność wyciętego obszaru zainteresowania &#34;Menu: Analiza &#62; Pomiary.&#34;</li>
	<li>Zidentyfikuj obszar tła i powiel go do rozmiaru pikseli odpowiadającego powierzchni błony komórkowej komórki przechwytującej (2n: 256x256, 128x128, 64x64). &#34;Menu: Obraz &#62; Duplikacja&#8230;&#34;</li>
	<li>Oblicz średnią intensywność przyciętego obszaru zainteresowania tła. &#34;Menu: Analiza &#62; Pomiary.&#34;</li>
	<li>Odejmij średnią intensywność tła od obrazu zawierającego obszar zainteresowania. &#34;Proces &#62; Kalkulator obrazów &#62; Odejmij.&#34;</li>
	<li>Wykonaj obliczenia autokorelacji. Obliczenia te znajdują się w strukturze menu: &#34;Proces &#62; FTT &#62; Matematyka FD.&#34;
	<ol>
		<li>W oknie dialogowym FD Math wybrać: Image 1: nazwa przyciętego obrazu (Cropped Image), Operation: Correlation, Image 2: nazwa przyciętego obrazu (Cropped Image), Inverse transformation: ON.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znormalizuj otrzymany obraz, dzieląc go przez całkowitą liczbę pikseli. &#34;Menu: Proces &#62; Matematyka &#62; Podzielić&#8230;&#34; (t. j.: 64x64 pikseli = 4096)</li>
	<li>Ponownie znormalizuj, dzieląc przez średnią intensywność znormalizowanego wyciętego obszaru podniesioną do kwadratu. &#34;Menu: Proces &#62; Matematyka &#62; Podzielić&#8230;&#34; 
	UWAGA: Można to osiągnąć poprzez dwukrotne podzielenie obrazu przez średnią wartość natężenia.&#160;</li>
	<li>Przeprowadź linię przez funkcję rozproszenia punktu.</li>
	<li>Należy wykreślić profil tej linii, aby obliczyć wartość szczytową. &#34;Menu: Analiza &#62; Profil wykresu.&#34;</li>
	<li>Oblicz liczbę skupisk na obszar wiązki, przenosząc wartość szczytową (wynik 5,12) do arkusza kalkulacyjnego i wykonując następujące obliczenia (Równanie 6): 
	<img alt="Równanie 7" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq7v2.jpg" /></li>
</ol>
6. Przetwarzanie wsadowe zbiorów danych ICS
UWAGA: W celu powtórzenia procedur opisanych w powyższym protokole zaleca się stworzenie makra FIJI/ImageJ. Umożliwia to spójną i szybką analizę wielu plików obrazów podczas przeprowadzania analizy spektroskopii korelacyjnej obrazów.
<ol>
	<li>Utwórz makro przepływu pracy ICS, rejestrując każde polecenie menu w protokole ICS za pomocą opcji 
	&#34;Menu: Plugins &#62; Macros &#62; Record…&#34;.</li>
	<li>Wybierz &#34;Create&#34;, aby wygenerować makro.</li>
	<li>Wybierz &#34;Language &#62; IJ1 Macro.&#34;</li>
	<li>Zapisz makro.</li>
	<li>Dodaj okna dialogowe do poszczególnych kroków makra, aby przypominać operatorowi o każdej funkcji. Okna dialogowe służą również jako metoda wstrzymania procesu analizy, aby umożliwić dokonanie odpowiednich wyborów przed dalszym przetwarzaniem (np. wybór obszaru do przycięcia)
	<ol>
		<li>Kod makra okna dialogowego 
		title = &#34;Dialog Box Title&#34;; 
		msg = &#34;Dialog Box/Protocol Step Message&#34;; 
		waitForUser(title, msg); 
		UWAGA: Dodatkową efektywność można osiągnąć, subskrybując witrynę aktualizacji BAR w programie FIJI Updater (instrukcje: https://imagej.net/BAR). Zapewnia to programowi FIJI &#34;zbiór szeroko stosowanych rutyn (Broadly Applicable Routines)&#34; 14. Jedną z takich rutyn jest Find Peaks. Struktura menu: &#34;BAR &#62; Data Analysis &#62; Find Peaks.&#34; Skrypt ten umożliwia szybkie obliczenie wartości szczytowej w profilu funkcji rozproszenia punktowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Rozszerzenia protokołu: Obliczanie powierzchni wiązki mikroskopu
UWAGA: Funkcja przenoszenia optycznego mikroskopu sprawia, że nawet obiekty o rozmiarach molekularnych pojawiają się jako obrazy o promieniu około 200-300 nm w płaszczyźnie x-y. Protokół ICS umożliwia wyznaczenie funkcji rozproszenia punktowego poprzez wykonanie kroków 4-5 na fluorescencyjnych koralikach o rozmiarach poniżej rozdzielczości. W szczególności:
<ol>
	<li>Zamocuj fluorescencyjne kulki o rozmiarze poniżej rozdzielczości (t.j. średnica &#60;100 nm) na szkiełku do obrazowania z 8 komorami.</li>
	<li>Obrazuj kulki zgodnie z opisanym protokołem, używając mikroskopu konfokalnego wykorzystywanego do eksperymentów ICS.</li>
	<li>Oblicz funkcję ICS z otrzymanego obrazu zgodnie z krokami protokołu 5.1-5.13.</li>
	<li>Na podstawie wykreślonego profilu oblicz promień wiązki (r) jako wartość pełnej szerokości połówki maksimum (FWHM) funkcji ICS.</li>
	<li>Oblicz pole powierzchni wiązki (BA) zgodnie z (Równanie 7): <img alt="Równanie 8" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq8v2.jpg" /></li>
</ol>
8. Rozszerzenia protokołu: Obliczanie liczby skupisk na jednostkę powierzchni
<ol>
	<li>Oblicz gęstość skupisk (CD) na jednostkę powierzchni zgodnie z (Eq 8): 
	<img alt="Równanie 9" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq9v2.jpg" /> 
	<img alt="Równanie 10" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq10v2.jpg" /></li>
	<li>Podziel liczbę skupisk na obszar wiązki (wynik z punktu 5.13) przez powierzchnię wiązki (wynik z punktu 7.5).</li>
</ol>

<ol><li>Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Antibody therapy of cancer.</a> Nature reviews. Cancer. 12 (4), 278-287 (2012).</li>
<li>Parslow, A. C., Parakh, S., Lee, F. -T., Gan, H., Scott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Drug+Conjugates+for+Cancer+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Antibody-Drug Conjugates for Cancer Therapy.</a> Biomedicines. 4 (3), 14(2016).</li>
<li>Sorkin, A., Waters, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytosis+of+growth+factor+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Endocytosis of growth factor receptors.</a> BioEssays. 15 (6), 375-382 (1993).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. , Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Petersen, N. O., Höddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+membrane+receptor+distributions+by+image+correlation+spectroscopy%3A+concept+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application.</a> Biophysical Journal. 65 (3), 1135-1146 (1993).</li>
<li>Wiseman, P. W., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Correlation+Spectroscopy.+II.+Optimization+for+Ultrasensitive+Detection+of+Preexisting+Platelet-Derived+Growth+Factor-%CE%B2+Receptor+Oligomers+on+Intact+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Image Correlation Spectroscopy. II. Optimization for Ultrasensitive Detection of Preexisting Platelet-Derived Growth Factor-β Receptor Oligomers on Intact Cells.</a> Biophysical Journal. 76 (2), 963-977 (1999).</li>
<li>Costantino, S., Comeau, J. W. D., Kolin, D. L., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+Dynamic+Range+of+Spatial+Image+Correlation+and+Cross-Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accuracy and Dynamic Range of Spatial Image Correlation and Cross-Correlation Spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1251-1260 (2005).</li>
<li>Claire Robertson, S. C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theory+and+practical+recommendations+for+autocorrelation-based+image+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Theory and practical recommendations for autocorrelation-based image correlation spectroscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 17 (8), 080801(2012).</li>
<li>Ciccotosto, G. D., Kozer, N., Chow, T. T. Y., Chon, J. W. M., Clayton, A. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+Distributions+on+Cells+Determined+by+Photobleaching+Image+Correlation+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Aggregation Distributions on Cells Determined by Photobleaching Image Correlation Spectroscopy.</a> Biophysical Journal. 104 (5), 1056-1064 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="https://imagescience.org/meijering/publications/1115/">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+for+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">ImageJ for microscopy.</a> BioTechniques. 43 (1 Suppl), 25-30 (2007).</li>
<li>Rappaz, B., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+correlation+spectroscopy+for+measurements+of+particle+densities+and+colocalization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Image correlation spectroscopy for measurements of particle densities and colocalization.</a> Current protocols in cell biology. , Chapter 4, Unit 4.27.1-15 (2013).</li>
<li>Ferreira, T., Hiner, M., Rueden, C., Miura, K., Eglinger, J., Chef, B. tferrS. criptsB. A. R. tferr/Scripts: BAR 1.5.1. Zenodo. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://zenodo.org/record/495245">https://zenodo.org/record/495245</a> (2017).</li>
<li>Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Correlation+Spectroscopy%3A+Past%2C+Present%2C+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Correlation Spectroscopy: Past, Present, Future.</a> Biophysical Journal. 101 (12), 2855-2870 (2011).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+molecular+interactions+in+living+cells+by+FRET+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy.</a> Current opinion in chemical biology. 10 (5), 409-416 (2006).</li>
<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2835776/">Super-Resolution Fluorescence Microscopy.</a> dx.doi.org.ez.library.latrobe.edu.au. 78 (1), 993-1016 (2009).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).</li>
<li>Nohe, A., Petersen, N. O. <a target="_blank" href="http://stke.sciencemag.org/content/2007/417/pl7">Image Correlation Spectroscopy.</a> Sci. Signal. (417), pl7(2007).</li>
</ol>

Andrew M. Scott jest wspierany finansowo przez AbbVie Pharmaceutics, EMD Serono i Daiichi-Sankyo Co, a także jest konsultantem i właścicielem udziałów w Life Science Pharmaceuticals. Autorzy nie mają żadnych innych istotnych powiązań ani powiązań finansowych z żadną organizacją lub podmiotem mającym interes finansowy lub konflikt finansowy z tematyką lub materiałami omawianymi w manuskrypcie, poza tymi, które zostały ujawnione.

Technika spektroskopii korelacji obrazu (ICS), którą opisujemy w tym protokole, wykorzystuje standardowe mikroskopy konfokalne bez konieczności stosowania specjalistycznych detektorów. Opisana technika ICS wykorzystuje dobrze znane metody immunocytochemiczne, aby zapewnić szybkie pobieranie próbek z wielu stanów leczenia w celu zwiększenia analizy statystycznej. Metodologia ta czyni to z niewielkim zmniejszeniem absolutnej precyzji w porównaniu z alternatywnymi technikami pojedynczych cząsteczek opartymi na korelacji flu...

Opracowanie przeciwciał terapeutycznych odniosło spektakularny sukces w leczeniu wielu typów nowotworów1. Niedawne postępy w dziedzinie koniugatów przeciwciało-lek (ADC) jako mechanizmów dostarczania związków cytotoksycznych zwiększyły zapotrzebowanie na zrozumienie dynamiki oddziaływań przeciwciało:receptor na powierzchni komórki2. Po skutecznym skierowaniu przeciwciała do receptora powierzchniowego komórki, kompleksy te mogą indukować wzorce agregacji podobne do tych obserwowanych w oddziaływaniach ligand:przeciwciało3. Zmiany w agregacji receptorów mogą wywoływać modyfikacje błony i prowadzić do internalizacji receptora oraz jego usunięcia z powierzchni komórki. W kontekście koniugatu przeciwciało-lek proces ten powoduje w następstwie uwalnianie ładunku cytotoksycznego do zinternalizowanych endosomów, a następnie do cytoplazmy, co skutkuje efektywnym zabiciem komórki.
Mikroskopia konfokalna zapewniła skuteczny sposób wizualizacji tych istotnych oddziaływań przeciwciał z ich receptorami docelowymi4. Aby zbadać zmiany w agregacji cząsteczki docelowej na powierzchni komórki, niniejszy protokół wykorzystuje postprocessing obrazów z mikroskopii konfokalnej za pomocą techniki spektroskopii korelacji przestrzennej obrazu (ICS) 5,6,7.
Podstawą spektroskopii korelacyjnej obrazów jest obserwacja, że przestrzenne fluktuacje intensywności fluorescencji są powiązane z gęstością i stanem agregacji znakowanych struktur. Zależność ta jest ustalana po obliczeniu przestrzennej funkcji autokorelacji przechwyconego obrazu5.
Wszystkie warianty spektroskopii korelacyjnej obrazów wymagają obliczenia autokorelacji obrazu. Następnie funkcję tę dopasowuje się do dwuwymiarowej krzywej Gaussa w celu wyekstrahowania ilościowych parametrów stanu agregacji zawartych w obrazie. Mówiąc prościej, obliczenie autokorelacji obrazu polega na porównywaniu wszystkich możliwych par pikseli w obrazie i obliczaniu prawdopodobieństwa, że oba są tak samo jasne. Jest to wizualizowane jako funkcja odległości i kierunków rozdzielenia pikseli8.
Teoretyczne podstawy spektroskopii korelacji obrazu zostały opracowane i zdefiniowane przez Petersena oraz Wisemana et al.5,6. W niniejszym protokole obliczenia autokorelacji są wykonywane w programie Fiji/ImageJ oraz w aplikacji arkusza kalkulacyjnego; podstawę funkcji przestrzennej autokorelacji fluktuacji intensywności można opisać następująco (Równanie 1):
<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq1v2.jpg" />&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;
gdzie F oznacza transformatę Fouriera; F−1 odwrotną transformatę Fouriera; F* jej sprzężony kompleks; oraz zmienne opóźnienia przestrzennego ε i η. W przestrzennej spektroskopii korelacyjnej (ICS), opisanej w niniejszym protokole, funkcję autokorelacji można obliczyć przy użyciu algorytmu dwuwymiarowej szybkiej transformaty Fouriera7,9. Autokorelacja przy zerowym oddaleniu przestrzennym, znana również jako zero-lag, g11(0,0), dostarcza odwrotnej średniej liczby cząsteczek obecnych na obszarze wiązki mikroskopu. Można ją uzyskać poprzez dopasowanie funkcji autokorelacji przestrzennej do dwuwymiarowej funkcji Gaussa (Równanie 2):
<img alt="Równanie 3" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq3v2.jpg" />&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;
Ponieważ piksele zarejestrowane na obrazie znajdują się w obrębie określonego obszaru, a pomiary te nie rozciągają się w nieskończoność, termin g∞ jest stosowany jako przesunięcie w celu uwzględnienia dalekozasięgowych korelacji przestrzennych zawartych w obrazie. W przypadku agregatów o rozmiarach molekularnych ω stanowi funkcję rozproszenia punktu mikroskopu i jest opisana przez pełną szerokość połówkową maksymalnej wartości funkcji autokorelacji przestrzennej. Obszar objęty funkcją rozproszenia punktu urządzenia może zostać skalibrowany przy użyciu fluorescencyjnych kulek o rozmiarze poniżej rozdzielczości.
W opisanym tutaj protokole spektroskopii korelacyjnej obrazu (ICS), autokorelacja oraz funkcje matematyczne niezbędne do przeprowadzenia ICS są realizowane przy użyciu otwartoźródłowej platformy przetwarzania obrazów Fiji10, która jest dystrybucją programu ImageJ11,12. Fiji/ImageJ wykorzystuje zainstalowaną funkcję szybkiej transformaty Fouriera w funkcji FFT Math. Funkcja ta skraca czas obliczeń niezbędny do wykonania tego rachunku poprzez dwukrotną redukcję zakresu danych w każdym wymiarze13. Ponieważ dwuwymiarowa funkcja autokorelacji jest w przybliżeniu symetryczna w osiach x,y, do pomiaru surowej autokorelacji jako funkcji przesunięcia przestrzennego można wykorzystać pojedynczy wykres profilu liniowego przechodzący przez obraz autokorelacji. Wszelki szum przy zerowym przesunięciu jest usuwany przed dalszymi obliczeniami, a otrzymana amplituda autokorelacji (wartość szczytowa, g(0)T) jest korygowana o tło zgodnie z wyrażeniem (Eq 3):
<img alt="Równanie 4" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq4v2.jpg" />&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;
gdzie Ib to średnia intensywność z obszaru tła z wyłączeniem komórki. Gęstość klastrów, czyli gęstość obiektów fluorescencyjnych, jest określona przez (Równanie 4):
<img alt="Równanie 5" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq5v2.jpg" />&#160;&#160;&#160;&#160;
W opisanym tutaj protokole dodatkowo upraszczamy obliczanie gęstości klastrów (CD), przyjmując założenie oparte na obserwacji, że znormalizowana funkcja autokorelacji będzie zanikać do wartości zbliżonej do 1,0 wraz ze wzrostem opóźnienia przestrzennego. Przy maksymalnym opóźnieniu przestrzennym nie występuje już korelacja wartości intensywności fluorescencji, a zatem bez korelacji obliczenia w tym obszarze wyznaczają wartość intensywności pomnożonej przez tę samą intensywność, co następnie zostaje podzielone przez kwadrat tej intensywności, co z definicji równa się 1,0. Zatem gęstość klastrów z znormalizowanej funkcji autokorelacji można obliczyć poprzez odjęcie 1,0 od znormalizowanej funkcji autokorelacji przed wyznaczeniem jej odwrotności (Eq 5):
<img alt="Równanie 6" src="/files/ftp_upload/57164/57164eq6v2.jpg" />&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;
Można przeprowadzić dalszą kalibrację obszaru wiązki, aby określić liczbę klastrów znajdujących się w obszarze funkcji rozproszenia punktowego instrumentu. Kalibracja ta musi być wykonana przy zastosowaniu tych samych warunków optycznych, które wykorzystano podczas analizy spektroskopii korelacyjnej obrazów.

<table><tbody><tr><td>Szkło nakrywkowe komorowe Nunc Lab-Tek II - 8 dołków</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu ThermoFisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>Enzym TrypLE Express (1x), bez czerwieni fenolowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało wtórne anty-ludzkiej IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11013</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck Wzorce mikrosfery fluorescencyjnej 0,1 i mikro; m</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>Cetuximab</td><td>Merck Serono</td><td>3023715501</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 38mx100mm</td><td>Merck Millipore</td><td>BRND701605</td><td></td></tr><tr><td>16% wodny roztwór paraformaldehydu (formaldehydu)</td><td>ProSciTech</td><td>C004</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki EGF</td><td>R& System D</td><td>236-EG</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu

Confocal Microscopy Reveals Cell Surface Receptor Aggregation Through Image Correlation Spectroscopy

Mikroskopia konfokalna dostarcza przystępnej metodologii do uchwycenia interakcji subkomórkowych krytycznych dla charakterystyki i dalszego rozwoju czynników przedklinicznych znakowanych sondami fluorescencyjnymi. Dzięki niedawnym postępom w cytotoksycznych systemach dostarczania leków opartych na przeciwciałach, zrozumienie zmian wywołanych przez te czynniki w sferze agregacji receptorów i internalizacji ma kluczowe znaczenie. Protokół ten wykorzystuje dobrze znaną metodologię immunocytochemii fluorescencyjnej i dystrybucję ImageJ w FIJI o otwartym kodzie źródłowym, z wbudowanymi funkcjami autokorelacji i matematycznymi obrazami, do wykonywania spektroskopii korelacji obrazów przestrzennych (ICS). Protokół ten określa ilościowo intensywność fluorescencji znakowanych receptorów w funkcji obszaru wiązki mikroskopu konfokalnego. Zapewnia to ilościową miarę stanu agregacji cząsteczki docelowej na powierzchni komórki. Metodologia ta koncentruje się na charakterystyce komórek statycznych z potencjałem do rozszerzenia się na czasowe badania agregacji receptorów. Protokół ten przedstawia przystępną metodologię zapewniającą kwantyfikację zdarzeń grupowania zachodzących na powierzchni komórki, wykorzystując dobrze znane techniki i niespecjalistyczną aparaturę do obrazowania.

Pomyślne przeprowadzenie eksperymentu spektroskopii korelacyjnej obrazów zależy od właściwego zastosowania kontroli zabiegowych. Grupy kontrolne te obejmują badanie fluorescencji w grupach bez zastosowania przeciwciała pierwszorzędowego oraz bez przeciwciała wtórnego. Po ustaleniu optymalnych ustawień lasera konfokalnego dla danego eksperymentu należy zarejestrować obrazy tych grup kontrolnych, aby potwierdzić brak nieswoistej fluorescencji w próbce. W przypadku wielu linii adherentnych k...

Przeciwciała, które wiążą się z docelowymi receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany konformacji i grupowania. Te dynamiczne zmiany mają implikacje dla charakterystyki rozwoju leków w komórkach docelowych. Protokół ten wykorzystuje mikroskopię konfokalną i spektroskopię korelacji obrazów za pomocą ImageJ/FIJI w celu ilościowego określenia zakresu grupowania receptorów na powierzchni komórki.

Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu

Confocal microscopy provides an accessible methodology to capture sub-cellular interactions critical for the characterization and further development of ...

Ogólnym celem tego protokołu spektroskopii korelacji obrazów jest zapewnienie dostępnej metodologii kwantyfikacji zdarzeń grupowania zachodzących na powierzchni komórki. Przeciwciała, które wiążą się z receptorami na powierzchni komórki, mogą powodować zmiany potwierdzające i grupujące. Analizy tych dynamicznych procesów są ważne dla charakterystyki celów leków.Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia dostępną metodologię kwantyfikacji zdarzeń grupowania na powierzchni komórki przy użyciu łatwo dostępnej aparatury do obrazowania. Aby rozpocząć, zasiej 10 000 komórek raka naskórka A431 do każdej studzienki ośmiokomorowego szkiełka obrazowego. Następnego dnia natychmiast dodaj 100 nanogramów na mililitr liganda EGF do komórek, aby stymulować agregację receptora EGF.Inkubować komórki z ligandem w temperaturze pokojowej przez 10 minut przed ich utrwaleniem. Następnie postępuj zgodnie z protokołem immunocytochemii i obrazowania konfokalnego zawartym w dołączonym protokole tekstowym, zwracając szczególną uwagę na ustawienia używane podczas zbierania, i załaduj uzyskane zestawy danych na Fidżi. Należy unikać nadmiernego nasycenia.Końcowe obrazy muszą zawierać piksele o rozmiarach m

confocal-microscopy-reveals-cell-surface-receptor-aggregation-through

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Neisseria meningitidis (Nm), gram-ujemny patogen dróg oddechowych specyficzny dla ludzi, może wiązać się z ludzką α-aktyniną. Przedstawiamy tutaj protokół wizualizacji kolokalizacji bakterii z wewnątrzkomórkową α-aktyniną po wniknięciu bakterii do ludzkich komórek śródbłonka mikro naczyniowego mózgu (HBMECs).

Wizualizacja i kwantyfikacja oddziaływań wewnątrzkomórkowych Neisseria meningitidis oraz ludzkiej α-aktyniny za pomocą obrazowania konfokalnego

Opisano technikę badania partycjonowania białek fluorescencyjnych w tratwach lipidowych błony plazmatycznej żywych komórek. Metoda ta wykorzystuje różnice w czasie dyfuzji białek znajdujących się wewnątrz lub na zewnątrz tratw lipidowych. Akwizycja danych może być przeprowadzana dynamicznie w warunkach kontrolnych lub po dodaniu leku.

Oznaczanie partycji sond znakowanych fluorescencyjnie w tratwach lipidowych w żywych komórkach metodą spektroskopii korelacyjnej fluorescencji (FCS)

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Opracowaliśmy platformę programową wykorzystującą Imaris Neuroscience, ImarisXT oraz MATLAB do pomiaru zmian morfologii nieokreślonego kształtu uzyskanego z trójwymiarowej konfokalnej fluorescencji pojedynczych komórek. To nowatorskie podejście może być wykorzystane do ilościowego określania zmian w kształcie komórek po aktywacji receptorów, stanowiąc tym samym potencjalne dodatkowe narzędzie w procesie odkrywania leków.

Narzędzie analityczne do ilościowej oceny zmian morfologii komórkowej na podstawie trójwymiarowych obrazów fluorescencyjnych

W tym filmie demonstrujemy technikę pomiaru interakcji międzykomórkowych między cząsteczkami adhezyjnymi komórek synaptycznych za pomocą testu agregacji komórek HEK. W tym teście równa liczba komórek HEK wyrażających pożądaną cząsteczkę adhezyjną komórek presynaptycznych i białko fluorescencyjne jest mieszana z komórkami HEK wyrażającymi postsynaptyczną cząsteczkę adhezyjną komórek i inne białko fluorescencyjne. Interakcja między cząsteczkami adhezyjnymi komórek zmusza komórki do agregacji, co...

Test agregacji komórek w celu wykrycia interakcji trans między cząsteczkami adhezyjnymi komórek

Ten film demonstruje technikę spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) do badania homooligomeryzacji białek. Białka znakowane fluorescencyjnie w próbce są dimeryzowane przy użyciu środka podczas badania oligomeryzacji białek za pomocą FFS. Za pomocą mikroskopu konfokalnego, gdy białka wchodzą i wychodzą z małej objętości obserwacyjnej, przeprowadza się analizę wahań jasności cząsteczek fluorescencyjnych w celu określenia stanu oligomerycznego białek.

Spektroskopia fluktuacji fluorescencji w celu zbadania homooligomeryzacji białek

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Komunikacja międzykomórkowa jest kluczowa dla kontrolowania różnych czynności fizjologicznych wewnątrz i na zewnątrz komórki. W artykule opisano protokół pomiaru czasoprzestrzennego charakteru wydzielin pojedynczych komórek. Aby to osiągnąć, zastosowano podejście multidyscyplinarne, które integruje bezznacznikowe wykrywanie nanoplazmoniczne z obrazowaniem żywych komórek.

Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Opisujemy metodę obrazowania w celu określenia średniego stanu oligomerów receptora znakowanego mEGFP, indukowanego przez wiązanie ligandów w błonie komórkowej żywych komórek. Protokół opiera się na mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) połączonej z analizą liczby i jasności (N&amp;B).

Dynamika oligomeryzacji receptorów powierzchniowych komórek w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego w połączeniu z analizą liczby i jasności

Poznaj metodę spektroskopii korelacji obrazu do ilościowej analizy agregacji receptorów na powierzchni komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia badanie dynamiki receptorów w badaniach nad celami leków.

Mikroskopia konfokalna ujawnia agregację receptorów na powierzchni komórki za pomocą spektroskopii korelacji obrazu

Przeglądaj więcej filmów