Name: Wykrywanie wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Poznaj metodę wykrywania wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi sortilin i GLUT4. Technika ta umożliwia badanie słabych interakcji białkowych w kontekście biochemicznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty badawcze DK52057 i DK107498 od NIH do K.V.K. X.P był wspierany przez grant szkoleniowy 2T32DK007201 od NIH.

1. Obchodzenie się z peptydem
<ol>
	<li>Projektowanie i zamawianie peptydu
	<ol>
		<li>Wybierz żądaną sekwencję peptydu i dodaj znacznik, taki jak epitop myc (EQKLISEED) na jego końcu N lub C.</li>
		<li>Sprawdź przewidywaną rozpuszczalność peptydu w wodzie, korzystając z kalkulatora rozpuszczalności peptydów http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Jeśli rozpuszczalność jest niska, spróbuj dodać kolejny rozpuszczalny w wodzie znacznik, aby zmienić równowagę ładunku. 
		UWAGA: Użyliśmy peptydu odpowiadającego pierwszej pętli świetlnej (fll) GLUT4 oznaczonej epitopem myc (pogrubiona czcionka) na końcu N (Myc-fll-GLUT4): EQKLISEEDLNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA, który ma "dobrą" przewidywaną rozpuszczalność w wodzie.</li>
		<li>Zamów niestandardowy peptyd o czystości co najmniej 75%, która jest wystarczająca do testu, i poproś dostawcę o test rozpuszczalności. Rozdzielić zamówienie na co najmniej dwie podwielokrotności na wypadek nieprzewidzianych problemów z rozpuszczeniem peptydu. 
		UWAGA: Myc-fll-GLUT4 został zamówiony w dwóch porcjach. Jego deklarowana rozpuszczalność w wodzie ultraczystej wynosi ≤10 mg/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuszczanie peptydu 
	Uwaga: Najlepszym rozpuszczalnikiem jest woda ultraczysta. Jeśli peptyd nie wydaje się być rozpuszczalny w wodzie, zapoznaj się z http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html, aby uzyskać instrukcje.
	<ol>
		<li>Przygotować 100-krotny roztwór roboczy peptydu w wodzie ultraczystej lub w wybranym buforze o stężeniu 100 μg/ml.</li>
		<li>Rozdzielić roztwór na 50-100 μl podwielokrotności i przechowywać je w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Postępowanie z komórkami
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa
	<ol>
		<li>Użyj komórek typu dzikiego (WT) jako kontroli negatywnej i komórek wyrażających docelowe białko oznaczone sześcioma histydynami (HisP). 
		UWAGA: Użyliśmy preadipocytów 3T3 L1 stabilnie transfekowanych Sortilin-myc/His5.</li>
		<li>Hoduj komórki w zmodyfikowanym podłożu Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości cukru, uzupełnionym 10% surowicą bydlęcą cielęcą, glutaminą (2 mM) i penicyliną/streptomycyną (5 μg/ml) w temperaturze 37 °C w 10% CO2 .</li>
		<li>Ułóż cztery 10-centymetrowe szalki komórek, transfekuj dwie z nich HisP i transfekuj pozostałe dwie plazmidem kontrolnym (WT). 48 godzin po transfekcji komórki powinny osiągnąć 80 - 90% konfluencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie lizatów komórkowych
	<ol>
		<li>Przygotować bufor do lizy (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, 5% glicerolu, 10 mM Imidazolu, 0,5% Triton X-100 i koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA do izolacji białek znakowanych His, pH 7,4) i utrzymywać go w temperaturze 4 °C:</li>
		<li>Przemyć komórki trzykrotnie 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Ułóż naczynia na lodzie i dodaj 500 μl buforu do lizy do każdego naczynia. Zbierz lizaty komórkowe za pomocą skrobaka do komórek.</li>
		<li>Umieść lizat komórkowy z każdej płytki w innej probówce o pojemności 1,5 ml. Oznacz probówki jako WT-pH6, WT-pH8, HisP-pH6, HisP-pH8.</li>
		<li>Przepuść lizaty komórek przez strzykawkę z igłą 26G pięć razy w górę iw dół, aby zakończyć lizę.</li>
		<li>Odwirować lizaty komórkowe przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść supernatanty do nowych, identycznie oznakowanych probówek.</li>
		<li>Analizuj stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA lub innego zestawu.</li>
		<li>Za pomocą buforu do lizy wyrównaj stężenie białka we wszystkich czterech lizatach.</li>
		<li>Oddzielić małą (ok. 20 μl) porcję każdego lizatu i utrzymywać ją w temperaturze -20 °C do celów ewentualnych eksperymentów kontrolnych i/lub rozwiązywania problemów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wiązanie białek oznaczonych przez HisPur z kulkami kobaltowymi HisPur
<ol>
	<li>Użyj dostępnego w handlu buforu do płukania lub przygotuj go (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu, pH 8) i utrzymuj go w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor do przemywania o pH 6, mieszając bufor do przemywania o pH 8 z HCl. Przechowywać go w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Delikatnie zakręć butelką z koralikami kobaltu, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.</li>
	<li>Dozować 40 μl zawiesiny kulek kobaltu do czterech probówek o pojemności 1,5 ml oznaczonych jak powyżej (krok 2.2.4).</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu do lizy do każdej probówki i odwirować probówki o stężeniu 1000 x g przez 5 s. Odessać supernatant i dodać 40 μl buforu do lizy do osiadłych kulek.</li>
	<li>Dodaj lizaty komórkowe do odpowiednich probówek.</li>
	<li>Inkubować probówki przez 90 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze probówkowym przy 20 obr./min.</li>
	<li>Odwirować probówki o stężeniu 1000 x g przez 5 s i zebrać supernatant. Przechowywać supernatant w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodaj 500 μl buforu do płukania o pH 8 lub pH 6 do odpowiednich probówek i delikatnie ponownie zawiesić kulki.</li>
	<li>Odwirować probówki o stężeniu 1000 x g przez 5 s i odrzucić supernatanty.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.9 i 3.10 cztery razy.</li>
</ol>
4. Wiązanie peptydu z białkiem oznaczonym przez Hisa unieruchomionym na koralikach
<ol>
	<li>Używając 100x roztworu roboczego peptydu (krok 1.2.1), przygotuj 1x roztwory robocze w buforze do płukania o pH 6 lub pH 8 (dwie podwielokrotności po 100 μl na każdy, 1 μg/ml).</li>
	<li>Dodaj 100 μL 1x roztworu peptydu do umytych kulek o odpowiednim pH.</li>
	<li>Inkubować kulki przez 30 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze rurowym z prędkością 20 obr./min.</li>
	<li>Odwirować probówki o stężeniu 1 000 x g przez 5 s, zebrać supernatant i utrzymywać go w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.9 i 3.10 cztery razy. 
	UWAGA: Aby zmniejszyć możliwe tło, poniższe kroki mogą zastąpić kroki 4.4 i 4.5.</li>
	<li>Weź cztery mikrokolumny z porami 30 μm, oznacz je jak w kroku 2.2.4 i umieść kolumny w probówkach zbiorczych.</li>
	<li>Po zakończeniu kroku 4.3 przenieść mieszaninę inkubacyjną do kolumn, pozwolić, aby roztwór przeszedł grawitacyjnie. Utrzymać przepływ w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Przepuścić grawitacyjnie 500 μl buforu do przemywania o pH 6 lub pH 8 przez odpowiednie kolumny. Odrzuć przepływ.</li>
	<li>Powtórz krok 4.8 cztery razy.</li>
	<li>Po ostatnim płukaniu odwirować kolumny o stężeniu 1 000 x g przez 15 s.</li>
</ol>
5. Elucja z koralików kobaltowych
<ol>
	<li>Użyj komercyjnego buforu do próbek tricine (200 mM Tris-HCl, 40% glicerol, 2% SDS, 0,04% Coomassie Blue, pH 6,8) i dodaj β-merkaptoetanol do końcowego stężenia 2%.</li>
	<li>Dodać 40 μl buforu do próbek Tricine (z β-merkaptoetanolem) do przemytych kulek i ponownie zawirować próbkę.</li>
	<li>Podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 100 °C, ponownie wirować próbki i odwirować probówki przy 1 000 x g przez 5 s. 
	UWAGA: W celu zmniejszenia możliwego niespecyficznego wiązania w elucji, następujące kroki mogą zastąpić kroki 5.1 - 5.3.</li>
	<li>Dodać 40 μl elucyjnego buforu imidazolowego (50 mM Na2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0,25 M imidazolu) do przemytych kulek, wirować i inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez 20 min.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 3 000 x g przez 30 s, zebrać supernatant (eluowane próbki) i przenieść go do nowych, oznakowanych probówek.</li>
	<li>Dodać 40 μl buforu do próbek Tricine do każdej probówki, podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 100 °C, wirować i odwirowywać probówki przy 1 000 x g przez 5 s. 
	UWAGA: Jeśli używane są mikrokolumny, dodać bufor elucyjny do przemytych kulek, inkubować przez 20 minut i zebrać elucję przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 2 min. 
	UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia elektroforezy.</li>
</ol>
6. Elektroforeza i Western blotting
Uwaga: Próbki są gotowe do separacji za pomocą SDS-PAGE i późniejszego Western blot. Postępuj zgodnie z protokołem elektroforezy żelowej (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) z następującymi modyfikacjami.
<ol>
	<li>Używaj dostępnych w handlu żeli gradientowych 10 - 20% Tricine.</li>
	<li>Na żel naładować 20 μl eluowanych próbek i 20 μl lizatów (etap 2.2.10). W celu rozwiązywania problemów zaleca się załadowanie 20 μl niezwiązanego materiału (krok 3.8) i 10 ng peptydu; przed załadowaniem dodać równą ilość buforu do próbek Tricine do tych próbek.</li>
	<li>Przeprowadź elektroforezę w komercyjnym buforze do pracy Tris/Tricine/SDS (100 mM Tris, 100 mM Tricine i 0,1% SDS, pH 8,3).</li>
	<li>Przenieść materiał z żelu na membranę nitrocelulozową o wielkości 0,45 μm za pomocą buforu transferowego (25 mM zasada Tris, 192 mM glicyna, pH 8,4) uzupełnionego 20% metanolem.</li>
	<li>Zablokuj błonę 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Używając wstępnie wybarwionych markerów masy cząsteczkowej jako przewodników, przetnij błonę poziomo, osusz górną część przeciwciałem przeciwko HisP i osusz dolną część przeciwciałem przeciwko epitopowi myc, aby zidentyfikować peptyd znakowany myc. 
	UWAGA: W naszym konkretnym przypadku przecięcie membrany nie jest wymagane, ponieważ zarówno HisP, jak i Myc-fll-GLUT4 można wykryć za pomocą przeciwciała anty-myc.</li>
</ol>
7. Analiza wyników
<ol>
	<li>Określ ilościowo intensywność wszystkich sygnałów Western blot za pomocą programu Image Station lub ImageJ.</li>
	<li>Znormalizuj sygnał z peptydu znakowanego myc względem sygnału z HisP przy obu wartościach pH.</li>
</ol>

<ol><li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li>
<li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sugar+is+sIRVed%3A+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li>
<li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li>
<li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li>
<li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li>
<li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shortcut+to+the+lysosome%3A+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li>
<li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li>
<li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95%2Fsortilin%2C+a+non-G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li>
<li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li>
<li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li>
<li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Sortylina jest ewolucyjnie konserwatywnym receptorem białkowym wieloligandowym, który bierze udział zarówno w sygnalizacji na błonie plazmatycznej, jak i w wewnątrzkomórkowych zdarzeniach sortowania 6,7. Jednak poszukiwanie autentycznych ligandów sortyliny (z których część jest białkami luminalnymi lub integralnymi białkami błonowymi) jest skomplikowane, ponieważ interakcja sortyliny z niektórymi z jej partnerów wiążących wydaje się być wrażliwa na detergenty. W ...

GLUT4 to białko transportujące glukozę, które ulega ekspresji głównie w komórkach tłuszczowych i mięśni szkieletowych, gdzie pośredniczy w wpływie insuliny na poposiłkowy poziom glukozy we krwi1. Będąc bardzo stabilnym białkiem, GLUT4 jest regulowany na poziomie potranslacyjnym. W przypadku braku insuliny, GLUT4 jest w dużej mierze wykluczony z błony plazmatycznej (stąd niska podstawowa przepuszczalność glukozy) i jest zlokalizowany głównie wewnątrz komórki w małych pęcherzykach reagujących na insulinę (IRV) i sieci trans-Golgiego (TGN), która prawdopodobnie reprezentuje przedział dawcy IRV. Po podaniu insuliny IRV łączą się z błoną plazmatyczną i dostarczają GLUT4 do miejsca jej funkcjonowania. Zwiększa to przepuszczalność błony komórkowej dla glukozy, dzięki czemu wychwyt glukozy z krwi do adipocytów i miocytów szkieletowych wzrasta od 10 do 40 razy. Po odstawieniu insuliny GLUT4 jest internalizowany do endosomów wczesnych/sortujących, a następnie pobierany do TGN, gdzie IRV są ponownie formowane. Oba etapy sortowania w szlaku GLUT4, tj. pobieranie z obwodowych wczesnych endosomów do okołojądrowego TGN, jak i tworzenie IRV na błonach donorowych TGN są możliwe dzięki członkowi rodziny Vps10p, sortylinie, która reprezentuje białko transbłonowe typu I i receptor sortujący. Według jednego z modeli, sortylina działa jako transbłonowe białko rusztowania: wiąże GLUT4 w świetle endosomów i TGN oraz rekrutuje adaptory retromeru lub klatryny do cytoplazmatycznej strony błony dawcy za pośrednictwem swojego C-końca 2,3. Ułatwia to dystrybucję GLUT4 do nośników pęcherzykowych, które przemieszczają GLUT4 między przedziałami wewnątrzkomórkowymi.
Interakcja cytoplazmatycznego ogona sortyliny z retromerem i różnymi białkami adaptorowymi została dobrze udokumentowana. Jednak wiązanie sortyliny z GLUT4 (i kilkoma innymi ligandami białkowymi) było trudne do udowodnienia. W szczególności próby koimmunoprecypitacji sortyliny i GLUT4 nie powiodły się, prawdopodobnie ze względu na wrażliwy na detergenty charakter interakcji między tymi dwoma białkami. Ponadto, jako typowe białko transportowe, GLUT4 ma 12 domen transbłonowych i 6 pętli luminalnych, których dowolna kombinacja może potencjalnie reprezentować miejsce wiązania sortyliny. Jednocześnie duża liczba dowodów pośrednich, takich jak znaczna kolokalizacja w komórce, sieciowanie z przepuszczalnym przez błonę DSP oraz interakcja w systemie hybrydowym drożdży sugeruje, że sortylina może wiązać się z GLUT4. Ponadto, stosując to drugie podejście w połączeniu z mutagenezą skaningową alaniny, ustaliliśmy wcześniej, że domena Vps10p sortyliny wiąże się przede wszystkim z pierwszą pętlą luminalną GLUT4. Do tej pory brakowało jednak dowodu na taką interakcję w komórkach ssaków. Tutaj wyizolowaliśmy sortylinę znakowaną przez Hisa z transfekowanych komórek 3T3-L1 za pomocą żywicy kobaltowej i wykazaliśmy, że może ona oddziaływać z chemicznie zsyntetyzowanym peptydem odpowiadającym pierwszej pętli świetlnej GLUT4 przy pH 6 i pH 8, które przypominają kwaśne środowisko w świetle endosomalnym i neutralne środowisko w świetle błon TGN. Nie wykryto wiązania peptydów w eksperymentach kontrolnych, w których ekstrakt przygotowany z komórek nietransfekowanych został załadowany na te same kulki.

<table><tbody><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Sigma</td><td>P8849</td><td>do stosowania w oczyszczaniu białka znacznika histydyny</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1mL Strzykawka insulinowa U-100</td><td>BD</td><td>329652</td><td>26G x 1/2</td></tr><tr><td>BCA Zestaw do oznaczania białek</td><td>Pierce</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do płukania</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-234</td><td>Do oczyszczania białek His-tag</td></tr><tr><td>Żywica kobaltowa</td><td>HisPur Thermo Scientific</td><td>89964</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do próbki tricine</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0739</td><td>z SDS, należy dodać bMerkaptaetanol</td></tr><tr><td>Elucja&nbsp; Bufor</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-236</td><td>Do oczyszczania białka His-tag za pomocą 250mM Imidazole</td></tr><tr><td>Mini-Protean Tris-Tricine prefabrykowane żele 10-20%&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>456-3115</td><td>Do separacji peptydu i małego białka</td></tr><tr><td>Tris/Tricine/SDS bufor do biegania&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0744</td><td></td></tr><tr><td>Bufor transferowy</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-190</td><td>Dodaj 20% metanolu</td></tr><tr><td>Membrana nitrocelulozowa&nbsp; 0,45 mm</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>BSA Przeciwciało</td></tr><tr><td>anty Myc</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>2272</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd</td><td>królika Genscipt</td><td></td><td>Dostosuj zamówienie</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual color Standarts</td><td>BioRad</td><td>161-0374</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Nasza zdolność do badania interakcji białko-białko jest kluczem do zrozumienia połączeń regulacyjnych w komórce. Jednak wykrycie interakcji białko-białko w wielu przypadkach wiąże się z poważnymi wyzwaniami eksperymentalnymi. W szczególności receptory sortujące oddziałują ze swoim ładunkiem białkowym w świetle przedziałów błonowych, często w sposób wrażliwy na detergenty, co sprawia, że koimmunoprecypitacja tych białek jest bezużyteczna. Wiązanie sortyliny receptora sortującego z transporterem glukozy GLUT4 może służyć jako przykład słabych oddziaływań luminalnych między białkami błonowymi. W tym miejscu opisujemy szybki, prosty i niedrogi test do walidacji interakcji między sortyliną a GLUT4. W tym celu zaprojektowaliśmy i zsyntetyzowaliśmy chemicznie peptyd znakowany myc, odpowiadający potencjalnemu epitopowi wiążącemu sortylinę w części świetlnej GLUT4. Sortylina oznaczona sześcioma histydynami ulegała ekspresji w komórkach ssaków i izolowana z lizatów komórkowych za pomocą kulek kobaltowych. Sortylinę unieruchomioną na kulkach inkubowano z roztworem peptydu o różnych wartościach pH, a wymyty materiał analizowano metodą Western blot. Test ten można łatwo dostosować do badania innych wrażliwych na detergenty interakcji białko-białko.

Lizaty przygotowano z komórek 3T3 L1 stabilnie transfekowanych Sortilin-myc/His5 oraz z komórek 3T3 L1 typu WT, które posłużyły jako kontrola negatywna. Oba lizaty inkubowano z koralikami kobaltowymi przy pH 6 lub pH 8, a następnie dokładnie przemyto. Koraliki z unieruchomionymi białkami inkubowano w roztworze Myc-fll-Glut4. Po dokładnym przemyciu białka związane z koralikami eluowano za pomocą 0,25 M Imidazolu. Próbki, wraz z oryginalnymi lizatami, poddano elektro...

Jako przykład opisujemy protokół wykrywania wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi za pomocą wiązania receptora sortującego, sortyliny, z pierwszą pętlą luminalną białka transportera glukozy, GLUT4.

Wykrywanie wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi lub innymi białkami. Ta procedura wymaga, aby jedno białko było znakowane histydyną i nadmiernie eksprymowane w komórkach, podczas gdy drugie jest peptydem znakowanym myc. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu biochemii ważnych badań interakcji białek.Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykrycia interakcji między białkami błonowymi w sposób wrażliwy na detergenty. Procedura jest szybka i łatwa. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat interakcji białek błonowych, może być również stosowana do badania słabych oddziaływań białek.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy chcieliśmy sprawdzić interakcję między białkami błonowymi, Saltiliną i GLUT4, ale próby koimmunoprecypitacji ich z lizy ssaków pozostają nieudane. Aby złożyć zamówienie na peptyd, wybierz docelową sekwencję peptydu krytyczną dla interakcji i dodaj epitop myc na końcu lub końcu C sekwencji. Po przybyciu peptydu należy podać 100 mikrogramów na mililitr roztworu roboczego peptydu w ultra czystej wodzie.Wysiewaj trzy komórki preadipocytów 3T3-L1 w czterech 10-centymetrowych szalkach hodowlanych i trzymaj w inkubatorze. Następnie przetransfekuj dwie szalki hodowlane z docelowym białkiem oznaczonym 6X histodyn i oznacz jako HISP w pozostałych dwóch szalkach dwoma plazmidami kontrolnymi i oznacz jako WT. Po transfekcji pozostaw komórki w inkubatorze na 48 godzin, aby osiągnąć 80 do 90% zgrywu. Aby przygotować lizat komórkowy, umyj komórki na lodzie trzy razy 10 mililitrami 1X buforowanej soli fizjologicznej schłodzonej o czterech stopniach Celsjusza.Następnie do każdego z nich dodaj 500 mikrolitrów buforu do lizy. Następnie odłącz komórki od naczyń za pomocą skrobaka do komórek, aby przygotować lizat. Przenieś lizat komórkowy przygotowany z każdej płytki hodowlanej do czterech oddzielnych probówek o średnicy 1,5 milimetra i oznacz wszystkie probówki.Następnie przepuść lizat komórkowy przez strzykawkę z igłą o rozmiarze 26 w górę iw dół pięć razy, aby uzyskać całkowitą lizę komórek. Następnie odwiruj lizaty komórkowe w temperaturze 16000xg przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatanty do czterech identycznie oznakowanych nowych probówek.Do przyszłych eksperymentów rozwiązywaniem problemów i kontrolnych należy podać 20 mikrolitrów lizatu komórkowego i przechowywać go w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Do późniejszego użycia należy mianować bufor do przemywania przy PH8 kwasem solnym w celu uzyskania PH6 i przechowywać bufor w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie, aby przygotować jednorodną zawiesinę koralików kobaltowych, ostrożnie zakręć butelką.Następnie przenieś 40 mikrolitrów zawiesiny kulek kobaltowych do wszystkich indywidualnie oznaczonych czterech probówek. Po dodaniu kulek kobaltu dodaj jeden mililitr buforu do lizy do probówek. Następnie odwiruj probówki o mocy 1000 x g przez pięć sekund.Odrzucić supernatant i odpipetować 40 mikrolitrów buforu do lizy do osadzonych kulek. Następnie przenieś lizat komórkowy do odpowiednich probówek i inkubuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 90 minut na rotatorze probówkowym. Po 90 minutach odwirować próbki o sile 1000 x g przez pięć sekund.Następnie zebrać supernatant oznaczony jako Flowthrough-1 i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 500 mikrolitrów buforu do płukania z PH8 do poszczególnych probówek i delikatnie ponownie zawieś kulki. Odwirować probówki o stężeniu 1000xg przez pięć sekund i usunąć supernatanty.Następnie dodaj bufor do płukania z PH8 z lub sześcioma do probówek, zgodnie z etykietami i ponownie dobrze zawieś kulki. Odwirować probówki o stężeniu 1000xg przez pięć sekund i usunąć supernatanty. Przygotować jeden mikrogram na mililitr roztworu roboczego peptydu i buforu wodnego o PH6 lub ośmiu.Następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu peptydu do umytych kulek odpowiadających podobnemu PH. Następnie inkubuj kulki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze rurowym przez 30 minut. Następnie weź cztery mikrokolumny, oznacz je i umieść w probówkach zbiorczych oznaczonych Flowthrough-2. Po zakończeniu inkubacji dodać mieszaninę inkubacyjną do kolumn.Pozwól, aby roztwór przeszedł przez siłę grawitacyjną i zbierz próbkę ze przepływu. Umieść kolumny w nowych probówkach zbiorczych i przechowuj w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie przepuścić 500 mikrolitrów buforu płuczącego o PH6 lub ośmiu przez przepływ grawitacyjny przez poszczególne kolumny i odrzucić przepływ.Powtórz ten krok cztery razy. Odwiruj probówki o sile 1000 x g przez pięć sekund. Umieść kolumnę w nowej probówce zbiorczej oznaczonej jako Elution.Ważne jest, aby umyć kulki we wszystkich probówkach bardzo dokładnie i równomiernie, aby pozbyć się niezwiązanego peptydu. Do umytych kulek dodać 40 mikrolitrów buforu do próbek trysyny z beta-merkaptoetanolem. Pozostaw na 20 minut w temperaturze pokojowej.Odwiruj kolumnę przy 8000xg przez dwie minuty. Wyrzuć kolumny i podgrzewaj probówki zbiorcze w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. A następnie odwiruj go przy 1000xg przez pięć sekund.Alternatywnie dodać 40 mikrolitrów buforu imidazolu elucji do umytych kulek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po zakończeniu inkubacji odwirować probówki o wymiarach 8000xg przez dwie minuty. Odrzucić kolumny i dodać 40 mikrolitrów próbki tryciny.Podgrzej probówki zbiorcze w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie odwiruj je w temperaturze 1000 x g przez pięć sekund. Stosuj dostępne na rynku żele gradientowe 10-20% tricine. Użyj buforu do biegania Tris / Tricine / SDS, a następnie załaduj 20 mikrolitrów każdej z eluowanych próbek i całkowitych lizatów na żel i rozpocznij pracę jednostki elektroforezy.Po zakończeniu elektroforezy należy użyć buforu transferowego uzupełnionego 20% metanolem, aby przenieść materiał z żelu na membranę nitrocelulozową o grubości 0,45 mikrometra. Po zablokowaniu membrany przetnij ją poziomo. Następnie zbadaj górną część błony przeciwciałem Anti His P w dolnej połowie błony za pomocą anty myc.W celu zbadania interakcji między unieruchomionym Sortiliną a kulkami kobaltu w GLUT4 przeprowadzono analizę immunoblot. Lizaty i eluaty komórkowe uzyskano w postaci dzikich i transfekowanych komórek 3T3-L1 oznaczonych Sortilin-myc/His, a następnie załadowano na stronę SDS. Plamę badano przeciwciałem anty-myc.Blot pokazuje 110 kilodotin Sortili-myc/His-tagged i pięć kilotin myc-first luminal loop-GLUT4 z transfekowanych eluatów. Następnie, w celu zbadania znaczenia PH i interakcji między Sortiliną unieruchomioną na kulkach kobaltowych a GLUT4, przeprowadzono analizę immunoblot. W tym teście pierwszą pętlę luminalną Myc-First GLUT4 inkubowano z kulkami unieruchomionymi białkami znakowanymi Sortilin-myc/His, zarówno przy PH6, jak i ośmiu.Blot wykazuje wyraźną interakcję między Sortilin-myc/His a myc-pierwszą pętlą luminalną GLUT4 zarówno przy PH6, jak i ośmiu z eluatów uzyskanych z transfekowanych komórek 3T3-L1 znakowanych Sortilin-myc/His. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech do czterech godzin, aż próbki będą gotowe do analizy krwi zachodniej. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zaprojektowaniu peptydu, który jest rozpuszczalny, najlepiej w wodzie.Aby wzmocnić wyniki, można wykonać inne metody, takie jak immunoprecypitacja po usieciowaniu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać białko błonowe, interakcje białek w procedurze wrażliwej na detergenty. Pozwala również na badanie interakcji między fragmentami białek.Miękki rytmiczny jazz.

detection-detergent-sensitive-interactions-between-membrane

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii z wykrywaniem fluorescencji i wykluczenia wielkości w celu sprawdzenia stabilności białka błonowego z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w Escherichia coli po solubilizacji detergentu. Białka wykazujące symetryczny pik w profilu wykluczenia wielkości z niewielką ilością wolnego GFP lub bez wolnej GFP wskazują na oczyszczone białka z minimalną degradacją i agregacją, które można następnie wybrać do analizy struktura-funkcja.

Chromatografia wykluczająca wielkość z detekcją fluorescencji: technika identyfikacji integralności fluorescencyjnych białek błonowych po rozpuszczaniu detergentu

Opisano podejście biochemiczne do identyfikacji in vivo interakcji białko-białko (PPI) białek błonowych. Metoda łączy w sobie sieciowanie białek, oczyszczanie powinowactwa i spektrometrię mas i można ją dostosować do prawie każdego typu komórki lub organizmu. Dzięki takiemu podejściu możliwa staje się nawet identyfikacja przejściowych IPP.

Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Ten protokół pokazuje, jak uzyskać model ab initio o niskiej rozdzielczości i szczegóły strukturalne białka błonowego rozpuszczonego przez detergent w roztworze przy użyciu rozpraszania neutronów pod małym kątem z dopasowaniem kontrastowym detergentu.

Detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio

Tutaj prezentujemy protokół techniki trawienia na błonie do przygotowania próbek do spektrometrii mas. Technika ta ułatwia wygodną analizę oddziaływań białko-białko.

Ocena interakcji białko-białko przy użyciu techniki trawienia na błonie

Termoforeza w mikroskali szybko uzyskuje stałe wiązania przy niskich kosztach materiałowych. Na rynku dostępna jest termoforeza w mikroskali znakowana lub bezetykietowa; Jednak termoforeza bezznacznikowa nie jest w stanie zapewnić różnorodności pomiarów interakcji, które można wykonać przy użyciu etykiet fluorescencyjnych. Udostępniamy protokół dla znakowanych pomiarów termoforezy.

Zastosowanie termoforezy w mikroskali do pomiaru interakcji białko-lipid

Prezentujemy metodę, która łączy oczyszczanie białek błonowych i rekonstytucję w peptydyskach w jednym kroku chromatograficznym. Biotynylowane rusztowania są używane do bezpośredniego przylegania do powierzchni i pomiaru interakcji białko-ligand za pomocą interferometrii biowarstw.

PeptiQuick, jednoetapowa inkorporacja białek błonowych do biotynylowanych peptydysków w celu usprawnienia testów wiązania białek

Prezentowany tutaj jest protokół do określania oligomerycznego stanu białek błonowych, który wykorzystuje natywny system nanocząstek błony komórkowej w połączeniu z mikroskopią elektronową.

System natywnych nanocząstek błony komórkowej do analizy interakcji białko-białko błonowe

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Poznaj metodę wykrywania wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi sortilin i GLUT4. Technika ta umożliwia badanie słabych interakcji białkowych w kontekście biochemicznym.

Wykrywanie wrażliwych na detergenty interakcji między białkami błonowymi

Przeglądaj więcej filmów