Szybki protokół barwienia srebrem umożliwiający proste i skuteczne wykrywanie markerów SSR przy użyciu niedenaturującego żelu poliakrylamidowego

Ogólnym celem tego protokołu jest wprowadzenie zoptymalizowanej metody barwienia srebrem w celu szybkiego, łatwego i taniego wykrywania markerów SSR w niedenaturujących żelach poliakrylamidowych. Szybkie genotypowanie markerów SSR może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań genetycznych i zastosowań, takich jak analiza różnorodności genetycznej i selekcja wspomagana markerami w programach hodowli molekularnej. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa do przeprowadzenia, zajmuje mniej czasu i zużywa mniej odczynników chemicznych niż inne protokoły wykrywania markerów SSR.

Ta metoda pozwala uniknąć mocowania, zatrzymywania i kilku etapów mycia, które można znaleźć w konwencjonalnych protokołach. I wymaga tylko dwóch głównych etapów: impregnacji i rozwoju. Przy użyciu tego protokołu można uzyskać wyraźne obrazy, ponieważ brak szumów tła w celu jednoznacznego wykrywania wzorców pasm SSR.

Za pomocą tej techniki można przebadać około 800 próbek DNA dziennie i jest ona z powodzeniem stosowana w badaniach nad tytoniem i kwitnącą kapustą pekińską. Po przygotowaniu produktów PCR i roztworów żelowych zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć detergentu w wodzie z kranu, aby umyć jeden zestaw szklanych płytek i przekładek, a następnie całkowicie spłukać wodą destylowaną. Umieść talerze w stojaku do suszenia talerzy do wyschnięcia na powietrzu.

Rozprowadzić jeden mililitr roztworu silanu Bind na wewnętrznej powierzchni prostokątnej szklanej płytki i suszyć przez pięć minut. Następnie rozprowadź jeden mililitr silanu Repel na wewnętrznej powierzchni płytki szklanej z karbem za pomocą wacika i użyj bibuły, aby zetrzeć nadmiar roztworu, zanim pozostawisz płytkę do wyschnięcia na powietrzu przez pięć minut. Zamontuj szklane płytki z przekładkami z karbowaną płytą na górze.

I użyj zacisków odlewniczych, aby zacisnąć obie strony zespołu. Następnie wlać odpowiednią ilość 6% niedenaturującego roztworu żelu poliakrylamidowego do zlewki na zestaw płytek. Dodaj 20 mikrolitrów TEMED i 200 mikrolitrów świeżego 20% APS i delikatnie wymieszaj.

Natychmiast i ostrożnie wlej roztwór do zmontowanych szklanych płytek wzdłuż krawędzi karbowanej płyty, wypełniając przestrzeń prawie do góry. I włóż grzebień. Następnie nałóż niewielką ilość roztworu żelu na grzebień i pozwól żelowi zastygnąć w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Gdy żel jest w pełni spolimeryzowany, zdejmij zaciski odlewnicze i umieść zestaw płytek w zbiorniku do elektroforezy tak, aby płyta z karbem była skierowana w stronę górnego zbiornika buforowego. Użyj dużych zacisków, aby przymocować zestaw płyt do jednostki zbiornika. Wlej jeden litr buforu 0,5 X TBE do każdej z górnych i dolnych komór.

Następnie wyjmij grzebień i użyj pipety lub strzykawki wypełnionej buforem, aby dokładnie przepłukać wszystkie studzienki. Aby uruchomić żel poliakrylamidowy, załaduj około jednego mikrolitra produktu PCR do każdej studzienki. Załaduj również drabinę DNA na obu końcach.

Następnie przymocuj pokrywę zabezpieczającą do górnej komory buforowej. Podłącz przewody do zasilacza, dopasowując kolor oznaczony kolorem czerwonym do czerwonego i czarnym do czarnego. Uruchom żel przy stałym napięciu 110 woltów, aż barwnik osiągnie określoną pozycję.

Zwykle przez około 70 minut. Po elektroforezie otwórz zawór i spuść bufor z górnej komory do dużej zlewki. Odłącz boczne clamps i wyjmij płytkę z urządzenia.

Następnie za pomocą szpatułki ostrożnie oddziel karbowaną szklaną płytkę po jednej stronie i upewnij się, że żel pozostaje przymocowany do drugiej szklanej płytki pokrytej Bind-silanem. Następnie przygotuj jeden litr świeżego roztworu impregnacyjnego, rozpuszczając 1,5 grama azotanu srebra w jednym litrze wody destylowanej. Następnie przygotuj jeden litr świeżego roztworu rozwojowego, rozpuszczając 10 gramów wodorotlenku sodu w 900 mililitrach wody destylowanej.

Dodaj jeden mililitr 37% formaldehydu i użyj wody destylowanej, aby dostosować się do końcowej objętości jednego litra. Dużą ilością wody destylowanej ostrożnie wypłucz żel i szklaną płytkę, aby usunąć bufor do elektroforezy. Następnie umieść płytkę z żelem skierowanym do góry na plastikowej tacce i zanurz żel w jednym litrze roztworu impregnującego.

Delikatnie potrząsaj tacą na wytrząsarce z prędkością 60 obr./min przez trzy do czterech minut. Przenieś płytkę z roztworu impregnacyjnego do innej tacy. Następnie użyj dużej ilości wody destylowanej, aby spłukać resztki roztworu impregnującego z powierzchni płytki i żelu dwa razy przez trzy do pięciu sekund każdy.

Etap mycia żelem po impregnacji ma kluczowe znaczenie. Niewystarczające mycie powoduje niepełne usunięcie roztworu impregnującego. I wynik w ciemnym tle.

Umieść miejsce żelem skierowanym do góry na innej tacy. Zanurz płytkę w jednym litrze roztworu do wywoływania, a następnie delikatnie potrząsaj tacą przy 50 obr./min przez około trzy minuty. Monitoruj pojawianie się fragmentów DNA i zatrzymuj rozwój, gdy zaobserwuje się najwyższy stosunek sygnału fragmentów DNA do szumu tła.

Kolejnym kluczowym krokiem jest odpowiedni czas rozwoju. Nadmierny rozwój może skutkować ciemnobrązowym tłem z obrazem fragmentów DNA o niskim kontraście. Opłucz płytkę i żel dużą ilością wody destylowanej dwukrotnie i użyj bibułki do wysuszenia płytki żelowej.

Następnie użyj skanera i odpowiedniego oprogramowania, aby zeskanować żel w rozdzielczości 300 DPI i dostosować jasność i kontrast, aby uzyskać wyraźną wizualizację prążków DNA. Na koniec oceń wzór prążków markerów SSR na podstawie rozmiarów fragmentów DNA na obrazie. Przedstawione tutaj amplikony PCR zostały wyprodukowane przy użyciu odpowiednich par starterów SSR w kwitnącej kapuście pekińskiej i tytoniu.

Po elektroforezie żele poliakryloamidowe zostały wybarwione przy użyciu protokołu barwienia srebrem pokazanego na tym filmie. Który jednoznacznie wykrył wzorce prążkowania markerów SSR. Aby porównać skuteczność wykrywania różnych protokołów barwienia srebrem, produkty PCR markerów SSR oddzielono za pomocą PAGE i zwizualizowano za pomocą pięciu opublikowanych protokołów barwienia srebrem i szóstej metody zademonstrowanej w tym filmie.

Zademonstrowany tutaj protokół charakteryzował się najniższym szumem tła i najwyższym kontrastem fragmentów DNA, dzięki czemu zapewniał najwyższą klarowność obrazu. Spośród sześciu testowanych protokołów, przedstawiona tutaj metoda zajmuje najmniej czasu i wymaga najmniejszej liczby odczynników chemicznych i etapów procesu. Wreszcie, rysunek ten pokazuje czułość protokołu mierzoną przy użyciu szeregowego rozcieńczania markera DNA o wartości od 50 do 2000 pz na niedenaturującym żelu poliakrylamidowym od 10 nanogramów na pasmo w pierwszym pasie do 9,8 pikogramów na pasmo DNA w pasie 11.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o tym, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu roztworów impregnacyjnych i rozwojowych. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała naukowcom drogę do szybkiego genotypowania markerów SSR.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwo i skutecznie wykrywać markery SSR w niedenaturującym żelu poliakrylamidowym za pomocą barwienia srebrem. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami chemicznymi może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze nosić środki ostrożności, takie jak rękawice.