Wariacje na temat metod mikroskopii elektronowej w barwieniu ujemnym: narzędzia do radzenia sobie z trudnymi systemami

Ogólnym celem tego filmu jest zademonstrowanie kilku różnych wariantów technik przygotowania próbek z mikroskopii elektronowej z transmisją barwienia ujemnego. Barwienie ujemne to najlepszy sposób na szybką ocenę jakości próbki EM. Ważne jest, aby zdać sobie sprawę, że różne techniki przygotowania siatki działają lepiej w przypadku niektórych próbek.

Technika, która najlepiej sprawdza się w przypadku danej próbki, musi być określona metodą prób i błędów. Na początek należy przygotować siatki EM przy użyciu metody arkusza węglowego i przygotować odczynniki do barwienia ujemnego zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym. Umieść siatkę EM pokrytą arkuszem węgla skierowaną do góry na szkiełku mikroskopowym.

Umieść szkiełko w jednostce wyładowczej jarzeniowej i traktuj siatkę przez co najmniej 30 sekund przy 10 miliamperach, aby uczynić siatkę hydrofilową. Po zakończeniu wyjmij próbkę z jednostki wyładowczej. Następnie użyj pęsety podciśnieniowej, aby chwycić krawędź siatki.

Aby zabarwić metodą blot boczny, najpierw nałóż od trzech do pięciu mikrolitrów próbki na powierzchnię podparcia. Pozwól próbce zaadsorbować się na powierzchni siatki przez 10 sekund do jednej minuty, a następnie dotknij krawędzią siatki arkusza bibuły filtracyjnej i pozwól, aby działanie kapilarne ściągnęło ciecz. Następnie umieść 50 mikrolitrowych kropli ultraczystej wody lub odpowiedniego lotnego roztworu buforowego na arkuszu folii laboratoryjnej.

Delikatnie dotknij węglowej powierzchni siatki do kropli i oderwij małą kroplę na powierzchnię siatki. Następnie przyłóż krawędź siatki do arkusza bibuły filtracyjnej i pozwól, aby działanie kapilarne oderwało ciecz. Następnie umieść dwie krople odczynnika barwiącego o pojemności 50 mikrolitrów na arkuszu folii laboratoryjnej.

Delikatnie dotknij węglowej powierzchni siatki do kropli i podnieś małą kroplę na górną powierzchnię siatki. Jeśli plama przeniesie się na tył siatki, oznacza to, że folia węglowa została zerwana i należy ją wyrzucić. Po 10 do 15 sekundach przyłóż krawędź siatki do arkusza bibuły filtracyjnej i pozwól, aby działanie kapilarne odciągnęło płyn.

Powtórz ten krok barwienia jeszcze raz, a następnie pozostaw siatkę do wyschnięcia na powietrzu. Aby zabarwić próbkę metodą trzepania, chwyć krawędź siatki pęsetą podciśnieniową i nałóż od trzech do pięciu mikrolitrów próbki na powierzchnię nośną. Trzymając pęsetę w jednej ręce, ustaw siatkę pod kątem około 45 stopni skierowaną w bok i szybko przesuń nadgarstek, aby strzepnąć większość kropli znajdującej się na górze siatki.

Następnie za pomocą szklanej pipety Pasteura nanieś kroplę roztworu myjącego na powierzchnię podparcia. Strzepnąć kroplę i powtórzyć kilka razy, aby umyć próbkę. Następnie nałóż kroplę odczynnika barwiącego na powierzchnię podparcia i ponownie strzepnij kroplę.

Powtórz ten krok barwienia od jednego do trzech razy, w zależności od głębokości barwienia, która jest wymagana do wizualizacji próbki. Usuń nadmiar plamy, dotykając rozdartą krawędzią kawałka bibuły filtracyjnej do krawędzi siatki, a następnie pozostaw siatkę do wyschnięcia na powietrzu. Aby wybarwić próbkę metodą szybkiego spłukiwania, najpierw narysuj od 30 do 70 mikrolitrów barwnika na końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów.

Obróć pokrętło głośności, aby pobrać pięć mikrolitrów powietrza, a następnie wciągnij od pięciu do 30 mikrolitrów odczynnika do mycia, a następnie kolejną małą szczelinę powietrzną, a następnie kolejne pięć mikrolitrów próbki. Chwyć krawędź siatki pęsetą podciśnieniową i ustaw siatkę pod kątem około 45 stopni skierowaną w bok. Jednym szybkim ruchem wyrzuć całą zawartość końcówki pipety w poprzek powierzchni siatki EM pokrytej węglem.

Usuń nadmiar plamy, dotykając rozdartą krawędzią kawałka bibuły filtracyjnej do krawędzi siatki i pozostaw siatkę do wyschnięcia na powietrzu. Idealny wybór dla barwie ujemnej jest w dużym stopniu zależny od próbki. Najczęściej stosowanym barwnikiem jest octan uranylu, ale można również stosować barwniki lantanowców.

W przypadku głęboko osadzonych próbek, barwienie na bazie lantanowców, octan tulu i octan erbu, powodowały barwienie ujemne o jakości równoważnej octanowi uranylu, oceniane na podstawie pozornego kontrastu i ostrości barwionych cząstek, przy czym octan tulu dawał wyraźniejsze i wyraźniejsze obrazy niż octan erbu. Duży rozmiar ziaren octanu tulu staje się widoczny przy dużym powiększeniu, pokazany tutaj, gdy próbka cząstek włóknistych mozaiki tytoniu została wybarwiona 1% octanem tulu. Używając octanu tulu, powtórzenie 23 angstremów włóknistej cząstki mozaiki tytoniu jest wyraźnie widoczne gołym okiem.

Żadne z innych testowanych plam lantanowców nie było w stanie rozwiązać tego problemu. Inną trudną do zobrazowania próbką jest białko C pochodzące z mięśni. Ta próbka daje znacznie różne obrazy w zależności od metody barwienia.

Po zabarwieniu metodą bocznej plamy wygląda jak kulista, zapadnięta struktura przypominająca skrzydło. Gdy siatki są przygotowywane metodą strzepywania, białko C jest obserwowane jako szereg domen, które przypominają koraliki na sznurku. To lepiej odzwierciedla rzeczywistą strukturę białka C.

Po opanowaniu przygotowanie negatywnie wybarwionej próbki zajmuje tylko około minuty. Ważne jest, aby pamiętać, że każda próbka inaczej reaguje na każdą technikę barwienia. W przypadku nowych próbek należy określić doświadczalnie najlepsze podejście.

Nie zapominaj, że odczynniki barwiące uranyl są toksyczne i lekko radioaktywne. Upewnij się, że są one wyrzucane do odpowiedniego strumienia odpadów.