Wytwarzanie i izolacja komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym ze złożonymi kariotypami
13 kwietnia 2018
Aneuploidia prowadzi do niestabilności genomu, co ostatecznie prowadzi do powstania komórek o skomplikowanych kariotypach. W artykule przedstawiono prostą i wygodną metodę izolowania komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, które przestają się dzielić.
Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie prostej metody generowania i izolowania komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym ze złożonymi kariotypami. Metoda ta może dostarczyć odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad aneuploidią, takie jak interakcja układu odpornościowego z komórkami aneuploidalnymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że generuje ona populację komórek, która zawiera tylko złożone kariotypy.
Aby rozpocząć synchronizację komórek RPE-1 hTERT, użyj świeżo rozmrożonych komórek i dozuj je do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej przy użyciu ośmiu mililitrów standardowej pożywki wzrostowej. Następnie użyj hemocytometru, aby określić numer komórki. Następnie inkubuj komórki przez noc.
Następnego dnia zastąp standardową pożywkę wzrostową pożywką zawierającą pięciomilimolową tymidynę. Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zsynchronizować komórki na granicy G1S. Po 24 godzinach umyj komórki trzykrotnie PBS.
Następnie dodaj standardową pożywkę wzrostową do umytych komórek i inkubuj przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Najpierw umyj komórki 10 mililitrami PBS. Następnie dodać pożywkę zawierającą 500 nanomolowych inhibitorów Mps1 Replican.
Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyj komórki trzykrotnie PBS. Następnie dodaj standardowe podłoże wzrostowe i włóż płytki z powrotem do inkubatora.
Około 72 godziny po pierwszej nieprawidłowej mitozie umyj komórki 10 mililitrami PBS. Następnie dodać pożywkę zawierającą 330 nanomolowych nokodazolu. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnego dnia odessać pożywkę z nokodazolem. Następnie dodaj trzy mililitry PBS do naczynia i postukaj w bok płytki, aby strząsnąć komórki mitotyczne. Obracaj płytkę między każdym kranem, aby umożliwić równomierne usunięcie komórek mitotycznych.
Po wstępnym strząśnięciu należy zassać płyn przylegający do pokrywki i krawędzi płytki. Następnie sprawdź płytkę pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu. Następnie umyj komórki pięcioma mililitrami PBS.
Następnie dodać pożywkę zawierającą 330 nanomolowych nokodazolu. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po ostatnim otrząśnięciu dodaj 10 mililitrów standardowej pożywki wzrostowej.
Inkubować komórki przez 12 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed wykonaniem testów. Komórki pozostające na płytce są określane jako zatrzymane ze złożonym kariotypem lub komórkami ArCK. Protokół ten opisuje prostą metodę izolowania komórek ArCK, a kilka cech specyficznych dla komórek ArCK jest analizowanych w celu potwierdzenia ich izolacji.
Komórki ArCK wykazują podwyższony poziom inhibitorów cyklu komórkowego p53, p21 i p16 w analizie immunoblot, podczas gdy komórki eupoidalne i aneuploidalne nie. Ponadto komórki ArCK są dodatnie pod kątem beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się, która barwi się na niebiesko-zielono, podczas gdy euploidalne komórki kontrolne nie. Wykresy segmentacji ujawniają, że komórki ArCK są aneuploidalne, charakteryzujące się wielokrotnymi, losowymi przyrostami chromosomów i utratą chromosomów.
Wykresy segmentacji pokazują liczbę kopii pojedynczych komórek od chromosomu pierwszego do X w stosunku do euploidalnej skali referencyjnej log dwa. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby upewnić się, że usunąłeś wszystkie komórki mitotyczne podczas każdego otrząsnięcia. Po wykonaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak oznaczanie cytokin
.Testy te pomogą w udzieleniu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak zdolność komórek ArCK do interakcji z komórkami układu odpornościowego. Nie zapominaj, że nokodazol jest niebezpieczny. Podczas stosowania tego odczynnika należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do skutecznego izolowania komórek ArCK in vitro. Tę procedurę można wykonać w ciągu siedmiu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Przegląd
To badanie przedstawia prostą metodę izolowywania komórek aneuploidalnych o złożonych kariotypach, które zatrzymały się w cyklu komórkowym. Technika ma na celu zwiększenie zrozumienia aneuploidii i jej implikacji w zachowaniu komórkowym oraz interakcjach immunologicznych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biologia komórki
- Genetyka
- Neuronauki
Tło
- Aneuploidia wiąże się z niestabilnością genomu.
- Komórki o złożonych kariotypach często przestają się dzielić.
- Zrozumienie tych komórek może dostarczyć wglądu w raka i inne choroby.
- Izolowanie tych komórek może ułatwić dalsze badania nad ich właściwościami.
Cel badania
- Opracowanie metody wytwarzania i izolowania komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym.
- Zbadanie cech komórek aneuploidalnych.
- Zbadanie interakcji między komórkami aneuploidalnymi a układem odpornościowym.
Stosowane metody
- Synchronizacja komórek RPE-1 hTERT za pomocą tymidyny i nokodazolu.
- Technika wytrząsania komórek w celu izolowywania komórek mitotycznych.
- Analiza immunoblotowa do oceny inhibitorów cyklu komórkowego.
- Barwienie beta-Galaktozydazą związaną z starzeniem się w celu identyfikacji komórek ArCK.
Główne wyniki
- Komórki ArCK wykazują podwyższone poziomy inhibitorów cyklu komórkowego.
- Komórki te są dodatnie w przypadku markerów związanych ze starzeniem się.
- Wykresy segmentacji potwierdzają aneuploidię w izolowanych komórkach.
- Metoda skutecznie izoluje komórki o złożonych kariotypach.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodny sposób badania komórek aneuploidalnych.
- Izolowane komórki ArCK mogą być wykorzystywane do dalszych badań nad interakcjami immunologicznymi.
- Właściwe wykonanie metody może przynieść wyniki w ciągu tygodnia.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolating cell cycle-arrested cells with complex karyotypes enables mechanistic de-risking of aneuploidy-driven phenotypes in discovery biology. This approach supports target validation by providing a reproducible system to study chromosomal instability and its impact on cellular senescence, inflammation, and immune interactions. The method’s reliance on standard tissue culture techniques enhances scalability and cross-functional adoption in early-stage R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses linking aneuploidy to genome instability and pro-inflammatory phenotypes.
- Operational Value: Provides a standardized, low-cost workflow for generating ArCK cells using thymidine, reversine, and nocodazole synchronization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a defined cell population with complex karyotypes for quantitative analysis of senescence markers and cytokine secretion.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent isolation of arrested cells via shake-off and nocodazole treatment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of aneuploid cell interactions with immune cells, informing immunomodulatory target assessment.
- Operational Value: Enables downstream functional assays such as cytokine profiling and senescence-associated beta-Galactosidase staining to validate phenotypic outputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to phenotypic screening, particularly for mechanisms involving chromosomal instability and stress response pathways.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating cells with defined karyotypic complexity to clarify causal links between aneuploidy and cellular phenotypes.
- Screening: Enables reproducible preparation of ArCK cells for high-content analysis of cell cycle inhibitors and secretory profiles.
- Analytics: Provides quantitative outputs including immunoblot detection of p53, p21, p16 and segmentation plots for single-cell copy number variation.
- Translational Research: Connects to immune interaction studies, supporting biomarker exploration in senescence-associated secretory phenotypes.
- Enterprise Reuse: Uses accessible reagents and standard culture equipment, allowing adaptation across laboratories without specialized infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in aneuploidy research by providing a defined arrest model with complex karyotypes.
- Operational Value: Delivers a seven-day protocol with high specificity for ArCK cells, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by enabling early assessment of aneuploidy-driven biological risks in target pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets linked to chromosomal instability and senescence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell synchronization techniques and mitotic shake-off procedures.
- Dependent on access to standard tissue culture incubators, hemocytometers, and fluorescence or brightfield microscopy for validation.
- Necessitates standardization of nocodazole handling and wash steps to ensure complete removal of mitotic cells across replicates.
- Adaptation to other cell lines may require optimization of thymidine, reversine, and nocodazole concentrations and timing.
- Limited to in vitro models; primary tissue or in vivo applicability not addressed in source material.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Synchronization of RPE-1 hTERT Cells
1:34
Generation of Aneuploid Cells by Interference with the Activity of the Mitotic Kinase Mps1 and Removal of Aneuploid Cycling Cells to Enrich the ArCK Population
3:36
Results: In Vitro Isolation and Characterization of Aneuploid Cells with Complex Karyotypes (ArCK)
4:35
Conclusion
