Wytwarzanie i izolacja komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym ze złożonymi kariotypami

Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie prostej metody generowania i izolowania komórek zatrzymanych w cyklu komórkowym ze złożonymi kariotypami. Metoda ta może dostarczyć odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu badań nad aneuploidią, takie jak interakcja układu odpornościowego z komórkami aneuploidalnymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że generuje ona populację komórek, która zawiera tylko złożone kariotypy.

Aby rozpocząć synchronizację komórek RPE-1 hTERT, użyj świeżo rozmrożonych komórek i dozuj je do 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej przy użyciu ośmiu mililitrów standardowej pożywki wzrostowej. Następnie użyj hemocytometru, aby określić numer komórki. Następnie inkubuj komórki przez noc.

Następnego dnia zastąp standardową pożywkę wzrostową pożywką zawierającą pięciomilimolową tymidynę. Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zsynchronizować komórki na granicy G1S. Po 24 godzinach umyj komórki trzykrotnie PBS.

Następnie dodaj standardową pożywkę wzrostową do umytych komórek i inkubuj przez sześć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Najpierw umyj komórki 10 mililitrami PBS. Następnie dodać pożywkę zawierającą 500 nanomolowych inhibitorów Mps1 Replican.

Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyj komórki trzykrotnie PBS. Następnie dodaj standardowe podłoże wzrostowe i włóż płytki z powrotem do inkubatora.

Około 72 godziny po pierwszej nieprawidłowej mitozie umyj komórki 10 mililitrami PBS. Następnie dodać pożywkę zawierającą 330 nanomolowych nokodazolu. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia odessać pożywkę z nokodazolem. Następnie dodaj trzy mililitry PBS do naczynia i postukaj w bok płytki, aby strząsnąć komórki mitotyczne. Obracaj płytkę między każdym kranem, aby umożliwić równomierne usunięcie komórek mitotycznych.

Po wstępnym strząśnięciu należy zassać płyn przylegający do pokrywki i krawędzi płytki. Następnie sprawdź płytkę pod mikroskopem w 10-krotnym powiększeniu. Następnie umyj komórki pięcioma mililitrami PBS.

Następnie dodać pożywkę zawierającą 330 nanomolowych nokodazolu. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po ostatnim otrząśnięciu dodaj 10 mililitrów standardowej pożywki wzrostowej.

Inkubować komórki przez 12 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza przed wykonaniem testów. Komórki pozostające na płytce są określane jako zatrzymane ze złożonym kariotypem lub komórkami ArCK. Protokół ten opisuje prostą metodę izolowania komórek ArCK, a kilka cech specyficznych dla komórek ArCK jest analizowanych w celu potwierdzenia ich izolacji.

Komórki ArCK wykazują podwyższony poziom inhibitorów cyklu komórkowego p53, p21 i p16 w analizie immunoblot, podczas gdy komórki eupoidalne i aneuploidalne nie. Ponadto komórki ArCK są dodatnie pod kątem beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem się, która barwi się na niebiesko-zielono, podczas gdy euploidalne komórki kontrolne nie. Wykresy segmentacji ujawniają, że komórki ArCK są aneuploidalne, charakteryzujące się wielokrotnymi, losowymi przyrostami chromosomów i utratą chromosomów.

Wykresy segmentacji pokazują liczbę kopii pojedynczych komórek od chromosomu pierwszego do X w stosunku do euploidalnej skali referencyjnej log dwa. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby upewnić się, że usunąłeś wszystkie komórki mitotyczne podczas każdego otrząsnięcia. Po wykonaniu tej procedury można wykonać inne metody, takie jak oznaczanie cytokin

Testy te pomogą w udzieleniu odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak zdolność komórek ArCK do interakcji z komórkami układu odpornościowego. Nie zapominaj, że nokodazol jest niebezpieczny. Podczas stosowania tego odczynnika należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.

Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do skutecznego izolowania komórek ArCK in vitro. Tę procedurę można wykonać w ciągu siedmiu dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.