Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie wysokiej jakości komórek protoplastowych z soi w celu zbadania mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach soi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w sieciach regulacyjnych, takie jak to, jaki jest ich bezpośredni gen docelowy, otwarty czynnik transfuzji i jaki jest ich partner oddziałujący, otwórz białko. Główną zaletą tej techniki jest sztuka.

Wytwarza duże ilości jednolitych komórek protoplastów soi i jest prosty i łatwy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ bardzo trudno jest uzyskać ładne protoplasty z liści soi, chyba że na określonym etapie ujednoliszczysz liście. Dobór liści w odpowiednim stadium rozwojowym jest kluczem do udanego przygotowania protoplastów soi.

Wytnij nowo ekspandowane liście jednolistne z 10-dniowych sadzonek soi. Aby upewnić się, że gdy próbka daje wysoki plon protoplastów, zbierz co najmniej trzy próbki liści jednolistnych na nieco różnych etapach rozwoju. Za pomocą świeżej żyletki usuń nerw środkowy z każdego jednolistnego liścia, a następnie pokrój resztki w paski o długości od 0,5 do jednego milimetra.

Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś paski liści natychmiast do 10 mililitrów świeżo przygotowanego roztworu enzymatycznego w 15-mililitrowej tubce. Próżniowo infiltrować paski liści przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować paski liści w roztworze enzymu, delikatnie mieszając w słabym świetle przez cztery do sześciu godzin w temperaturze pokojowej.

W miarę uwalniania protoplastów roztwór enzymatyczny zmieni kolor na żółto-zielony. Sprawdź roztwór enzymu protoplastów pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu, aby wybrać próbkę o najlepszym trawieniu protoplastów. Uwolnione protoplasty mają kształt kulisty, podczas gdy niestrawione komórki mają nieregularne lub owalne kształty.

Aby zatrzymać trawienie, delikatnie wlej 10 mililitrów roztworu protoplastu enzymatycznego z najlepszym trawieniem protoplastów do 50-mililitrowej probówki i dodaj 10 mililitrów roztworu W5 w temperaturze pokojowej. Delikatnie odwróć rurkę kilka razy. Następnie delikatnie wlej roztwór protoplastu enzymatycznego do czystej nylonowej siatki o grubości 75 mikronów umieszczonej na 50-mililitrowej probówce, aby usunąć niestrawione tkanki liści.

Następnie odwirować przepływ przez roztwór protoplastu enzymatycznego o stężeniu 100 razy G przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Następnie użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby delikatnie usunąć supernatant bez naruszania osadu protoplastowego. Ponownie zawiesić protoplast w schłodzonym roztworze W5 i utrzymać 50-mililitrową probówkę na lodzie.

Po zliczeniu liczby protoplastów na hemocytometrze pod mikroskopem, rozcieńczyć do stężenia dwa razy 10 do piątych protoplastów na mililitr w schłodzonym roztworze W5. Trzymaj protoplast na lodzie przez 30 minut. Odwirować zawiesinę o stężeniu 100 razy G przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej.

Następnie użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby delikatnie usunąć roztwór W5 bez naruszania osadu protoplastu. Zawiesić protoplast w roztworze MMG w temperaturze pokojowej o stężeniu dwa razy 10 do piątego protoplastu na mililitr. Aby przygotować protoplast do transformacji, użyj nieoszlifowanych końcówek pipet o pojemności 200 mikrolitrów, aby uzyskać 100 mikrolitrów podwielokrotności protoplastów w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych o niskiej przyczepności.

Odłożyć jedną podwielokrotność, która ma służyć jako kontrola ujemna. Do pozostałej podwielokrotności protoplastów dodaj 10 mikrolitrów plazmidowego DNA. Powoli dodaj 110 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu kołków na wewnętrzną ściankę 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Następnie delikatnie odwróć i obracaj probówkę, aż roztwór stanie się jednorodny. Mieszaniny transformacyjne inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Aby zatrzymać przemianę, powoli dodaj 400 mikrolitrów roztworu W5 do każdej 1,5 mililitrowej probówki w temperaturze pokojowej i delikatnie odwróć probówkę, aż roztwór stanie się jednorodny.

Odwirować probówki w temperaturze 100 razy G przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Dodaj jeden mililitr roztworu WI do każdej probówki.

Pokryj powierzchnię studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej, aby zapobiec przywieraniu protoplastów do płytki. Dodaj jeden mililitr pięcioprocentowej sterylnej surowicy cielęcej do każdego dołka, a po kilku sekundach usuń surowicę cielęcą za pomocą pipety. Przenieś ponownie zawieszone protoplasty do studzienek płytki hodowlanej i przykryj płytkę pokrywką.

Przed zbiorem inkubować protoplasty w temperaturze pokojowej przez dwa dni w ciemności. Po dwóch dniach przenieś roztwór protoplastu do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej o niskiej przyczepności. Odwirować probówki w temperaturze 100 razy G przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej.

Usunąć supernatant za pomocą pipety. Przenieś 10 mikrolitrów protoplastu na szklane szkiełko. Obserwuj sygnały fluorescencyjne pod mikroskopią fluorescencyjną lub konfokalną przy użyciu nieprzekształconych protoplastów jako kontroli negatywnej.

Komórki protoplastu przygotowano z różnych narządów 10-dniowej soi i obserwowano pod mikroskopem. Ściany komórkowe z hipogonowego i epiaudalnego były prawie nie trawione. Niektóre komórki pozostały ze sobą połączone.

W ołowiu ogonowym i korzeniu ściany komórkowe zostały usunięte tylko w niewielkiej części komórek. W przeciwieństwie do tego, dużą liczbę protoplastów zaobserwowano, gdy zastosowano jednolistnik. Sadzonki na tym zdjęciu od lewej do prawej ilustrują jednolistne liście, które są nierozszerzone, tylko rozszerzone lub w pełni rozwinięte.

Podczas gdy zarówno nierozciągnięte, jak i dopiero co rozwinięte liście jednolistne powodowały wysokie plony protoplastów, wielkość protoplastów z dopiero co ekspandowanego jednolistnego była bardziej jednolita niż nieekspandowanego jednolistnego. W przypadku w pełni rozwiniętego jednolistnego ściany komórkowe były nadal nienaruszone w większości komórek. Testowanie szeregu różnych ilości plazmidowego DNA sugerowało, że większe ilości DNA skutkują wyższą wydajnością transformacji.

Konfokalne obrazy protoplastów soi przekształconych za pomocą konstruktu, który wyraża GFP połączony z genem E1 specyficznym dla roślin strączkowych, wykazały lokalizację jądrową białka fuzyjnego GFP E1, zgodnie z poprzednim badaniem z wykorzystaniem systemu protoplastów Arabidopsis. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o empirycznej optymalizacji każdego warunku eksperymentalnego, takiego jak wybór odpowiedniego etapu materiału liściowego, długość czasu trawienia ściany komórkowej, wiek koncentracji i ilość plazmidowego DNA do transformacji. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak replikacja RNA i białka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, które geny lub białka są regulowane, a które nieregulowane?

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać wysokiej jakości komórki protoplastów sojowych.