Name: Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Poznaj prostą metodę izolacji protoplastów soi do analizy ekspresji genów i mechanizmów regulacyjnych w żywych komórkach roślinnych. Technika ta umożliwia badanie sieci sygnałowych oraz interakcji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Program Badań nad Genomem Roślinnym od Narodowej Fundacji Nauki (NSF-PGRP-IOS-1339388).

1. Wzrost roślin
<ol>
	<li>Wysiewaj 5 - 10 nasion soi (Williams 82) w doniczce o średnicy 13 cm w szklarni w warunkach długiego dnia (16 godzin światła przy 1 500 μmol m-2 s-1) w temperaturze 25 °C na niestandardowej mieszance gleby dla soi (stosunek 1:1:1 gleby, perlitu i piasku torpedowego).</li>
</ol>
2. Przygotowanie plazmidowego DNA
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnej końcówki pipety lub wykałaczki wybierz pojedynczą kolonię lub mrożony bulion glicerolowy E. coli przenoszący plazmid zawierający interesujący nas gen i zaszczep go w 20 ml płynnej pożywki Luria-Bertani (LB) odpowiednimi antybiotykami w kolbie o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez noc na wytrząsarce. Zebrać bakterie, odwirowując zawiesinę o sile 12 000 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i odrzucając supernatant. Ekstrahuj i oczyść plazmid zgodnie z procedurą producenta zestawu do przygotowania plazmidu.</li>
</ol>
3. Izolacja protoplastów
<ol>
	<li>Wytnij nowo ekspandowane liście jednolistne z 10-dniowych siewek soi (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Selekcja liści w odpowiednim etapie rozwojowym jest kluczem do sukcesu preparatu protoplastów soi. Używaj tylko rozszerzonych liści we wczesnych stadiach rozwoju. W miarę dojrzewania liści ściany komórkowe stają się trudniejsze do strawienia.</li>
	<li>Za pomocą świeżej żyletki usuń nerw środkowy z jednolistnego liścia, a następnie pokrój resztki w paski o grubości 0,5-1 mm. 
	UWAGA: Dwa jednolistkowe liście strawione w 10 ml roztworu enzymatycznego dadzą wystarczającą ilość protoplastów na więcej niż 10 przemian.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków natychmiast i delikatnie przenieść paski liści do 10 ml świeżo przygotowanego roztworu enzymatycznego (Tabela 1) w probówce o pojemności 15 ml. Infiltrować próżniowo paski liści przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować paski liści w roztworze enzymu, delikatnie mieszając (40 obr./min) w słabym świetle przez 4-6 godzin w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że roztwór enzymatyczny zmieni kolor na żółto-zielony, gdy protoplasty zostaną uwolnione. Sprawdzić roztwór enzymu/protoplastów pod mikroskopem (X10). 
	UWAGA: Uwolnione protoplasty mają kulisty kształt, podczas gdy niestrawione komórki mają nieregularny lub owalny kształt.</li>
	<li>Przenieść 10 ml roztworu enzymu/protoplastu do probówki o pojemności 50 ml, delikatnie wlewając i dodając 10 ml roztworu W5 (Tabela 1) w temperaturze pokojowej, aby zatrzymać trawienie. Delikatnie odwróć rurkę kilka razy. Delikatnie wlej roztwór enzymu/protoplastów na czystą nylonową siatkę o grubości 75 μm umieszczoną na probówce o pojemności 50 ml, aby usunąć niestrawione tkanki liści.</li>
	<li>Odwirować przepływowy roztwór enzymu/protoplastów o sile 100 x g w probówce o pojemności 50 ml przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Delikatnie usunąć sklarowany osad za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml, nie naruszając osadu protoplastu.</li>
	<li>Zawiesić protoplasty i rozcieńczyć do stężenia 2 x 105 mL-1 w schłodzonym roztworze W5 w temperaturze 4 °C, licząc liczbę protoplastów na hemytometrze pod mikroskopem (x10). Trzymaj protoplasty na lodzie przez 30 minut.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 100 x g przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej i delikatnie usunąć roztwór W5 za pomocą pipety o pojemności 1 ml, nie naruszając osadu protoplastu. Zawiesić protoplasty w roztworze MMG (Tabela 1) w stężeniu 2 x 105 mL-1 w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
4. Transformacja protoplastów
<ol>
	<li>Przygotować 100 μl porcji protoplastów (2 x 104 protoplasty w 2 x 105 ml-1) w probówkach wirówek mikrowirówek o niskiej przyczepności o pojemności 1,5 ml za pomocą nieoszlifowanych końcówek do pipet o pojemności 200 μl. Odłożyć jedną porcję na bok, aby służyła jako kontrola ujemna. Dodać 10 μl plazmidu (10-20 μg) do każdej z pozostałych podwielokrotności protoplastów.</li>
	<li>Powoli dodać 110 μl świeżo przygotowanego roztworu PEG (Tabela 1) na wewnętrzną ściankę probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, a następnie delikatnie odwrócić i obrócić probówkę, aż roztwór stanie się jednorodny.</li>
	<li>Mieszaninę transformacyjną inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	<li>Aby zatrzymać przemianę, powoli dodaj 400 μl roztworu W5 do probówki o pojemności 1,5 ml w temperaturze pokojowej i delikatnie odwróć probówkę, aż roztwór stanie się jednorodny. Odwirować probówkę o masie 100 g przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 1 ml roztworu WI (Tabela 1) do probówki i ponownie zawiesić, delikatnie pipetując 1-2 razy. Dodaj 1 ml sterylnej surowicy cielęcej o stężeniu 5% (obj./obj.) do każdej studzienki 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej, aby pokryć powierzchnię i zapobiec przywieraniu protoplastów do płytki.</li>
	<li>Po kilku sekundach wyrzuć surowicę cielęcą za pomocą pipety. Przenieś zawieszone protoplasty do studzienki płytki hodowlanej. Przykryj talerz pokrywką.</li>
</ol>
5. Inkubacja i zbiór protoplastów
<ol>
	<li>Inkubuj protoplasty w temperaturze pokojowej przez 1-2 dni w ciemności. 
	UWAGA: Odkryliśmy, że dwudniowa inkubacja daje ogólnie silniejszy sygnał białka fluorescencyjnego w porównaniu z inkubacją jednodniową, a sygnał białka fluorescencyjnego może trwać do 3-4 dni.</li>
	<li>Przenieść roztwór protoplastu do probówki mikrowirówkowej o niskiej przyczepności o pojemności 1,5 ml. Odwirować probówkę o stężeniu 100 x g przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać protoplasty. Usunąć supernatant za pomocą pipety i przenieść 10 μl protoplastów na szkiełko podstawowe.</li>
	<li>Obserwuj sygnał fluorescencyjny pod mikroskopią fluorescencyjną lub konfokalną. Używaj nieprzekształconych protoplastów jako kontroli negatywnej (nie należy obserwować żadnego sygnału).</li>
</ol>

<ol><li>Melchers, G., Labib, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00271144">Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).</li>
<li>Gresshoff, P. M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2474847">In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration.</a> Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).</li>
<li>Lörz, H., Baker, B., Schell, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00330256">Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation.</a> Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).</li>
<li>Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation+system+for+production+of+fertile+transgenic+rice+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants.</a> Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).</li>
<li>Koop, H. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+foreign+sequences+into+the+tobacco+plastome+via+polyethylene+glycol-mediated+protoplast+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation.</a> Planta. 199 (2), 193-201 (1996).</li>
<li>Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003194220089679X">Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts.</a> Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).</li>
<li>Lin, W., Wittenbach, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+proteases+in+wheat+and+corn+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).</li>
<li>Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+cadmium+and+cadmium-binding+peptides+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves.</a> Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defence+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li>
<li>Wu, F. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tape-Arabidopsis+Sandwich-a+simpler+Arabidopsis+protoplast+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method.</a> Plant methods. 5 (1), 16(2009).</li>
<li>Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+polyubiquitin+genes%3A+structure%2C+thermal+perturbation+of+expression+and+transcript+splicing%2C+and+promoter+activity+following+transfer+to+protoplasts+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation.</a> Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).</li>
<li>Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v335/n6189/abs/335454a0.html">Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts.</a> Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).</li>
<li>Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+and+fungal+elicitor+regulation+of+a+plant+defense+gene+promoter+in+electroporated+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).</li>
<li>Cocking, E. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v187/n4741/abs/187962a0.html">A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles.</a> Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+rice+plants+produced+by+electroporation-mediated+plasmid+uptake+into+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts.</a> Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).</li>
<li>Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+genes+transferred+into+monocot+and+dicot+plant+cells+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).</li>
<li>Crossway, A., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00331634">Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts.</a> Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).</li>
<li>Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+barley+by+microinjection+into+isolated+zygote+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts.</a> Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).</li>
<li>Schapire, A. L., Lois, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+and+rapid+method+for+the+isolation+and+transfection+of+Arabidopsis+leaf+mesophyll+protoplasts+for+large-scale+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signal+Transduction%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications.</a> Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).</li>
<li>Niedz, R. P. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-005-9028-4">Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes.</a> Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).</li>
<li>Sheng, X., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11240-011-0002-z">Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis).</a> Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).</li>
<li>Grun, P., Chu, L. -J. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2442587">Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae).</a> Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).</li>
<li>Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+protoplasts%3A+status+and+biotechnological+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives.</a> Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).</li>
<li>Pitzschke, A., Persak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poinsettia+protoplasts-a+simple%2C+robust+and+efficient+system+for+transient+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies.</a> Plant methods. 8 (1), 14(2012).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat. Protoc. 2 (7), 1565(2007).</li>
<li>Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+domestication%3A+the+origin%2C+genetic+architecture+and+molecular+bases%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases.</a> New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).</li>
<li>Yang, Y., Li, R., Qi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+plant+promoters+and+transcription+factors+by+agroinfiltration+of+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves.</a> Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).</li>
<li>Marion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+protein+subcellular+localization+and+interaction+using+high-throughput+transient+transformation+of+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings.</a> Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).</li>
<li>Wu, H. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGROBEST%3A+an+efficient+Agrobacterium-mediated+transient+expression+method+for+versatile+gene+function+analyses+in+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+methods%22%5BJournal%5D)">AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings.</a> Plant methods. 10 (1), 19(2014).</li>
<li>Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+constitutive+viral+promoters+in+transgenic+soybean+roots+and+nodules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules.</a> Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).</li>
<li>Nagamatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+soybean+genes+involved+in+flavonoid+biosynthesis+by+virus-induced+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing.</a> Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).</li>
<li>Juvale, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+Bean+pod+mottle+virus-induced+gene+silencing+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean.</a> Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).</li>
<li>Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+an+efficient+multipurpose+bean+pod+mottle+virus+viral+vector+set+for+foreign+gene+expression+and+RNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing.</a> Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).</li>
<li>Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mesophyll+protoplasts+from+mature+leaves+of+soybeans%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans.</a> Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-repeat+MYB+transcription+factor%2C+GmMYB176%2C+regulates+CHS8+gene+expression+and+affects+isoflavonoid+biosynthesis+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean.</a> Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).</li>
<li>Faria, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAC+domain-containing+protein%2C+GmNAC6%2C+is+a+downstream+component+of+the+ER+stress-and+osmotic+stress-induced+NRP-mediated+cell-death+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway.</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 129(2011).</li>
<li>Kidokoro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+DREB1%2FCBF-type+transcription+factors+function+in+heat+and+drought+as+well+as+cold+stress-responsive+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression.</a> Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+soybean+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system.</a> Sci Rep-UK. 5, 10342(2015).</li>
<li>Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11992820">GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).</li>
<li>Xia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positional+cloning+and+characterization+reveal+the+molecular+basis+for+soybean+maturity+locus+E1+that+regulates+photoperiodic+flowering%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+A.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering.</a> P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ten protokół izolacji protoplastów soi i zastosowania do badań nad ekspresją przejściową został dokładnie przetestowany i bardzo dobrze sprawdza się w naszym laboratorium. Procedury są proste i łatwe, wymagają zwykłego sprzętu i minimalnych kosztów. Nasz protokół daje duże ilości jednorodnych, wysokiej jakości protoplastów w porównaniu z wcześniej opisanymi metodami 34,35,36,37,38.<sup class="x...

Protoplasty to komórki roślinne, z których usunięto ściany komórkowe. Ze względu na to, że zachowują większość cech i aktywności komórek roślinnych, protoplasty są dobrym systemem modelowym do obserwacji i oceny różnorodnych zdarzeń komórkowych oraz są cennymi narzędziami do badania hybrydyzacji somatycznej1 i regeneracji roślin2. Protoplasty są również szeroko wykorzystywane do transformacji roślin3,4,5, ponieważ w przeciwnym razie ściany komórkowe blokowałyby przenikanie DNA do komórki. Protoplasty posiadają niektóre reakcje fizjologiczne i procesy komórkowe nienaruszonych roślin, oferując tym samym fundamentalną wartość w badaniach podstawowych w celu zbadania lokalizacji białek subkomórkowych6,7,8, interakcje białko-białko9,10, oraz aktywność promotora11,12, 13 w aktywnych komórkach.
Izolacja protoplastów roślinnych została po raz pierwszy opisana w 1960 roku14, a protokoły zarówno izolacji, jak i transformacji protoplastów zostały opracowane i zoptymalizowane. Standardowa procedura izolacji protoplastów polega na ścinaniu liści i enzymatycznym trawieniu ścian komórkowych, a następnie oddzieleniu uwolnionych protoplastów od niestrawionych szczątków tkankowych. Strategie transformacji obejmują metody elektroporation15,16, metody mikroiniekcji17,18 oraz metody oparte na glikolu polietylenowym (PEG)4,5,19. Stwierdzono, że wiele gatunków z powodzeniem izoluje protoplasty, w tym Citrus20, Brassica21, Solanaceae22 i inne rodziny roślin ozdobnych23,24. Podczas gdy różne typy tkanek są używane u różnych gatunków, system przejściowej ekspresji w protoplastach mezofilu Arabidopsis (TEAMP) wyizolowanych z liści modelowej rośliny Arabidopsis thaliana został dobrze ugruntowany25 i szeroko przyjęty do różnych zastosowań.
Soja (Glycine max (L.) Merr.) jest jedną z najważniejszych roślin białkowych i oleistych26. W przeciwieństwie do rzodkiewnika i ryżu, uzyskanie transgenicznych roślin soi jest znane z tego, że jest dość trudne i mało wydajne. Naciek, w którym pośredniczy Agrobacterium tumefaciens, jest powszechnie stosowany do badań nad przejściową ekspresją genów w komórkach naskórka u tytoniu27 i siewkach Arabidopsis28,29, podczas gdy Agrobacterium rhizogenes jest używany do przekształcania owłosionych korzeni w soi30. Metody wyciszania genów wywołane przez wirusa zostały wykorzystane do regulacji w dół docelowych genów31,32 i ekspresja przejściowa33 w sposób systemowy. Protoplasty stanowią cenną i wszechstronną alternatywę dla tych podejść. Protoplasty można uzyskać z materiałów nadziemnych soi i umożliwiają szybką i zsynchronizowaną ekspresję transgenu. Jednak od czasu początkowej udanej izolacji protoplastów soi w 198334, pojawiły się ograniczone doniesienia na temat zastosowania protoplastów w soibean35,36,37,38, głównie ze względu na stosunkowo niską wydajność protoplastów soi.
Tutaj opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji protoplastów soi oraz jego zastosowanie do badań nad przejściową ekspresją genów. Wykorzystując młode jednolistne liście z sadzonek soi, byliśmy w stanie uzyskać duże ilości ważnych protoplastów w ciągu kilku godzin. Ponadto zoptymalizowaliśmy metodę transformacji za pośrednictwem PEG i wapnia, która jest prosta i tania, aby dostarczyć DNA do protoplastów soi z wysoką wydajnością.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8250-100G</td><td></td></tr><tr><td>Celulaza CELF</td><td>Worthington Biological Corporation</td><td>LS002611</td><td></td></tr><tr><td>Pektoliaza Y-23</td><td>BioWorld</td><td>9033-35-6</td><td></td></tr><tr><td>CELULAZA "ONOZUKA" R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>MACEROZYME R-10</td><td>yakult</td><td>10g</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>ICN Biomedicals</td><td>152540</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher</td><td>C79-500g</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>PEG4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>siatka nylonowa</td><td>carolina</td><td>652222N</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowych</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td> Fisher <td>12-640</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hememytometr</td><td>Hausserscientific</td><td>1483</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw miniprzygotowawczy plazmidu EZNA</td><td>Omega</td><td>D6942-01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do miniprzygotowania plazmidu GeneJET</td><td>Wirówka Thermo Scientific</td><td>K0502</td><td></td></tr><tr><td>5810</td> Wirówka do <td>5811000827</td><td></td><td>eppendorf</td></tr><tr><td>5424</td><td>eppendorf</td><td>22620401</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler rur Jencons Powerpette Plus</td><td>Jencons</td><td>14526-202</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Zeiss 710</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nieprzywierające, wolne od RNaz probówki do mikrofugowania, 1,5 ml</td><td>Ambion</td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Probówki</td> wirówkowe <td>Denville</td><td>C1018-P</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>Denville</td><td>C1060-P</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla noworodków</td><td>Thermo Scientific</td><td>16010159</td><td></td></tr><tr><td>Gleba</td><td>Szkółka</td><td></td><td></td>Ingrama</tr><tr><td>perlit</td><td>Vigoro</td><td>100521091</td><td></td></tr><tr><td>Piasek torpedowy</td><td>JKS Ventures</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół, Lennox (proszek)</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr></tbody></table>

prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

A Simple Method for Isolation of Soybean Protoplasts and Application to Transient Gene Expression Analyses

Soja (Glycine max (L.) Merr.) jest ważnym gatunkiem uprawnym i stała się modelem roślin strączkowych do badań nad szlakami genetycznymi i biochemicznymi. Dlatego ważne jest, aby ustanowić wydajny system przejściowej ekspresji genów w soi. W tym miejscu przedstawiamy prosty protokół przygotowania protoplastów sojowych i jego zastosowanie do przejściowych analiz funkcjonalnych. Odkryliśmy, że młode jednolistne liście z siewek soi dały duże ilości wysokiej jakości protoplastów. Optymalizując metodę transformacji za pośrednictwem PEG i wapnia, osiągnęliśmy wysoką wydajność transformacji przy użyciu jednolistnych protoplastów soi. System ten stanowi wydajny i wszechstronny model do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach soi i może pomóc w lepszym zrozumieniu różnorodnych procesów komórkowych, rozwojowych i fizjologicznych roślin strączkowych.

W celu przygotowania protoplastów przebadano różne organy 10-dniowych siewek soi (Rysunek 1), a uzyskane wydajności zaobserwowano pod mikroskopem (Rysunek 2). Ścianki komórkowe z podkotylidonu i epikotylonu były słabo trawione, a niektóre komórki pozostały ze sobą połączone (Rysunek 2B, 2C). W kotyledonach (Rysunek 2D) oraz korzeniu (<strong class="xfig"...

Opracowaliśmy prosty i efektywny protokół do przygotowania dużych ilości protoplastów soi do badania złożonych mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach.

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) is an important crop species and has become a legume model for the studies of genetic and biochemical pathways. ...

Ogólnym celem tej metody jest uzyskanie wysokiej jakości komórek protoplastowych z soi w celu zbadania mechanizmów regulacyjnych i sygnalizacyjnych w żywych komórkach soi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w sieciach regulacyjnych, takie jak to, jaki jest ich bezpośredni gen docelowy, otwarty czynnik transfuzji i jaki jest ich partner oddziałujący, otwórz białko. Główną zaletą tej techniki jest sztuka.Wytwarza duże ilości jednolitych komórek protoplastów soi i jest prosty i łatwy. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ bardzo trudno jest uzyskać ładne protoplasty z liści soi, chyba że na określonym etapie ujednoliszczysz liście. Dobór liści w odpowiednim stadium rozwojowym jest kluczem do udanego przygotowania protoplastów soi.Wytnij nowo ekspandowane liście jednolistne z 10-dniowych sadzonek soi. Aby upewnić się, że gdy próbka daje wysoki plon protoplastów, zbierz co najmniej trzy próbki liści jednolistnych na nieco różnych etapach rozwoju. Za pomocą świeżej żyletki usuń nerw środkowy z każdego jednolistnego liścia, a następnie pokrój resztki w paski o długości od 0,5 do jednego milimetra.Za pomocą kleszczy delikatnie przenieś paski liści natychmiast do 10 mililitrów świeżo przygotowanego roztworu enzymatycznego w 15-mililitrowej tubce. Próżniowo infiltrować paski liści przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować paski liści w roztworze enzymu, delikatnie mieszając w słabym świetle przez cztery do sześciu godzin w temperaturze pokojowej.W miarę uwalniania protoplastów roztwór enzymatyczny zmieni kolor na żółto-zielony. Sprawdź roztwór enzymu protoplastów pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu, aby wybrać próbkę o najlepszym trawieniu protoplastów. Uwolnione protoplasty mają kształt kulisty, podczas gdy niestrawione komórki mają nieregularne lub owalne kształty.Aby zatrzymać trawienie, delikatnie wlej 10 mililitrów roztworu protoplastu enzymatycznego z najlepszym trawieniem protoplastów do 50-mililitrowej probówki i dodaj 10 mililitrów roztworu W5 w temperaturze pokojowej. Delikatnie odwróć rurkę kilka razy. Następnie delikatnie wlej roztwór protoplastu enzymatycznego do czystej nylonowej siatki o grubości 75 mikronów umieszczonej na 50-mililitrowej probówce, aby usunąć niestrawione tkanki liści.Następnie odwirować przepływ przez roztwór protoplastu enzymatycznego o stężeniu 100 razy G przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Następnie użyj 10-mililitrowej pipety serologicznej, aby delikatnie usunąć supernatant bez naruszania osadu protoplastowego. Ponownie zawiesić protoplast w schłodzonym roztworze W5 i utrzymać 50-mililitrową probówkę na lodzie.Po zliczeniu liczby protoplastów na hemocytometrze pod mikroskopem, rozcieńczyć do stężenia dwa razy 10 do piątych protoplastów na mililitr w schłodzonym roztworze W5. Trzymaj protoplast na lodzie przez 30 minut. Odwirować zawiesinę o stężeniu 100 razy G przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej.Następnie użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby delikatnie usunąć roztwór W5 bez naruszania osadu protoplastu. Zawiesić protoplast w roztworze MMG w temperaturze pokojowej o stężeniu dwa razy 10 do piątego protoplastu na mililitr. Aby przygotować protoplast do transformacji, użyj nieoszlifowanych końcówek pipet o pojemności 200 mikrolitrów, aby uzyskać 100 mikrolitrów podwielokrotności protoplastów w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych o niskiej przyczepności.Odłożyć jedną podwielokrotność, która ma służyć jako kontrola ujemna. Do pozostałej podwielokrotności protoplastów dodaj 10 mikrolitrów plazmidowego DNA. Powoli dodaj 110 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu kołków na wewnętrzną ściankę 1,5 mililitrowej probówki do mikrowirówki.Następnie delikatnie odwróć i obracaj probówkę, aż roztwór stanie się jednorodny. Mieszaniny transformacyjne inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Aby zatrzymać przemianę, powoli dodaj 400 mikrolitrów roztworu W5 do każdej 1,5 mililitrowej probówki w temperaturze pokojowej i delikatnie odwróć probówkę, aż roztwór stanie się jednorodny.Odwirować probówki w temperaturze 100 razy G przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Dodaj jeden mililitr roztworu WI do każdej probówki.Pokryj powierzchnię studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej, aby zapobiec przywieraniu protoplastów do płytki. Dodaj jeden mililitr pięcioprocentowej sterylnej surowicy cielęcej do każdego dołka, a po kilku sekundach usuń surowicę cielęcą za pomocą pipety. Przenieś ponownie zawieszone protoplasty do studzienek płytki hodowlanej i przykryj płytkę pokrywką.Przed zbiorem inkubować protoplasty w temperaturze pokojowej przez dwa dni w ciemności. Po dwóch dniach przenieś roztwór protoplastu do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej o niskiej przyczepności. Odwirować probówki w temperaturze 100 razy G przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej.Usunąć supernatant za pomocą pipety. Przenieś 10 mikrolitrów protoplastu na szklane szkiełko. Obserwuj sygnały fluorescencyjne pod mikroskopią fluorescencyjną lub konfokalną przy użyciu nieprzekształconych protoplastów jako kontroli negatywnej.Komórki protoplastu przygotowano z różnych narządów 10-dniowej soi i obserwowano pod mikroskopem. Ściany komórkowe z hipogonowego i epiaudalnego były prawie nie trawione. Niektóre komórki pozostały ze sobą połączone.W ołowiu ogonowym i korzeniu ściany komórkowe zostały usunięte tylko w niewielkiej części komórek. W przeciwieństwie do tego, dużą liczbę protoplastów zaobserwowano, gdy zastosowano jednolistnik. Sadzonki na tym zdjęciu od lewej do prawej ilustrują jednolistne liście, które są nierozszerzone, tylko rozszerzone lub w pełni rozwinięte.Podczas gdy zarówno nierozciągnięte, jak i dopiero co rozwinięte liście jednolistne powodowały wysokie plony protoplastów, wielkość protoplastów z dopiero co ekspandowanego jednolistnego była bardziej jednolita niż nieekspandowanego jednolistnego. W przypadku w pełni rozwiniętego jednolistnego ściany komórkowe były nadal nienaruszone w większości komórek. Testowanie szeregu różnych ilości plazmidowego DNA sugerowało, że większe ilości DNA skutkują wyższą wydajnością transformacji.Konfokalne obrazy protoplastów soi przekształconych za pomocą konstruktu, który wyraża GFP połączony z genem E1 specyficznym dla roślin strączkowych, wykazały lokalizację jądrową białka fuzyjnego GFP E1, zgodnie z poprzednim badaniem z wykorzystaniem systemu protoplastów Arabidopsis. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o empirycznej optymalizacji każdego warunku eksperymentalnego, takiego jak wybór odpowiedniego etapu materiału liściowego, długość czasu trawienia ściany komórkowej, wiek koncentracji i ilość plazmidowego DNA do transformacji. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak replikacja RNA i białka, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, które geny lub białka są regulowane, a które nieregulowane?Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać wysokiej jakości komórki protoplastów sojowych.

a-simple-method-for-isolation-soybean-protoplasts-application-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę izolacji nienaruszonych protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis. Biorąc pod uwagę, że wyizolowane protoplasty pozostają nienaruszone przez co najmniej 96h i są izolowane z siewek zamiast z miesięcznych, dojrzałych roślin, procedura ta przyspiesza analizy wymagające zastosowania nienaruszonych protoplastów.

Izolacja protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana

Opisujemy metodę wprowadzania, śledzenia i ilościowej analizy ekspresji GFP w komórkach roślinnych. Metoda ta wykorzystuje specjalnie zaprojektowany system robotyczny do półciągłego zbierania obrazów z dużej liczby próbek w czasie. Demonstrujemy również zastosowanie programów ImageJ i ImageReady do analizy serii obrazów.

Robotyka i dynamiczna analiza obrazu w badaniach ekspresji genów w tkankach roślinnych

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Rośliny oferują nowatorski system do produkcji białek farmaceutycznych na skalę komercyjną, który jest bardziej skalowalny, opłacalny i bezpieczny niż obecne paradygmaty ekspresji. W tym badaniu przedstawiamy proste i wygodne, a jednocześnie skalowalne podejście do wprowadzenia genu docelowego zawierającego Agrobacterium tumefaciens do roślin w celu przejściowej ekspresji białka.

Efektywna agroinfiltracja roślin w celu uzyskania przejściowej ekspresji białek rekombinowanych na wysokim poziomie

Opisana jest wysokoprzepustowa, zautomatyzowana metodologia produkcji i przetwarzania protoplastów tytoniu. Zrobotyzowany system umożliwia masowo równoległą ekspresję i odkrywanie genów w modelowym systemie BY-2, które powinno być możliwe do przełożenia na uprawy niemodelowe.

Zrobotyzowana platforma do wysokowydajnej izolacji i transformacji protoplastów

Istniejące metody modyfikacji roślin mają ograniczone zastosowanie. Zaproponowana tu nowatorska technologia oparta na peptydach obiecuje zarówno prostotę, jak i skuteczność we wprowadzaniu egzogennych białek lub genów do pożądanych przedziałów wewnątrzkomórkowych nienaruszonych roślin.

Peptydowa metoda transportu genów i białek przez bariery komórkowe i organellarne w roślinach

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Tutaj prezentujemy protokół o wysokiej przepustowości do przejściowego transfekcji milionów protoplastów kukurydzy do testowania dużych bibliotek plazmidów w komórkach mezofilu kukurydzy.

Skalowalna transfekcja protoplastów mezofilu kukurydzy

Tutaj prezentujemy protokół do wysokowydajnej produkcji transgenicznych korzeni owłosionych soi.

Transformacja owłosionych korzeni soi w celu analizy funkcji genów

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Poznaj prostą metodę izolacji protoplastów soi do analizy ekspresji genów i mechanizmów regulacyjnych w żywych komórkach roślinnych. Technika ta umożliwia badanie sieci sygnałowych oraz interakcji białek.

Prosta metoda izolacji protoplastów soi i zastosowanie do analiz przejściowej ekspresji genów

Przeglądaj więcej filmów