Name: Kolorymetryczna metoda pomiaru zawartości żelaza w roślinach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj kolorymetryczną metodę Pruskiego Błękitu do pomiaru zawartości żelaza w tkankach roślinnych. Protokół zapewnia precyzyjną i niezawodną analizę żelaza w próbkach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez izraelskie Ministerstwo Nauki, Technologii i Przestrzeni oraz przez grant od Głównego Naukowca izraelskiego Ministerstwa Rolnictwa (#16-16-0003).

1. Materiał roślinny i warunki wzrostu
<ol>
	<li>Zasiej jedno nasiono tytoniu (odmiana Samsun) do doniczki o wymiarach 5 cm x 5 cm wypełnionej standardowym podłożem doniczkowym. Umieść doniczki na tackach. Uprawiaj rośliny w pomieszczeniu wzrostowym w warunkach długiego dnia (16/8 h światło/ciemność) przy stałej temperaturze 23 °C. Podlewaj wodą z kranu do momentu, aż woda zacznie wypływać z doniczki.</li>
	<li>Po 50±5 dniach rozpocznij zabiegi z Fe podczas podlewania, stosując stężenia odpowiednie dla danego eksperymentu. Przykładowo, zastosowano zakres stężeń żelaza od 0 do 6 mM, z dodatkiem rozpuszczalnego chelatora Fe (Fe EDDHA). Podlewaj rośliny odpowiednim roztworem co dwa dni (aby uniknąć odwodnienia) przez okres 6-8 dni.</li>
</ol>
2. Przygotowanie liści do pomiaru zawartości żelaza
Uwagi: Wszystkie wykorzystywane materiały muszą być wolne od żelaza, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia żelazem. Przed użyciem dwukrotnie wyczyść moździerz i tłuczek roztworem 4% HCl, za każdym razem osuszając je papierem filtracyjnym. W przypadku ponownego wykorzystania materiałów, należy je dwukrotnie wyczyścić roztworem 4% HCl i osuszyć papierem filtracyjnym.
<ol>
	<li>Oddziel liście od łodygi ręcznie, używając rękawiczek (nie używaj żadnych metalowych narzędzi). Do każdej próbki wykorzystaj około 10 g liści (masa świeża). Oczyść każdy liść wodą dwukrotnie destylowaną (DDW) za pomocą butelki z atomizerem. Ten krok jest istotny, aby uniknąć zanieczyszczenia Fe.</li>
	<li>Osusz liście na ręczniku papierowym i umieść je w papierowej torbie. Przenieś papierowe torby do susznika w stałej temperaturze 80 °C na 2-3 dni.</li>
	<li>Po wysuszeniu rozetrzyj liście na proszek w moździerzu i przenieś do sterylnych plastikowych probówek o pojemności 15 mL.</li>
</ol>
3. Spalanie liści do postaci popiołu
Uwagi: Zastosowanie roztworu HCl o niskim pH (bliskim 0) ma na celu zwiększenie rozpuszczalności żelaza. Watę mineralną stosuje się, aby zapobiec ucieczce gazów z probówki podczas spalania.
<ol>
	<li>Zważ nową, szczelną fiolkę scyntylacyjną o pojemności 20 mL bez nakrętki. Zapisz wartość lub ustaw ją na zero za pomocą przycisku tary. Przenieś rozkruszone wysuszone liście (próbkę) do fiolki.</li>
	<li>Zważ próbkę wraz z pojemnikiem i zapisz wartość. Zamknij fiolkę wełną mineralną.</li>
	<li>Zważ 3 dodatkowe fiolki bez dodawania próbek i zapisz ich wartości. Fiolki te posłużą jako kontrole do oceny ilości wełny mineralnej, która mogłaby doprowadzić do zwiększenia masy próbki.</li>
	<li>Umieść fiolki z próbką oraz kontrolne w piecu i rozpocznij spalanie, stosując następujące etapy temperatury: temperatura pokojowa, szybki wzrost do 425 °C, a na koniec 425°C przez 4 godziny. Po tym czasie suche liście zamienią się w popiół.</li>
	<li>Pozostaw próbki do ostygnięcia do około 10 °C, ale nie poniżej tej temperatury w dwóch kolejnych krokach, aby uniknąć wilgoci, która mogłaby wpłynąć na końcową masę próbki. Używając grubych rękawic, wyjmij próbki z pieca za pomocą pęsety, trzymając fiolkę z zewnątrz.</li>
	<li>Postaw fiolki na płaskiej powierzchni, usuń wełnę mineralną i zamknij fiolki oryginalnymi nakrętkami.</li>
	<li>Zważ 3 fiolki kontrolne (patrz pkt 3.3) i oblicz średni przyrost ich masy. Jeśli przyrost masy jest równy lub przekracza 1% masy popiołu (patrz krok 4.2), przyjmij tę wartość jako szacunek błędu pomiarowego.</li>
</ol>
4. Przygotowanie popiołów do oznaczenia żelaza
Uwagi: Końcowe stężenie żelaza w próbce początkowej oblicza się jako masę popiołów podzieloną przez dodaną objętość HCl.
<ol>
	<li>Przygotować 1 M roztwór HCl (4% HCl), dodając 12,5 mL roztworu stokowego 37% HCl do 87,5 mL DDW (w kolbie plastikowej lub szklanej).</li>
	<li>Zważyć plastikową probówkę o pojemności 15 mL i zapisać wartość lub ustawić wartość na zero za pomocą przycisku tary. Przenieść popiół do probówki, zważyć i zapisać wartość. Jest to masa popiołu.</li>
	<li>Dodać 5 mL 1 M HCl do popiołu. Przefiltrować popiół przez filtr 2 µm i dodać kolejne 5 mL 1 M HCl przez ten sam filtr.</li>
	<li>Objętość końcowa powinna wynosić 10 mL. Należy pamiętać, że część roztworu zostanie utracona w filtrze. 
	UWAGA: Próbki są teraz gotowe do pomiaru Fe za pomocą FAAS lub metodą błękitu pruskiego.</li>
	<li>Sporządzić krzywą kalibracyjną z koncentracją Fe zmierzoną spektrometrią atomową oraz metodą błękitu pruskiego (patrz Rysunek 4) dla każdego gatunku rośliny. Następnie koncentrację Fe można mierzyć wyłącznie metodą błękitu pruskiego.</li>
</ol>
5. Pomiar stężenia Fe za pomocą FAAS
<ol>
	<li>Pobrać 4 mL z każdej próbki do pomiaru metodą FAAS.</li>
	<li>Wyniki otrzymane z pomiaru FAAS podzielić przez wagę popiołu. Otrzymaną wartość podzielić przez 0,01 (ponieważ popioły zostały rozpuszczone w 10 mL). Wynikowa wartość stanowi stężenie żelaza na gram popiołu (ppm).</li>
</ol>
6. Przygotowanie roztworu do barwienia błękitem pruskim
<ol>
	<li>Przygotować 4% roztwór błękitu pruskiego, dodając 4 g K4Fe(CN)6 do 10 mL DDW i mieszając w wibromikserze (w zależności od potrzeb można zastosować inne objętości i/lub stężenia). Należy zauważyć, że w niniejszym badaniu zastosowano mniej skoncentrowany roztwór błękitu pruskiego niż zgłoszono we wcześniejszych publikacjach (20%)14.</li>
	<li>Przechowywać roztwór w ciemności w temperaturze 4 °C do momentu użycia. W takich warunkach roztwór pozostaje stabilny przez 6 miesięcy.</li>
</ol>
7. Tworzenie krzywej kalibracyjnej dla metody błękitu pruskiego z wykorzystaniem wyników FAAS
UWAGA: Oblicz stężenie żelaza w popiołach, korzystając z następującego wzoru 
<img alt="Wzór na stężenie żelaza z wykorzystaniem absorpcji atomowej; równanie dla analizy w chemii analitycznej." src="/files/ftp_upload/57408/57408eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie">             Równanie 1 
C: stężenie, V: objętość próbki, W: masa popiołu (g).
<ol>
	<li>Wymieszaj 0,50 mL roztworu błękitu pruskiego i 0,50 mL 1 M HCl. Posłuży to jako roztwór ślepy.</li>
	<li>Wymieszaj poprzez pipetowanie 0,5 mL próbki (popioły w 4% HCl, zgodnie z opisem w sekcji 3) oraz 0,5 mL roztworu błękitu pruskiego (krok 6.1). Odczekaj co najmniej 1 minutę, ale nie więcej niż 5 minut. Po upływie 5 minut w próbkach nastąpi sedymentacja.</li>
	<li>Przenieś mieszaninę do kuwety i zmierz OD przy 715 nm za pomocą spektrofotometru. Zapisz otrzymaną wartość.</li>
	<li>Podziel wartość OD (krok 7.3) przez masę popiołu (krok 3.2) próbki. Wynik reprezentuje OD na gram popiołu.</li>
	<li>Wyznacz regresję liniową między stężeniami żelaza otrzymanymi z pomiarów FAAS (oś Y) a wartościami OD (oś X). Wykorzystaj wyniki uzyskane w krokach 5.2 i 7.4. Oblicz wzór regresji Y = a + bX, gdzie Y oznacza stężenie żelaza, a oznacza punkt przecięcia absorbancji, b oznacza nachylenie krzywej absorbancji, a X oznacza OD.</li>
</ol>
8. Wykorzystanie metody błękitu pruskiego do oznaczania poziomu żelaza w innych próbkach z tego samego gatunku rośliny
Uwagi: Ponieważ dla tego rodzaju roślin opracowano już krzywą kalibracyjną, stężenie żelaza w nowych próbkach pobranych z tego samego rodzaju roślin można obliczyć bezpośrednio, korzystając ze wzoru regresji liniowej.
<ol>
	<li>Wykonaj czynności opisane w sekcjach 3 i 4, a następnie kroki od 7.1 do 7.4.</li>
	<li>Oblicz stężenie żelaza w roztworze, korzystając ze wzoru uzyskanego z regresji liniowej (krok 7.5).</li>
</ol>

<ol><li>Kobayashi, T., Nishizawa, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+uptake%2C+translocation%2C+and+regulation+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Iron uptake, translocation, and regulation in higher plants.</a> Annual Review of Plant Biology. 63 (1), 131-152 (2012).</li>
<li>Bradley, J. M., Le Brun, N. E., Moore, G. R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00775-016-1336-0">Ferritins: Furnishing proteins with iron.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 21 (1), 13-28 (2012).</li>
<li>Zielińska-Dawidziak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+ferritin+-+a+source+of+iron+to+prevent+its+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Plant ferritin - a source of iron to prevent its deficiency.</a> Nutrients. 7 (2), 1184-1201 (2015).</li>
<li>Johnson, D. C., Dean, D. R., Smith, A. D., Johnson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+formation+of+biological+iron-sulfur+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and formation of biological iron-sulfur clusters.</a> Annual Review of Biochemistry. 74 (1), 247-281 (2015).</li>
<li>Guo, H., Barnard, A. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2013/ta/c2ta00523a">Naturally occurring iron oxide nanoparticles: morphology, surface chemistry and environmental stability.</a> Journal of Materials Chemistry A. 1 (1), 27-42 (2013).</li>
<li>Hem, J. D., Cropper, W. H. <a target="_blank" href="https://pubs.usgs.gov/wsp/1459a/report.pdf">Chemistry of iron in natural water.</a> Report US Geological Survey. , 1-31 (1962).</li>
<li>Rout, G. R., Sahoo, S. <a target="_blank" href="http://www.agrsci.jp/ras/article/view/12">Role of iron in plant growth and metabolism.</a> Reviews in Agricultural Science. 3, 1-24 (2015).</li>
<li>Speretto, R. A., Ricachenevsky, F. K., Stein, R. J., de Abreu Waldow, V., Fett, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+stress+in+plants+Dealing+with+deprivation+and+overload%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Stress%22%5BJournal%5D)">Iron stress in plants Dealing with deprivation and overload.</a> Plant Stress. 4, 57-69 (2010).</li>
<li>Tautkus, S., Steponeniene, L., Kazlauskas, R. <a target="_blank" href="https://www.shd.org.rs/JSCS/Vol69/No5/V69-No5-10.pdf">Determination of iron in natural and mineral waters by flame atomic absorption spectrometry.</a> Journal of the Serbian Chemical Society. 69 (5), 393-402 (2006).</li>
<li>Braunschweig, J., Bosch, J., Heister, K., Kuebeck, C., Meckenstock, R. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reevaluation+of+colorimetric+iron+determination+methods+commonly+used+in+geomicrobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Reevaluation of colorimetric iron determination methods commonly used in geomicrobiology.</a> Journal of Microbiological Methods. 89 (1), 41-48 (2012).</li>
<li>PerkinElmer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Atomic+Spectroscopy+-+Guide+to+Selecting+the+Appropriate+Technique+and+System%22">Atomic Spectroscopy - Guide to Selecting the Appropriate Technique and System</a>. 16, (2011).</li>
<li>Wachasunder, S. D., Nafade, A. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/00207230108711348">Precision and accuracy control in the determination of heavy metals by atomic absorption spectrometry.</a> Science. 58, 517-528 (2001).</li>
<li>Woods, J. T., Mellon, M. G. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/i560096a013">Thiocyanate method for iron. A spectrophotometric study.</a> Industrial & Engineering Chemistry Analytical Edition. 13 (8), 551-554 (1941).</li>
<li>Perls, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007%2FBF01878983">Nachweis von Eisenoxyd in gewissen Pigmenten.</a> Virchows Archiv Fur Pathologische Anatomie Und Physiologie Und Fur Klinische Medizin. 39 (1), 42-48 (1867).</li>
<li>Connorton, J. M., Jones, E. R., Rodriguez-Ramiro, I., Fairweather-Tait, S., Uauy, C., Balk, J. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2017/04/28/131888">Altering expression of a vacuolar iron transporter doubles iron content in white wheat flour.</a> bioRxiv. , 1-25 (2017).</li>
<li>de la Fuente, V., Rufo, L., Rodríguez, N., Franco, A., Amils, R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11104-017-3251-8">Comparison of iron localization in wild plants and hydroponic cultures of Imperata cylindrica (L.) P. Beauv.</a> Plant Soil. 418 (1-2), 25-35 (2017).</li>
<li>Hsiao, P. Y., Cheng, C. P., Koh, K. W., Chan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+defensin+gene%2C+AtPDF1.1%2C+mediates+defence+against+Pectobacterium+carotovorum+subsp.+carotovorum+via+an+iron-withholding+defence+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis defensin gene, AtPDF1.1, mediates defence against Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum via an iron-withholding defence system.</a> Science Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Johnson, D. B., Kanao, T., Hedrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+transformations+of+iron+at+extremely+low+pH%3A+Fundamental+and+applied+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Redox transformations of iron at extremely low pH: Fundamental and applied aspects.</a> Frontiers in Microbiology. 3, 1-13 (2012).</li>
<li>Stumm, W., Lee, G. F. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ie50614a030">Oxygenation of ferrous iron.</a> Industrial & Engineering Chemistry. 53 (2), 143-146 (1961).</li>
<li>Jones, A. M., Griffin, P. J., Collins, R. N., Waite, T. D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703714005663">Ferrous iron oxidation under acidic conditions - The effect of ferric oxide surfaces.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 145, 1-12 (2014).</li>
<li>Hawkesworth, C. J., Kemp, A. I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+continental+crust%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Evolution of the continental crust.</a> Nature. 443 (7113), (2006).</li>
<li>Thompson, L. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThompson%2C+LM+%22Soils+and+soil+fertility%22">Soils and soil fertility</a>. Louis, M., Troeh, F. R., Thompson, L. M. , (1973).</li>
<li>Krueger, B. J., Grassian, V. H., Cowin, J. P., Laskin, A. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1352231004006442">Heterogeneous chemistry of individual mineral dust particles from different dust source regions: The importance of particle mineralogy.</a> Atmospheric Environment. 38 (36), 6253-6261 (2004).</li>
<li>Bewick, V., Cheek, L., Ball, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistics+review+7%3A+Correlation+and+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Critical+Care%22%5BJournal%5D)">Statistics review 7: Correlation and regression.</a> Journal of Critical Care. 7 (6), 451-459 (2003).</li>
<li>Asuero, A. G., Sayago, A., González, A. G. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/10408340500526766">The correlation coefficient: An overview.</a> Critical Reviews in Analytical Chemistry. 36 (1), 41-59 (2006).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Analytical Chemistry. Calibration Curves. , Journal of Visualized Experiments. Cambridge, MA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves">https://www.jove.com/science-education/10188/calibration-curves</a> (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Pomiar żelaza w tkankach roślinnych jest bardzo ważny dla oceny skutków nawadniania lub innych warunków środowiskowych. W tym miejscu opisaliśmy łatwą i dokładną metodę kolorymetryczną pomiaru zawartości żelaza w liściach tytoniu, którą można łatwo dostosować do innych gatunków roślin i tkanek.
Optymalizując warunki dla metody kolorymetrycznej, użyliśmy podłoża o niskim pH (pH < 1,0), aby umożliwić rozpuszczalność żelaza. Proces spalania przeprowadzono w celu uwolnienia wszystkich form żelaza ...

Żelazo (Fe) jest ważnym mikroskładnikiem we wszystkich organizmach żywych. W roślinach stanowi niezbędny mikroskładnik1 ze względu na udział w procesach podstawowych, takich jak oddychanie, fotosynteza i biosynteza chlorofilu. Wysoka akumulacja wolnych jonów żelaza jest szkodliwa dla komórek roślinnych z powodu reakcji prowadzących do uwalniania wolnych rodników, co powoduje stres oksydacyjny. Aby utrzymać homeostazę żelaza w komórce roślinnej, jony są magazynowane wakuolach i sekwestrowane w ferrytynach — białkowych klatkach bezpośrednio zaangażowanych w homeostazę żelaza2 i stanowiących główną strukturę magazynową żelaza we wszystkich organizmach żywych. Jednocześnie anemia z niedoboru żelaza dotyka znaczną część populacji ludzkiej, co skutkuje rosnącą potrzebą biofortyfikacji roślin w Fe. Ze względu na unikalne właściwości ferrytyny roślinnej, wzbogacanie żywności w żelazo z ferrytyny stanowi obiecującą strategię walki z tym problemem niedożywienia3.
Jony żelaza występują głównie w dwóch stopniach utlenienia: żelazistym (dwuwartościowy Fe2+ lub żelazo(II)) oraz żelazowym (trójwartościowy Fe3+ lub żelazo(III)). W komórkach znajdują się również inne formy żelaza, takie jak klastry żelaza4. Fe jest magazynowane wewnątrz komórki w postaci tlenku żelaza i w warunkach fizjologicznych naturalnie tworzy hematyty (Fe2O3) oraz ferrihydryty ((Fe3+)2O3•0,5H2O)5. Wodorotlenki powstające w tych reakcjach, zwłaszcza forma żelazowa, charakteryzują się bardzo niską rozpuszczalnością. W konsekwencji retencja żelaza zależy od pH roztworu i powyżej pH 5 występuje ono głównie w stanie stałym6.
Biorąc pod uwagę słabą rozpuszczalność i wysoką reaktywność Fe, jego transport pomiędzy tkankami i organami roślin musi być związany z odpowiednimi cząsteczkami chelatującymi. Ponadto konieczna jest kontrola jego stanów redoks pomiędzy formami żelaza dwuwartościowego i trójwartościowego1. W liściach około 80% żelaza znajduje się w komórkach fotosyntetyzujących, ze względu na jego kluczową rolę w systemie transportu elektronów, w biosyntezie cytochromów, chlorofilu i innych cząsteczek hemu, a także w tworzeniu klastrów Fe-S7. W przypadku nadmiaru żelaza w komórce, nadwyżka jest transportowana do wakuoli, gdzie metal jest magazynowany w cząsteczkach ferrytyny8.
Zawartość żelaza w tkankach roślinnych można pomiarzyć za pomocą kilku metod, w tym spektroskopii absorpcyjnej z atomizacją w płomieniu9 (FAAS) lub testów kolorymetrycznych10, przy czym pierwsza z nich jest znacznie bardziej precyzyjna. FAAS to wysoce dokładna technika, która umożliwia określenie składu pierwiastkowego próbki na podstawie emisji elektromagnetycznej poszczególnych pierwiastków. FAAS przekształca jony metali w stany atomowe poprzez ogrzewanie próbki w płomieniu, co prowadzi do wzbudzenia jonów i emisji specyficznej długości fali w momencie powrotu danego jonu do stanu podstawowego. Emisje z różnych jonów są rozdzielane przez monochromator i wykrywane przez czujnik absorpcyjny1. W ten sposób FAAS służy do bezpośredniego oznaczania stężenia żelaza. Dostępne są jednak inne techniki wizualizacji żelaza w tkankach biologicznych. Spektrometria mas z plazmą indukcyjnie sprzężoną (ICP-MS)12 jest bardzo precyzyjną techniką pomiaru żelaza i innych pierwiastków śladowych, lecz powszechnym problemem jest brak odpowiedniego sprzętu, zarówno dla FAAS, jak i ICP-MS. Z drugiej strony, pomiar żelaza metodą kolorymetrii tiocyjanianowej13 charakteryzuje się niską precyzją i nie pozwala na wykrycie niewielkich różnic między próbkami. Barwienie błękitem pruskim14,15,16,17 jest metodą pośrednią opartą na reakcji ferrocyjan jodku potasu (K4Fe(CN)6) z kationami Fe, co prowadzi do powstania intensywnego niebieskiego zabarwienia; metoda ta jest stosowana do jakościowego wykrywania żelaza w przekrojach histologicznych tkanek zwierzęcych i roślinnych.
Żelazo metaliczne (zerowartościowe) występuje rzadko w litosferze. Dominująca niekompleksowa forma jonowa żelaza w środowisku jest w głównej mierze determinowana przez ilość tlenu w otoczeniu, przy czym żelazo dwuwartościowe jest względnie bardziej rozpowszechnione w środowiskach anoksycznych, a żelazo trójwartościowe przeważa w miejscach aerobowych. Ta druga forma dominuje również w środowiskach ekstremalnie kwasowych, choć czynniki wywołujące utlenianie żelaza dwuwartościowego często różnią się w warunkach anoksycznych i kwasowych18. Gdy żelazo zostaje rozpuszczone w 4% HCl (pH 0) w środowisku aerobowym, główna część rozcieńczonego żelaza występuje w formie trójwartościowej (Fe3+)19,20.
Reakcje między jonami Fe a K4Fe(CN)6 przebiegają w następujący sposób:
Fe3+: FeCl3 + K4Fe(CN)6 = KFe(III)Fe(II)(CN)6¯ + 3KCl
Fe2+: 4 FeCl2 + 2 K4Fe(CN)6 = Fe4(Fe(CN)6)2 + 8 KCl
W niniejszym badaniu sprawdzono, czy barwienie błękitem pruskim może być przydatne do pomiaru poziomu żelaza w roztworze.
W pierwszej kolejności zweryfikowano korelację między stężeniem Fe w roztworze wodnym a barwieniem błękitem pruskim. Stężenie Fe (w postaci FeCl2, FeCl3 lub mieszaniny obu w stosunku 1:1) w roztworach wodnych mierzono zarówno metodą spektroskopii atomowej, jak i za pomocą absorbancji (OD) po dodaniu błękitu pruskiego. Rysunek 1 przedstawia krzywe regresji liniowej dla pomiarów uzyskanych każdą z metod. Wyciągnięto wniosek, że metoda z użyciem błękitu pruskiego może być stosowana do analizy ilościowej stężenia żelaza w roztworze.
<img alt="Wykres zależności absorbancji od stężenia jonów Fe; liniowy wykres kalibracyjny gęstości optycznej (OD)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57408/57408fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Regresje liniowe między stężeniem Fe zmierzonym za pomocą FAAS a absorbancją światła (OD, 715 nm) uzyskaną metodą błękitu pruskiego. Niebieskie kwadraty i linia reprezentują Fe2+ roztworu, czerwone kwadraty i linia reprezentują Fe3+ roztwór, a czarne kwadraty i linia reprezentują mieszaninę Fe w stosunku 1:12+ oraz Fe3+Otrzymano następujące regresje: [Fe2+] = 3 + 123 x OD, r = 0,96, R2 = 0,989; [Fe3+] = 1 + 292 x OD, r = 0,9, R2 = 0,97; oraz [Fe2+/3+] = 11 + 146 x OD, r = 0,983, R2 = 0,956. Żelazo (Fe)2+ donorem był FeCl32 or Fe3+ donorem był FeCl33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57408/57408fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
Aby dostosować kolorymetryczną metodę błękitu pruskiego do ilościowej analizy żelaza w tkankach roślinnych, zawartość żelaza w popiołach z liści tytoniu zmierzono za pomocą płomieniowej spektroskopii absorpcyjnej oraz barwienia błękitem pruskim. Odnotowano dobrą korelację między wynikami uzyskanymi obiema technikami.

<table><tbody><tr><td>Heksacyjanożelazian(II)</td><td>potasu Fisher Chemical</td><td>14459-95-1</td><td>Odczynnik do</td></tr><tr><td>filtra strzykawkowego Pussian Blue Millex, odpowietrznik fiolki 0,22 i mu; m</td><td>Millec</td><td>SLGP033RS</td><td>Filtr służący do filtrowania popiołu + 4% HCl Roztwór</td></tr><tr><td>Fiolki scyntylacyjne</td><td>Fisherbrand</td><td>03-337-4</td><td>Służy do utrzymywania suchego sproszkowanego materiału roślinnego podczas procedury spalania.</td></tr><tr><td>Jednorazowa strzykawka 10 ml</td><td>Medi-Plus</td><td>1931</td><td>Strzykawka używana podczas filtracji</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>231-595-7</td><td>Stosowany w 4% roztworze HCl do rozcieńczania popiołów i czyszczenia materiałów</td></tr><tr><td>Tytoń, Nicotiana tabacum cv. Samsun NN</td><td>Uzyskany od prof. Simona Baraka i rutynowo stosowany w laboratorium</td> <td>ZaccaiBarak S, Nejidat A, Heimer Y, Volokita M. Regulacja transkrypcji i potranskrypcji genu oksydazy glikolanowej w sadzonkach tytoniu. Biologia molekularna roślin. 1 marca 2001; 45(4):399-407.</td><td>Odmiana tytoniu użyta w tym protokole</td></tr><tr><td>Wełna szklana (wełna mineralna)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>659997-17-3</td><td>Stosowana w procedurze spalania próbek w piecu.</td></tr></tbody></table>

kolorymetryczna metoda pomiaru zawartości żelaza w roślinach

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Żelazo, jeden z najważniejszych mikroelementów w organizmach żywych, bierze udział w podstawowych procesach, takich jak oddychanie i fotosynteza. Zawartość żelaza jest raczej niska we wszystkich organizmach i wynosi w roślinach około 0,009% suchej masy. Do tej pory jedną z najdokładniejszych metod pomiaru stężenia żelaza w tkankach roślinnych jest spektroskopia atomowa absorpcji płomienia. Takie podejście jest jednak czasochłonne i kosztowne oraz wymaga specjalnego sprzętu, który nie jest powszechnie spotykany w laboratoriach zakładowych. Dlatego potrzebna jest prostsza, ale dokładna metoda, którą można rutynowo stosować. Metoda kolorymetrycznego błękitu pruskiego jest regularnie stosowana do jakościowego barwienia żelaza w przekrojach histologicznych zwierząt i roślin. W niniejszej pracy dostosowaliśmy metodę błękitu pruskiego do ilościowych pomiarów żelaza w liściach tytoniu. Zweryfikowaliśmy dokładność tej metody przy użyciu zarówno spektroskopii atomowej, jak i barwienia błękitem pruskim w celu zmierzenia zawartości żelaza w tych samych próbkach i znaleźliśmy regresję liniową (R2 = 0,988) między tymi dwiema procedurami. Dochodzimy do wniosku, że metoda błękitu pruskiego do ilościowego pomiaru żelaza w tkankach roślinnych jest precyzyjna, prosta i niedroga. Jednak przedstawiona tutaj regresja liniowa może nie być odpowiednia dla innych gatunków roślin ze względu na potencjalne interakcje między próbką a odczynnikiem. W związku z tym konieczne jest wyznaczenie krzywej regresji dla różnych gatunków roślin.

Przy prawidłowym przeprowadzeniu tego protokołu powinno uzyskać się doskonałą korelację między wynikami otrzymanymi metodą błękitu pruskiego a metodą spektroskopii atomowej. W związku z tym metodę błękitu pruskiego można z łatwością zastosować do dokładnego pomiaru stężenia żelaza w próbkach roślinnych, co wykazano w poniższym doświadczeniu.
Rośliny tytoniu uprawiano zgodnie z opisem w protokole i podlewano wodą o różnych stężen...

Przedstawiamy prosty i niezawodny protokół pomiaru zawartości żelaza w tkankach roślinnych za pomocą metody kolorymetrycznej błękitu pruskiego.

Kolorymetryczna metoda pomiaru zawartości żelaza w roślinach

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Tylko z medycznego punktu widzenia może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie biologii. Na przykład, w jaki sposób możemy łatwo określić ilościowo żelazo w próbkach rdzeniowych biologii. Głównym przedsięwzięciem tej techniki jest to, że jest to łatwa do wyprodukowania i bardzo precyzyjna technika kolorymetryczna.Preferując tę technikę, należy unikać zanieczyszczenia żelazem. Wizualna demonstracja tej metody pomoże Ci zrozumieć jej różne kroki. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj doniczki o wymiarach pięć centymetrów na pięć centymetrów, wypełniając je standardowym podłożem doniczkowym.Posadź jedno ziarno tytoniu w każdej doniczce. Przenieś rośliny do pomieszczenia do wzrostu, w którym panuje stała temperatura, w warunkach długiego dnia 23 stopni Celsjusza. Nawadniaj wodą z kranu, aż woda spłynie z doniczki i uprawiaj rośliny przez około 50 dni.Po tym czasie należy rozpocząć zabiegi z żelazem w irygacji w stężeniach odpowiednich dla eksperymentu. Nawadniaj rośliny tym roztworem co dwa dni przez sześć do ośmiu dni. Następnie ręcznie oderwij liście od łodygi, uważając, aby nie używać żadnego metalowego sprzętu.Za pomocą butelki z rozpylaczem wypełnionej podwójnie destylowaną wodą oczyść każdy liść. Osusz liście na ręczniku papierowym, a następnie przenieś je do papierowej torby. Umieść torebki wypełnione liśćmi w piekarniku, ustawionym na stałą temperaturę 80 stopni Celsjusza, na dwa do trzech dni.Wyczyść moździerz i tłuczek dwukrotnie 4% roztworem kwasu solnego. I użyj bibuły filtracyjnej do wyschnięcia. Za pomocą moździerza i tłuczka zmiażdż suche liście na proszek.Następnie przenieś proszek do sterylnych 15-mililitrowych plastikowych probówek. Najpierw zważ nową, szczelnie zapieczętowaną 20-mililitrową fiolkę scyntylacyjną bez pokrywki. Albo zanotuj wagę, albo wytaruj wagę.Następnie dodaj zmiażdżone liście. Zważyć próbkę w fiolce i zanotować masę. Użyć wełny mineralnej, aby zamknąć fiolkę.Zważyć trzy dodatkowe fiolki bez dodawania próbek, do wykorzystania jako kontrole, odnotowując każdą masę. Następnie przenieść próbkę i fiolki kontrolne do pieca. Spal liście zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Następnie pozwól próbkom ostygnąć do około 100 stopni Celsjusza. Używając grubych rękawic i pęsety, wyjmij próbki z pieca, upewniając się, że fiolka jest trzymana na zewnątrz. Umieścić fiolki na płaskiej powierzchni.Usunąć wełnę mineralną i zamknąć fiolki oryginalnymi pokrywkami. Następnie zważyć trzy fiolki kontrolne i obliczyć ich średni przyrost masy ciała. Jeżeli przyrost masy jest równy lub większy niż 1% masy popiołu, należy użyć tej wartości jako oszacowania błędu pomiaru.Zważ 15-mililitrową plastikową rurkę. Zapisz wagę lub wytaruj wagę. Następnie przenieś popiół do probówki.Zapisz tę wartość, która jest masą popiołu. Następnie dodaj do popiołu pięć mililitrów jednomolowego roztworu kwasu solnego. Przefiltruj popiół przez filtr o średnicy 22 mikrometrów.Następnie dodaj dodatkowe pięć mililitrów jednego molowego roztworu kwasu solnego przez ten sam filtr, co prowadzi do uzyskania końcowej objętości próbki 10 mililitrów. Następnie usuń cztery mililitry z każdej próbki do pomiaru za pomocą spektroskopii atomowej. I określ stężenie żelaza na gram popiołu, jak określono w protokole tekstowym.Na początek dodaj cztery gramy żelazocyjanku potasu do 100 mililitrów podwójnie destylowanej wody, aby przygotować pruski niebieski roztwór. Wiruj do wymieszania i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia. Gdy produkt jest gotowy do użycia, wymieszaj 50 mililitrów roztworu błękitu pruskiego z 50 mililitrami jednego molowego kwasu solnego, aby służył jako roztwór ślepej próby.Następnie za pomocą pipety wymieszaj 0,5 mililitra wcześniej uzyskanej próbki z 0,5 mililitra roztworu błękitu pruskiego. Pozwól tej mieszaninie odpocząć przez co najmniej jedną minutę, ale krócej niż pięć minut. Przenieś tę mieszaninę do kuwety i użyj spektrofotometru do zmierzenia gęstości optycznej przy 715 nanometrach.Następnie określ gęstość optyczną na gram popiołu i wykreśl regresję liniową między stężeniami żelaza, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Reprezentatywne wyniki z 21 próbek liści tytoniu pokazują, że stężenie żelaza w wodzie do nawadniania miało duży wpływ na zawartość żelaza w liściach. Widma wszystkich 21 reprezentatywnych próbek są następnie badane metodą błękitu pruskiego.Jak widać tutaj, absorbancja przy 715 nanometrach jest optymalną długością fali podczas pomiaru roztworów zawierających różne stężenia żelaza dwa i żelaza trzeciego. Krzywa regresji liniowej, którą uzyskuje się poprzez wykreślenie wartości stężenia żelaza uzyskanych za pomocą spektroskopii atomowej, w porównaniu z wartościami absorbancji, uzyskanymi metodą błękitu pruskiego, pozwala na analizę nowych próbek tego samego typu rośliny. Nie zapominaj, że praca z HCL może być bardzo niebezpieczna.Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak ochrona oczu. W przypadku regresji liniowej ważne jest, aby sprawdzić, czy wyniki mieszczą się w realistycznym zakresie. Po opracowaniu technika ta może pomóc badaczom biologii w badaniu dodatkowych roślin do produkcji żywności lub bioremediacji.

a-colorimetric-method-for-measuring-iron-content-in-plants

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie opisujemy opartą na kolorymetrii metodę określania zawartości żelaza niehemowego w tkance wątroby myszy. Sulfonian batofenantroliny jest stosowany jako substrat chromogenny w obecności środka redukującego, który przekształca żelazo żelazowe w chelatowalne żelazo żelaza.

Test kolorymetryczny na bazie sulfonianu batofenantroliny: prosta i szybka metoda oznaczania ilościowego żelaza niehemowego w tkance wątroby myszy

Ten film demonstruje technikę in vitro do oceny biodostępności żelaza w złożonych źródłach żywności. Technika ta łączy symulację trawienia człowieka wraz z wychwytem żelaza przez zróżnicowane komórki Caco-2. Wewnątrzkomórkowe tworzenie ferrytyny działa jako marker komórkowego wychwytu żelaza.

Test biologiczny komórek Caco-2: metoda in vitro do pomiaru biodostępności żelaza w złożonych źródłach żywności

Ten film opisuje metodę ilościowego oznaczania strawnych węglowodanów obecnych w tkankach roślinnych. Pomaga to zbierać dane z różnych tkanek roślinnych w celu badania ekologii żywieniowej, interakcji między roślinami a roślinożercami oraz dynamiki sieci pokarmowej.

Test kolorymetryczny do oznaczania ilościowego węglowodanów niestrukturalnych w tkankach roślinnych

Symulowaliśmy prekambryjski system upwellingu morskiego w pionowej kolumnie przepływowej na skalę laboratoryjną. Celem było zrozumienie, w jaki sposób profile geochemiczneO2 i Fe(II) ewoluują, gdy cyjanobakterie wytwarzająO2. Wyniki wskazują na powstanie chemokliny w wyniku utleniania Fe(II) przez fotosyntetycznie wytwarzanyO2.

Symulacja laboratoryjna bogatego w żelazo(II) prekambryjskiego systemu upwellingu morskiego w celu zbadania wzrostu bakterii fotosyntetycznych

Ta metoda specjacji żelaza redoks opiera się na elektroforezie kapilarnej - spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie z układaniem próbek połączonym z krótką analizą w jednym przebiegu. Metoda szybko analizuje i zapewnia niskie limity oznaczalności dla form redoks żelaza w różnych próbkach tkanek i płynów biologicznych.

Konfiguracja spektrometrii mas z elektroforezą kapilarną i indukcyjnie sprzężoną plazmą (CE-ICP-MS) do oznaczania ilościowego gatunków redoks żelaza (Fe(II), Fe(III))

Ten artykuł pokazuje, jak przygotować i podawać nieradioaktywne izotopowe żelazo związane z transferyną do badań nad transportem żelaza w ciąży myszy. Opisano również podejście do ilościowego oznaczania izotopowego żelaza w przedziałach płodowo-łożyskowych.

Kwantyfikacja transportu żelaza przez łożysko myszy in vivo przy użyciu nieradioaktywnych izotopów żelaza

Tutaj dostępny jest protokół pomiaru zawartości żelaza niehemowego w tkankach zwierzęcych, przy użyciu prostego, dobrze znanego testu kolorymetrycznego, który można łatwo wdrożyć w większości laboratoriów.

Pomiar zawartości żelaza niehemowego w tkankach za pomocą testu kolorymetrycznego na bazie batofenantroliny

Test biologiczny komórek Caco-2 na biodostępność żelaza (Fe) stanowi opłacalne i wszechstronne podejście do oceny biodostępności Fe z żywności, produktów spożywczych, suplementów, posiłków, a nawet schematów dietetycznych. Dokładnie zwalidowany w badaniach na ludziach, reprezentuje stan wiedzy w zakresie badań nad biodostępnością Fe.

Test biologiczny komórek Caco-2 do pomiaru biodostępności żelaza w żywności

Opisujemy test fluorescencyjny, który może szybko i tanio potwierdzić zdolność nowych związków do chelatowania żelaza. Test mierzy zdolność związków do konkurowania z aktywnością wiązania żelaza przez słabą sondę fluorescencyjną chelatującą żelazo Calceinę, co skutkuje wymiernym wzrostem fluorescencji, gdy zachodzi chelatacja.

Ilościowa i niedroga bezkomórkowa metoda fluorescencyjna potwierdzająca zdolność nowych związków do chelatowania żelaza

Ten protokół przedstawia metody oceny rozkładu i ilości odkładania się żelaza w tkankach, zwłaszcza w mózgu. Protokół szczegółowo opisuje procedury przygotowania próbek, barwienia Perls/DAB, przechwytywania obrazu i analizy danych.

Ocena osadzania się żelaza w mózgach myszy 5xFAD za pomocą barwienia Perls/DAB

W niniejszej pracy omawiano protokół projektowania i opracowania urządzenia E-Eye-Enable POCT do wykrywania Fe, Cr, As i F w próbkach środowiskowych, próbkach biologicznych oraz żywności i napojach. Przetestowano prawie 2000 próbek, a wyniki odpowiadają standardowej technice.

TD-DFT Guided Advanced E-Eye Sensing Technique do kwantyfikacji na miejscu Fe, Cr, F oraz As w próbkach środowiskowych, biologicznych i spożywczych

Poznaj kolorymetryczną metodę Pruskiego Błękitu do pomiaru zawartości żelaza w tkankach roślinnych. Protokół zapewnia precyzyjną i niezawodną analizę żelaza w próbkach biologicznych.

Kolorymetryczna metoda pomiaru zawartości żelaza w roślinach

Przeglądaj więcej filmów