Kolorymetryczna metoda pomiaru zawartości żelaza w roślinach

Przedstawiamy prosty i niezawodny protokół pomiaru zawartości żelaza w tkankach roślinnych za pomocą metody kolorymetrycznej błękitu pruskiego.

Tylko z medycznego punktu widzenia może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie biologii. Na przykład, w jaki sposób możemy łatwo określić ilościowo żelazo w próbkach rdzeniowych biologii. Głównym przedsięwzięciem tej techniki jest to, że jest to łatwa do wyprodukowania i bardzo precyzyjna technika kolorymetryczna.

Preferując tę technikę, należy unikać zanieczyszczenia żelazem. Wizualna demonstracja tej metody pomoże Ci zrozumieć jej różne kroki. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj doniczki o wymiarach pięć centymetrów na pięć centymetrów, wypełniając je standardowym podłożem doniczkowym.

Posadź jedno ziarno tytoniu w każdej doniczce. Przenieś rośliny do pomieszczenia do wzrostu, w którym panuje stała temperatura, w warunkach długiego dnia 23 stopni Celsjusza. Nawadniaj wodą z kranu, aż woda spłynie z doniczki i uprawiaj rośliny przez około 50 dni.

Po tym czasie należy rozpocząć zabiegi z żelazem w irygacji w stężeniach odpowiednich dla eksperymentu. Nawadniaj rośliny tym roztworem co dwa dni przez sześć do ośmiu dni. Następnie ręcznie oderwij liście od łodygi, uważając, aby nie używać żadnego metalowego sprzętu.

Za pomocą butelki z rozpylaczem wypełnionej podwójnie destylowaną wodą oczyść każdy liść. Osusz liście na ręczniku papierowym, a następnie przenieś je do papierowej torby. Umieść torebki wypełnione liśćmi w piekarniku, ustawionym na stałą temperaturę 80 stopni Celsjusza, na dwa do trzech dni.

Wyczyść moździerz i tłuczek dwukrotnie 4% roztworem kwasu solnego. I użyj bibuły filtracyjnej do wyschnięcia. Za pomocą moździerza i tłuczka zmiażdż suche liście na proszek.

Następnie przenieś proszek do sterylnych 15-mililitrowych plastikowych probówek. Najpierw zważ nową, szczelnie zapieczętowaną 20-mililitrową fiolkę scyntylacyjną bez pokrywki. Albo zanotuj wagę, albo wytaruj wagę.

Następnie dodaj zmiażdżone liście. Zważyć próbkę w fiolce i zanotować masę. Użyć wełny mineralnej, aby zamknąć fiolkę.

Zważyć trzy dodatkowe fiolki bez dodawania próbek, do wykorzystania jako kontrole, odnotowując każdą masę. Następnie przenieść próbkę i fiolki kontrolne do pieca. Spal liście zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie pozwól próbkom ostygnąć do około 100 stopni Celsjusza. Używając grubych rękawic i pęsety, wyjmij próbki z pieca, upewniając się, że fiolka jest trzymana na zewnątrz. Umieścić fiolki na płaskiej powierzchni.

Usunąć wełnę mineralną i zamknąć fiolki oryginalnymi pokrywkami. Następnie zważyć trzy fiolki kontrolne i obliczyć ich średni przyrost masy ciała. Jeżeli przyrost masy jest równy lub większy niż 1% masy popiołu, należy użyć tej wartości jako oszacowania błędu pomiaru.

Zważ 15-mililitrową plastikową rurkę. Zapisz wagę lub wytaruj wagę. Następnie przenieś popiół do probówki.

Zapisz tę wartość, która jest masą popiołu. Następnie dodaj do popiołu pięć mililitrów jednomolowego roztworu kwasu solnego. Przefiltruj popiół przez filtr o średnicy 22 mikrometrów.

Następnie dodaj dodatkowe pięć mililitrów jednego molowego roztworu kwasu solnego przez ten sam filtr, co prowadzi do uzyskania końcowej objętości próbki 10 mililitrów. Następnie usuń cztery mililitry z każdej próbki do pomiaru za pomocą spektroskopii atomowej. I określ stężenie żelaza na gram popiołu, jak określono w protokole tekstowym.

Na początek dodaj cztery gramy żelazocyjanku potasu do 100 mililitrów podwójnie destylowanej wody, aby przygotować pruski niebieski roztwór. Wiruj do wymieszania i przechowuj w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia. Gdy produkt jest gotowy do użycia, wymieszaj 50 mililitrów roztworu błękitu pruskiego z 50 mililitrami jednego molowego kwasu solnego, aby służył jako roztwór ślepej próby.

Następnie za pomocą pipety wymieszaj 0,5 mililitra wcześniej uzyskanej próbki z 0,5 mililitra roztworu błękitu pruskiego. Pozwól tej mieszaninie odpocząć przez co najmniej jedną minutę, ale krócej niż pięć minut. Przenieś tę mieszaninę do kuwety i użyj spektrofotometru do zmierzenia gęstości optycznej przy 715 nanometrach.

Następnie określ gęstość optyczną na gram popiołu i wykreśl regresję liniową między stężeniami żelaza, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Reprezentatywne wyniki z 21 próbek liści tytoniu pokazują, że stężenie żelaza w wodzie do nawadniania miało duży wpływ na zawartość żelaza w liściach. Widma wszystkich 21 reprezentatywnych próbek są następnie badane metodą błękitu pruskiego.

Jak widać tutaj, absorbancja przy 715 nanometrach jest optymalną długością fali podczas pomiaru roztworów zawierających różne stężenia żelaza dwa i żelaza trzeciego. Krzywa regresji liniowej, którą uzyskuje się poprzez wykreślenie wartości stężenia żelaza uzyskanych za pomocą spektroskopii atomowej, w porównaniu z wartościami absorbancji, uzyskanymi metodą błękitu pruskiego, pozwala na analizę nowych próbek tego samego typu rośliny. Nie zapominaj, że praca z HCL może być bardzo niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak ochrona oczu. W przypadku regresji liniowej ważne jest, aby sprawdzić, czy wyniki mieszczą się w realistycznym zakresie. Po opracowaniu technika ta może pomóc badaczom biologii w badaniu dodatkowych roślin do produkcji żywności lub bioremediacji.