Ocena wpływu agregacji białek na komórkowy stres oksydacyjny u drożdży

Agregacja białek wywołuje komórkowy stres oksydacyjny. Protokół ten opisuje metodę monitorowania stanów wewnątrzkomórkowych białek amyloidogennych i związanego z nimi stresu oksydacyjnego za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to służy do badania zachowania rozpuszczalnych i podatnych na agregację wariantów peptydu β amyloidu.

Ogólnym celem tej procedury jest określenie związku między powstawaniem wewnątrzkomórkowych agregatów białkowych a ich wpływem na komórkowy stres oksydacyjny przy użyciu drożdży piekarskich Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem i agregacją białek, takich jak zaburzenia neurodegeneracyjne i amyloidozy nieneuropatyczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, szybka i umożliwia ilościowe określenie uszkodzeń spowodowanych stresem oksydacyjnym w dużej populacji drożdży.

Dzięki tej metodzie możemy zapewnić wgląd w korelację między wewnątrzkomórkowym stanem rozpuszczalnym lub zagregowanym białka amyloidogennego a poziomem stresu oksydacyjnego u drożdży. Ponadto może być również stosowany do innych organizmów modelowych wykazujących ekspresję białek rekombinowanych. Analizę metodą cytometrii przepływowej zademonstruje Manuela Costa, technik z Zakładu Cytometrii Przepływowej UAB.

W tym badaniu wewnątrzkomórkowy stan agregacji różnych wariantów peptydu A-beta-42 jest śledzony za pomocą S. cerevisiae przekształconych plazmidem kodującym A-beta-42 połączonego z GFP pod kontrolą promotora indukowanego galaktozą. Wybierz jedną kolonię przekształconych komórek drożdży i zaszczep w 20 mililitrach pożywki SC minus Ura zawierającej 2% glukozy. Uprawiaj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem przez noc.

Następnego dnia zaszczepij 100 mikrolitrów nocnej kultury w pięciu mililitrach świeżej pożywki SC minus Ura i hoduj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin. Gdy kultura ma gęstość optyczną 590 nanometrów lub OD 590 0,5, odwirować kulturę przy 3 000 razy g przez cztery minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach świeżej pożywki SC minus Ura zawierającej 2% rafinozy. Inkubować komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem przez 30 minut.

Po 30 minutach odwirować komórki z prędkością 3 000 g przez cztery minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce SC minus Ura zawierającej 2% galaktozy w celu indukcji ekspresji rekombinowanego białka. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na 16 godzin. Po 16 godzinach zebrać komórki, przenosząc jednomililitrowe porcje kultury do sterylnych probówek do mikrowirówek i odwirowując przy 3 000 g przez cztery minuty.

Rozpocznij tę procedurę od określenia OD 590 w 16-godzinnych komórkach drożdży indukowanych. Następnie rozcieńczyć komórki w sterylnym PBS do OD 590 0,1. Zawiesiny komórek wykazujących ekspresję przenieść do odpowiednio oznakowanych okrągłodennych probówek z polistyrenu i chronić je przed światłem.

Przygotować nieindukowane komórki jako kontrolę ujemną do analizy cytometrii przepływowej. Dodać sondę stresu oksydacyjnego do każdej próbki o końcowym stężeniu pięciu mikromolów. Przykryj próbki folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po zakończeniu inkubacji odwiruj komórki, usuń supernatant i ponownie zawieś granulki komórek w PBS. Umyj komórki trzy razy w ten sposób za pomocą PBS. Po trzecim płukaniu ponownie zawiesić komórki w tej samej objętości PBS.

Upewnij się, że niebarwione komórki są uwzględnione w analizie cytometrii przepływowej. Za pomocą odpowiednich laserów i filtrów wykonaj analizę cytometrii przepływowej w celu wykrycia GFP i sygnału fluorescencyjnego sondy stresu oksydacyjnego. Zacznij od kliknięcia panelu Otwórz nowy arkusz i nadaj eksperymentowi nazwę.

Na pasku narzędzi wybierz narzędzie Wykres punktowy i utwórz wykres ze zmiennymi Boczny obszar punktowy na osi y i Obszar punktowy do przodu w skali liniowej na osi x. Kliknij narzędzie Wykres punktowy i utwórz wykres ze zmiennymi Obszar FITC na osi x i Obszar APC w skali logarytmicznej na osi y. Kliknij ikonę Instrument Setting (Ustawienia instrumentu) i ustaw wszystkie poziomy kompensacji na zero w zakładce Compensation (Kompensacja).

Następnie kliknij zakładkę Akwizycja i wybierz łączną liczbę 20 000 zdarzeń, które mają zostać zarejestrowane przy niskim natężeniu przepływu. Ponieważ fluorescencyjny sygnał emisyjny jednego fluorochromu może być wykryty przez inny detektor, ważne jest, aby przeprowadzić proces kompensacji w celu wyrównania minimalnego sygnału każdego fluorochromu we wszystkich detektorach za pomocą kontroli jednokolorowej. Zmień nazwę probówki 001 na kontrolę ujemną i kliknij kartę Pobierz, aby rozpocząć uruchamianie nieindukowanych, niebarwionych komórek.

Dostosuj napięcie w ustawieniach instrumentu rozproszenia do przodu i z boku, aż populacja zostanie rozłożona w środkowym lewym kwadrancie. Kliknij ikonę wielokąta, aby ustawić region R1 wokół populacji komórek z wyłączeniem szczątków komórek, a następnie użyj tej bramkowanej populacji P1 równa się R1 dla wszystkich fluorescencyjnych wykresów punktowych i reprezentacji histogramu. Aby wyregulować napięcie PMT sygnału fluorescencji, uruchom niebarwione komórki na wykresie punktowym FL1 do FL3, dostrajając wzmocnienie w zakładce Ustawienia instrumentu, aż komórki zostaną rozmieszczone w lewym dolnym kwadrancie.

Korzystając z narzędzia do tworzenia wykresów punktowych, utwórz wykres punktowy ze zmiennymi FITC-A na osi x w porównaniu z FSC-A oraz drugi wykres punktowy ze zmiennymi APC-A na osi x w porównaniu z FSC-A. Następnie zmień próbkę na indukowane komórki, aby zmierzyć fluorescencję GFP. Na karcie Instrument Setting (Ustawienia instrumentu) ustaw wzmocnienie w FSC-A w porównaniu z FITC, gdy populacja jest rozłożona w prawym dolnym kwadrancie.

Zdefiniuj populację komórek GFP-dodatnich za pomocą bramki. Zmień próbkę na nieindukowane wybarwione komórki. Wyświetlanie stresu oksydacyjnego przez fluorescencję na wykresie punktowym FSC-A i APC-A.

Dostosuj wzmocnienie, aż populacja komórek zostanie rozłożona w lewym górnym kwadrancie. Bramka dodatniej populacji komórek w P3. Za pomocą ikony histogramu utwórz dwa wykresy histogramu reprezentujące fluorescencję komórek, jeden dla FITC, a drugi dla fluorescencji APC. Należy utworzyć tabelę przedstawiającą średnią intensywność fluorescencji i medianę fluorescencji wraz z odpowiadającym im błędem standardowym i/lub współczynnikiem wariancji dla poziomów fluorescencji GFP i stresu oksydacyjnego.

Kliknij kartę Wynagrodzenie i ustaw wszystkie poziomy wynagrodzeń na zero. Kliknij zakładkę Akwizycja i wybierz łączną liczbę 20 000 zdarzeń, które mają zostać zarejestrowane. Przygotuj trzy nowe probówki z próbkami i nazwij je nieindukowanymi, indukowanymi rozpuszczalnymi i indukowanymi zagregowanymi.

Pobieraj dane z próbek z wstępnie ustawionymi ustawieniami. Przeanalizuj dane, otwierając nowy arkusz i tworząc wykres punktowy dla zmiennych FITC-A i APC-A, bramkując dodatnie komórki do barwienia CellROX. Dla każdej próbki utwórz tabelę statystyczną ze średnią fluorescencją i błędem standardowym dla kanałów FITC i APC.

Możliwe jest również sortowanie komórek za pomocą sortera FACS po zliczeniu zagregowanych białek. Komórki drożdży wykazujące ekspresję wariantów A-beta-42 po okresie indukcji wynoszącym 16 godzin są wizualizowane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia rozmieszczenia rekombinowanych białek wewnątrz komórek. Obrazy te są reprezentatywne dla wybranych wariantów A-beta-42 GFP.

Powstawanie inkluzji białkowych, czyli PI, potwierdzono w 10 z 20 wariantów z analizowanej kolekcji. Ten wykres słupkowy przedstawia odsetek komórek zawierających różną liczbę PI obliczony na podstawie łącznie 500 komórek fluorescencyjnych dla każdego wariantu w kontrpróbach biologicznych. Zaobserwowano doskonałą zgodność między właściwościami przewidywanymi a właściwościami agregacji in vivo.

Poziomy ekspresji białek w ekstraktach komórkowych określono ilościowo przy użyciu przeciwciała swoistego dla A-beta. Jako ogólny trend, warianty A-beta-42 tworzące PI, zabarwione na zielono, są obecne na niższych poziomach niż te rozproszone w cytozolu, zabarwione na czerwono. Istotne różnice między wariantami A-beta-42 zaobserwowano, gdy ich fluorescencja sondy stresu oksydacyjnego, poziomy białek i właściwości fluorescencji GFP były reprezentowane w odniesieniu do ich zdolności do tworzenia PI i ich wewnętrznych skłonności do agregacji przewidywanych przez algorytm bioinformatyczny AGGRESCAN lub TANGO.

Warianty formujące PI są oznaczone kolorem zielonym, a warianty nietworzące PI są oznaczone kolorem czerwonym. Po tej procedurze można również zastosować inne metody, takie jak barwienie jodkiem propidyny lub aneksyną V, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak określenie wpływu wewnątrzkomórkowego wariantu białka wyrażonego na apoptozę komórek lub cytotoksyczność.