Name: Ocena wpływu agregacji białek na komórkowy stres oksydacyjny u drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Poznaj metodę oceny agregacji białek i stresu oksydacyjnego w komórkach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika ta pozwala ilościowo analizować uszkodzenia komórkowe w dużych populacjach drożdży.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Hodowle S. cerevisiae i ekspresja białek
Uwaga: Warianty Aβ wykazują różną względną skłonność do agregacji ze względu na mutację w pojedynczym aminokwasie w pozycji 19 (Phe19) peptydu Aβ42 (Ryc. 1A). Warianty te są znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), które pełni rolę reportera agregacji (Ryc. 1)29.
<ol>
	<li>Przetransformuj plazmidy kodujące 20 wariantów Aβ42-GFP do komórek drożdży o szczepie rodzicielskim BY4741 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0)30. Każdy plazmid koduje mutant Aβ42 połączony z GFP za pomocą łącznika GSSGSSG. Plazmidy to pESC(-URA) i zawierają marker selekcyjny URA329.
	<ol>
		<li>Przygotuj syntetyczne medium kompletne bez uracylu (SC-URA) z następujących składników: 1,9 g/L bazy azotowej dla drożdży bez uracylu, 5 g/L siarczanu amonu oraz 900 mL ddH2O połączone ze 100 mL 20% (w/v) glukozy.</li>
		<li>Przenieś jedną kolonię przetransformowanych komórek drożdży do 20 mL medium SC-URA zawierającego 2% glukozy i hoduj kultury przez noc w 30 °C przy mieszaniu z prędkością 210 rpm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnego dnia wyhoduj nowe kultury komórek drożdży, szczepiając 100 µL kultury nocnej do 5 mL świeżego medium SC-URA.</li>
	<li>Przy OD590 wynoszącej 0,5 odwiruj kultury w wirowce przy 3 000 x g przez 4 min, odlej supernatant i resuspenderuj komórki w tej samej objętości świeżego medium SC-URA zawierającego 2% rafinozy.</li>
	<li>Inkubuj w 30 °C przy mieszaniu z prędkością 210 rpm przez 30 min. Następnie odwiruj komórki przy 3 000 x g przez 4 min i odlej supernatant. Resuspenderuj komórki w świeżym medium SC-URA zawierającym 2% galaktozy, aby indukować ekspresję białka rekombinowanego.</li>
	<li>Po 16 h indukcji ekspresji białka w medium SC-URA zawierającym 2% galaktozy, zbierz 1 mL indukowanych komórek do sterylnych probówek do mikrocentryfugi poprzez wirowanie przy 3 000 x g przez 4 min. 
	UWAGA: Najistotniejsze różnice pojawiają się po 16 h okresu indukcji. Indukowane komórki drożdży wykazujące ekspresję wariantów Aβ42-GFP można wizualizować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby określić rozkład białka rekombinowanego wewnątrz komórek (Rysunek 2B).</li>
</ol>
2. Barwienie komórek
Uwaga: Świeże nieindukowane komórki są wymagane jako kontrola negatywna w celu ustalenia progu fluorescencji podczas analizy FC.
<ol>
	<li>Pobrać komórki drożdży indukowane przez 16 h i oznaczyć ich gęstość optyczną przy 590 nm (OD590).590). Rozcieńczyć je w sterylnym roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) do wartości OD590 wynoszącego 0,1.
	<ol>
		<li>Przygotować 1x roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym w następujący sposób: dodać 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4oraz 0,24 g KH2PO4 do 800 mL ddH2O2O. Uzupełnić roztwór wodą ddH do objętości 1 l.2po dostosowaniu pH do wartości 7,4 za pomocą HCl. Przefiltrować bufor przez 0.2 µm filtr</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś zawiesiny komórek ekspresyjnych do odpowiednio oznakowanych probówek (polistyrenowe z zaokrąglonym dnem, 12 × 75 mm) i chroń je przed światłem. Upewnij się, że są one gotowe do załadowania do cytometru przepływowego w celu przeprowadzenia analizy, wraz z komórkami nieindukowanymi i niebarwionymi.</li>
	<li>Dodaj sondę stresu oksydacyjnego (np. CellROX Deep Red) do każdej próbki do stężenia końcowego wynoszącego 5 µM i inkubować komórki w temperaturze 30 °C przez 30 min w ciemności.</li>
	<li>Po inkubacji komórki należy przemyć 3 razy 1x PBS, a następnie zawiesić ponownie w tej samej objętości buforu przed analizą metodą FC.</li>
</ol>
3. Analiza cytometryczna
Uwaga: Należy użyć układu FC z odpowiednimi laserami i filtrami w celu wykrycia sygnału fluorescencji GFP oraz sondy stresu oksydacyjnego. Można zastosować cytometr przepływowy wyposażony w niebieski laser 488 nm do detekcji GFP oraz czerwony laser 635 nm do detekcji fluorescencji sondy stresu oksydacyjnego. Akwizycję fluorescencji emisyjnej GFP i sondy stresu oksydacyjnego przeprowadza się odpowiednio z użyciem filtra BP 530/30 nm i filtra BP 660/20 nm (Tabela 1).
<ol>
	<li>Kliknij Open New Worksheet Panel i utwórz następujące wykresy kropkowe akwizycji.
	<ol>
		<li>Wybierz narzędzie Scatter Plot Tool z paska narzędzi i utwórz wykres ze zmiennymi Side Scatter-Area (SSC-A) na osi y vs. Forward Scatter-Area (FSC-A) w skali liniowej na osi x.</li>
		<li>Kliknij narzędzie Scatter Plot Tool z paska narzędzi i utwórz wykres ze zmiennymi FL1-Area (FITC) na osi x vs. FL3-Area (APC) w skali logarytmicznej na osi y.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij ikonę Instruments Settings. Przejdź do karty Compensation i ustaw wszystkie poziomy kompensacji. Kliknij kartę Acquisition i wybierz całkowitą liczbę 20 000 zdarzeń do rejestracji.</li>
	<li>Kliknij ikonę Flow Rate, aby przełączyć szybkość przepływu na Low.</li>
	<li>Kliknij kartę Acquire, aby rozpocząć analizę nieindukowanych, niebarwionych komórek i dostosuj napięcie w ustawieniach Instrument Settings dla rozpraszania przedniego i bocznego, aż populacja zostanie rozmieszczona w lewym środkowym kwadrancie.
	<ol>
		<li>Kliknij ikonę Polygon, aby wyznaczyć obszar R1 wokół populacji komórek z wykluczeniem debris komórkowego, a następnie użyj tej bramkowanej populacji P1 = R1 dla wszystkich fluorescencyjnych wykresów kropkowych i reprezentacji histogramowych (Rysunek 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby dostosować napięcie PMT sygnału fluorescencji, przeanalizuj niebarwione komórki na wykresie kropkowym FL1-FL3, regulując wzmocnienie w karcie Instrument Setting, aż komórki zostaną rozmieszczone w dolnym lewym kwadrancie.</li>
	<li>Zmień próbkę na komórki indukowane, aby zmierzyć fluorescencję GFP. W karcie Instrument Setting ustaw wzmocnienie dla FSC-A vs. FL1 (FITC) tak, aby populacja była rozmieszczona w dolnym prawym kwadrancie. Zdefiniuj populację komórek pozytywnych za pomocą bramki (Bramka P2).</li>
	<li>Zmień próbkę na nieindukowane komórki barwione, aby zobrazować stres oksydacyjny za pomocą fluorescencji na wykresie kropkowym FSC-A vs. FL3 (APC). Reguluj wzmocnienie, aż populacja komórek zostanie rozmieszczona w lewym górnym kwadrancie. Wyznacz bramkę dla pozytywnej populacji komórek w P3.</li>
	<li>Utwórz dwa wykresy histogramowe za pomocą ikony histogram, aby przedstawić fluorescencję komórek. Aby zobrazować intensywność fluorescencji, upewnij się, że FL1 (FITC) reprezentujący fluorescencję GFP znajduje się na osi x, a FL3 (APC) reprezentujący fluorescencję znajduje się na osi y, stosując odpowiednio populacje P2 i P3 w skali logarytmicznej. 
	UWAGA: Nałożone na siebie histogramy (overlays) są dobrym sposobem na zilustrowanie różnic między profilami fluorescencji komórek wykazujących ekspresję różnych wariantów Aβ.</li>
</ol>
4. Immunodetekcja białek rekombinowanych
<ol>
	<li>Aby określić poziomy ekspresji białek, zebrać kultury drożdży indukowane przez 16 h poprzez wirowanie przy 4 000 x g przez 6 min, a następnie przechowywać osady komórkowe w temperaturze -80 °C.
	<ol>
		<li>Resuspender zebrane komórki wykazujące ekspresję białka rekombinowanego przez 16 h w PBS. Przygotować zawiesiny komórkowe o objętości 200 µL dla każdego mutanta Aβ42-GFP o gęstości OD590 wynoszącej 20.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu analizy całkowitej frakcji białek, zebrać 100 µL każdego mutanta poprzez wirowanie przy 14 000 x g przez 20 min i resuspender osady komórkowe w tej samej objętości buforu do lizy drożdży Y-PER (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1% DMSO, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA zawierającego 10 mg/mL SB3-14 (mirystylosulfobetainę), uzupełnionego o 1 mM fenylometanosulfonylofluorid (PMSF)).
	<ol>
		<li>Inkubować próbki przez 20 min w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określić stężenie ekstraktu białkowego za pomocą metody Bradforda. Nanieść do 5 µg ekstraktu białkowego z każdej próbki na żel do elektroforezy SDS-PAGE z 15% akryloamidem i przenieść na membranę z polifluorurenylidenu (PVDF) przy 100 V przez 60 min.
	<ol>
		<li>Przygotować odczynnik Bradforda, rozpuszczając 100 mg Coomassie Brilliant Blue G-250 w 50 mL 95% etanolu i dodając 100 mL 85% (m/v) kwasu fosforowego. Następnie, gdy barwnik całkowicie się rozpuści, rozcieńczyć mieszaninę wodą ddH2O do 1 L i przefiltrować przez celulozowy papier filtracyjny bezpośrednio przed użyciem. 
		UWAGA: Odczynnik Bradforda powinien mieć jasnobrązowy kolor.</li>
		<li>Przygotować standard z albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w zakresie od 5 do 100 µg białka w 1 000 µL odczynnika Bradforda.</li>
		<li>Dodać 1–10 µL ekstraktu białkowego do 1 mL odczynnika Bradforda i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
		<li>Zmierzyć absorbancję standardów oraz próbek ekstraktu białkowego przy OD595.</li>
		<li>Do analizy sporządzić wykres wartości absorbancji uzyskanych dla standardów vs. µg białka. Na podstawie krzywej standardowej określić stężenia w oryginalnych próbkach na podstawie ilości białka, uwzględniając objętość i ewentualne rozcieńczenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przepłukać membranę 1x solą buforową Tris (TBS) z 0,1% Tween 20 (TTBS) i zablokować ją, używając 5% (m/v) beztłustego suchego mleka w 1x TTBS.
	<ol>
		<li>Aby przygotować 1 L 10x TBS, rozpuścić 24 g bazy Tris i 88 g NaCl w 900 mL H2Odd i dostosować pH do 7,6. Dodać ddH2O do objętości końcowej 1 L. W celu przygotowania roztworu 1x zmieszać 1 część roztworu stokowego 10x z 9 częściami ddH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować membranę przez 1 h z pierwotnym przeciwciałem przeciwko β-amyloidowi 6E10 rozcieńczonym 1:1 000 oraz przez 1 h w temperaturze pokojowej z wtórnym przeciwciałem, koniugatem kozi anty-mysi IgG-HRP rozcieńczonym 1:10 000.</li>
	<li>Wywołać membrany, używając 1 mL fluorescencyjnego odczynnika Luminata, i przeprowadzić kwantyfikację prążków za pomocą analizy densytometrycznej zgodnie z opisem w kroku 5.2.</li>
</ol>
5. Analiza danych
<ol>
	<li>Aby przeanalizować dane uzyskane za pomocą FC, należy stworzyć tabelę przedstawiającą średnią intensywność fluorescencji (MFI) oraz medianę fluorescencji wraz z odpowiadającym im błędem standardowym i/lub współczynnikiem zmienności (CV) dla fluorescencji GFP oraz poziomów stresu oksydacyjnego.
	<ol>
		<li>Kliknij kartę Inspector, a następnie ikonę Statistics, aby dostosować dane statystyczne wymagane dla każdego kanału. 
		UWAGA: Podczas porównywania wariantów białek należy przekształcić dane wartości fluorescencji na krotność tła lub wskaźnik rozdzielczości (RD): 
		<img alt="Równanie wielkości efektu d Cohena, ilustrujące porównanie statystyczne w badaniach eksperymentalnych." src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
		W tym wskaźniku średnia próbki (mean sample) to średnia fluorescencja próbek badanych, średnia kontrolna (mean control) to średnia fluorescencja komórek użytych jako kontrola, a SD to odchylenie standardowe średniej fluorescencji. Współczynnik RD jest dokładniejszym indeksem niż wartość MFI, ponieważ nie tylko oblicza różnicę między próbkami, ale także uwzględnia rozrzut danych. Obliczenie to jest szczególnie istotne przy porównywaniu danych pochodzących z różnych eksperymentów przeprowadzonych w różnym czasie. Po obliczeniu RD zaleca się zastosowanie testu statystycznego w celu potwierdzenia istotności zaobserwowanych różnic między wariantami białek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu immunodetekcji białek należy ilościowo określić poziomy białka rekombinowanego metodą Western blot przy użyciu oprogramowania ImageJ.
	<ol>
		<li>Przed analizą densytometryczną należy przekonwertować oryginalne surowe obrazy wywołanej membrany do formatu plików JPEG i trybu skali szarości.</li>
		<li>W sekcji Set Measurements menu Analyze należy wybrać opcję Mean Grey Value.</li>
		<li>Wybierz narzędzie Rectangle w programie ImageJ i zdefiniuj obszar zainteresowania (ROI) o stałym rozmiarze dla analizy densytometrycznej prążków. Wyśrodkuj każdy prążek na obrazie membrany wewnątrz utworzonej ramki prostokątnej i zapisuj pomiary jeden po drugim, używając Ctrl+M (polecenie pomiaru).</li>
		<li>Zmierz lokalne tło sąsiadujące z każdym prążkiem, stosując ten sam obszar ROI. Po pomiarze odejmij odpowiadające lokalne tło od każdego poszczególnego prążka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+newly+translated+proteins+in+vivo%3A+the+role+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones.</a> Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).</li>
<li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li>
<li>Wong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+selective+clearance+of+protein+inclusions+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy.</a> Nature Communications. 3, (2012).</li>
<li>Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+networks+in+protein+disaggregation+and+prion+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation.</a> Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).</li>
<li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%3A+destruction+for+the+sake+of+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction.</a> Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).</li>
<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12181546">Getting out of shape.</a> Nature. 418, 729-730 (2002).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Aguzzi, A., O'Connor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+diseases%3A+pathogenicity+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transthyretin-related+amyloidoses+and+the+heart%3A+a+clinical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview.</a> Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).</li>
<li>Deas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+oligomers+interact+with+metal+ions+to+induce+oxidative+stress+and+neuronal+death+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson's disease.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).</li>
<li>Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+protein+aggregates+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).</li>
<li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).</li>
<li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431, 805-810 (2004).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+what+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration?</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).</li>
<li>Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+characterization+of+diverse+amyloid+fibrils+in+vitro+by+the+fluorescent+dye+Nile+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red.</a> Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).</li>
<li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+amyloid+by+congo+red+spectral+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay.</a> Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).</li>
<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+why+cook+with+baker%27s+yeast%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast?</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).</li>
<li>Tenreiro, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+is+good%3A+yeast+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Simple is good: yeast models of neurodegeneration.</a> FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).</li>
<li>Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+model+of+amyloid-%CE%B2+and+Tau+aggregation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 47, 9-16 (2015).</li>
<li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).</li>
<li>Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+sequestration+and+detoxification+of+huntingtin+by+the+ribosome+quality+control+complex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nervous+yeast%3A+modeling+neurotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).</li>
<li>Figley, M. D., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+genetic+screen+reveals+novel+therapeutic+strategy+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS.</a> Rare Diseases. 1, e24420(2013).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).</li>
<li>Bharathi, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27654890">Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33, 607-620 (2016).</li>
<li>Pallarès, I., Ventura, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28685682">Advances in the prediction of protein aggregation propensity.</a> Current Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Villar-Piqué, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+propensity+is+a+crucial+determinant+of+intracellular+inclusion+formation+and+quality+control+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).</li>
<li>Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+against+toxic+aggregation-prone+protein+sequences+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).</li>
<li>Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+amyloid+protein+aggregation+and+yeast+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Linking amyloid protein aggregation and yeast survival.</a> Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).</li>
<li>Conchillo-Solé, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGGRESCAN%3A+a+server+for+the+prediction+and+evaluation+of+%26%2334%3Bhot+spots%26%2334%3B+of+aggregation+in+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of &#34;hot spots&#34; of aggregation in polypeptides.</a> BMC Bioinformatics. 8, 65(2007).</li>
<li>Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+sequence-dependent+and+mutational+effects+on+the+aggregation+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).</li>
<li>Renner, M., Melki, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24698014">Protein aggregation and prionopathies.</a> Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).</li>
<li>Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+into+insoluble+deposits+protects+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress.</a> Redox Biology. 12, 699-711 (2017).</li>
</ol>

Szeroki zakres chorób jest związany z akumulacją nieprawidłowo sfałdowanych białek w złogi komórkowe 6,7,8,33. Podjęto wiele wysiłków w celu rozwikłania mechanizmów molekularnych, które wywołują wystąpienie tych chorób, przy użyciu podejść obliczeniowych, które nie uwzględniają stężeń białek, lub podejść in vitro, w których stężenie białka pozostaje stałe podczas reakcji. Jednak w komó...

Proteostaza jest podstawowym wyznacznikiem sprawności komórek i procesów starzenia. W komórkach homeostaza białek jest utrzymywana przez zaawansowane sieci kontroli jakości białek, których celem jest zapewnienie prawidłowego fałdowania nieprawidłowo sfałdowanych konformerów białkowych przez białka opiekuńcze i/lub ich ukierunkowanej proteolizy z kilkoma dobrze zachowanymi mechanizmami1,2,3,4,5. Duża liczba badań potwierdza związek między wystąpieniem i progresją szerokiego zakresu chorób u ludzi a niepowodzeniem proteostazy, prowadzącym do nieprawidłowego fałdowania i agregacji białek. Na przykład obecność złogów białkowych jest uważana za patologiczną cechę charakterystyczną wielu zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona6,7,8, choroby prionogenne i amyloidozy niezwyrodnieniowe9. Zasugerowano, że wczesne zespoły oligomeryczne i protofibrylarne w reakcji agregacji są głównymi elicytorami cytotoksyczności, ustanawiającymi nieprawidłowe interakcje z innymi białkami w zatłoczonym środowisku komórkowym10. Ponadto inkluzje białkowe (PI) mogą być przenoszone między komórkami, propagując ich toksyczne działanie11,12. W związku z tym może się zdarzyć, że tworzenie PI może rzeczywiście stanowić mechanizm detoksykacyjny, który ogranicza obecność niebezpiecznych zagregowanych gatunków do określonych miejsc w komórce, gdzie mogą być przetwarzane lub akumulowane bez większych skutków ubocznych13,14.
Standardowe podejścia biochemiczne in vitro dostarczyły ważnych informacji na temat różnych gatunków, które zamieszkują reakcje agregacji i ich właściwości15,16. Jednak warunki stosowane w tych testach wyraźnie różnią się od tych występujących w komórce, a zatem kwestionują ich fizjologiczne znaczenie. Ze względu na godną uwagi ochronę szlaków komórkowych, takich jak kontrola jakości białek, autofagia lub regulacja komórkowego stanu redoks17,18 wśród eukariontów19,20,21,22,23, pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) pojawił się jako uprzywilejowany prosty model komórkowy do badania molekularnych uwarunkowań agregacji białek i związanego z tym wpływu cytotoksycznego w biologicznie istotnych środowiskach24,25,26.
Skłonność do agregacji białek jest cechą wpisaną w sekwencję pierwotną. W ten sposób powstawanie struktur podobnych do amyloidu można przewidzieć na podstawie identyfikacji i oceny siły działania regionów promujących agregację w polipeptydach27. Jednak pomimo sukcesu algorytmów bioinformatycznych w przewidywaniu właściwości agregacji in vitro sekwencji białek, nadal są one dalekie od prognozowania, w jaki sposób skłonności te przekładają się na wpływ cytotoksyczny in vivo. Badania, które w sposób systematyczny zajmują się związkiem między stanem zagregowanym danego białka a powiązanym z nim uszkodzeniem komórek, mogą pomóc w obejściu tego ograniczenia obliczeniowego. Związek ten został rozwiązany w niniejszym badaniu, wykorzystując duży zestaw wariantów peptydu Aβ42 β amyloidu, różniących się tylko pojedynczą resztą, ale wykazujących ciągły zakres skłonności do agregacji in vivo28. W szczególności opisano oparte na FC podejście do identyfikacji gatunków konformacyjnych odpowiedzialnych za uszkodzenia oksydacyjne wywoływane przez białka podatne na agregację w komórkach drożdży. Metodologia zapewnia wiele korzyści, takich jak prostota, wysoka przepustowość i dokładne pomiary ilościowe. Takie podejście pozwoliło potwierdzić, że PI odgrywają rolę ochronną przed stresem oksydacyjnym.

<table><tbody><tr><td>Komórki drożdży BY4741&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>Genotyp: MATa his3&Delta; 1 leu2&Delta; 0 met15 i Delta; 0 ura3 i Delta; 0</td></tr><tr><td>plazmid pESC(-Ura)&nbsp;</td><td>Agilent Genomics</td><td>217454</td><td>plazmid ekspresji drożdży z promotorem Gal. Marker do wyboru URA3</td></tr><tr><td>Syntetyczne pożywki drożdżowe Drop-out</td><td>Sigma</td><td>Y1501</td><td>Drożdże w proszku</td></tr><tr><td>Azot bazowy bez aminokwasów</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>Rafinoza</td><td>Sigma</td><td>R7630</td><td>Proszek</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>W proszku</td></tr><tr><td>Galaktoza</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td>Fosforan w proszku</td></tr><tr><td> Buforowana sól fizjologiczna (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991&nbsp;</td><td>Rozwiązanie 10X</td></tr><tr><td>Odczynnik CellROX Deep Red&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C10422</td><td>Czujnik fluorescencyjny przenikający się z wolnymi rodnikami, niefluorescencyjny w stanie zredukowanym, wykazujący jasną fluorescencję po utlenieniu przez reaktywne formy tlenu (ROS), z maksimami absorpcji/emisji przy 644/665 nm.</td></tr><tr><td>Odczynnik do ekstrakcji białek Y-PER&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78990</td><td>Bufor do lizy komórek płynnych</td></tr><tr><td>Akrylamid/Bis-akryloamid</td><td>Sigma</td><td>A6050</td><td>Roztwór</td></tr><tr><td>odczynnik barwnika Bradford</td><td>Bio-Rad&nbsp;</td><td>5000205</td><td>Odczynnik barwnikowy do jednoetapowego oznaczania stężenia białka</td></tr> <tr><td>i przeciwciała beta-amyloidowego 6E10&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>803001</td><td>Mysz IgG1. Epitop znajduje się w aminokwasach 3-8 beta-amyloidu (EFRHDS).</td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysi koniugat IgG-HRP&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1721011</td><td></td></tr><tr><td>Membrane Immobilon-P, PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Luminata forte</td><td>Merk</td><td>WBLUF0100</td><td>Premiksowany, gotowy do użycia chemiluminescencyjny odczynnik do wykrywania HRP</td></tr><tr><td>Roztwór fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td>Inhibitor proteazy. Rozpuszczony w 0,1 M w etanolu</td></tr><tr><td>FACSCanto cytometr przepływowy&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>657338</td><td>Wyposażony w 488&nbsp; niebieski laser nm do wykrywania GFP i 635&nbsp; czerwony laser nm / filtr BP 530/30 nm i filtr 660/20 BP</td></tr><tr><td>Elektroforeza Mini Trans-Blot Komórka transferowa</td><td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td>System przenoszenia białek System do elektroforezy</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra System</td><td>elektroforezy</td> <td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td></tr></tbody></table>

ocena wpływu agregacji białek na komórkowy stres oksydacyjny u drożdży

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Nieprawidłowe fałdowanie i agregacja białek w konformacje amyloidu były związane z początkiem i progresją kilku chorób neurodegeneracyjnych. Jednak nadal niewiele jest informacji na temat tego, w jaki sposób nierozpuszczalne agregaty białkowe wywierają swoje toksyczne działanie in vivo. Proste modelowe organizmy prokariotyczne i eukariotyczne, takie jak bakterie i drożdże, znacząco przyczyniły się do naszego obecnego zrozumienia mechanizmów stojących za wewnątrzkomórkowym tworzeniem amyloidu, propagacją agregatów i toksycznością. W tym protokole zastosowanie drożdży jest opisane jako model do analizy związku między powstawaniem agregatów białkowych a ich wpływem na komórkowy stres oksydacyjny. Metoda łączy wykrywanie wewnątrzkomórkowego stanu rozpuszczalnego/zagregowanego białka amyloidogennego z ilościowym określeniem komórkowego uszkodzenia oksydacyjnego wynikającego z jego ekspresji za pomocą cytometrii przepływowej (FC). To podejście jest proste, szybkie i ilościowe. Badanie ilustruje tę technikę poprzez korelację komórkowego stresu oksydacyjnego wywołanego przez duży zestaw wariantów peptydów β amyloidu z ich odpowiednimi wewnętrznymi skłonnościami do agregacji.

Niniejszy protokół opisuje sposób wykorzystania zestawu 20 wariantów peptydu Aβ42, w których Phe19 został zmutowany na wszystkie naturalne aminokwasy proteinogenne28. Teoretyczne skłonności do agregacji tych białek można przeanalizować przy użyciu dwóch różnych algorytmów bioinformatycznych (AGGRESCAN i TANGO31,32). W obu przypadkach analiza ta wykazuje progresywny stopień tendencji do agregacji, przypisują...

Agregacja białek wywołuje komórkowy stres oksydacyjny. Protokół ten opisuje metodę monitorowania stanów wewnątrzkomórkowych białek amyloidogennych i związanego z nimi stresu oksydacyjnego za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to służy do badania zachowania rozpuszczalnych i podatnych na agregację wariantów peptydu β amyloidu.

Ocena wpływu agregacji białek na komórkowy stres oksydacyjny u drożdży

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

Ogólnym celem tej procedury jest określenie związku między powstawaniem wewnątrzkomórkowych agregatów białkowych a ich wpływem na komórkowy stres oksydacyjny przy użyciu drożdży piekarskich Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem i agregacją białek, takich jak zaburzenia neurodegeneracyjne i amyloidozy nieneuropatyczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, szybka i umożliwia ilościowe określenie uszkodzeń spowodowanych stresem oksydacyjnym w dużej populacji drożdży.Dzięki tej metodzie możemy zapewnić wgląd w korelację między wewnątrzkomórkowym stanem rozpuszczalnym lub zagregowanym białka amyloidogennego a poziomem stresu oksydacyjnego u drożdży. Ponadto może być również stosowany do innych organizmów modelowych wykazujących ekspresję białek rekombinowanych. Analizę metodą cytometrii przepływowej zademonstruje Manuela Costa, technik z Zakładu Cytometrii Przepływowej UAB.W tym badaniu wewnątrzkomórkowy stan agregacji różnych wariantów peptydu A-beta-42 jest śledzony za pomocą S. cerevisiae przekształconych plazmidem kodującym A-beta-42 połączonego z GFP pod kontrolą promotora indukowanego galaktozą. Wybierz jedną kolonię przekształconych komórek drożdży i zaszczep w 20 mililitrach pożywki SC minus Ura zawierającej 2% glukozy. Uprawiaj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem przez noc.Następnego dnia zaszczepij 100 mikrolitrów nocnej kultury w pięciu mililitrach świeżej pożywki SC minus Ura i hoduj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin. Gdy kultura ma gęstość optyczną 590 nanometrów lub OD 590 0,5, odwirować kulturę przy 3 000 razy g przez cztery minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach świeżej pożywki SC minus Ura zawierającej 2% rafinozy. Inkubować komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem przez 30 minut.Po 30 minutach odwirować komórki z prędkością 3 000 g przez cztery minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce SC minus Ura zawierającej 2% galaktozy w celu indukcji ekspresji rekombinowanego białka. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na 16 godzin. Po 16 godzinach zebrać komórki, przenosząc jednomililitrowe porcje kultury do sterylnych probówek do mikrowirówek i odwirowując przy 3 000 g przez cztery minuty.Rozpocznij tę procedurę od określenia OD 590 w 16-godzinnych komórkach drożdży indukowanych. Następnie rozcieńczyć komórki w sterylnym PBS do OD 590 0,1. Zawiesiny komórek wykazujących ekspresję przenieść do odpowiednio oznakowanych okrągłodennych probówek z polistyrenu i chronić je przed światłem.Przygotować nieindukowane komórki jako kontrolę ujemną do analizy cytometrii przepływowej. Dodać sondę stresu oksydacyjnego do każdej próbki o końcowym stężeniu pięciu mikromolów. Przykryj próbki folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut.Po zakończeniu inkubacji odwiruj komórki, usuń supernatant i ponownie zawieś granulki komórek w PBS. Umyj komórki trzy razy w ten sposób za pomocą PBS. Po trzecim płukaniu ponownie zawiesić komórki w tej samej objętości PBS.Upewnij się, że niebarwione komórki są uwzględnione w analizie cytometrii przepływowej. Za pomocą odpowiednich laserów i filtrów wykonaj analizę cytometrii przepływowej w celu wykrycia GFP i sygnału fluorescencyjnego sondy stresu oksydacyjnego. Zacznij od kliknięcia panelu Otwórz nowy arkusz i nadaj eksperymentowi nazwę.Na pasku narzędzi wybierz narzędzie Wykres punktowy i utwórz wykres ze zmiennymi Boczny obszar punktowy na osi y i Obszar punktowy do przodu w skali liniowej na osi x. Kliknij narzędzie Wykres punktowy i utwórz wykres ze zmiennymi Obszar FITC na osi x i Obszar APC w skali logarytmicznej na osi y. Kliknij ikonę Instrument Setting (Ustawienia instrumentu) i ustaw wszystkie poziomy kompensacji na zero w zakładce Compensation (Kompensacja).Następnie kliknij zakładkę Akwizycja i wybierz łączną liczbę 20 000 zdarzeń, które mają zostać zarejestrowane przy niskim natężeniu przepływu. Ponieważ fluorescencyjny sygnał emisyjny jednego fluorochromu może być wykryty przez inny detektor, ważne jest, aby przeprowadzić proces kompensacji w celu wyrównania minimalnego sygnału każdego fluorochromu we wszystkich detektorach za pomocą kontroli jednokolorowej. Zmień nazwę probówki 001 na kontrolę ujemną i kliknij kartę Pobierz, aby rozpocząć uruchamianie nieindukowanych, niebarwionych komórek.Dostosuj napięcie w ustawieniach instrumentu rozproszenia do przodu i z boku, aż populacja zostanie rozłożona w środkowym lewym kwadrancie. Kliknij ikonę wielokąta, aby ustawić region R1 wokół populacji komórek z wyłączeniem szczątków komórek, a następnie użyj tej bramkowanej populacji P1 równa się R1 dla wszystkich fluorescencyjnych wykresów punktowych i reprezentacji histogramu. Aby wyregulować napięcie PMT sygnału fluorescencji, uruchom niebarwione komórki na wykresie punktowym FL1 do FL3, dostrajając wzmocnienie w zakładce Ustawienia instrumentu, aż komórki zostaną rozmieszczone w lewym dolnym kwadrancie.Korzystając z narzędzia do tworzenia wykresów punktowych, utwórz wykres punktowy ze zmiennymi FITC-A na osi x w porównaniu z FSC-A oraz drugi wykres punktowy ze zmiennymi APC-A na osi x w porównaniu z FSC-A. Następnie zmień próbkę na indukowane komórki, aby zmierzyć fluorescencję GFP. Na karcie Instrument Setting (Ustawienia instrumentu) ustaw wzmocnienie w FSC-A w porównaniu z FITC, gdy populacja jest rozłożona w prawym dolnym kwadrancie.Zdefiniuj populację komórek GFP-dodatnich za pomocą bramki. Zmień próbkę na nieindukowane wybarwione komórki. Wyświetlanie stresu oksydacyjnego przez fluorescencję na wykresie punktowym FSC-A i APC-A.Dostosuj wzmocnienie, aż populacja komórek zostanie rozłożona w lewym górnym kwadrancie. Bramka dodatniej populacji komórek w P3. Za pomocą ikony histogramu utwórz dwa wykresy histogramu reprezentujące fluorescencję komórek, jeden dla FITC, a drugi dla fluorescencji APC. Należy utworzyć tabelę przedstawiającą średnią intensywność fluorescencji i medianę fluorescencji wraz z odpowiadającym im błędem standardowym i/lub współczynnikiem wariancji dla poziomów fluorescencji GFP i stresu oksydacyjnego.Kliknij kartę Wynagrodzenie i ustaw wszystkie poziomy wynagrodzeń na zero. Kliknij zakładkę Akwizycja i wybierz łączną liczbę 20 000 zdarzeń, które mają zostać zarejestrowane. Przygotuj trzy nowe probówki z próbkami i nazwij je nieindukowanymi, indukowanymi rozpuszczalnymi i indukowanymi zagregowanymi.Pobieraj dane z próbek z wstępnie ustawionymi ustawieniami. Przeanalizuj dane, otwierając nowy arkusz i tworząc wykres punktowy dla zmiennych FITC-A i APC-A, bramkując dodatnie komórki do barwienia CellROX. Dla każdej próbki utwórz tabelę statystyczną ze średnią fluorescencją i błędem standardowym dla kanałów FITC i APC.Możliwe jest również sortowanie komórek za pomocą sortera FACS po zliczeniu zagregowanych białek. Komórki drożdży wykazujące ekspresję wariantów A-beta-42 po okresie indukcji wynoszącym 16 godzin są wizualizowane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia rozmieszczenia rekombinowanych białek wewnątrz komórek. Obrazy te są reprezentatywne dla wybranych wariantów A-beta-42 GFP.Powstawanie inkluzji białkowych, czyli PI, potwierdzono w 10 z 20 wariantów z analizowanej kolekcji. Ten wykres słupkowy przedstawia odsetek komórek zawierających różną liczbę PI obliczony na podstawie łącznie 500 komórek fluorescencyjnych dla każdego wariantu w kontrpróbach biologicznych. Zaobserwowano doskonałą zgodność między właściwościami przewidywanymi a właściwościami agregacji in vivo.Poziomy ekspresji białek w ekstraktach komórkowych określono ilościowo przy użyciu przeciwciała swoistego dla A-beta. Jako ogólny trend, warianty A-beta-42 tworzące PI, zabarwione na zielono, są obecne na niższych poziomach niż te rozproszone w cytozolu, zabarwione na czerwono. Istotne różnice między wariantami A-beta-42 zaobserwowano, gdy ich fluorescencja sondy stresu oksydacyjnego, poziomy białek i właściwości fluorescencji GFP były reprezentowane w odniesieniu do ich zdolności do tworzenia PI i ich wewnętrznych skłonności do agregacji przewidywanych przez algorytm bioinformatyczny AGGRESCAN lub TANGO.Warianty formujące PI są oznaczone kolorem zielonym, a warianty nietworzące PI są oznaczone kolorem czerwonym. Po tej procedurze można również zastosować inne metody, takie jak barwienie jodkiem propidyny lub aneksyną V, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak określenie wpływu wewnątrzkomórkowego wariantu białka wyrażonego na apoptozę komórek lub cytotoksyczność.

evaluation-impact-protein-aggregation-on-cellular-oxidative-stress

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym protokole ekspresja genów w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), który jest środkiem utleniającym.

Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Niniejszy manuskrypt opisuje trzy komplementarne protokoły służące do oceny toksyczności białek z ekspansją poliglutaminy (polyQ) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokoły te można łatwo zmodyfikować w celu monitorowania toksyczności innych błędnie sfałdowanych białek w drożdżach.

Testy wzrostu do oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Żywotność komórek zależy od szybkiego i skutecznego radzenia sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek.  W tym miejscu opisujemy metodę wizualizacji różnych potencjalnych losów nieprawidłowo sfałdowanego białka: ponownego fałdowania, degradacji lub sekwestracji w inkluzjach. Demonstrujemy zastosowanie czujnika składania, Ubc9ts, do monitorowania proteostazy i kontroli jakości agregacji w żywych komórkach za pomocą mikroskopii 4D.

Obrazowanie 4D agregacji białek w żywych komórkach

Ten artykuł opisuje użycie białka fuzyjnego lucyferazy świetlika i GFP do badania in vivo fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae.  Za pomocą tego odczynnika można jednocześnie monitorować fałdowanie modelowego białka zdenaturowanego termicznie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i testu enzymatycznego w celu zbadania roli składników sieci proteostazy w kontroli jakości białka.

Sprzężone testy do monitorowania ponownego fałdowania białek u Saccharomyces cerevisiae

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Obfitość białek odzwierciedla tempo zarówno syntezy białek, jak i ich degradacji. W artykule opisano zastosowanie cykloheksymidu, po którym następuje western blot, do analizy degradacji białek w modelowym jednokomórkowym eukarioncie, Saccharomyces cerevisiae (drożdże pączkujące).

Analiza Cycloheximide Chase degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Celem przedstawionej tutaj metody jest zbadanie agregacji białek podczas normalnego starzenia się w modelowym organizmie C. elegans. Protokół stanowi potężne narzędzie do badania wysoce nierozpuszczalnych dużych agregatów, które tworzą się wraz z wiekiem i do określenia, w jaki sposób zmiany w proteostazie wpływają na agregację białek.

Metody badania zmian w inherentnej agregacji białek wraz z wiekiem u Caenorhabditis elegans

Jednym z najtrudniejszych warunków stresowych, z jakimi organizmy spotykają się w ciągu swojego życia, jest akumulacja utleniaczy. Podczas stresu oksydacyjnego komórki w dużym stopniu polegają na molekularnych białkach opiekuńczych. W tym miejscu przedstawiono metody wykorzystywane do badania regulowanej przez redoks aktywności antyagregacyjnej, a także do monitorowania zmian strukturalnych regulujących funkcję opiekuńczą za pomocą HDX-MS.

Definiowanie regulowanej przez redoks aktywności chaperonu Hsp33 i mapowanie zmian konformacyjnych na Hsp33 przy użyciu spektrometrii mas wymiany wodorowo-deuterowej

Ten protokół opisuje ekstrakcję i wizualizację zagregowanych i rozpuszczalnych białek z Escherichia coli po leczeniu proteotoksycznym środkiem przeciwbakteryjnym. Postępowanie zgodnie z tą procedurą pozwala na jakościowe porównanie tworzenia agregatów białkowych in vivo w różnych szczepach bakteryjnych i/lub między zabiegami.

Ekstrakcja i wizualizacja agregatów białkowych po leczeniu Escherichia coli stresorem proteotoksycznym

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Poznaj metodę oceny agregacji białek i stresu oksydacyjnego w komórkach Saccharomyces cerevisiae przy użyciu cytometrii przepływowej. Technika ta pozwala ilościowo analizować uszkodzenia komórkowe w dużych populacjach drożdży.

Ocena wpływu agregacji białek na komórkowy stres oksydacyjny u drożdży

Przeglądaj więcej filmów