Ocena wpływu agregacji białek na komórkowy stres oksydacyjny u drożdży
23 czerwca 2018
Agregacja białek wywołuje komórkowy stres oksydacyjny. Protokół ten opisuje metodę monitorowania stanów wewnątrzkomórkowych białek amyloidogennych i związanego z nimi stresu oksydacyjnego za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to służy do badania zachowania rozpuszczalnych i podatnych na agregację wariantów peptydu β amyloidu.
Ogólnym celem tej procedury jest określenie związku między powstawaniem wewnątrzkomórkowych agregatów białkowych a ich wpływem na komórkowy stres oksydacyjny przy użyciu drożdży piekarskich Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem i agregacją białek, takich jak zaburzenia neurodegeneracyjne i amyloidozy nieneuropatyczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, szybka i umożliwia ilościowe określenie uszkodzeń spowodowanych stresem oksydacyjnym w dużej populacji drożdży.
Dzięki tej metodzie możemy zapewnić wgląd w korelację między wewnątrzkomórkowym stanem rozpuszczalnym lub zagregowanym białka amyloidogennego a poziomem stresu oksydacyjnego u drożdży. Ponadto może być również stosowany do innych organizmów modelowych wykazujących ekspresję białek rekombinowanych. Analizę metodą cytometrii przepływowej zademonstruje Manuela Costa, technik z Zakładu Cytometrii Przepływowej UAB.
W tym badaniu wewnątrzkomórkowy stan agregacji różnych wariantów peptydu A-beta-42 jest śledzony za pomocą S. cerevisiae przekształconych plazmidem kodującym A-beta-42 połączonego z GFP pod kontrolą promotora indukowanego galaktozą. Wybierz jedną kolonię przekształconych komórek drożdży i zaszczep w 20 mililitrach pożywki SC minus Ura zawierającej 2% glukozy. Uprawiaj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem przez noc.
Następnego dnia zaszczepij 100 mikrolitrów nocnej kultury w pięciu mililitrach świeżej pożywki SC minus Ura i hoduj komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie do trzech godzin. Gdy kultura ma gęstość optyczną 590 nanometrów lub OD 590 0,5, odwirować kulturę przy 3 000 razy g przez cztery minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach świeżej pożywki SC minus Ura zawierającej 2% rafinozy. Inkubować komórki w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem przez 30 minut.
Po 30 minutach odwirować komórki z prędkością 3 000 g przez cztery minuty, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce SC minus Ura zawierającej 2% galaktozy w celu indukcji ekspresji rekombinowanego białka. Umieść komórki z powrotem w inkubatorze na 16 godzin. Po 16 godzinach zebrać komórki, przenosząc jednomililitrowe porcje kultury do sterylnych probówek do mikrowirówek i odwirowując przy 3 000 g przez cztery minuty.
Rozpocznij tę procedurę od określenia OD 590 w 16-godzinnych komórkach drożdży indukowanych. Następnie rozcieńczyć komórki w sterylnym PBS do OD 590 0,1. Zawiesiny komórek wykazujących ekspresję przenieść do odpowiednio oznakowanych okrągłodennych probówek z polistyrenu i chronić je przed światłem.
Przygotować nieindukowane komórki jako kontrolę ujemną do analizy cytometrii przepływowej. Dodać sondę stresu oksydacyjnego do każdej próbki o końcowym stężeniu pięciu mikromolów. Przykryj próbki folią aluminiową i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut.
Po zakończeniu inkubacji odwiruj komórki, usuń supernatant i ponownie zawieś granulki komórek w PBS. Umyj komórki trzy razy w ten sposób za pomocą PBS. Po trzecim płukaniu ponownie zawiesić komórki w tej samej objętości PBS.
Upewnij się, że niebarwione komórki są uwzględnione w analizie cytometrii przepływowej. Za pomocą odpowiednich laserów i filtrów wykonaj analizę cytometrii przepływowej w celu wykrycia GFP i sygnału fluorescencyjnego sondy stresu oksydacyjnego. Zacznij od kliknięcia panelu Otwórz nowy arkusz i nadaj eksperymentowi nazwę.
Na pasku narzędzi wybierz narzędzie Wykres punktowy i utwórz wykres ze zmiennymi Boczny obszar punktowy na osi y i Obszar punktowy do przodu w skali liniowej na osi x. Kliknij narzędzie Wykres punktowy i utwórz wykres ze zmiennymi Obszar FITC na osi x i Obszar APC w skali logarytmicznej na osi y. Kliknij ikonę Instrument Setting (Ustawienia instrumentu) i ustaw wszystkie poziomy kompensacji na zero w zakładce Compensation (Kompensacja).
Następnie kliknij zakładkę Akwizycja i wybierz łączną liczbę 20 000 zdarzeń, które mają zostać zarejestrowane przy niskim natężeniu przepływu. Ponieważ fluorescencyjny sygnał emisyjny jednego fluorochromu może być wykryty przez inny detektor, ważne jest, aby przeprowadzić proces kompensacji w celu wyrównania minimalnego sygnału każdego fluorochromu we wszystkich detektorach za pomocą kontroli jednokolorowej. Zmień nazwę probówki 001 na kontrolę ujemną i kliknij kartę Pobierz, aby rozpocząć uruchamianie nieindukowanych, niebarwionych komórek.
Dostosuj napięcie w ustawieniach instrumentu rozproszenia do przodu i z boku, aż populacja zostanie rozłożona w środkowym lewym kwadrancie. Kliknij ikonę wielokąta, aby ustawić region R1 wokół populacji komórek z wyłączeniem szczątków komórek, a następnie użyj tej bramkowanej populacji P1 równa się R1 dla wszystkich fluorescencyjnych wykresów punktowych i reprezentacji histogramu. Aby wyregulować napięcie PMT sygnału fluorescencji, uruchom niebarwione komórki na wykresie punktowym FL1 do FL3, dostrajając wzmocnienie w zakładce Ustawienia instrumentu, aż komórki zostaną rozmieszczone w lewym dolnym kwadrancie.
Korzystając z narzędzia do tworzenia wykresów punktowych, utwórz wykres punktowy ze zmiennymi FITC-A na osi x w porównaniu z FSC-A oraz drugi wykres punktowy ze zmiennymi APC-A na osi x w porównaniu z FSC-A. Następnie zmień próbkę na indukowane komórki, aby zmierzyć fluorescencję GFP. Na karcie Instrument Setting (Ustawienia instrumentu) ustaw wzmocnienie w FSC-A w porównaniu z FITC, gdy populacja jest rozłożona w prawym dolnym kwadrancie.
Zdefiniuj populację komórek GFP-dodatnich za pomocą bramki. Zmień próbkę na nieindukowane wybarwione komórki. Wyświetlanie stresu oksydacyjnego przez fluorescencję na wykresie punktowym FSC-A i APC-A.
Dostosuj wzmocnienie, aż populacja komórek zostanie rozłożona w lewym górnym kwadrancie. Bramka dodatniej populacji komórek w P3. Za pomocą ikony histogramu utwórz dwa wykresy histogramu reprezentujące fluorescencję komórek, jeden dla FITC, a drugi dla fluorescencji APC. Należy utworzyć tabelę przedstawiającą średnią intensywność fluorescencji i medianę fluorescencji wraz z odpowiadającym im błędem standardowym i/lub współczynnikiem wariancji dla poziomów fluorescencji GFP i stresu oksydacyjnego.
Kliknij kartę Wynagrodzenie i ustaw wszystkie poziomy wynagrodzeń na zero. Kliknij zakładkę Akwizycja i wybierz łączną liczbę 20 000 zdarzeń, które mają zostać zarejestrowane. Przygotuj trzy nowe probówki z próbkami i nazwij je nieindukowanymi, indukowanymi rozpuszczalnymi i indukowanymi zagregowanymi.
Pobieraj dane z próbek z wstępnie ustawionymi ustawieniami. Przeanalizuj dane, otwierając nowy arkusz i tworząc wykres punktowy dla zmiennych FITC-A i APC-A, bramkując dodatnie komórki do barwienia CellROX. Dla każdej próbki utwórz tabelę statystyczną ze średnią fluorescencją i błędem standardowym dla kanałów FITC i APC.
Możliwe jest również sortowanie komórek za pomocą sortera FACS po zliczeniu zagregowanych białek. Komórki drożdży wykazujące ekspresję wariantów A-beta-42 po okresie indukcji wynoszącym 16 godzin są wizualizowane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu określenia rozmieszczenia rekombinowanych białek wewnątrz komórek. Obrazy te są reprezentatywne dla wybranych wariantów A-beta-42 GFP.
Powstawanie inkluzji białkowych, czyli PI, potwierdzono w 10 z 20 wariantów z analizowanej kolekcji. Ten wykres słupkowy przedstawia odsetek komórek zawierających różną liczbę PI obliczony na podstawie łącznie 500 komórek fluorescencyjnych dla każdego wariantu w kontrpróbach biologicznych. Zaobserwowano doskonałą zgodność między właściwościami przewidywanymi a właściwościami agregacji in vivo.
Poziomy ekspresji białek w ekstraktach komórkowych określono ilościowo przy użyciu przeciwciała swoistego dla A-beta. Jako ogólny trend, warianty A-beta-42 tworzące PI, zabarwione na zielono, są obecne na niższych poziomach niż te rozproszone w cytozolu, zabarwione na czerwono. Istotne różnice między wariantami A-beta-42 zaobserwowano, gdy ich fluorescencja sondy stresu oksydacyjnego, poziomy białek i właściwości fluorescencji GFP były reprezentowane w odniesieniu do ich zdolności do tworzenia PI i ich wewnętrznych skłonności do agregacji przewidywanych przez algorytm bioinformatyczny AGGRESCAN lub TANGO.
Warianty formujące PI są oznaczone kolorem zielonym, a warianty nietworzące PI są oznaczone kolorem czerwonym. Po tej procedurze można również zastosować inne metody, takie jak barwienie jodkiem propidyny lub aneksyną V, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak określenie wpływu wewnątrzkomórkowego wariantu białka wyrażonego na apoptozę komórek lub cytotoksyczność.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę oceny związku między wewnątrzkomórkową agregacją białek a stresem oksydacyjnym u Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Koncentruje się on na białkach amyloidogennych, w szczególności na peptydzie amyloid-β, oraz ich wpływie na kondycję komórkową.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Błędne zwijanie białek
Wstęp
- Agregacja białek może prowadzić do stresu oksydacyjnego komórek.
- Zrozumienie tej zależności jest kluczowe dla badania chorób neurodegeneracyjnych.
- Metoda ta umożliwia analizę białek zarówno w stanie rozpuszczalnym, jak i zagregowanym.
- Cytometria przepływowa zapewnia ilościowe podejście do oceny stresu oksydacyjnego w dużych populacjach.
Cel badania
- Zbadanie korelacji między amyloidogennymi stanami białek a stresem oksydacyjnym.
- Przedstawienie informacji na temat chorób związanych z błędnym zwijaniem i agregacją białek.
- Opracowanie prostej i efektywnej metody badania tych zjawisk u drożdży oraz w innych organizmach modelowych.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa do monitorowania agregacji białek.
- Wykorzystanie Saccharomyces cerevisiae jako organizmu modelowego.
- Ilościowe określanie uszkodzeń wywołanych stresem oksydacyjnym.
- Analiza wariantów peptydów amyloid-β.
Główne wyniki
- Wykazano wyraźną zależność między agregacją białek a poziomem stresu oksydacyjnego.
- Przedstawiono metodę ilościowego określania uszkodzeń komórkowych w populacjach drożdży.
- Wnioski mają zastosowanie do innych organizmów ekspresyjących białka rekombinowane.
- Wskazano na zalety wykorzystania cytometrii przepływowej w niniejszych badaniach.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu agregacji białek i ich skutków komórkowych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw chorób neurodegeneracyjnych.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć różne organizmy modelowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa ocena stresu oksydacyjnego indukowanego przez agregację białek w drożdżach umożliwia wczesną minimalizację ryzyka w badaniach nad celami terapeutycznymi i mechanizmami chorób neurodegeneracyjnych. Metoda ta dostarcza przewidywalnych informacji na temat komórkowych skutków wariantów białek amyloidogennych, wspierając walidację celów oraz triage mechanistyczny w procesach na etapie odkrywania leków. Jej skalowalność i ilościowe wyniki ułatwiają podejmowanie solidnych decyzji portfelowych w programach dotyczących błędnego fałdowania i agregacji białek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią korelację stanu agregacji białek ze stressem oksydacyjnym komórek w celu mechanistycznego ograniczania ryzyka.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów amyloidogennych poprzez kwantyfikację sygnatur toksyczności in vivo.
- Ułatwia priorytetyzację wariantów białek na podstawie skłonności do agregacji i wpływu na komórki.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia powtarzalną metodę analizy opartą na cytometrii przepływowej do wysokoprzepustowej oceny agregacji białek i fenotypów stresu.
- Dostarcza ilościowe odczyty na poziomie populacyjnym, odpowiednie do przesiewania bibliotek związków lub wariantów genetycznych.
- Umożliwia standaryzację pomiarów stresu oksydacyjnego dla wielu konstruktów białkowych i różnych warunków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia system modelowy pozwalający na powiązanie fenotypów agregacji ze stresem komórkowym, co wspomaga opracowywanie strategii w zakresie biomarkerów translacyjnych.
- Wspiera ciągłość procesów, od odkryć opartych na drożdżach po walidację toksyczności indukowanej przez agregację w modelach wyższego rzędu.
- Jest zgodne z działaniami przedklinicznymi mającymi na celu charakterystykę mechanizmów istotnych dla przebiegu chorób leżących u podstaw neurodegeneracji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejsza metoda wpisuje się w ciąg procesów od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących toksyczności indukowanej agregacją oraz wspierając priorytetyzację wiodących związków na podstawie wyników stresu komórkowego.
- Biologia odkrywcza: Ilościowo określa wpływ agregacji białek na stres oksydacyjny, wyjaśniając mechanistyczne powiązania między właściwościami wariantów a fenotypami komórkowymi.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki agregacji i stresu, wspierając gotowość do analizy oraz powtarzalność testów.
- Analityka: Generuje dane dotyczące średniej i medianowej intensywności fluorescencji w celu przeprowadzenia solidnego porównania statystycznego wariantów białek.
- Badania translacyjne: Oferuje platformę do oceny toksyczności indukowanej agregacją, istotną dla modeli chorób neurodegeneracyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do innych białek rekombinowanych i organizmów modelowych w celu szerokiego zastosowania w badaniach i rozwoju (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu poprzez powiązanie agregacji z fenotypami stresu komórkowego.
- Wartość operacyjna: Dostarcza skalowalnych, powtarzalnych i ilościowych testów służących do standaryzacji międzyprogramowej.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu działań (go/no-go), dostarczając wczesnych dowodów mechanistycznych na ryzyko toksyczności.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowany do ryzyka postęp i selekcję celów związanych z błędnym zwijaniem białek.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie genetyki drożdży, cytometrii przepływowej oraz analityki opartej na fluorescencji.
- Wymaga dostępu do aparatury do cytometrii przepływowej oraz oprogramowania analitycznego do akwizycji danych i wyznaczania bramkowania.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji strategii bramkowania i kompensacji fluorescencji pomiędzy zespołami.
- Można dostosować do innych systemów modelowych wykazujących ekspresję białek rekombinowanych przy zastosowaniu odpowiednich kontroli.
- Zależne od właściwego doboru i walidacji sond do pomiaru stresu oksydacyjnego.
