Name: Ekstrakcja i wizualizacja agregatów białkowych po leczeniu Escherichia coli stresorem proteotoksycznym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji i wizualizacji agregatów białkowych w bakteriach Escherichia coli po leczeniu stresem proteotoksycznym. Protokół ten jest prostszy niż istniejące metody i wymaga mniejszej liczby komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze startowe Illinois State University School of Biological Sciences, Illinois State University New Faculty Initiative Grant oraz grant NIAID R15AI164585 (dla J.-U. D.). G.M.A. był wspierany przez Illinois State University Undergraduate Research Support Program (dla G.M.A.). K. P. H. był wspierany przez stypendium RISE zapewnione przez Niemiecką Centralę Wymiany Akademickiej (DAAD). Autorzy dziękują dr Uwe Landau i dr Carstenowi Meyerowi z Largentech Vertriebs GmbH za dostarczenie proszku AGXX. Rysunki 1, Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4 i Rysunek 5 zostały wygenerowane za pomocą Biorender.

1. Poddawanie szczepów E. coli MG1655 i CFT073 działaniu stresu
<ol>
	<li>Zaszczep 5 mL pożywki LB (lyzogenowej) pojedynczą kolonią komensalnego szczepu E. coli MG1655 oraz uropatogennego szczepu E. coli (UPEC) CFT073 i inkubuj przez 14-16 h (całą noc) w temperaturze 37 °C przy 300 rpm. 
	UWAGA: Escherichia coli CFT073 jest patogenem ludzkim. Praca ze szczepem CFT073 musi być prowadzona z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium z certyfikatem poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).</li>
	<li>Przenieś każdy szczep do kolby o pojemności 500 mL zawierającej 70 mL pożywki z kwasem 3-(N-morfolinoprponiosulfonowym) i glukozą (MOPS-g) (Tabela 1), tak aby uzyskać gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) równą 0,1. Inkubuj w temperaturze 37 °C przy 300 rpm aż do osiągnięcia środkowej fazy logarytmicznej wzrostu (OD600 = 0,5-0,55).</li>
	<li>Przenieś 20 mL każdej kultury do trzech uprzednio ogrzanych kolb o pojemności 125 mL i inkubuj w temperaturze 37 °C przy 300 rpm przez 2 min. 
	UWAGA: Ze względu na konieczność szybkiej obróbki próbek, przetwarzaj nie więcej niż 6 kultur jednocześnie.</li>
	<li>Przygotuj roztwór związku przeciwdrobnoustrojowego w pożywce MOPS-g o stężeniu 2 mg/mL. Dodaj środek przeciwdrobnoustrojowy do każdej kultury, aby osiągnąć wskazane stężenia. W przypadku kontroli nieleczonej dodaj odpowiednią objętość pożywki MOPS-g. 
	UWAGA: Wymieszaj roztwór przeciwdrobnoustrojowy o stężeniu 2 mg/mL na wortexie, aby zapewnić równomierny rozkład cząsteczek związku i uniknąć ich sedymentacji.</li>
	<li>Inkubuj kultury przez 45 min w temperaturze 37 °C przy 300 rpm.</li>
</ol>
<img alt="Schemat stresowania E. coli: hodowla LB, środek przeciwdrobnoustrojowy Ag/Ru, inkubacja w 37°C, 300 rpm, 45 min." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Leczenie stresowe Escherichia coli. Kultury bakteryjne są hodowane w MOPS-g i traktowane wskazanymi stężeniami środka przeciwdrobnoustrojowego zawierającego srebro i ruten po osiągnięciu środkowej fazy logarytmicznej. Skróty: LB = pożywka lysogeny broth; Ag-Ru = srebro-ruten; MOPS-g = kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS)-glukoza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62628/62628fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Pobieranie próbek komórek bakteryjnych
<ol>
	<li>Po 45 min stresu zmierz OD600 każdej hodowli. Dla każdej próbki odwirowuj komórki w ilości odpowiadającej 4 mL przy OD600 = 1 w 15-mililitrowych probówkach do wirowania przez 15 min przy 3,000 × g i 4 °C.</li>
	<li>Całkowicie usuń supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 50 µL lodowatego buforu lizującego (Tabela 1). Inkubuj próbki przez 30 min na lodzie. 
	UWAGA: Ten etap lizy degraduje warstwę peptydoglikanu. Zawsze używaj świeżo przygotowanego buforu lizującego.</li>
	<li>Przenieś próbki do 1,7-mililitrowych probówek do mikrowirowania. Zamroź w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
<img alt="Schemat pobierania próbek bakteryjnych; wirowanie, bufor lizujący, etapy chłodzenia; mikrobiologia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Pobieranie próbek bakteryjnych. Próbki komórek są zbierane poprzez wirowanie i resuspenderowane w buforze lizującym, a następnie przechowywane w temperaturze -80 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62628/62628fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
3. Wyodrębnianie nierozpuszczalnych agregatów białkowych
<ol>
	<li>Odprzemrozić próbki na lodzie. 
	UWAGA: Cykl zamrażania i rozmrażania wspomaga lizę komórek.</li>
	<li>Dodać 360 µL schłodzonego do temperatury 0 °C buforu A (Tabela 1) i delikatnie wymieszać za pomocą pipety. 
	UWAGA: Szok osmotyczny również wspomaga lizę komórek.</li>
	<li>Przenieść próbkę do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL zawierającej ~200 µL szklanych kulek o średnicy 0,5 mm. Inkubować przez 30 min w temperaturze 8 °C w termomikserze przy wytrząsaniu z prędkością 1 400 rpm. 
	UWAGA: Ten krok prowadzi do fizycznej dezintegracji komórek. W celu zminimalizowania degradacji białek można zastosować inhibitor proteaz. Dezintegrację można przeprowadzić w temperaturze 4 °C. Należy pamiętać, że w przypadku drożdży zgłaszano, iż użycie szklanych kulek może indukować agregację niewielkiej grupy białek19.</li>
	<li>Inkubować przez 5 min na lodzie bez wytrząsania, aby szklane kulki osiadły. Przenieść 200 µL lizatu komórkowego do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL. 
	UWAGA: Należy unikać przenoszenia szklanych kulek.</li>
	<li>Wirować przy 16 000 × g i 4 °C przez 20 min. Zebrać supernatant zawierający białka rozpuszczalne i przejść do sekcji 4.</li>
	<li>Resuspender osad w 200 µL schłodzonego do temperatury 0 °C buforu A (Tabela 1) za pomocą pipety. Wirować przy 16 000 × g i 4 °C przez 20 min. Ostrożnie całkowicie usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 200 µL schłodzonego do temperatury 0 °C buforu B (patrz Tabela 1 oraz Tabela materiałów) i ostrożnie resuspender osad za pomocą pipety. 
	UWAGA: Niejonowy detergent solubilizuje białka błonowe.</li>
	<li>Powtórzyć wirowanie przy 16 000 × g i 4 °C przez 20 min. Ostrożnie usunąć supernatant.</li>
	<li>Resuspender osad w 200 µL zimnego buforu A (Tabela 1) za pomocą pipety. Wirować przy 16 000 × g i 4 °C przez 20 min. Całkowicie usunąć supernatant.</li>
	<li>Resuspender osad w 100 µL 1x redukującego buforu do próbek SDS (Tabela 1) i gotować przez 5 min w temperaturze 95 °C w termomikserze.</li>
	<li>Próbkę przechowywać w temperaturze -20 °C w celu późniejszej analizy lub niezwłocznie nałożyć na żel poliakrylamidowy SDS w celu rozdziału.</li>
</ol>
<img alt="Ekstrakcja nierozpuszczalnych agregatów białkowych z wykorzystaniem wirowania, termomiksera i roztworów buforowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Ekstrakcja nierozpuszczalnych agregatów białkowych. Ekstrakcja agregatów białkowych obejmuje szereg etapów, w tym rozbicie komórek, oddzielenie agregatów białkowych od białek rozpuszczalnych, solubilizację białek błonowych oraz płukanie. Skrót: SDS = dodecylsiarczan sodu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62628/62628fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
4. Przygotowanie próbek białek rozpuszczalnych
<ol>
	<li>Wymieszać 1 objętość 100% kwasu trichlorooctowego (TCA) z 4 objętościami rozpuszczalnej próbki białka z kroku 3.6. 
	UWAGA: Praca z TCA wymaga użycia dygestorium, środków ochrony osobistej oraz zatwierdzonej procedury utylizacji odpadów.</li>
	<li>Inkubować przez 10 min w temperaturze 4 °C, aby umożliwić wytrącenie białka. 
	UWAGA: Biały osad pojawi się bardzo szybko.</li>
	<li>Wirować w celu wytrącenia osadu przy 21 000 × g i 4 °C przez 5 min, a następnie usunąć nadsącz. Przemyć osad 200 µL lodowatego acetonu, aby usunąć resztki komórkowe. Wirować przy 21 000 × g i 4 °C przez 5 min i usunąć nadsącz. Powtórzyć czynności z kroku 4.3 łącznie trzy razy.</li>
	<li>Umieścić probówki do mikrocentryfugi z otwartymi pokrywkami w termomikserze w temperaturze 37 °C, aby usunąć pozostały aceton z osadu. 
	UWAGA: Inkubacja trwająca ponad 5 min może zmniejszyć rozpuszczalność osadu białkowego.</li>
	<li>Dodać 100 µL 1x redukującego buforu SDS (Tabela 1) i całkowicie rozpuścić osad. Gotować próbkę przez 5 min w temperaturze 95 °C.</li>
	<li>Próbkę przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania lub niezwłocznie nanieść na żel poliakrylamidowy SDS w celu rozdziału.</li>
</ol>
<img alt="Przygotowanie białek rozpuszczalnych; etapy wirowania i mieszania termicznego; schemat ekstrakcji białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przygotowanie białek rozpuszczalnych. Przygotowanie białek rozpuszczalnych obejmuje etap wytrącania kwasem trichlorooctowym oraz wielokrotne przemywanie lodowatym acetonem. Skróty: TCA = kwas trichlorooctowy; SDS = dodecylosiarczan sodu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62628/62628fig04large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
5. Rozdział i wizualizacja wyekstrahowanych agregatów białkowych za pomocą SDS-PAGE
<ol>
	<li>Przygotuj 12% żel SDS-poliakrylamidowy.
	<ol>
		<li>W przypadku dwóch żeli rozdzielczych, do probówki wirówki o pojemności 15 mL odmierz pipetą 5,1 mL wody podwójnie destylowanej (ddH2O), 3,75 mL Tris-HCl (pH 8.8), 7,5 mL 20% (w/v) SDS, 6 mL 30% roztworu akrylamidu/bisakrylamidu (29:1), 75 mL 10% w/v nadsiarczanu amonu oraz 10 mL tetrametyloetylenediamine (TEMED), a następnie delikatnie wymieszaj, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Wlej żel za pomocą pipety 1 mL pomiędzy szklane płytki, pozostawiając wolne górne 2 cm. Na powierzchnię żelu rozdzielczego dodaj 70% etanol i dopasuj równą granicę między obiema warstwami.</li>
		<li>Po polimeryzacji żelu rozdzielczego przygotuj żel koncentrujący, odmierzając pipetą 1,535 mL ddH2O, 625 mL Tris-HCl (pH 6.8), 12,5 mL 20% (w/v) SDS, 335 mL 30% roztworu akrylamidu/bisakrylamidu (29:1), 12,5 mL 10% w/v nadsiarczanu amonu oraz 2,5 mL TEMED. Usuń etanol z żeli rozdzielczych i dodaj roztwór żelu koncentrującego. Włóż grzebień z odpowiednią liczbą zagłębień, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Pozostaw do polimeryzacji na 20-30 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nanieś 4 µL każdej próbki oraz marker białek do oddzielnych zagłębień i prowadź elektroforezę w buforze do prowadzenia Tris-Glycine (Tabela 1) przy napięciu 144 V przez 45 min w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Przerwij elektroforezę, gdy prążek błękitu bromofenolowego będzie bliski wyjścia z żelu.</li>
	<li>Barw żel(e) w podgrzanym wcześniej roztworze Fairbanks A (Tabela 1) przez 30 min na wytrząsarce.</li>
	<li>Odbarwiaj żel(e) w podgrzanym wcześniej roztworze Fairbanks D (Tabela 1) na wytrząsarce aż do uzyskania pożądanego tła (np. przez całą noc).</li>
</ol>
<img alt="Proces rozdziału białek; schemat elektroforezy żelowej w poliakrylamidzie; wynik barwienia Coomassie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Rozdział i wizualizacja białek. Próbki zostały rozdzielone metodą SDS-PAGE i zwizualizowane za pomocą barwienia Coomassie. Skrót: SDS-PAGE = elektroforeza żelowa w poliakrylamidzie z użyciem dodecylosiarczanu sodu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62628/62628fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Dahl, J. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li>
<li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+activation+by+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li>
<li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964(2020).</li>
<li>Dahl, J. -U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li>
<li>Groitl, B., Dahl, J. -U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li>
<li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577(2016).</li>
<li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response%3A+life+on+the+verge+of+death%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li>
<li>Van Loi, V., Busche, T., Preuß, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AGXX+%C2%AE+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The AGXX ® antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037(2018).</li>
<li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li>
<li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li>
<li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li>
<li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li>
<li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tamás, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554(2016).</li>
<li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins%3A+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li>
<li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516(2014).</li>
<li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Thüring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148(2017).</li>
<li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li>
<li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-Föhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li>
<li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li>
<li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li>
<li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress%3A+Lessons+from+a+model+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li>
<li>Mühlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li>
<li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li>
<li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP60%2F10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs%2C+natural+products%2C+and+known+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li>
<li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodologię analizy tworzenia agregatów białkowych po potraktowaniu różnych szczepów E. coli proteotoksycznym środkiem przeciwdrobnoustrojowym. Protokół pozwala na jednoczesną ekstrakcję nierozpuszczalnych i rozpuszczalnych frakcji białkowych z leczonych i nietraktowanych komórek E. coli. W porównaniu z istniejącymi protokołami izolacji agregatów białkowych z komórek 14,15,16,20, metoda ta ma kilka zalet: (i) potrzebne są tylko małe objętości hodowli (4-8 ml...

Bakterie są nieuchronnie narażone na niezliczone stresy środowiskowe, w tym niskie pH (np. w żołądku ssaków)1,2, reaktywne formy tlenu i chloru (ROS/RCS) (np. podczas wybuchu oksydacyjnego w fagocytach)3,4,5, podwyższone temperatury (np. w gorących źródłach lub podczas szoku cieplnego)6,7, oraz kilka silnych środków przeciwdrobnoustrojowych (np. AGXX używany w tym protokole)8. Białka są szczególnie podatne na którykolwiek z tych stresorów, a ekspozycja może wywołać nieprawidłowe fałdowanie białek, które następnie zasiewa agregację. Wszystkie organizmy wykorzystują systemy ochronne, które pozwalają im radzić sobie z nieprawidłowym fałdowaniem białek9. Jednak silny stres może przytłoczyć maszynerię kontroli jakości białek i zakłócić drugorzędową i/lub trzeciorzędową strukturę białek, co ostatecznie dezaktywuje białka. W konsekwencji agregaty białkowe mogą poważnie upośledzać krytyczne funkcje komórkowe niezbędne do wzrostu i przetrwania bakterii, odporności na stres i zjadliwości10. Dlatego badania koncentrujące się na agregacji białek i jej konsekwencjach u bakterii są istotnym tematem ze względu na ich potencjalny wpływ na kontrolę chorób zakaźnych.
Rozwijanie i agregacja białek wywołane ciepłem są często odwracalne7. W przeciwieństwie do tego, inne stresy proteotoksyczne, takie jak stres oksydacyjny, mogą powodować nieodwracalne modyfikacje białek poprzez utlenianie określonych łańcuchów bocznych aminokwasów, co skutkuje nieprawidłowym fałdowaniem białka i ostatecznie agregacją białek4. Indukowane stresem tworzenie nierozpuszczalnych agregatów białkowych zostało szeroko zbadane w kontekście molekularnych białek opiekuńczych i ich funkcji ochronnych u drożdży i bakterii11,12,13. Opublikowano kilka protokołów, które wykorzystują różne techniki biochemiczne do izolacji i analizy nierozpuszczalnych agregatów białkowych14,15,16,17. Istniejące protokoły były wykorzystywane głównie do badania agregacji białek bakteryjnych po szoku cieplnym i/lub identyfikacji molekularnych białek opiekuńczych. Chociaż protokoły te z pewnością stanowiły postęp w tej dziedzinie, istnieją pewne poważne niedogodności w procedurach eksperymentalnych, ponieważ wymagają one (i) dużej objętości hodowli bakteryjnej do 10 L14,17, (ii) skomplikowane procesy fizycznego zakłócania pracy, w tym stosowanie substancji zakłócających funkcjonowanie komórek, prasy francuskiej i/lub sonikacji14,15,17, lub (iii) czasochłonne, powtarzające się etapy mycia i inkubacji15,16,17.
Ten artykuł opisuje zmodyfikowany protokół, który ma na celu rozwiązanie ograniczeń poprzednich podejść i pozwala na analizę ilości agregatów białkowych powstałych w dwóch różnych szczepach Escherichia coli po leczeniu proteotoksyczną powłoką przeciwbakteryjną. Powłoka składa się z metalu i srebra (Ag) i rutenu (Ru) kondycjonowanych kwasem askorbinowym, a jej aktywność przeciwdrobnoustrojową uzyskuje się poprzez wytwarzanie reaktywnych form tlenu8,18. Niniejszy dokument zawiera szczegółowy opis przygotowania kultury bakteryjnej po zastosowaniu związku przeciwdrobnoustrojowego oraz porównanie stanu agregacji białek po ekspozycji dwóch szczepów E. coli o różnych profilach podatności na rosnące stężenie środka przeciwdrobnoustrojowego. Opisana metoda jest niedroga, szybka i powtarzalna i może być stosowana do badania agregacji białek w obecności innych związków proteotoksycznych. Ponadto protokół może być modyfikowany w celu analizy wpływu, jaki delecje określonych genów mają na agregację białek u wielu różnych bakterii.

<table><tbody><tr><td>Chemikalia/odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>30% roztwór akrylamidu/bisakryloamidu 29:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu</td><td>Millipore Sigma</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza benzonazowa</td><td>Sigma</td><td>E1014-5KU</td><td></td></tr><tr><td>Bluestain 2 Drabinka białkowa, 5-245 kDa</td><td>GoldBio</td><td>P008-500</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol niebieski</td><td>GoldBio</td><td>B-092-25</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>821616</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-Sacharoza</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBT9686</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>ARK2183-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol, 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>GoldBio</td><td>G-630-1</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny, odczynnik ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol (2-Propanol)</td><td>Sigma</td><td>402893-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion (Miller)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3522-1KG</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion z agarem (Miller)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L2897-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>GoldBio</td><td>L-040-25</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor MOPS</td><td>Teknova</td><td>M2101</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>Thomas Scientific</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu, jednozasadowy</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Millipore Sigma</td><td>T9281-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625-100G 100%</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trichlorooctowy</td><td>Millipore Sigma</td><td>T6399-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>GoldBio</td><td>T-400-1</td><td></td></tr><tr><td>Materiał/Wyposażenie</mocne></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe (15 ml)</td><td>Alkali Scientific</td><td>JABG-1019</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera (125 ml)</td><td>Carolina</td><td>726686</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera (500 ml)</td><td>Carolina</td><td>726694</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka: -80 &deg; C</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koraliki szklane (0,5 mm)</td><td>BioSpec Products</td><td>1107-9105</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td>Hermle</td><td>Z216MK</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (1,7 ml)</td><td>VWR International</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek (2,0 ml)</td><td>Axygen Maxiclear Microtubes</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety plastikowe</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-377-012</td><td></td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EC105</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Alkali Scientific</td><td>RS7235</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem (37 &deg; C)</td><td>Benchmark Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mała szklana płytka</td><td>Bio-Rad</td><td>1653311</td><td></td></tr><tr><td>Płytki dystansowe (1 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Thermoscientific</td><td>3339053</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa do probówek wirówkowych 15 ml</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pionowa komora do elektroforezy żelowej</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>1658004</tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td></td></tr><tr><td>10-studzienkowy grzebień</td><td>Bio-Rad</td><td>1653359</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja i wizualizacja agregatów białkowych po leczeniu escherichia coli stresorem proteotoksycznym

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

Narażenie organizmów żywych na stresy środowiskowe i komórkowe często powoduje zakłócenia homeostazy białek i może prowadzić do agregacji białek. Nagromadzenie agregatów białkowych w komórkach bakteryjnych może prowadzić do znaczących zmian w zachowaniu fenotypowym komórek, w tym do zmniejszenia tempa wzrostu, odporności na stres i zjadliwości. Istnieje kilka procedur eksperymentalnych do badania tych fenotypów, w których pośredniczą czynniki stresogenne. W tym artykule opisano zoptymalizowany test do ekstrakcji i wizualizacji zagregowanych i rozpuszczalnych białek z różnych szczepów Escherichia coli po potraktowaniu środkiem przeciwdrobnoustrojowym zawierającym srebro i ruten. Wiadomo, że związek ten wytwarza reaktywne formy tlenu i powoduje powszechną agregację białek. 
Metoda łączy oparte na wirowaniu rozdzielanie agregatów białkowych i rozpuszczalnych białek z komórek traktowanych i nietraktowanych z późniejszym rozdzielaniem i wizualizacją za pomocą elektroforezy w żelu dodecylowo-poliakrylamidowym siarczanu sodu (SDS-PAGE) i barwienia Coomassie. Podejście to jest proste, szybkie i pozwala na jakościowe porównanie tworzenia agregatów białkowych w różnych szczepach E. coli. Metodologia ta ma szeroki zakres zastosowań, w tym możliwość badania wpływu innych proteotoksycznych środków przeciwdrobnoustrojowych na agregację białek in vivo w szerokim zakresie bakterii. Co więcej, protokół może być wykorzystany do identyfikacji genów, które przyczyniają się do zwiększonej odporności na substancje proteotoksyczne. Opaski żelowe mogą być wykorzystywane do późniejszej identyfikacji białek, które są szczególnie podatne na agregację.

<img alt="Rozdział białek metodą SDS-PAGE, frakcje nierozpuszczalne i rozpuszczalne, MG1655, CFT073, marker kDa, schemat elektroforezy żelowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6: Reprezentatywne wyniki agregacji białek indukowanej przez środek przeciwdrobnoustrojowy w komensalnym szczepie Escherichia coli MG1655 oraz szczepie UPEC CFT073. ...

Ten protokół opisuje ekstrakcję i wizualizację zagregowanych i rozpuszczalnych białek z Escherichia coli po leczeniu proteotoksycznym środkiem przeciwbakteryjnym. Postępowanie zgodnie z tą procedurą pozwala na jakościowe porównanie tworzenia agregatów białkowych in vivo w różnych szczepach bakteryjnych i/lub między zabiegami.

Ekstrakcja i wizualizacja agregatów białkowych po leczeniu Escherichia coli stresorem proteotoksycznym

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

Narażenie na stres może powodować agregację białek i powodować znaczące zmiany w fenotypowym zachowaniu bakterii. Procedura opisana w tym filmie pozwala na ekstrakcję i wizualizację agregatów białkowych po leczeniu stresu. W przeciwieństwie do innych opublikowanych procedur, ten protokół wymaga mniejszej liczby komórek i powstrzymania się od skomplikowanych procesów fizycznego zakłócania, a także czasochłonnych etapów mycia i inkubacji.Protokół ten może być stosowany do badania agregacji białek w szerokiej gamie bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich. Można również przeanalizować wpływ delecji genów lub porównać skuteczność związków proteotoksycznych. Zacznij od zaszczepienia pojedynczej kolonii szczepu E. coli MG1655 i uropatogennego szczepu E. coli CFT073, każdy w pięciu mililitrach bulionu lizogenicznego lub LB, podłoża.Inkubować dwie kultury bulionu w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 300 obr./min przez 14 do 16 godzin. Rozcieńczyć każdy szczep do gęstości optycznej 600 nanometrów lub OD600 0,1 w 500-mililitrowej kolbie zawierającej 70 mililitrów pożywki MOPS-g. Inkubować kolby w temperaturze 37 stopni i prędkości obrotowej 300 obr./min, aż do osiągnięcia fazy środkowej logarytmu.Po inkubacji przenieś 20 mililitrów każdej kultury do trzech wstępnie podgrzanych kolb o pojemności 125 mililitrów i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 300 obr./min przez dwie minuty. Przygotować roztwór związku przeciwdrobnoustrojowego o stężeniu dwóch miligramów na mililitr w pożywce MOPS-g. Dodaj ten roztwór do każdej kultury, aby osiągnąć pożądane stężenia, i dodaj wymaganą objętość pożywki MOPS-g dla nieleczonej kontroli.Określ OD600 w każdej kulturze po 45 minutach leczenia stresu. Dla każdej próbki podwielokrotność czterech mililitrów kultury z OD600 wynoszącym jeden do 15-mililitrowych probówek wirówkowych. Ponownie zawiesić granulki komórek w 50 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy.Próbki należy inkubować przez 30 minut na lodzie. Dodać 360 mikrolitrów lodowatego buforu A do próbek i delikatnie wymieszać pipetując. Przenieś próbki do dwumililitrowych probówek wirówkowych z około 200 mikrolitrami szklanych kulek o średnicy 0,5 milimetra.Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza w mieszalniku ThermoMixer z wytrząsaniem z prędkością 1400 obr./min. Inkubuj probówki na lodzie przez pięć minut bez potrząsania, aby osadzić szklane kulki. Następnie przenieś 200 mikrolitrów lizatu komórkowego do 1,7-mililitrowych probówek wirówek.Odwiruj lizat komórkowy przez 20 minut w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Zebrać supernatant, który zostanie później wykorzystany jako próbka białka rozpuszczalnego. Za pomocą pipety ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego buforu A. Odwirować probówki w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.Następnie ostrożnie usuń supernatant w całości. Za pomocą pipety ostrożnie ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego buforu B. Ponownie odwirować probówki i ostrożnie usunąć supernatant. Następnie powtórzyć mycie buforem A. Zawiesić osad w 100 mikrolitrach 1x redukującego buforu do próbek SDS i gotować przez pięć minut w ThermoMixerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza.Wymieszaj jedną objętość 100% TCA z czterema objętościami próbki rozpuszczalnego białka pobranej wcześniej i inkubuj przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu wytrącenia białka. Odwirować próbkę w temperaturze 21 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, aby uzyskać osad i usunąć supernatant. Użyj 200 mikrolitrów lodowatego acetonu do umycia granulki, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.Ponownie odwirować próbkę w celu uzyskania osadu i usunąć supernatant. Aby usunąć pozostały aceton z granulek, trzymaj probówki mikrowirówek w ThermoMixerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z otwartymi pokrywkami. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 1x redukującego buforu SDS, aby całkowicie rozpuścić osad i gotuj próbkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.Natychmiast załaduj próbkę do żelu poliakryloamidowego SDS w celu separacji lub przechowuj próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby kontynuować później. Przygotować dwa żele separujące zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Wlej żel między szklane płytki za pomocą jednomililitrowej pipety, upewniając się, że górne dwa centymetry są wolne od mieszaniny.Dodaj 70% etanolu na wierzch żelu separującego, tworząc równomierne połączenie między dwiema warstwami. Po polimeryzacji żeli separujących należy je przygotować, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w rękopisie tekstowym. Następnie usuń etanol z żeli separujących i dodaj roztwór żelu do układania w stosy.Ostrożnie włóż grzebień z żądaną liczbą kieszeni bez wprowadzania pęcherzyków powietrza i pozwól żelowi polimeryzować przez 20 do 30 minut. Załaduj cztery mikrolitry każdej próbki, a także drabinkę białkową, do oddzielnych studzienek. Następnie uruchom żel w buforze tris-glicynowym o napięciu 144 woltów przez 45 minut w temperaturze pokojowej.Użyj wstępnie podgrzanego roztworu Fairbanks A, aby zabarwić żele na bujaku przez 30 minut i wstępnie podgrzanego roztworu Fairbanks D, aby odbarwić żele na bujaku, aż do uzyskania pożądanego tła. Zaobserwowano wzrost ilości agregatu białkowego utworzonego, gdy komórki traktowano 175 mikrogramami na mililitr i 200 mikrogramami na mililitr środka przeciwdrobnoustrojowego, w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Wzrost nierozpuszczalnej frakcji białkowej był bardziej wyraźny w bardziej wrażliwym szczepie MG1655.Zaobserwowano zmniejszenie ilości rozpuszczalnych białek, gdy komórki potraktowano 175 mikrogramami na mililitr i 200 mikrogramami na mililitr środka przeciwdrobnoustrojowego, w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że normalizacja do gęstości optycznej przy 600 nanometrach jest ważna dla porównania zakresu agregacji białek w próbkach.

extraction-visualization-protein-aggregates-after-treatment

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Oczyszczanie powinowactwa oznaczonych białek w połączeniu ze spektrometrią mas (APMS) to potężna metoda systematycznego mapowania sieci interakcji białek i badania mechanistycznych podstaw procesów biologicznych. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowaną procedurę APMS opartą na powinowactwie do peptydów sekwencyjnych (SPA) opracowaną dla bakterii Escherichia coli, która może być stosowana do izolowania i charakteryzowania stabilnych kompleksów wielobiałkowych do niemal jednorodności, nawet...

Identyfikacja kompleksów białkowych w Escherichia coli za pomocą sekwencyjnego oczyszczania powinowactwa peptydów w połączeniu z tandemową spektrometrią mas

Opisano metodę wielkoskalowego oczyszczania wewnątrzkomórkowej domeny białka APP (AICD). Opisano również metodologię indukcji agregacji AICD in vitro oraz jej wizualizację za pomocą mikroskopii sił atomowych. Przedstawione metody są przydatne do biochemicznej i strukturalnej charakterystyki AICD oraz badania wpływu chaperonów molekularnych na jej agregację.

Oczyszczanie i agregacja domeny wewnątrzkomórkowej białka prekursorowego amyloidu

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

W tym filmie demonstrujemy komórkowy test agregacji białek za pomocą inhibitorów proteasomów, które blokują aktywność proteasomu, zapobiegając nieprawidłowo sfałdowanym, zmutowanym białkom, połączonym z fluorescencyjnym znacznikiem, przed degradacją proteasomalną zależną od ubikwityny, prowadzącą do ich akumulacji w cytoplazmie komórki. Agregaty białkowe są następnie wizualizowane i oznaczane ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test tworzenia agregatów białkowych: metoda wykrywania i ilościowego określania agregacji białek w hodowanych komórkach po indukcji przez inhibitor proteasomu

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Społeczny ameba Dictyostelium discoideum został niedawno założony jako system do badania nieprawidłowego fałdowania białek i proteostazy. W tym miejscu opisujemy nową metodologię opartą na obrazowaniu do badania agregacji białek wywołanej temperaturą i odpowiedzi na stres komórkowy u D. discoideum.

Badanie systemu kontroli jakości białek D. discoideum przy użyciu obrazowania żywych komórek w kontrolowanej temperaturze

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Agregacja białek wywołuje komórkowy stres oksydacyjny. Protokół ten opisuje metodę monitorowania stanów wewnątrzkomórkowych białek amyloidogennych i związanego z nimi stresu oksydacyjnego za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to służy do badania zachowania rozpuszczalnych i podatnych na agregację wariantów peptydu β amyloidu.

Ocena wpływu agregacji białek na komórkowy stres oksydacyjny u drożdży

Ten protokół demonstruje aktywność białka szoku cieplnego 70 (Hsp70). Komórki E. coli dnaK756 służą jako model dla testu, ponieważ zawierają natywny, funkcjonalnie upośledzony Hsp70, co czyni je podatnymi na stres cieplny. Heterologiczne wprowadzenie funkcjonalnego Hsp70 ratuje niedobór wzrostu komórek.

Test komplementacji oparty na Escherichia coli w celu zbadania funkcji białka szoku cieplnego 70

Protokół ten opisuje szybką, powtarzalną metodę ekstrakcji i wytrącania opartą na rozpuszczalnikach organicznych do oczyszczania polipeptydu podobnego do elastyny (ELP) z Escherichia coli, oferując potencjalnie skalowalną alternatywę dla konwencjonalnych metod oczyszczania ELP.

Efektywne oczyszczanie polipeptydów podobnych do elastyny (ELP) z E. coli przy użyciu metody ekstrakcji i wytrącenia opartej na rozpuszczalnikach organicznych

Poznaj metodę ekstrakcji i wizualizacji agregatów białkowych w bakteriach Escherichia coli po leczeniu stresem proteotoksycznym. Protokół ten jest prostszy niż istniejące metody i wymaga mniejszej liczby komórek.

Ekstrakcja i wizualizacja agregatów białkowych po leczeniu Escherichia coli stresorem proteotoksycznym

Przeglądaj więcej filmów