Ekstrakcja i wizualizacja agregatów białkowych po leczeniu Escherichia coli stresorem proteotoksycznym

Narażenie na stres może powodować agregację białek i powodować znaczące zmiany w fenotypowym zachowaniu bakterii. Procedura opisana w tym filmie pozwala na ekstrakcję i wizualizację agregatów białkowych po leczeniu stresu. W przeciwieństwie do innych opublikowanych procedur, ten protokół wymaga mniejszej liczby komórek i powstrzymania się od skomplikowanych procesów fizycznego zakłócania, a także czasochłonnych etapów mycia i inkubacji.

Protokół ten może być stosowany do badania agregacji białek w szerokiej gamie bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich. Można również przeanalizować wpływ delecji genów lub porównać skuteczność związków proteotoksycznych. Zacznij od zaszczepienia pojedynczej kolonii szczepu E. coli MG1655 i uropatogennego szczepu E. coli CFT073, każdy w pięciu mililitrach bulionu lizogenicznego lub LB, podłoża.

Inkubować dwie kultury bulionu w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 300 obr./min przez 14 do 16 godzin. Rozcieńczyć każdy szczep do gęstości optycznej 600 nanometrów lub OD600 0,1 w 500-mililitrowej kolbie zawierającej 70 mililitrów pożywki MOPS-g. Inkubować kolby w temperaturze 37 stopni i prędkości obrotowej 300 obr./min, aż do osiągnięcia fazy środkowej logarytmu.

Po inkubacji przenieś 20 mililitrów każdej kultury do trzech wstępnie podgrzanych kolb o pojemności 125 mililitrów i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 300 obr./min przez dwie minuty. Przygotować roztwór związku przeciwdrobnoustrojowego o stężeniu dwóch miligramów na mililitr w pożywce MOPS-g. Dodaj ten roztwór do każdej kultury, aby osiągnąć pożądane stężenia, i dodaj wymaganą objętość pożywki MOPS-g dla nieleczonej kontroli.

Określ OD600 w każdej kulturze po 45 minutach leczenia stresu. Dla każdej próbki podwielokrotność czterech mililitrów kultury z OD600 wynoszącym jeden do 15-mililitrowych probówek wirówkowych. Ponownie zawiesić granulki komórek w 50 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy.

Próbki należy inkubować przez 30 minut na lodzie. Dodać 360 mikrolitrów lodowatego buforu A do próbek i delikatnie wymieszać pipetując. Przenieś próbki do dwumililitrowych probówek wirówkowych z około 200 mikrolitrami szklanych kulek o średnicy 0,5 milimetra.

Inkubować probówki przez 30 minut w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza w mieszalniku ThermoMixer z wytrząsaniem z prędkością 1400 obr./min. Inkubuj probówki na lodzie przez pięć minut bez potrząsania, aby osadzić szklane kulki. Następnie przenieś 200 mikrolitrów lizatu komórkowego do 1,7-mililitrowych probówek wirówek.

Odwiruj lizat komórkowy przez 20 minut w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Zebrać supernatant, który zostanie później wykorzystany jako próbka białka rozpuszczalnego. Za pomocą pipety ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego buforu A. Odwirować probówki w temperaturze 16 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 20 minut.

Następnie ostrożnie usuń supernatant w całości. Za pomocą pipety ostrożnie ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego buforu B. Ponownie odwirować probówki i ostrożnie usunąć supernatant. Następnie powtórzyć mycie buforem A. Zawiesić osad w 100 mikrolitrach 1x redukującego buforu do próbek SDS i gotować przez pięć minut w ThermoMixerze w temperaturze 95 stopni Celsjusza.

Wymieszaj jedną objętość 100% TCA z czterema objętościami próbki rozpuszczalnego białka pobranej wcześniej i inkubuj przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w celu wytrącenia białka. Odwirować próbkę w temperaturze 21 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut, aby uzyskać osad i usunąć supernatant. Użyj 200 mikrolitrów lodowatego acetonu do umycia granulki, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.

Ponownie odwirować próbkę w celu uzyskania osadu i usunąć supernatant. Aby usunąć pozostały aceton z granulek, trzymaj probówki mikrowirówek w ThermoMixerze w temperaturze 37 stopni Celsjusza z otwartymi pokrywkami. Następnie dodaj 100 mikrolitrów 1x redukującego buforu SDS, aby całkowicie rozpuścić osad i gotuj próbkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Natychmiast załaduj próbkę do żelu poliakryloamidowego SDS w celu separacji lub przechowuj próbkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby kontynuować później. Przygotować dwa żele separujące zgodnie z opisem w rękopisie tekstu. Wlej żel między szklane płytki za pomocą jednomililitrowej pipety, upewniając się, że górne dwa centymetry są wolne od mieszaniny.

Dodaj 70% etanolu na wierzch żelu separującego, tworząc równomierne połączenie między dwiema warstwami. Po polimeryzacji żeli separujących należy je przygotować, postępując zgodnie z instrukcjami zawartymi w rękopisie tekstowym. Następnie usuń etanol z żeli separujących i dodaj roztwór żelu do układania w stosy.

Ostrożnie włóż grzebień z żądaną liczbą kieszeni bez wprowadzania pęcherzyków powietrza i pozwól żelowi polimeryzować przez 20 do 30 minut. Załaduj cztery mikrolitry każdej próbki, a także drabinkę białkową, do oddzielnych studzienek. Następnie uruchom żel w buforze tris-glicynowym o napięciu 144 woltów przez 45 minut w temperaturze pokojowej.

Użyj wstępnie podgrzanego roztworu Fairbanks A, aby zabarwić żele na bujaku przez 30 minut i wstępnie podgrzanego roztworu Fairbanks D, aby odbarwić żele na bujaku, aż do uzyskania pożądanego tła. Zaobserwowano wzrost ilości agregatu białkowego utworzonego, gdy komórki traktowano 175 mikrogramami na mililitr i 200 mikrogramami na mililitr środka przeciwdrobnoustrojowego, w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Wzrost nierozpuszczalnej frakcji białkowej był bardziej wyraźny w bardziej wrażliwym szczepie MG1655.

Zaobserwowano zmniejszenie ilości rozpuszczalnych białek, gdy komórki potraktowano 175 mikrogramami na mililitr i 200 mikrogramami na mililitr środka przeciwdrobnoustrojowego, w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że normalizacja do gęstości optycznej przy 600 nanometrach jest ważna dla porównania zakresu agregacji białek w próbkach.