Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Jest to prosta metoda monitorowania fenotypów komórkowych i cech jąder R-pass. Często można go również odzyskać w badaniach całego genomu, aby znaleźć czynniki genetyczne wpływające na stabilność jąder R-pass. Ponieważ jest to dobrze ugruntowany organizm motoryczny, technika ta jest łatwa i nie wymaga dużo czasu i wysiłku w porównaniu z wykorzystaniem ludzkich linii komórkowych lub modeli zwierzęcych.

Agregacja jąder R-pass jest ściśle związana z chorobą Parkinsona. Białka lub substancje chemiczne, które prawdopodobnie wpływają na stabilność jąder R-pass, można przetestować w tym humanizowanym modelu drożdży. Na początek nałóż trzy pojedyncze kolonie na płytkę agarową SD-URA w celu selekcji komórek zawierających plazmidy alfa-synukleiny.

Następnie zaszczepić trójłatowe transformanty drożdżowe na szczep w 3 mililitrach SRD-URA w celu selektywnego wzrostu drożdży zawierających plazmidy z 2% rafinozą w celu zahamowania indukcji alfa-synukleiny pod promotorem Gal1 i 0,1% glukozy. Inkubować zaszczepioną kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem z prędkością 200 obrotów na minutę. Następnego dnia zaszczepij komórki hodowane przez noc w 3 mililitrach świeżego SRD-URA, aż osiągną gęstość optyczną 0,2 przy 600 nanometrach.

Następnie inkubuj kulturę przez sześć godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem z prędkością 200 obrotów na minutę. Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Następnie rozcieńczyć próbki do gęstości optycznej 0,5 przy 600 nanometrach sterylną wodą destylowaną na torze 1 96-dołkowej płytki, aby wyrównać liczbę komórek w każdej kulturze.

Wykonaj 5-krotne seryjne rozcieńczenia komórek drożdży, dodając 160 mikrolitrów sterylnej wody destylowanej do następnych pięciu pasów i zapewnij całkowitą objętość 40 mikrolitrów podczas seryjnego rozcieńczania komórek na każdym pasie. Użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 10 mikrolitrów z każdej studzienki, aby wykryć próbki na płytkach agarowych SD-URA do kontroli i płytkach agarowych SG-URA do monitorowania toksyczności. Inkubuj nakrapiane płytki do góry nogami w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez cztery dni.

Rób zdjęcia płytek co 24 godziny do czwartego dnia, a następnie analizuj dane, porównując różnice we wzroście między szczepami zauważonymi gołym okiem. Zaszczepić trzy połatane transformanty drożdżowe na szczep w trzech mililitrach SRD-URA i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem z prędkością 200 obrotów na minutę przez noc. Następnego dnia zmierz gęstość optyczną komórek hodowanych przez noc w odległości 600 nanometrów i zaszczep komórki w sumie 200 mikrolitrów świeżych SD-URA i SG-URA na 96-dołkowych płytkach.

Dostosuj końcową objętość, w tym komórki, do 200 mikrolitrów i dostosuj początkową gęstość optyczną komórki do 0,05 przy 600 nanometrach. Dostosuj ustawienia programu w płytce do mikromiareczkowania. Ustaw temperaturę docelową na 30 stopni Celsjusza, czas interwału na 15 minut, czas wytrząsania na 890 sekund, amplitudę wytrząsania na 5 milimetrów, a pomiar jako absorbancję na 600 nanometrów.

Inkubuj płytkę przez 2-3 dni, aby wszystkie szczepy osiągnęły fazę stacjonarną w czytniku mikropłytek. Przeanalizuj dane, wykreślając krzywą wzrostu. Zaszczepić połatane transformanty drożdżowe w 3 mililitrach SRD-URA i hodować je przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem przy 200 obrotach na minutę.

Następnego dnia ponownie zaszczepij komórki hodowane przez noc w 3 mililitrach świeżego SRD-URA do gęstości optycznej 0,003 przy 600 nanometrach, a następnie inkubuj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem z prędkością 200 obrotów na minutę, aż gęstość optyczna osiągnie 0,2. Następnie dodaj 300 mikrolitrów 20% galaktozy, a następnie inkubuj przez kolejne 6 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem z prędkością 200 obrotów na minutę. Zebrać jeden mililitr kultury komórkowej przez odwirowanie przy 800 g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.

Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 30 mikrolitrach wody destylowanej. Przygotuj podkładkę z żelu agarozowego na szklanym szkiełku. Ponownie zawiesić komórki i załadować pięć mikrolitrów zawiesiny komórek na szkiełko podstawowe i przykryć komórki za pomocą pociętej podkładki agarozowej do badania.

Aby wykonać obrazowanie mikroskopowe za pomocą obiektywu 100x, użyj opcji przechwytywania ekranu do generowania obrazów za pomocą programu i wybierz jasne pole, aby ustawić ostrość komórki za pomocą obiektywu 100x za pomocą olejku immersyjnego. Przełącz się na filtr fluorescencyjny GFP i dostosuj czas ekspozycji obrazu w zakresie od 50 milisekund do 300 milisekund, aby uzyskać wyraźny obraz poprzez zrównoważenie stosunku sygnału do szumu. Otwórz plik obrazu i przeanalizuj dane, zliczając komórki na podstawie liczby ognisk w komórkach za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Ekspresja synukleiny pod promotorem Gal1 w wektorze PRS426 wykazała znaczne opóźnienie wzrostu na płytce agarowej zawierającej galaktozę jako induktor. Różnicę we wzroście przez ekspresję synukleiny zaobserwowano również w kulturach płynnych. W obu warunkach hodowli synukleina typu dzikiego i warianty z mutacjami E46K lub A53T wykazywały defekty wzrostu spowodowane toksycznością synukleiny.

Jednak wariant synukleiny A30p, który nie tworzy agregatów, wykazał nietoksyczny fenotyp. Szczepy wykazujące ciężką cytotoksyczność wykazywały ogniska agregatów synukleiny, ale w wariancie A30p mniej toksyczna forma synukleiny była dyfundowana po komórkach. Aby osiągnąć powtarzalne wyniki, ważne jest, aby używać komórki na tym samym etapie wzrostu w każdym eksperymencie, szczególnie podczas monitorowania fenotypów związanych z synukleiną.

Jak wykazaliśmy w danych z mikroskopu fluorescencyjnego, synukleina może tworzyć większe agregaty. Dlatego można go po prostu frakcjonować przez wirowanie i można go określić ilościowo za pomocą western blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla synukleiny. Technika ta ma zastosowanie w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych w celu znalezienia nowych czynników genetycznych i związków chemicznych wpływających na agregację synukleiny.

W związku z tym mamy nadzieję znaleźć nowych kandydatów terapeutycznych w chorobie Parkinsona.