Name: Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj metodę badania toksyczności i agregacji α-synukleiny w humanizowanym modelu drożdży. Technika umożliwia monitorowanie fenotypów komórkowych i identyfikację czynników genetycznych wpływających na stabilność białka związanego z chorobą Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jamesowi Bardwellowi i Tiago F. Outeiro za uprzejme podzielenie się plazmidami zawierającymi α-synukleinę. Changhan Lee otrzymał dofinansowanie z Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowane przez rząd koreański (MSIT) (grant 2021R1C1C1011690), Program Badań Podstawowych za pośrednictwem NRF finansowany przez Ministerstwo Edukacji (grant 2021R1A6A1A10044950) oraz nowy wydziałowy fundusz badawczy Uniwersytetu Ajou.

1. Przygotowanie pożywek i roztworów
<ol>
	<li>Przygotowanie podłoża
	<ol>
		<li>Aby przygotować pożywkę YPD, rozpuść 50 g proszku YPD w dH2O, aby uzyskać końcową objętość 1 l. Autoklaw do sterylizacji. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Aby przygotować podłoże agarowe YPD, rozpuść 50 g proszku YPD i 20 g agaru w 1 L dH2O. Autoklaw do sterylizacji. Po wystudzeniu wylać na szalki Petriego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Aby zrobić SC z pożywką rafinozową (SRd)-Ura, rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej z siarczanem amonu i bez aminokwasów w 795 ml dH2O. Autoklaw do sterylizacji. Przed użyciem dodaj 100 ml 20% rafinozy, 5 ml 20% glukozy i 100 ml 10x -Ura dropout.</li>
		<li>Aby przygotować pożywkę agarową SD-Ura, rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej z siarczanem amonu i bez aminokwasów oraz 20 g agaru w 800 ml dH2O. Autoklaw w kolbie o objętości ponad 2 l. Dodać 100 ml 20% glukozy i 100 ml 10x -Ura drop-out. Dobrze wymieszaj i wylej na szalki Petriego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Aby zrobić SC z pożywką agarową galaktozy (SG)-Ura, rozpuść 6,7 g drożdżowej zasady azotowej z siarczanem amonu i bez aminokwasów oraz 20 g agaru w 800 ml dH2O. Autoklaw w kolbie o objętości ponad 2 l. Dodaj 100 ml 20% galaktozy i 100 ml 10x -Ura drop-out. Dobrze wymieszaj i wlej na szalki Petriego. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwory podstawowe do użycia z nośnikami SD
	<ol>
		<li>Aby uzyskać 20% źródło węgla (glukoza, galaktoza i rafinoza), rozpuść 100 g glukozy, galaktozy lub rafinozy w dH2O, aby uzyskać końcową objętość 500 ml. Autoklaw i przechowywanie w RT.</li>
		<li>Aby przygotować 10 syntetycznych pożywek drożdżowych bez uracylu (10x-Ura drop-out), rozpuść 19,2 g "syntetycznych pożywek drożdżowych bez uracylu" w dH2O, aby uzyskać końcową objętość 1 L. Autoklaw i przechowywać w RT. 
		UWAGA: W celu przygotowania pożywki zawierającej agar, dodać do kolby mieszadło magnetyczne, aby dobrze wymieszać wszystkie roztwory przed wylaniem na szalki Petriego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przemiana drożdży
UWAGA: Plazmid pRS426 został użyty do sklonowania genu α-synukleiny i zawierał gen URA3 jako marker do wyboru. Istnieją rodzinne warianty α-synukleiny związane z chorobą Parkiny, które mają ciężkie fenotypy choroby (np. cytotoksyczność). Warianty te wykorzystano również tutaj do monitorowania ich cytotoksyczności i tworzenia zagregowanych ognisk. Użyj tej samej kolonii transformantów drożdżowych do wszystkich eksperymentów, aby uzyskać spójne wyniki.
<ol>
	<li>Do transformacji plazmidów ekspresyjnych drożdży należy użyć pustego wektora (pRS426) jako plazmidów kontrolnych i plazmidów zawierających α-synukleinę. Odnosząc się do standardowej metody octanu litu (LiAc) 11, przygotuj sześć kompetentnych komórek i 0,5 μg każdego plazmidu i przeprowadź transformację.</li>
	<li>Aby wybrać transformanty drożdżowe zawierające plazmidy, należy użyć syntetycznego zdefiniowanego podłoża (pożywki SD) bez uracylu (SD-Ura) i inkubować płytki w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni.</li>
	<li>Umieść trzy pojedyncze kolonie na płytce agarowej SD-Ura w celu selekcji komórek zawierających plazmidy do dalszych eksperymentów. 
	UWAGA: Aby uzyskać dokładne i wiarygodne wyniki, zbadaliśmy co najmniej trzy kontrpróby biologiczne na szczep.</li>
</ol>
3. Test plamienia
UWAGA: Wiadomo, że ekspresja α-synukleiny znakowanej GFP w plazmidach o dużej liczbie kopii jest związana z cytotoksycznością u drożdży10.
<ol>
	<li>Zaszczepić trzy połatane transformanty drożdżowe na szczep w 3 ml SRd-Ura w celu selektywnego wzrostu drożdży zawierających plazmidy z 2% rafinozą w celu zahamowania indukcji α-synukleiny pod promotorem GAL1 i 0,1% glukozy. Inkubować kulturę komórkową w temperaturze 30 °C pod mieszaniem przy 200 obr./min. 
	UWAGA: Powtórzenie wszystkich eksperymentów z różnymi koloniami jest ważne. Uzyskanie tych samych wyników z ponad trzech niezależnych kolonii oznacza, że wynik jest wiarygodny.</li>
	<li>Następnego dnia zaszczepić wyhodowane przez noc komórki w 3 ml świeżego SRd-Ura do OD600 0,2 i inkubować przez 6 godzin w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przy 200 obr./min. </li>
	<li>Gdy OD600 osiągnie 0,6-0,8, rozcieńczyć komórki w 96-dołkowych płytkach do testu plamienia w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Zmierzyć OD600 wszystkich próbek i rozcieńczyć próbki do OD600 0,5 za pomocą sterylnego dH2O (mieszanina objętości wynosi 100 μl) na torze 1 96-dołkowej płytki w celu wyrównania liczby komórek w każdej hodowli.</li>
		<li>Wykonać pięciokrotne seryjne rozcieńczenia komórek drożdży, dodając 160 μl sterylnego dH2O do następnych pięciu pasów. Zapewnić całkowitą objętość 40 μl podczas seryjnego rozcieńczania komórek na każdym pasie. 
		UWAGA: Niskie współczynniki rozcieńczenia mogą powodować większe różnice między próbkami. Wymagane jest odpowiednie pipetowanie, aby zapewnić równomierne mieszanie podczas wykonywania rozcieńczeń seryjnych. Końcówkę pipety należy wymieniać w każdym punkcie rozcieńczenia. W przeciwnym razie komórki przyczepione do powierzchni końcówki mogą zostać przeniesione do następnej studzienki i wpłynąć na liczbę komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 10 μl z każdej studzienki, aby wykryć próbki na płytkach agarowych SD-Ura do kontroli i płytkach agarowych SG-Ura do monitorowania toksyczności. 
	UWAGA: Płytki należy suszyć do momentu, aż plamiste próbki zostaną całkowicie wchłonięte przez płytki.</li>
	<li>Inkubować nakrapiane płytki do góry nogami w temperaturze 30 °C przez 4 dni.</li>
	<li>Wykonuj zdjęcia płytek co 24 godziny do 4 dnia, a następnie analizuj dane, porównując różnice we wzroście między szczepami zauważonymi gołym okiem. Policz poszczególne kolonie w najbardziej rozcieńczonej próbce, oblicz liczbę żywotnych komórek w oryginalnej kulturze dla każdego szczepu lub porównaj wielkość pojedynczych kolonii.</li>
</ol>
4. Pomiar wzrostu drożdży za pomocą czytnika mikropłytek
<ol>
	<li>Zaszczepić trzy połatane transformanty drożdżowe na szczep w 3 ml SRd-Ura i inkubować w temperaturze 30 °C pod mieszaniem przy 200 obr./min przez noc. 
	UWAGA: Aby zrozumieć każdy fenotyp kolonii humanizowanego szczepu drożdży wyrażającego α-synukleinę, użyj tych samych transformantów do wszystkich eksperymentów.</li>
	<li>Następnego dnia zaszczepij komórki hodowane przez noc w sumie 200 μl świeżych SD-Ura i SG-Ura na 96-dołkowych płytkach. Dostosuj końcową objętość, w tym komórki, do 200 μl i dostosuj początkową średnicę zewnętrzną komórki600 do 0,05.
	<ol>
		<li>Dostosuj ustawienia programu na płytce mikromiareczkowej w następujący sposób: ustaw temperaturę docelową na 30 ° C, ustaw czas trwania wytrząsania (liniowy) na 890 s, ustaw amplitudę wytrząsania (liniową) na 5 mm, ustaw czas interwału na 00:15:00 i ustaw pomiar jako absorbancję na 600 nm.</li>
		<li>Inkubuj płytkę przez 2-3 dni, aby wszystkie szczepy osiągnęły fazę stacjonarną w czytniku mikropłytek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj dane, wykreślając krzywą wzrostu (np. za pomocą skoroszytu). Uzyskać punkty danych, uśredniając wartości absorbancji z trzech kontrprób biologicznych i wskazać słupki błędu. Użyj wartości absorbancji tylko z pożywki jako kontroli i odejmij ją od wartości z hodowanych komórek (opcjonalnie).</li>
</ol>
5. Mikroskopia fluorescencyjna
<ol>
	<li>Zaszczepić połatane transformanty drożdżowe w 3 ml SRd-Ura i hodować je przez noc w temperaturze 30 °C pod mieszaniem przy 200 obr./min. 
	UWAGA: Aby określić korelację fenotypu z cytotoksycznością i powstawaniem ognisk, należy użyć tych samych kolonii do eksperymentu.</li>
	<li>Następnego dnia ponownie zaockuluj komórki hodowane przez noc w 3 ml świeżego SRd-Ura do OD600 0,003. Inkubować kulturę, aż OD600 osiągnie 0,2 w temperaturze 30 °C pod wpływem mieszania przy 200 obr./min (~18 h).</li>
	<li>Po osiągnięciu OD600 wynoszącego 0,2 dodać 300 μl 20% galaktozy, a następnie inkubować przez kolejne 6 godzin w temperaturze 30 °C przy mieszaniu przy 200 obr./min.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie przy 800 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 30 μl wody destylowanej.</li>
	<li>Załadować 5 μl zawieszonych komórek na szkiełko szkiełkowe. Przygotuj podkładkę z żelu agarozowego12 i umieść ją na załadowanych komórkach, aby równomiernie się rozprowadziła.</li>
	<li>Wykonuj obrazowanie mikroskopowe za pomocą obiektywu 100x, korzystając zarówno z filtrów jasnego pola, jak i fluorescencyjnych GFP.
	<ol>
		<li>Najpierw użyj jasnego pola, aby ustawić ostrość komórki za pomocą obiektywu 100x za pomocą olejku immersyjnego. Użyj opcji zrzutu ekranu, aby wygenerować obrazy za pomocą programu.</li>
		<li>Przełącz się na filtr fluorescencyjny GFP. Dostosuj czas ekspozycji obrazu w zakresie od 50 ms do 300 ms, aby uzyskać wyraźny obraz, równoważąc stosunek sygnału do szumu. Przechwyć obraz ekranu za pomocą programu.</li>
		<li>Obrazuj wiele komórek z wielu punktów, a nie tylko z jednego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj obrazy, zliczając procent komórek zawierających ogniska agregatów α-synukleiny za pomocą oprogramowania analitycznego. Obserwuj różnice między sygnałem rozpuszczalnego białka GFP a sygnałem GFP utworzonym przez ogniska, a także dyfuzję GFP z wariantem A30P formy α-synukleiny. 
	UWAGA: Powstawanie ognisk będzie obserwowane w przypadku wariantów α-synukleiny typu dzikiego, E46K i A53T. </li>
</ol>

<ol><li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+Why+cook+with+baker%27s+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).</li>
<li>Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+synucleins%3A+%26%2334%3BHere%2C+there+and+everywhere%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of synucleins: &#34;Here, there and everywhere&#34;.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).</li>
<li>Soto, C., Pritzkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+aggregation%2C+and+conformational+strains+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).</li>
<li>Gordon, J., Amini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+overview+of+neuronal+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).</li>
<li>Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Animal models of neurodegenerative diseases.</a> Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).</li>
<li>Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+genes+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Yeast genes and human disease.</a> Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).</li>
<li>Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+actin-like+protein+from+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).</li>
<li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).</li>
<li>Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+yeast+to+model+human+biology%2C+disease+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Humanized yeast to model human biology, disease and evolution.</a> Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).</li>
<li>Outeiro, T. F., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+cells+provide+insight+into+alpha-synuclein+biology+and+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology.</a> Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).</li>
<li>Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunham%2C+M+%22Methods+in+Yeast+Genetics+and+Genomics%22">Methods in Yeast Genetics and Genomics</a>. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Woodbury, New York. (2015).</li>
<li>Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+copy+number+in+individual+Escherichia+coli+cells+using+single-molecule+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).</li>
<li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).</li>
<li>Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+systems+biology%3A+Model+organism+and+cell+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Yeast systems biology: Model organism and cell factory.</a> Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421(2019).</li>
<li>Eleutherio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+aging%3A+learning+from+yeast+lessons%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Biology%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons.</a> Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).</li>
<li>Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+models+for+the+study+of+amyloid-associated+disorders+and+development+of+future+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15(2019).</li>
<li>Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+implicated+in+familial+Parkinson%27s+disease+provide+a+dual+picture+of+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+with+mitochondria+taking+center+stage%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643(2021).</li>
<li>Wan, O. W., Chung, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+alpha-synuclein+oligomerization+and+aggregation+in+cellular+and+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease.</a> PLoS One. 7 (6), 38545(2012).</li>
<li>Xu, L., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+in+Parkinson%27s+disease%3A+From+pathogenetic+dysfunction+to+potential+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application.</a> Parkinson's Disease. 2016, 1720621(2016).</li>
<li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+%CE%B1-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li>
<li>Sampson, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+bacterial+amyloid+promotes+%CE%B1-synuclein+aggregation+and+motor+impairment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice.</a> Elife. 9, 53111(2020).</li>
<li>Evans, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+curli+system+possesses+a+potent+and+selective+inhibitor+of+amyloid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation.</a> Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).</li>
<li>Su, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compounds+from+an+unbiased+chemical+screen+reverse+both+ER-to-Golgi+trafficking+defects+and+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models.</a> Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Biorąc pod uwagę złożoność różnych układów komórkowych u ludzi, korzystne jest wykorzystanie drożdży jako modelu do badania ludzkich chorób neurodegeneracyjnych. Chociaż prawie niemożliwe jest zbadanie złożonych interakcji komórkowych ludzkiego mózgu za pomocą drożdży, z perspektywy pojedynczej komórki komórki drożdży mają wysoki poziom podobieństwa do komórek ludzkich pod względem homologii sekwencji genomowej i podstawowych eukariotycznych procesów komórkowych 8,13</...

Choroba Parkinsona (PD) jest poważnym problemem dla starzejących się społeczeństw na całym świecie. Agregacja α-synukleiny jest ściśle związana z chorobą Parkinsona, a agregaty białkowe α-synukleiny są szeroko stosowane jako biomarker molekularny do diagnozowania choroby1. α-synukleina jest małym kwaśnym białkiem (o długości 140 aminokwasów) z trzema domenami, a mianowicie N-końcową α-helisą wiążącą lipidy, centralną domeną wiążącą amyloid (NAC) i C-końcowym kwaśnym ogonem2. Nieprawidłowe fałdowanie α-synukleiny może wystąpić spontanicznie i ostatecznie prowadzi do powstania agregatów amyloidowych zwanych ciałami Lewy'ego3. α-synukleina może przyczyniać się do patogenezy choroby Parkinsona na kilka sposobów. Ogólnie uważa się, że jego nieprawidłowe, rozpuszczalne oligomeryczne formy zwane protofibrylami są gatunkami toksycznymi, które powodują śmierć komórek neuronalnych, wpływając na różne cele komórkowe, w tym funkcję synaptyczną3.
Modele biologiczne używane do badania chorób neurodegeneracyjnych muszą być istotne dla ludzi pod względem ich genomu i biologii komórkowej. Najlepszymi modelami byłyby ludzkie linie komórkowe neuronów. Jednak te linie komórkowe wiążą się z kilkoma problemami technicznymi, takimi jak trudności w utrzymaniu kultur, niska wydajność transfekcji i wysokie koszty4. Z tych powodów potrzebne jest łatwe i niezawodne narzędzie, które przyspieszy postęp w tej dziedzinie badań. Co ważne, narzędzie powinno być łatwe w obsłudze do analizy zebranych danych. Z tej perspektywy szeroko stosowano różne organizmy modelowe, w tym Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, drożdże i gryzonie5. Wśród nich drożdże są najlepszym organizmem modelowym, ponieważ manipulacja genetyczna jest łatwa i jest tańsza niż inne organizmy modelowe. Co najważniejsze, drożdże mają duże podobieństwa do komórek ludzkich, takie jak 60% homologii sekwencji do ludzkich ortologów i 25% bliskiej homologii z ludzkimi genami związanymi z chorobami6, a także mają wspólną fundamentalną biologię komórki eukariotycznej. Drożdże zawierają wiele białek o podobnych sekwencjach i analogicznych funkcjach do tych w komórkach ludzkich7. Rzeczywiście, drożdże wyrażające ludzkie geny są szeroko stosowane jako system modelowy do wyjaśniania procesów komórkowych8. Ten szczep drożdży nazywa się drożdżami humanizowanymi i jest użytecznym narzędziem do badania funkcji ludzkich genów9. Humanizowane drożdże mają zalety w badaniu interakcji genetycznych, ponieważ manipulacja genetyczna jest dobrze ugruntowana w drożdżach.
W tym badaniu użyliśmy drożdży Saccharomyces cerevisiae jako organizmu modelowego do badania patogenezy PD, szczególnie do badania tworzenia agregatów α-synukleiny i cytotoksyczności10. Do ekspresji α-synukleiny w pączkujących drożdżach szczep W303a wykorzystano do transformacji z plazmidami kodującymi warianty α-synukleiny typu dzikiego i rodzinnego związane z PD. Ponieważ szczep W303a ma mutację auksotroficzną na URA3, ma zastosowanie do selekcji komórek zawierających plazmidy z URA3. Ekspresja α-synukleiny kodowanej w plazmidzie jest regulowana przez promotor GAL1. W ten sposób można kontrolować poziom ekspresji α-synukleiny. Ponadto fuzja białka zielonej fluorescencji (GFP) w regionie C-końcowym α-synukleiny umożliwia monitorowanie powstawania ognisk α-synukleiny. Aby zrozumieć charakterystykę rodzinnych wariantów α-synukleiny związanych z chorobą Parkinsona, wyraziliśmy również te warianty w drożdżach i zbadaliśmy ich działanie komórkowe. System ten jest prostym narzędziem do badań przesiewowych związków lub genów wykazujących rolę ochronną przed cytotoksycznością α-synukleiny.

<table><tbody><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>SPL</td><td>30096</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>TAESHIN</td><td>0158</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Oddychająca,</td><td>zróżnicowana biotechnologia</td><td>BEM-1</td><td>Membrana uszczelniająca przepuszczająca gaz do płytek do mikromiareczkowania</td></tr><tr><td>okularów nakrywkowych</td><td>Marienfeld</td><td></td><td>24 x 60 mm</td></tr><tr><td>Probówka hodowlana</td><td>SPL</td><td>40014</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta</td><td>ratiolab</td><td>2712120</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>sigma</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoza</td><td>sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Rafinoza pentahydrat</td><td>Daejung</td><td>6638-4105</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator (wytrząsanie)</td><td>Model Labtron</td><td></td><td>: Inkubator SHI1</td></tr><tr><td>(statyczny)</td><td>Vision scientific</td><td></td><td>model: VS-1203PV-O</td></tr><tr><td>LiAc</td><td>sigma</td><td>L6883</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Tecan</td><td>30050303 01</td><td>Model: Pipeta wielokanałowa Infinite 200 pro</td></tr><tr><td>20-200 i mikro; L</td><td>gilson</td><td>FA10011</td><td></td></tr><tr><td>pipeta wielokanałowa 2-20 &mikro; L</td><td>gilson</td><td>FA10009</td><td></td></tr><tr><td>mikroskop Olympus</td><td>Olympus</td><td>IX-53</td><td></td></tr><tr><td>PEG</td><td>sigma</td><td>P4338</td><td>średnia mol wt 3,350</td></tr><tr><td>Petridish</td><td>SPL</td><td>10090</td><td></td></tr><tr><td>pRS426</td><td></td><td></td><td>Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Wielofunkcyjne wektory wahadłowe drożdży o wysokiej liczbie kopii. Gen. 110 (1), 119-122 (1992).</td></tr><tr><td>pRS426 GAL1 promotor &alpha;-synukleina A30P</td><td></td><td></td><td>Outeiro, TF & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td></tr><tr><td>pRS426 GAL1 promotor &alfa;-synukleina A53T</td><td></td><td></td><td>Outeiro, TF & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td></tr><tr><td>pRS426 GAL1 promotor &alpha;-synukleina E46K</td><td></td><td></td><td>Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td></tr><tr><td>pRS426 GAL1 promotor &alpha;-synukleina WT</td><td></td><td></td><td>Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Komórki drożdży zapewniają wgląd w biologię alfa-synukleiny i patobiologię. Nauka. 302 (5651), 1772-1775 (2003)</td></tr><tr><td>Zbiornik</td><td>SPL</td><td>23050</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>eppendorf</td><td>6131 05560</td><td></td></tr><tr><td>W303a</td><td></td><td></td><td>Obecny od Jamesa Bardwella</td></tr><tr><td>Drożdżowa zasada azotowa bez aminokwasów</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Syntetyczne suplementy drożdżowe bez uracylu</td><td>sigma</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>YPD</td><td>Condalab</td><td>1547.00</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

A Method to Study &#945;-Synuclein Toxicity and Aggregation Using a Humanized Yeast Model

Choroba Parkinsona jest drugim najczęściej występującym zaburzeniem neurodegeneracyjnym i charakteryzuje się postępującą śmiercią komórkową spowodowaną powstawaniem ciał Lewy'ego zawierających nieprawidłowo sfałdowane i zagregowane α-synukleiny. α-synukleina jest obfitym białkiem presynaptycznym, które reguluje transport pęcherzyków synaptycznych, ale nagromadzenie jej inkluzji białkowych powoduje neurotoksyczność. Ostatnie badania wykazały, że różne czynniki genetyczne, w tym opiekuńcze bakterie, mogą zmniejszać tworzenie się agregatów α-synukleiny in vitro. Jednak ważne jest również monitorowanie efektu antyagregacji w komórce, aby zastosować go jako potencjalne leczenie dla pacjentów. Idealnie byłoby użyć komórek neuronalnych, ale te komórki są trudne w obsłudze i potrzebują dużo czasu, aby wykazać fenotyp antyagregacji. W związku z tym potrzebne jest szybkie i skuteczne narzędzie in vivo do dalszej oceny aktywności antyagregacyjnej in vivo. Opisana tutaj metoda została wykorzystana do monitorowania i analizy fenotypu antyagregacji u humanizowanych drożdży Saccharomyces cerevisiae, które wykazywały ekspresję ludzkiej α-synukleiny. Protokół ten demonstruje narzędzia in vivo, które można wykorzystać do monitorowania toksyczności komórkowej indukowanej α-synukleiną, a także tworzenia agregatów α-synukleiny w komórkach.

Wiadomo, że wysoka ekspresja α-synukleiny jest powiązana ze śmiercią komórek neuronalnych i chorobą Parkinsona (PD) w systemach modelowych PD. Niniejsze badanie opisuje trzy metody monitorowania cytotoksyczności α-synukleiny oraz tworzenia się ognisk zagregowanej α-synukleiny w drożdżach. W pracy tej zastosowano nadekspresję α-synukleiny w drożdżach i zbadano fenotypy α-synukleiny typu dzikiego oraz trzech wariantów α-synukleiny znanych jako mutacje rodzinne PD (Rysunek 1 oraz Tabela...

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder and is characterized by progressive cell death caused by the formation of Lewy ...

Jest to prosta metoda monitorowania fenotypów komórkowych i cech jąder R-pass. Często można go również odzyskać w badaniach całego genomu, aby znaleźć czynniki genetyczne wpływające na stabilność jąder R-pass. Ponieważ jest to dobrze ugruntowany organizm motoryczny, technika ta jest łatwa i nie wymaga dużo czasu i wysiłku w porównaniu z wykorzystaniem ludzkich linii komórkowych lub modeli zwierzęcych.Agregacja jąder R-pass jest ściśle związana z chorobą Parkinsona. Białka lub substancje chemiczne, które prawdopodobnie wpływają na stabilność jąder R-pass, można przetestować w tym humanizowanym modelu drożdży. Na początek nałóż trzy pojedyncze kolonie na płytkę agarową SD-URA w celu selekcji komórek zawierających plazmidy alfa-synukleiny.Następnie zaszczepić trójłatowe transformanty drożdżowe na szczep w 3 mililitrach SRD-URA w celu selektywnego wzrostu drożdży zawierających plazmidy z 2% rafinozą w celu zahamowania indukcji alfa-synukleiny pod promotorem Gal1 i 0,1% glukozy. Inkubować zaszczepioną kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem z prędkością 200 obrotów na minutę. Następnego dnia zaszczepij komórki hodowane przez noc w 3 mililitrach świeżego SRD-URA, aż osiągną gęstość optyczną 0,2 przy 600 nanometrach.Następnie inkubuj kulturę przez sześć godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem z prędkością 200 obrotów na minutę. Zmierz gęstość optyczną przy 600 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Następnie rozcieńczyć próbki do gęstości optycznej 0,5 przy 600 nanometrach sterylną wodą destylowaną na torze 1 96-dołkowej płytki, aby wyrównać liczbę komórek w każdej kulturze.Wykonaj 5-krotne seryjne rozcieńczenia komórek drożdży, dodając 160 mikrolitrów sterylnej wody destylowanej do następnych pięciu pasów i zapewnij całkowitą objętość 40 mikrolitrów podczas seryjnego rozcieńczania komórek na każdym pasie. Użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść 10 mikrolitrów z każdej studzienki, aby wykryć próbki na płytkach agarowych SD-URA do kontroli i płytkach agarowych SG-URA do monitorowania toksyczności. Inkubuj nakrapiane płytki do góry nogami w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez cztery dni.Rób zdjęcia płytek co 24 godziny do czwartego dnia, a następnie analizuj dane, porównując różnice we wzroście między szczepami zauważonymi gołym okiem. Zaszczepić trzy połatane transformanty drożdżowe na szczep w trzech mililitrach SRD-URA i inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem z prędkością 200 obrotów na minutę przez noc. Następnego dnia zmierz gęstość optyczną komórek hodowanych przez noc w odległości 600 nanometrów i zaszczep komórki w sumie 200 mikrolitrów świeżych SD-URA i SG-URA na 96-dołkowych płytkach.Dostosuj końcową objętość, w tym komórki, do 200 mikrolitrów i dostosuj początkową gęstość optyczną komórki do 0,05 przy 600 nanometrach. Dostosuj ustawienia programu w płytce do mikromiareczkowania. Ustaw temperaturę docelową na 30 stopni Celsjusza, czas interwału na 15 minut, czas wytrząsania na 890 sekund, amplitudę wytrząsania na 5 milimetrów, a pomiar jako absorbancję na 600 nanometrów.Inkubuj płytkę przez 2-3 dni, aby wszystkie szczepy osiągnęły fazę stacjonarną w czytniku mikropłytek. Przeanalizuj dane, wykreślając krzywą wzrostu. Zaszczepić połatane transformanty drożdżowe w 3 mililitrach SRD-URA i hodować je przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem przy 200 obrotach na minutę.Następnego dnia ponownie zaszczepij komórki hodowane przez noc w 3 mililitrach świeżego SRD-URA do gęstości optycznej 0,003 przy 600 nanometrach, a następnie inkubuj kulturę w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem z prędkością 200 obrotów na minutę, aż gęstość optyczna osiągnie 0,2. Następnie dodaj 300 mikrolitrów 20% galaktozy, a następnie inkubuj przez kolejne 6 godzin w temperaturze 30 stopni Celsjusza pod mieszaniem z prędkością 200 obrotów na minutę. Zebrać jeden mililitr kultury komórkowej przez odwirowanie przy 800 g przez 5 minut i wyrzucić supernatant.Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 30 mikrolitrach wody destylowanej. Przygotuj podkładkę z żelu agarozowego na szklanym szkiełku. Ponownie zawiesić komórki i załadować pięć mikrolitrów zawiesiny komórek na szkiełko podstawowe i przykryć komórki za pomocą pociętej podkładki agarozowej do badania.Aby wykonać obrazowanie mikroskopowe za pomocą obiektywu 100x, użyj opcji przechwytywania ekranu do generowania obrazów za pomocą programu i wybierz jasne pole, aby ustawić ostrość komórki za pomocą obiektywu 100x za pomocą olejku immersyjnego. Przełącz się na filtr fluorescencyjny GFP i dostosuj czas ekspozycji obrazu w zakresie od 50 milisekund do 300 milisekund, aby uzyskać wyraźny obraz poprzez zrównoważenie stosunku sygnału do szumu. Otwórz plik obrazu i przeanalizuj dane, zliczając komórki na podstawie liczby ognisk w komórkach za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.Ekspresja synukleiny pod promotorem Gal1 w wektorze PRS426 wykazała znaczne opóźnienie wzrostu na płytce agarowej zawierającej galaktozę jako induktor. Różnicę we wzroście przez ekspresję synukleiny zaobserwowano również w kulturach płynnych. W obu warunkach hodowli synukleina typu dzikiego i warianty z mutacjami E46K lub A53T wykazywały defekty wzrostu spowodowane toksycznością synukleiny.Jednak wariant synukleiny A30p, który nie tworzy agregatów, wykazał nietoksyczny fenotyp. Szczepy wykazujące ciężką cytotoksyczność wykazywały ogniska agregatów synukleiny, ale w wariancie A30p mniej toksyczna forma synukleiny była dyfundowana po komórkach. Aby osiągnąć powtarzalne wyniki, ważne jest, aby używać komórki na tym samym etapie wzrostu w każdym eksperymencie, szczególnie podczas monitorowania fenotypów związanych z synukleiną.Jak wykazaliśmy w danych z mikroskopu fluorescencyjnego, synukleina może tworzyć większe agregaty. Dlatego można go po prostu frakcjonować przez wirowanie i można go określić ilościowo za pomocą western blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla synukleiny. Technika ta ma zastosowanie w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych w celu znalezienia nowych czynników genetycznych i związków chemicznych wpływających na agregację synukleiny.W związku z tym mamy nadzieję znaleźć nowych kandydatów terapeutycznych w chorobie Parkinsona.

a-method-to-study-synuclein-toxicity-aggregation-using-humanized

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy manuskrypt opisuje trzy komplementarne protokoły służące do oceny toksyczności białek z ekspansją poliglutaminy (polyQ) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokoły te można łatwo zmodyfikować w celu monitorowania toksyczności innych błędnie sfałdowanych białek w drożdżach.

Testy wzrostu do oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Modele proteinopatii drożdży są cennymi narzędziami do oceny toksyczności i agregacji białek związanych z chorobą. W tym miejscu przedstawiamy metody badań przesiewowych bibliotek wariantów Hsp104 pod kątem supresorów toksyczności. Protokół ten można dostosować do badań przesiewowych dowolnej biblioteki białek pod kątem supresorów toksyczności dowolnego białka, które jest toksyczne w drożdżach.

Izolowanie wzmocnionych wariantów Hsp104 przy użyciu modeli proteinopatii drożdżowej

Opisujemy metodę ilościowego określania agregacji nieprawidłowo sfałdowanych białek. Nasz protokół szczegółowo opisuje indukowane lentiwirusem stabilne generowanie linii komórkowych, automatyczne obrazowanie konfokalne i analizę obrazu agregatów białkowych. Jako przykładowe zastosowanie, zbadaliśmy wpływ małych cząsteczek na promowanie agregacji SOD1 w sposób zależny od czasu i dawki.

Opracowanie testu do oznaczania ilościowego wysokiej zawartości zmutowanego białka Sod1 w tworzeniu agregatów w żywych komórkach

Agregacja białek wywołuje komórkowy stres oksydacyjny. Protokół ten opisuje metodę monitorowania stanów wewnątrzkomórkowych białek amyloidogennych i związanego z nimi stresu oksydacyjnego za pomocą cytometrii przepływowej. Podejście to służy do badania zachowania rozpuszczalnych i podatnych na agregację wariantów peptydu β amyloidu.

Ocena wpływu agregacji białek na komórkowy stres oksydacyjny u drożdży

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

Ten artykuł przedstawia metodę opartą na kojarzeniu, która ułatwia badanie przesiewowe nadekspresji u pączkujących drożdży przy użyciu biblioteki plazmidów z tablicą.

Badania przesiewowe biblioteki nadekspresji opartej na kryciach u drożdży

Ten artykuł opisuje protokoły do oceny wpływu białek fluorescencyjnych na agregację i toksyczność nieprawidłowo sfałdowanej ekspansji poliglutaminy w celu szybkiej oceny nowo niescharakteryzowanego białka fluorescencyjnego w kontekście reporterów fluorescencyjnych.

Wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Ten protokół przedstawia procedury eksperymentalne do charakteryzowania zmian w całym genomie w poziomach modyfikacji potranslacyjnych histonów (PTM) występujących w związku z nadekspresją białek związanych z ALS i chorobą Parkinsona w modelach Saccharomyces cerevisiae. Po oddzieleniu SDS-PAGE poszczególne poziomy PTM histonów są wykrywane za pomocą przeciwciał specyficznych dla modyfikacji za pomocą Western blot.

Charakterystyka zmian modyfikacji potranslacyjnej histonów w modelach neurodegeneracyjnej proteinopatii drożdży

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę, w której ludzkie kultury neuronalne są transdukowane za pomocą lentiwirusowych konstruktów kodujących zmutowane ludzkie tau. Transdukowane kultury wykazują agregaty tau i związane z nimi patologie.

Model in vitro do badania agregacji tau za pomocą transdukcji ludzkich neuronów za pośrednictwem lentiwirusa

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania akumulacji neuronalnej α-synukleiny w pierwotnych mysich neuronach dopaminowych. Fosforylowane agregaty α-synukleiny w neuronach są indukowane za pomocą wstępnie uformowanych włókienek α-synukleinowych. Zautomatyzowane obrazowanie komórek znakowanych immunofluorescencyjnie i bezstronna analiza obrazu sprawiają, że ten solidny protokół nadaje się do średnio- i wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, które hamują akumulację α-synukleiny.

Badanie indukowanej wcześniej fibrylami akumulacji α-synukleiny w pierwotnych embrionalnych neuronach dopaminowych śródmózgowia myszy

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Poznaj metodę badania toksyczności i agregacji α-synukleiny w humanizowanym modelu drożdży. Technika umożliwia monitorowanie fenotypów komórkowych i identyfikację czynników genetycznych wpływających na stabilność białka związanego z chorobą Parkinsona.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Przeglądaj więcej filmów