Name: Pierwotne ludzkie komórki nabłonka nosa: biobankowanie w kontekście medycyny precyzyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-22T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj metodę izolacji, wzrostu i biobankowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka nosa w interfejsie powietrze-ciecz. Technika umożliwia ocenę aktywności CFTR i personalizowane terapie mukowiscydozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy wszystkim pacjentom i ich rodzinom za udział w badaniu. Prace te były wspierane przez granty francuskiego stowarzyszenia Vaincre la Mucoviscidose; Francuskie Stowarzyszenie ABCF 2 i Vertex Pharmaceuticals Innovation Awards.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami opisanymi w Deklaracji Helsińskiej i prawie Huriet-Serusclat dotyczącym etyki badań na ludziach.
1. Przygotowanie kolb i różnych pożywek
<ol>
	<li>Przygotować amplifikację, powietrze-ciecz i pożywkę zamrażającą zgodnie z opisem w Tabeli 1.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy ludzkiego kolagenu dożylnie, rozpuszczając 50 mg kolagenu w 100 ml 0,2% lodowatego kwasu octowego. Mieszać na mieszadle magnetycznym przez co najmniej 1 godzinę i przefiltrować, wysterylizować roztwór. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy w szklanej butelce, chronić przed światłem.</li>
	<li>Przygotuj roztwór roboczy kolagenu dożylnego, rozcieńczając roztwór podstawowy w stosunku 1:5 w wodzie podwójnie destylowanej. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.</li>
	<li>Pokryj plastikowe kolby do hodowli komórkowych lub filtry transwell roztworem roboczym kolagenu. Równomiernie rozprowadzić 100 μl dla 0,33 cm2 filtrów transwell, 500 μldla kolb 25 cm 2 i 1 ml dla kolb 75 cm2 na całej powierzchni wzrostu kolby. 
	UWAGA: Można to osiągnąć poprzez delikatne przechylanie kolby z boku na bok. Alternatywnie, aby ułatwić powlekanie kolb, można zastosować zwiększoną objętość, a gdy cała powierzchnia jest równomiernie pokryta, odsysa się roztwór kolagenu, aby pozostawić tylko wskazaną objętość. Zasysany roztwór kolagenu można następnie natychmiast użyć do pokrycia następnej kolby (tj. w przypadku trzech kolbo długości 75 cm2 równomiernie rozprowadzić 3 ml roztworu kolagenu w pierwszej kolbie, odessać 2 ml, które następnie stosuje się do następnej kolby i tak dalej).</li>
	<li>Kolby do hodowli komórkowych należy pozostawić w inkubatorze na co najmniej 2 godziny lub na noc. Dokładnie odessać kolagen i pozostawić kolby do wyschnięcia w inkubatorze lub pod pokrywą na co najmniej 20 minut lub na noc.</li>
	<li>Umyć 10 ml DPBS wolnego od Mg2+ i Ca2+, pozostawić do wyschnięcia w inkubatorze i przechowywać w folii aluminiowej w celu ochrony przed światłem. Kolby należy przechowywać do 6 miesięcy w temperaturze pokojowej (RT).</li>
</ol>
2. Szczotkowanie nosa
UWAGA: Upewnij się, że mycie nosa jest wykonywane, gdy uczestnik nie ma ostrej infekcji. Jeśli u pacjentów z mukowiscydozą występuje infekcja płuc, należy zapoznać się z antybiogramem pacjenta i dodać dodatkowe antybiotyki do pożywki amplifikacyjnej. Ludzkie komórki nabłonka nosa pobrano metodą szczotkowania nosa od pacjentów z F508del/F508del, jak opisano wcześniej9.
<ol>
	<li>Poproś pacjenta o wydmuchanie nosa, a następnie znieczulenie miejscowo błony śluzowej obu nozdrzy za pomocą siatek bawełnianych nasączonych 5% ksylocainą z roztworem nafazoliny.</li>
	<li>Delikatnie przeczesz ścianę przyśrodkową i dolną małżowinę obu nozdrzy za pomocą szczoteczki cytologicznej. Namocz szczoteczkę w probówce o pojemności 15 ml z 2 ml dostępnego w handlu środka do płukania; Delikatnie wstrząśnij, aby oderwać komórki. Powtórz szczotkowanie w drugim nozdrzu.</li>
	<li>Do pożywki płuczącej dodać następujące antybiotyki: penicylinę (100 μg/ml), streptomycynę (100 μg/ml), tazocylinę (10 μg/ml), amfoterycynę B (2,5 μg/ml) i kolimycynę (16 μg/ml). 
	UWAGA: Szczotkowanie nosa może być wysyłane w RT do dedykowanych laboratoriów w celu ekspansji i hodowli i może być wysiewane do 72 godzin po szczotkowaniu.</li>
</ol>
3. Izolacja HNE
UWAGA: HNE wyizolowano ze szczoteczki cytologicznej, przemyto DPBS wolnym od Mg2+- i Ca2+, zdysocjowano 0,25% trypsyny i wysiano na plastikową kolbę o średnicy 25 cm, jak wcześniej opisano10.
<ol>
	<li>Odłącz komórki od szczoteczki cytologicznej, wielokrotnie przepuszczając szczoteczkę przez stożek do pipety o pojemności 1000 μl i spłukując 2 ml DPBS bez Mg2+ i Ca2+. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 0,25% trypsyny na 8-12 minut, aby zdysocjować komórki. Zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając 5 ml pożywki amplifikacyjnej.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 8 ml pożywki do amplifikacji i umieścić nasiona w kolbie pokrytejkolagenem o średnicy 25 cm2. Rosną w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Odpowiada to fragmentowi 0.</li>
	<li>Następnego dnia zastąp pożywkę 5 ml świeżej pożywki do amplifikacji i codziennie monitoruj komórki pod kątem przyłączenia, morfologii (komórki powinny mieć spójny wygląd kostki brukowej) i liczby. 
	UWAGA: Początkowa gęstość wysiewu różni się w zależności od jakości szczotkowania nosa i proporcji komórek nabłonkowych. Świeżo wyizolowane komórki HNE zwykle osiągają 80%-90% konfluencji w ciągu 3-10 dni. Wolniejsze tempo wzrostu sugeruje niewystarczającą ilość komórek nabłonkowych w próbce i należy je odrzucić.</li>
</ol>
4. Amplifikacja i pasażowanie ludzkich komórek nabłonka nosa
<ol>
	<li>Hodować ludzkie komórki nabłonka nosa w pożywce do amplifikacji w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na kolbach pokrytych kolagenem do zbiegu 80%-90%, zmieniając podłoże co 48-72 godziny. W przypadku kolb o średnicy 2 cm należy użyć 5 ml pożywki amplifikacyjnej i 10 ml w przypadku kolb o średnicy75 cm 2.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną zbieżność 80%-90%, umyj je 10 ml DPBS wolnego od Mg2 + i Ca2 +, aspiruj i wyrzuć.</li>
	<li>Dodać 1 ml 0,25% trypsyny do kolby o średnicy 25 cm(lub 2 ml trypsyny do kolby o średnicy75 cm 2) i ponownie umieścić w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) na 8-12 minut.</li>
	<li>Postukaj mocno w kolbę dłonią, aby pomóc komórkom się odłączyć.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki amplifikacyjnej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Energicznie przepłukać kolbę, używając pipety o pojemności 10 ml, w celu pobrania i usunięcia pożywki wzmacniającej na powierzchnię kolby w celu przepłukania i odłączenia komórek.</li>
	<li>Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5-10 ml pożywki amplifikacyjnej.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. 
	UWAGA: W tym momencie komórki mogą zostać zamrożone (patrz kroki 5.1-5.3). Jeśli wymagane jest dalsze amplifikowanie, należy ponownie wysiać do kolb pokrytych kolagenem (kolba o średnicy 25 cm2 może być rozszerzona na trzy kolby o średnicy 75 cm2, większe rozcieńczenie nie jest zalecane).</li>
</ol>
5. Kriokonserwacja pierwotnych komórek nabłonka nosa
UWAGA: Hoduj komórki HNE do przejścia 1 przed biobankowaniem, aby uzyskać wystarczającą ilość komórek, aby ułatwić wzrost komórek po rozmrożeniu. Biobankowanie jest jednak możliwe przy początkowym przejściu 0 lub przejściu 2. Następujące etapy kriokonserwacji są dostosowane do wszystkich przejść.
<ol>
	<li>Po zliczeniu komórek odwirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant</li>
	<li>Zawiesić osad we wzbogaconym podłożu zamrażającym (Tabela 1), aby uzyskać 3 x 106-5 x 106 komórek na ml i na kriowial.</li>
	<li>Powoli zamrażać komórki, zmniejszając temperaturę do ~1 °C na minutę w odpowiednim pojemniku do kriozamrażania w temperaturze -80 °C. Następnego dnia należy przenieść zakonserwowaną próbkę do pojemnika do przechowywania azotu w celu długotrwałego przechowywania (niniejsze badanie jest ograniczone do 17 miesięcy przechowywania).</li>
</ol>
6. Rozmrażanie zamrożonych wzmocnionych komórek HNE
<ol>
	<li>Podgrzać łaźnię wodną do temperatury 37 °C. Przygotować pożywkę wzmacniającą zgodnie z opisem w tabeli 1 i ogrzać pożywkę do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Wyjąć kriowiale ze zbiornika do przechowywania azotu i szybko umieścić je w łaźni wodnej, uważając, aby nie zanurzyć całej fiolki w wodzie. Wyjmij kriowiale z łaźni wodnej, gdy pozostanie tylko mała zamrożona kropla. Wytrzeć fiolkę 70% alkoholem, wytrzeć do sucha i umieścić pod pokrywą.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml przenieś rozmrożone komórki do pustej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Kroplami dodać 1 ml ciepłej pożywki amplifikacyjnej. Po 1 minucie dodaj kolejny 1 ml pożywki amplifikacyjnej i odczekaj dodatkową minutę.</li>
	<li>Dodać 10 ml pożywki amplifikacyjnej i wirować przez 2 minuty przy 500 x g.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w objętości pożywki amplifikacyjnej wymaganej do uzyskania gęstości komórek co najmniej 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Wysiać komórki w kolbie pokrytej kolagenem zawierającej pożywkę amplifikacyjną.
	<ol>
		<li>Jeżeli kriowial zawiera więcej niż 4 x 106 komórek, wysiewać nasiona do kolby o średnicy 75cm2, w 10 ml pożywki amplifikacyjnej</li>
		<li>Jeśli kriowial zawiera mniej niż 4 x 106 komórek, komórki nasienne do kolby o średnicy 25cm2, w 5 ml pożywki do amplifikacji</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i obserwować wzrokowo ekspansję komórek w ciągu następnych 2-3 dni.</li>
	<li>Następnie wykonaj amplifikację komórek zgodnie z opisem w sekcji 4. 
	UWAGA: Jeśli w kroku 4.7 zebrano kilka komórek. (tj. w przypadku zamrożenia w przejściu 0 przed rozprężeniem), kroki 6.5. oraz 6.6. można pominąć, a komórki można wysiewać bezpośrednio do kolby pokrytej kolagenem o średnicy 25cm2 bez wirowania. Pożywkę należy następnie zmienić następnego dnia w celu usunięcia dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
</ol>
7. Różnicowanie ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrze-ciecz
UWAGA: HNE zostały rozróżnione na granicy faz powietrze-ciecz, jak opisano wcześniej10.
<ol>
	<li>Zasiać komórki o gęstości 330 000 komórek/filtr na 0,33 cm2 porowatych filtrach pokrytych kolagenem i uzupełnić 300 μl pożywki amplifikacyjnej po stronie wierzchołkowej i 900 μl pożywki powietrzno-cieczowej po stronie podstawno-bocznej.</li>
	<li>Po 3 dniach odessać pożywkę wierzchołkową i hodować komórki na granicy faz powietrze-ciecz przez 3-4 tygodnie w podłożu powietrze-ciecz, aby ustalić zróżnicowany nabłonek. Zmieniaj podłoże podstawowe co 48-72 h.</li>
</ol>
8. Modulatory CFTR
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę powietrzno-ciekłą zawierającą modulatory CFTR. Użyj VX-445, VX-661 i VX-809 w końcowym stężeniu 3 μM i VX-770 przy 100 nM. Użyj korektora ABBV-2222 przy stężeniu końcowym 1 μM i wzmacniacza ABBV-974 przy 10 μM. Użyj 100% DMSO, aby rozpuścić wszystkie modulatory CFTR.</li>
	<li>Przygotować pożywkę powietrzno-płynną zawierającą taką samą ilość 100% DMSO jak w pożywce korektora.</li>
	<li>Dodać pożywkę zawierającą leki lub DMSO do podstawno-bocznej strony spolaryzowanych komórek HNE hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz i inkubować przez 24 godziny w 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 24 godzinach odessać i odrzucić pożywkę, a następnie zastąpić ją świeżą pożywką przygotowaną w sposób opisany w punktach 8.1-8.2, a następnie inkubować przez okres 24 godzin w 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
9. Studia komorowe
<ol>
	<li>Zmierz pomiary prądu zwarciowego (Isc) w warunkach cęgów napięciowych, jak opisano wcześniej9. 
	UWAGA: Przeznabłonkowy opór elektryczny (TEER) kultur mierzono za pomocą woltomierza pałeczkowego, a w poniższych eksperymentach uwzględniono tylko kultury osiągające co najmniej 200 Ω·cm2. Filtry spolaryzowanych ogniw HNE zamontowano w komorach Ussinga, a pomiary prądu zwarciowego (Isc) wykonano w warunkach cęgów napięciowych.</li>
</ol>
10. Immunocytochemia
<ol>
	<li>Wykonaj detekcję immunologiczną zgodnie z wcześniejszym opisem9. 
	UWAGA: Immunodetekcję CFTR przeprowadzono przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty-CFTR C-końcowego (24-1) przez noc w rozcieńczeniu 1/100. Barwienie Zona-occludens-1 (ZO-1) (rozcieńczenie 1/500), alfa-tubulina (rozcieńczenie 1/300), Muc 5AC (rozcieńczenie 1/250) i cytokeratyny 8 (rozcieńczenie 1/250) przeprowadzono na dodatkowych filtrach. Po umyciu PBS-Triton-X100 0,1%, kozie przeciwciała drugorzędowe sprzężone z Alexa 488 lub 594 dodano na 30 minut w 10% surowicy koziej (rozcieńczenie 1/1000). Po końcowym myciu filtry zostały odcięte od podłoża i zamontowane za pomocą medium montażowego Vectashield zawierającego DAPI. Do wykonania zdjęć użyto mikroskopu konfokalnego (63x/1,4 kontrastu różnicowego oleju λ niebieski obiektyw PL APO) do wykonania obrazów, które analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ.</li>
</ol>
11. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Wykonaj analizę statystyczną za pomocą odpowiedniego oprogramowania. 
	UWAGA: Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania S.A.S. Ponieważ na jednego pacjenta i na stan przypada kilka filtrów HNE, parametry ilościowe wyrażono jako medianę wartości (± SEM) na pacjenta. Porównania (średnia ± SD) przeprowadzono za pomocą testu rang ze znakiem Wilcoxona lub niesparowanego testu t.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, S. J., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+CFTR+folding+at+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum.</a> Frontiers in Pharmacology. 3, 201(2012).</li>
<li>Lukacs, G. L., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR%3A+folding%2C+misfolding+and+correcting+the+%CE%94F508+conformational+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect.</a> Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).</li>
<li>Wainwright, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumacaftor-Ivacaftor+in+patients+with+cystic+fibrosis+homozygous+for+Phe508del+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).</li>
<li>Griese, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+efficacy+of+elexacaftor%2Ftezacaftor%2Fivacaftor+for+24+weeks+or+longer+in+people+with+cystic+fibrosis+and+one+or+more+F508del+alleles%3A+Interim+results+of+an+open-label+phase+3+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).</li>
<li>Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-associated+protein+kinase+inhibition+enhances+airway+epithelial+basal-cell+proliferation+and+lentivirus+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+reprogramming+and+long-term+expansion+of+normal+and+tumor+cells+from+human+biospecimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens.</a> Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).</li>
<li>Saint-Criq, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+differentiation+media+significantly+impacts+cell+lineage+and+response+to+CFTR+modulators+in+fully+differentiated+primary+cultures+of+cystic+fibrosis+human+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells.</a> Cells. 9 (9), 2137(2020).</li>
<li>Bukowy-Bieryłło, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+differentiating+primary+human+airway+epithelial+cell+cultures%3A+how+far+are+we%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Communication+and+Signaling%3A+CCS%22%5BJournal%5D)">Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we.</a> Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).</li>
<li>Pranke, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+CFTR+function+in+nasal+epithelial+cells+from+cystic+fibrosis+patients+predicts+improvement+of+respiratory+function+by+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators.</a> Scientific Reports. 7 (1), 7375(2017).</li>
<li>Noel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlating+genotype+with+phenotype+using+CFTR-mediated+whole-cell+Cl%E2%88%92+currents+in+human+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li>
<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brushed+nasal+epithelial+cells+are+a+surrogate+for+bronchial+epithelial+CFTR+studies%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies.</a> JCI Insight. 3 (13), 99385(2018).</li>
<li>Pranke, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Might+brushed+nasal+cells+be+a+surrogate+for+cftr+modulator+clinical+response%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).</li>
<li>de Courcey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+primary+human+nasal+epithelial+cell+cultures+for+the+study+of+cystic+fibrosis+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).</li>
<li>Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+comparison+of+human+bronchial+and+nasal+epithelial+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro.</a> Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).</li>
<li>McDougall, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+epithelial+cells+as+surrogates+for+bronchial+epithelial+cells+in+airway+inflammation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).</li>
<li>Mosler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility+of+nasal+epithelial+brushing+for+the+study+of+airway+epithelial+functions+in+CF+infants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%3A+Official+Journal+of+the+European+Cystic+Fibrosis+Society%22%5BJournal%5D)">Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants.</a> Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).</li>
<li>Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+drugs+to+probe+the+variability+of+trans-epithelial+airway+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance.</a> PLOS One. 11 (2), 0149550(2016).</li>
<li>Schögler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pediatric+cystic+fibrosis+airway+epithelial+cell+cultures+at+the+air-liquid+interface+obtained+by+non-invasive+nasal+cytology+brush+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling.</a> Respiratory Research. 18 (1), 215(2017).</li>
<li>Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+of+human+nasal+epithelial+cells+at+the+air+liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646(2013).</li>
<li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+functional+responses+in+human+primary+lung+cells+as+a+basis+for+personalized+therapy+for+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis.</a> EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).</li>
<li>Brewington, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+nasal+epithelial+cell+spheroids+for+individualized+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492(2018).</li>
<li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).</li>
<li>Reynolds, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+progenitor+clone+formation+is+enhanced+by+Y-27632-dependent+changes+in+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).</li>
<li>Suprynowicz, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+reprogrammed+cells+represent+a+stem-like+state+of+adult+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).</li>
<li>Awatade, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+functional+differences+in+differentiated+Conditionally+Reprogrammed+%28CRC%29-+and+Feeder-free+Dual+SMAD+inhibited-expanded+human+nasal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).</li>
<li>Veit, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+folding+correction+of+F508del+and+rare+CFTR+mutants+by+elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor+%28Trikafta%29+combination%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination.</a> JCI Insight. 5 (18), 139983(2020).</li>
<li>Dale, T. P., Borg D'anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rock+Inhibitor+Y-27632+enables+feeder-free%2C+unlimited+expansion+of+Sus+scrofa+domesticus+swine+airway+stem+cells+to+facilitate+respiratory+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research.</a> Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+multiple+class+II+CFTR+mutations+by+elexacaftor%2Btezacaftor%2Bivacaftor+mediated+in+part+by+the+dual+activities+of+elexacaftor+as+both+corrector+and+potentiator%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator.</a> The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774(2021).</li>
<li>Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+improves+survival+of+cryopreserved+serum%2Ffeeder-free+single+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells.</a> Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).</li>
<li>Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+primary+cultures+of+human+bronchial+epithelial+cells+isolated+from+cystic+fibrosis+patients+for+the+pre-clinical+testing+of+CFTR+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators.</a> Methods in Molecular Biology. 741, Clifton, N.J. 39-54 (2011).</li>
<li>Laselva, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+pre-clinical+modulators+developed+for+F508del-CFTR+have+the+potential+to+be+effective+for+ORKAMBI+resistant+processing+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych związanych z tą publikacją lub naukową produkcją wideo.

Wykorzystanie komórek nabłonka nosa pochodzących od pacjenta jako substytutów ludzkich komórek nabłonka oskrzeli (HBE) do pomiaru aktywności CFTR w kontekście medycyny spersonalizowanej zostało zaproponowane jako właściwości komórek reprodukcyjnych HNE w hodowli 9,11. Zdecydowaną przewagą HNE nad hodowlami komórkowymi HBE jest to, że można je łatwo i nieinwazyjnie pobierać próbki. Pomiary prądu zwarciowego w hodowlach komórek HNE umożliwiają ocenę zależnego od CF...

Mukowiscydoza (CF) jest chorobą dziedziczoną autosomalnie recesywnie, wynikającą z mutacji w genie CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator), prowadzącej do braku lub dysfunkcji białka CFTR, kanału anionowego znajdującego się na wierzchołkowej powierzchni nabłonka1,2. Ostatnie postępy w terapii CFTR poprawiły rokowanie w chorobie, a ostatnie zatwierdzone leki łączące korektory CFTR i wzmacniacze CFTR doprowadziły do znacznej poprawy czynności płuc i jakości życia pacjentów z mukowiscydozą, u których występuje najczęstsza mutacja p.Phe508del (F508del)3,4. Pomimo tego obiecującego postępu terapeutycznego, około 10% pacjentów z mukowiscydozą nie kwalifikuje się do leczenia, ponieważ są nosicielami mutacji, których nie można uratować za pomocą tych modulatorów CFTR. W przypadku tych pacjentów istnieje potrzeba przetestowania innych leków lub kombinacji leków, aby znaleźć najbardziej efektywną kombinację dla określonych mutacji, co podkreśla znaczenie spersonalizowanych terapii.
Ludzkie komórki nabłonka nosa (HNE) są łatwe do zebrania za pomocą prostego, nieinwazyjnego szczotkowania nosa i pozwalają na ilościowe określenie cyklicznego transportu chlorków za pośrednictwem AMP (Cl−) jako wskaźnika funkcji CFTR. Komórki HNE dają dokładny model ludzkich dróg oddechowych, ale ich żywotność jest ograniczona w hodowli. Dzięki optymalizacji technik hodowli, pierwotne komórki HNE pochodzące od pacjenta mogą być warunkowo przeprogramowane za pomocą inhibitora kinazy związanej z Rho (ROCKi), amplifikowane i różnicowane w pseudowarstwowy nabłonek w warunkach granicy faz powietrze-ciecz (ALI) na filtrach mikroporowatych5,6. Istnieje wiele protokołów hodowli HNE (dostępnych na rynku, bez surowicy, "domowej roboty", kohodowla z komórkami karmicielskimi itp.), a wybór pożywek i warunków hodowli został opisany pod kątem wpływu na wzrost, różnicowanie populacji komórek i funkcję nabłonka7,8. Protokół przedstawia uproszczoną, bezdaniową metodę amplifikacji ROCKi, która pozwala z powodzeniem uzyskać dużą liczbę komórek HNE, które są następnie różnicowane w ALI do testów funkcji CFTR.
Wykazaliśmy, że w zróżnicowanych komórkach HNE 48-godzinna terapia modulatorami CFTR jest wystarczająca do wywołania elektrofizjologicznej korekty prądu Cl- zależnego od CFTR i że korekta obserwowana in vitro może być skorelowana z poprawą kliniczną pacjenta9. Komórki HNE stanowią zatem odpowiedni model nie tylko do podstawowych badań nad mukowiscydozą, ale także do badań przedklinicznych z testami modulatorów CFTR specyficznymi dla pacjenta. W tym kontekście terapii spersonalizowanej, celem protokołu było sprawdzenie, czy kriokonserwowane komórki HNE od pacjentów z mukowiscydozą, hodowane w naszych warunkach, są odpowiednim modelem dla badań korekcyjnych CFTR, a podobnych wyników można się spodziewać, porównując zależny od CFTR transport Cl- ze świeżych i mrożono-rozmrożonych komórek. W badaniu oceniono również skuteczność różnych modulatorów CFTR podczas stosowania terapii podwójnej i potrójnej.

<table><tbody><tr><td>ABBV-2222</td><td>Selleckchem</td><td>S8535</td><td></td></tr><tr><td>ABBV-974</td><td>Selleckchem</td><td>S8698</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowane technologie życia DMEM / F-12</td><td></td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488 kozie przeciwciało wtórne</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594 kozie przeciwciało wtórne</td><td>Invitrogen</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Life Technologies</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-alfa-tubulinowe</td><td>Abcam</td><td>ab80779</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne anty-CFTR (24-1)</td><td>R& D Systems</td><td>MAB25031</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-cytokeratyny 8</td><td>Progen</td><td>61038</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Muc5AC</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-20118</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ZO-1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-10804</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloksacyna</td><td></td><td>dostarczane przez Necker Hospital Pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>Colimycin</td><td>Sanofi</td><td>dostarczane przez Necker Apteka</td><td></td>szpitalna</tr><tr><td>Kolagen typu IV</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>C-7521</td><td></td></tr><tr><td>szczoteczka cytologiczna</td><td>Laboratorium GYNEAS</td><td>02.104</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>Epinefryna</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>E4375</td><td></td></tr><tr><td>F12-Mieszanka składników odżywczych</td><td>Technologie życia</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Technologie życia</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Kolby Ferticult</td><td>Fertipro NV</td><td>FLUSH020</td><td></td></tr><tr><td>25</td><td>Termos Scientific</td><td>156.367</td><td></td></tr><tr><td>Kolby 75</td><td>Thermo Scientific</td><td>156.499</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>VWR</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>SLCJ0893</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Mg2+ oraz Ca2+ wolne od DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Life Technologies</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>Tazocillin</td><td>Mylan</td><td>dostarczone przez Necker Hospital Pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Filters</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże montażowe Vectashield z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>VX-445</td><td>Selleckchem</td><td>S8851</td><td></td></tr><tr><td>VX-661</td><td>Selleckchem</td><td>S7059</td><td></td></tr><tr><td>VX-770</td><td>Selleckchem</td><td>S1144</td><td></td></tr><tr><td>VX-809</td><td>Selleckchem</td><td>S1565</td><td></td></tr><tr><td>Ksylokaina nafazolina 5%</td> <td>Aspen Francja</td><td>dostarczone przez Necker Hospital Pharmacy</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleckchem</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

pierwotne ludzkie komórki nabłonka nosa: biobankowanie w kontekście medycyny precyzyjnej

Primary Human Nasal Epithelial Cells: Biobanking in the Context of Precision Medicine

Ludzkie komórki nabłonka nosa (HNE) są łatwe do pobrania za pomocą prostego, nieinwazyjnego szczotkowania nosa. Pierwotne komórki HNE pochodzące od pacjenta mogą być amplifikowane i różnicowane w pseudo-warstwowy nabłonek w warunkach granicy powietrze-ciecz w celu ilościowego określenia cyklicznego transportu chlorków za pośrednictwem AMP (Cl-) jako wskaźnika funkcji transbłonowego regulatora przewodnictwa (CFTR) mukowiscydozy. Jeśli krytyczne kroki, takie jak jakość szczotkowania nosa i gęstość komórek podczas kriokonserwacji, są wykonywane wydajnie, komórki HNE mogą być z powodzeniem biobankowane. Co więcej, badania prądów zwarciowych wykazują, że zamrażanie i rozmrażanie nie modyfikuje znacząco właściwości elektrofizjologicznych ogniw HNE i odpowiedzi na modulatory CFTR. W warunkach hodowli zastosowanych w tym badaniu, gdy mniej niż 2 x 106 komórek jest zamrażanych na kriowial, odsetek niepowodzeń jest bardzo wysoki. Zalecamy zamrożenie co najmniej 3 x 106 komórek na kriowial. Pokazujemy, że podwójne terapie łączące korektor CFTR z potencjolitrem CFTR mają porównywalną skuteczność korekcji aktywności CFTR w komórkach HNE homozygotycznych F508del. Potrójna terapia VX-445 + VX-661 + VX-770 znacznie zwiększyła korekcję aktywności CFTR w porównaniu z podwójną terapią VX-809 + VX-770. Pomiar aktywności CFTR w komórkach HNE jest obiecującym przedklinicznym biomarkerem przydatnym w leczeniu modulatorów CFTR.

Świeże komórki HNE hodowane na granicy powietrze-ciecz wykazują typowe cechy spolaryzowanego i zróżnicowanego nabłonka oddechowego, co oceniono za pomocą immunobarwienia (Rysunek 1). Komórki HNE ulegają ponownemu różnicowaniu w heterogenną warstwę komórek nabłonkowych (dodatnie immunobarwienie na keratynę 8), które naśladują sytuację in vivo w obrębie pseudo-warstwowego nabłonka oddechowego składającego się z komórek rzęsatych (dodatnie barwienie na alfa-tubulinę) oraz nierzęsatych,...

Tutaj opisujemy izolację, amplifikację i różnicowanie pierwotnych komórek ludzkiego nabłonka nosa (HNE) na granicy powietrze-ciecz oraz protokół biobankowania pozwalający na skuteczne zamrażanie, a następnie rozmrażanie amplifikowanego HNE. W protokole analizowane są właściwości elektrofizjologiczne zróżnicowanych komórek HNE i korekcja wydzielania chlorków związanych z CFTR po różnych zabiegach modulatorowych.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka nosa: biobankowanie w kontekście medycyny precyzyjnej

Human nasal epithelial (HNE) cells are easy to collect by simple, non-invasive nasal brushing. Patient-derived primary HNE cells can be amplified and ...

Protokół ten podkreśla kluczowe etapy amplifikacji, różnicowania i kriokonserwacji pierwotnych komórek nabłonka nosa. W naszych warunkach hodowli pierwotne komórki nabłonka nosa naśladują nabłonek płuc. Pozwala to na hodowle pochodzące od pacjentów i badania medycyny spersonalizowanej ze świeżych lub pochodzących z biobanków.Posiewy nabłonka nosa pochodzące od pacjenta mogą być wykorzystane do oceny aktywności CFTR i pomocy w leczeniu mukowiscydozy poprzez ocenę indywidualnej odpowiedzi pacjenta na nowe terapie. Procedurę zademonstruje Aurelie Hatton, inżynier z mojego laboratorium. Na początek wyhoduj komórki nabłonka nosa lub HNE w 10 mililitrach pożywki amplifikacyjnej.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w kolbie pokrytej kolagenem o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych, aż osiągnie zbieżność od 80 do 90%. Zmieniaj podłoże co 48 do 72 godzin. Później umyj komórki 10 mililitrami DPBS bez magnezu i wapnia.Odessać i wyrzucić sól fizjologiczną. Przed dodaniem dwóch mililitrów 0,25% trypsyny i powrotem kolby do inkubatora na osiem do 12 minut. Później mocno postukaj w kolbę dłonią, aby pomóc w odłączeniu komórki.Dodaj 10 mililitrów pożywki amplifikacyjnej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Energicznie przepłukać kolbę za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów, aby pobrać i usunąć pożywkę wzmacniającą na powierzchnię kolby w celu przepłukania i odłączenia komórek oraz zebrania komórek w probówce o pojemności 15 mililitrów. Odwirować zawiesinę komórkową o temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.Ponownie zawiesić osad w pięciu do 10 mililitrach pożywki amplifikacyjnej. Następnie policz komórki na hemocytometrze. Po zliczeniu komórek odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant.Następnie ponownie zawiesić osad we wzbogaconym podłożu zamrażającym, aby uzyskać od trzech do pięciu razy od 10 do sześciu komórek na mililitr i umieścić w kriofiolce. Powoli zamrażaj komórki, obniżając temperaturę o około jeden stopień Celsjusza na minutę w odpowiednim pojemniku do kriozamrażania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnego dnia należy przenieść zakonserwowaną próbkę do pojemnika do przechowywania azotu w celu długotrwałego przechowywania.Podgrzej świeżo przygotowane podłoże wzmacniające w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza. Wyjąć fiolki kriogeniczne ze zbiornika do przechowywania azotu i szybko umieścić je w łaźni wodnej, uważając, aby nie zanurzyć całej fiolki w wodzie. Wyjąć fiolki kriogeniczne z łaźni wodnej, gdy pozostanie tylko niewielka zamrożona kropla.Przetrzyj fiolki 70% alkoholem i umieść je pod pokrywą. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przenieś rozmrożone komórki do 15-mililitrowej probówki. Następnie dodaj jeden mililitr ciepłej pożywki amplifikacyjnej w kroplach.Po minucie dodaj kolejny mililitr pożywki amplifikacyjnej i odczekaj minutę. Dodaj 10 mililitrów pożywki amplifikacyjnej i odwiruj w temperaturze 500 razy G przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza. Odessać i wyrzucić supernatant.Ponownie zawiesić osad w objętości pożywki amplifikacyjnej wymaganej do osiągnięcia gęstości komórek od jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Po wysianiu komórek do kolby pokrytej kolagenem o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych, zawierającej pożywkę amplifikacyjną, inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Obserwuj wzrokowo ekspansję komórek przez dwa do trzech dni przed wykonaniem amplifikacji komórek, jak pokazano wcześniej.Zasiej komórki o gęstości 3,3 razy 10 do piątej komórki na filtr na porowatych filtrach pokrytych kolagenem o powierzchni 0,33 centymetra kwadratowego, uzupełnionych 300 mikrolitrami pożywki amplifikacyjnej po stronie wierzchołkowej i 900 mikrolitrów pożywki powietrznej po stronie podstawno-bocznej. Po trzech dniach odessać pożywkę wierzchołkową i hodować komórki na granicy faz powietrze-ciecz przez trzy do czterech tygodni w pożywce powietrze-ciecz, aby ustalić zróżnicowany nabłonek. Zmieniaj podłoże podstawowe co 48 do 72 godzin.Świeże komórki HNE hodowane na granicy faz powietrze-ciecz wykazywały typowe cechy spolaryzowanego i zróżnicowanego nabłonka oddechowego. W 78 próbkach komórek HNE porównano wskaźniki sukcesu w szczotkowaniu nosa wysiewanym natychmiast i po jednym do siedmiu dni transportu w pożywce płuczącej. Początkowy średni odsetek udanych kultur wynosił 82% i osiągnął 87% w próbkach wysiewanych w okresie od zera do pięciu dni.83% próbek, które z powodzeniem różnicowały się w świeżych warunkach, odniosło również sukces w próbkach kriokonserwowanych. Podobnie, w próbkach, które nie różniły się w warunkach świeżych, 71% nie powiodło się również w warunkach zamrażania i rozmrażania. Co więcej, 50% próbek zamrożonych od dwóch do trzech razy od 10 do sześciu komórek w jednej fiolce kriogenicznej nie rosło po rozmrożeniu, osiągając 80% poniżej dwóch razy 10 do sześciu komórek.W przypadku zmiany prądu zwarciowego w odpowiedzi na forskolinę i zmiany prądu zwarciowego w odpowiedzi na inhibitor CFTR 172 w komórkach HNE traktowanych DMSO, nie zaobserwowano istotnej różnicy między świeżym lub mrożonym rozmrożonym HNE. Po leczeniu oba typy komórek wykazywały znaczną korektę ze wzrostem zmiany prądu zwarciowego w odpowiedzi na forskolinę i spadkiem zmiany prądu zwarciowego w odpowiedzi na inhibitor CFTR 172. oceniono odpowiedź korekcyjną podwójnych terapii funkcji CFTR w porównaniu z komórkami HNE leczonymi DMSO, zmiana prądu zwarciowego w odpowiedzi na forskolinę i w odpowiedzi na inhibitor CFTR 172 uległa znacznej poprawie zarówno w przypadku VX-809 plus VX-770, jak i VX-661 w skojarzeniu z VX-770.Porównano trzy różne terapie modulatorami CFTR w HNE od sześciu pacjentów z homozygotą F508del. W połączeniu z korektorem i potencjometrem CFTR, zarówno modulatorami wierzchołkowymi, jak i CFTR, korygowały zmianę prądu zwarciowego w odpowiedzi na forskolinę i zmianę prądu zwarciowego w odpowiedzi na inhibitor CFTR 172 w podobnym stopniu. Podczas zamrażania komórek HNE ważne jest, aby mieć co najmniej 3 miliony komórek w fiolce kriogenicznej, aby zwiększyć szanse na dobry wynik po rozmrożeniu.Wykazano, że aktywność CFTR w komórkach HNE jest dobrym modelem predykcyjnym do oceny i dostosowania spersonalizowanych terapii w mukowiscydozie.

primary-human-nasal-epithelial-cells-biobanking-context-precision

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy tutaj metodę pobierania biopsji błony śluzowej węchowej z jam nosowych szczura i człowieka. Biopsje te mogą być wykorzystane do identyfikacji anomalii molekularnych w chorobach mózgu lub do izolacji wielopotencjalnych dorosłych komórek macierzystych, które mogą zostać użyte do transplantacji komórkowej w zwierzęcych modelach urazów i chorób mózgu.

Izolowanie komórek macierzystych węchowych z nosa gryzoni lub ludzi

Komórki nabłonka nosa, uzyskane poprzez powierzchowną biopsję zeskrobaną ludzkich ochotników, są rozszerzane i przenoszone do wkładek do hodowli tkankowych. Po osiągnięciu konfluencji komórki są hodowane na granicy faz powietrze-ciecz, dając kultury komórek rzęskowych i nierzęskowych. Zróżnicowane hodowle komórek nabłonka nosa dostarczają realnych modeli eksperymentalnych do badania błony śluzowej układu oddechowego.

Hodowla ludzkich komórek nabłonka nosa na granicy faz powietrza i cieczy

Ta publikacja demonstruje metody skutecznego pobierania próbek i hodowli błony śluzowej nabłonka nosa od dzieci oraz przeprogramowania tych komórek na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC).

Hoduj pierwotne komórki nabłonka nosa od dzieci i przeprogramuj je w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Guzy skórne są często usuwane po operacji mikrograficznej Mohsa. Opisano tutaj protokół, który umożliwia personelowi pomocniczemu klinicznemu skuteczne przetwarzanie i przechowywanie próbek guzów skóry (np. raka płaskonabłonkowego, raka podstawnokomórkowego i czerniaka) do dalszych zastosowań laboratoryjnych bez zakłócania operacji klinicznych.

Utworzenie klinicznego repozytorium biologicznego

Tutaj opisujemy metodę generowania trójwymiarowych kultur sferoidalnych ludzkich komórek nabłonka nosa. Sferoidy są następnie stymulowane do napędzania wydzielania jonów i płynów zależnych od cyscydozy Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), określając ilościowo zmianę wielkości sferoidalnego światła jako wskaźnik zastępczy dla funkcji CFTR.

Generowanie sferoid ludzkich komórek nabłonka nosa do zindywidualizowanego badania transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy

Szczegółowy protokół jest tutaj przedstawiony w celu opisania modelu organoidowego in vitro z ludzkich komórek nabłonka nosa. Protokół posiada opcje pomiarów wymagających standardowego sprzętu laboratoryjnego, z dodatkowymi możliwościami dla specjalistycznego sprzętu i oprogramowania.

Hodowla i obrazowanie ludzkich organoidów nabłonkowych nosa

Ten protokół opisuje zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie komórek nabłonka nosa do organotypowych modeli komórek nabłonka dróg oddechowych oraz kwantyfikację częstotliwości uderzeń rzęsek za pomocą obrazowania żywych komórek i niestandardowych skryptów.

Zbieranie, rozszerzanie i różnicowanie pierwotnych modeli ludzkich komórek nabłonka nosa w celu ilościowego określenia częstotliwości uderzeń rzęsek

Ostatnie postępy w protokołach różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pozwalają na stopniowe wyprowadzanie typów komórek specyficznych dla narządów. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe kroki dotyczące utrzymania i ekspansji komórek podstawnych dróg oddechowych pochodzących z iPSC oraz ich różnicowania w nabłonek śluzowo-rzęskowy w kulturach na granicy faz powietrze-ciecz.

Wytwarzanie kultur komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Nabłonek nosa jest główną barierą, z którą spotykają się wszystkie patogeny układu oddechowego. W tym miejscu przedstawiamy metody wykorzystania pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych jako kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) w celu scharakteryzowania interakcji człowieka między koronawirusem a gospodarzem w fizjologicznie istotnym systemie.

Zakażenie pierwotnych komórek nabłonka nosa hodowanych na granicy faz powietrze-ciecz w celu scharakteryzowania interakcji między człowiekiem a koronawirusem

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Poznaj metodę izolacji, wzrostu i biobankowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka nosa w interfejsie powietrze-ciecz. Technika umożliwia ocenę aktywności CFTR i personalizowane terapie mukowiscydozy.

Pierwotne ludzkie komórki nabłonka nosa: biobankowanie w kontekście medycyny precyzyjnej

Przeglądaj więcej filmów