Pierwotne ludzkie komórki nabłonka nosa: biobankowanie w kontekście medycyny precyzyjnej

Protokół ten podkreśla kluczowe etapy amplifikacji, różnicowania i kriokonserwacji pierwotnych komórek nabłonka nosa. W naszych warunkach hodowli pierwotne komórki nabłonka nosa naśladują nabłonek płuc. Pozwala to na hodowle pochodzące od pacjentów i badania medycyny spersonalizowanej ze świeżych lub pochodzących z biobanków.

Posiewy nabłonka nosa pochodzące od pacjenta mogą być wykorzystane do oceny aktywności CFTR i pomocy w leczeniu mukowiscydozy poprzez ocenę indywidualnej odpowiedzi pacjenta na nowe terapie. Procedurę zademonstruje Aurelie Hatton, inżynier z mojego laboratorium. Na początek wyhoduj komórki nabłonka nosa lub HNE w 10 mililitrach pożywki amplifikacyjnej.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla w kolbie pokrytej kolagenem o powierzchni 75 centymetrów kwadratowych, aż osiągnie zbieżność od 80 do 90%. Zmieniaj podłoże co 48 do 72 godzin. Później umyj komórki 10 mililitrami DPBS bez magnezu i wapnia.

Odessać i wyrzucić sól fizjologiczną. Przed dodaniem dwóch mililitrów 0,25% trypsyny i powrotem kolby do inkubatora na osiem do 12 minut. Później mocno postukaj w kolbę dłonią, aby pomóc w odłączeniu komórki.

Dodaj 10 mililitrów pożywki amplifikacyjnej, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną. Energicznie przepłukać kolbę za pomocą pipety o pojemności 10 mililitrów, aby pobrać i usunąć pożywkę wzmacniającą na powierzchnię kolby w celu przepłukania i odłączenia komórek oraz zebrania komórek w probówce o pojemności 15 mililitrów. Odwirować zawiesinę komórkową o temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad w pięciu do 10 mililitrach pożywki amplifikacyjnej. Następnie policz komórki na hemocytometrze. Po zliczeniu komórek odwirować komórki w temperaturze 500 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić supernatant.

Następnie ponownie zawiesić osad we wzbogaconym podłożu zamrażającym, aby uzyskać od trzech do pięciu razy od 10 do sześciu komórek na mililitr i umieścić w kriofiolce. Powoli zamrażaj komórki, obniżając temperaturę o około jeden stopień Celsjusza na minutę w odpowiednim pojemniku do kriozamrażania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnego dnia należy przenieść zakonserwowaną próbkę do pojemnika do przechowywania azotu w celu długotrwałego przechowywania.

Podgrzej świeżo przygotowane podłoże wzmacniające w łaźni wodnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza. Wyjąć fiolki kriogeniczne ze zbiornika do przechowywania azotu i szybko umieścić je w łaźni wodnej, uważając, aby nie zanurzyć całej fiolki w wodzie. Wyjąć fiolki kriogeniczne z łaźni wodnej, gdy pozostanie tylko niewielka zamrożona kropla.

Przetrzyj fiolki 70% alkoholem i umieść je pod pokrywą. Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra przenieś rozmrożone komórki do 15-mililitrowej probówki. Następnie dodaj jeden mililitr ciepłej pożywki amplifikacyjnej w kroplach.

Po minucie dodaj kolejny mililitr pożywki amplifikacyjnej i odczekaj minutę. Dodaj 10 mililitrów pożywki amplifikacyjnej i odwiruj w temperaturze 500 razy G przez dwie minuty w czterech stopniach Celsjusza. Odessać i wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad w objętości pożywki amplifikacyjnej wymaganej do osiągnięcia gęstości komórek od jednego razy 10 do sześciu komórek na mililitr. Po wysianiu komórek do kolby pokrytej kolagenem o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych, zawierającej pożywkę amplifikacyjną, inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Obserwuj wzrokowo ekspansję komórek przez dwa do trzech dni przed wykonaniem amplifikacji komórek, jak pokazano wcześniej.

Zasiej komórki o gęstości 3,3 razy 10 do piątej komórki na filtr na porowatych filtrach pokrytych kolagenem o powierzchni 0,33 centymetra kwadratowego, uzupełnionych 300 mikrolitrami pożywki amplifikacyjnej po stronie wierzchołkowej i 900 mikrolitrów pożywki powietrznej po stronie podstawno-bocznej. Po trzech dniach odessać pożywkę wierzchołkową i hodować komórki na granicy faz powietrze-ciecz przez trzy do czterech tygodni w pożywce powietrze-ciecz, aby ustalić zróżnicowany nabłonek. Zmieniaj podłoże podstawowe co 48 do 72 godzin.

Świeże komórki HNE hodowane na granicy faz powietrze-ciecz wykazywały typowe cechy spolaryzowanego i zróżnicowanego nabłonka oddechowego. W 78 próbkach komórek HNE porównano wskaźniki sukcesu w szczotkowaniu nosa wysiewanym natychmiast i po jednym do siedmiu dni transportu w pożywce płuczącej. Początkowy średni odsetek udanych kultur wynosił 82% i osiągnął 87% w próbkach wysiewanych w okresie od zera do pięciu dni.

83% próbek, które z powodzeniem różnicowały się w świeżych warunkach, odniosło również sukces w próbkach kriokonserwowanych. Podobnie, w próbkach, które nie różniły się w warunkach świeżych, 71% nie powiodło się również w warunkach zamrażania i rozmrażania. Co więcej, 50% próbek zamrożonych od dwóch do trzech razy od 10 do sześciu komórek w jednej fiolce kriogenicznej nie rosło po rozmrożeniu, osiągając 80% poniżej dwóch razy 10 do sześciu komórek.

W przypadku zmiany prądu zwarciowego w odpowiedzi na forskolinę i zmiany prądu zwarciowego w odpowiedzi na inhibitor CFTR 172 w komórkach HNE traktowanych DMSO, nie zaobserwowano istotnej różnicy między świeżym lub mrożonym rozmrożonym HNE. Po leczeniu oba typy komórek wykazywały znaczną korektę ze wzrostem zmiany prądu zwarciowego w odpowiedzi na forskolinę i spadkiem zmiany prądu zwarciowego w odpowiedzi na inhibitor CFTR 172. oceniono odpowiedź korekcyjną podwójnych terapii funkcji CFTR w porównaniu z komórkami HNE leczonymi DMSO, zmiana prądu zwarciowego w odpowiedzi na forskolinę i w odpowiedzi na inhibitor CFTR 172 uległa znacznej poprawie zarówno w przypadku VX-809 plus VX-770, jak i VX-661 w skojarzeniu z VX-770.

Porównano trzy różne terapie modulatorami CFTR w HNE od sześciu pacjentów z homozygotą F508del. W połączeniu z korektorem i potencjometrem CFTR, zarówno modulatorami wierzchołkowymi, jak i CFTR, korygowały zmianę prądu zwarciowego w odpowiedzi na forskolinę i zmianę prądu zwarciowego w odpowiedzi na inhibitor CFTR 172 w podobnym stopniu. Podczas zamrażania komórek HNE ważne jest, aby mieć co najmniej 3 miliony komórek w fiolce kriogenicznej, aby zwiększyć szanse na dobry wynik po rozmrożeniu.

Wykazano, że aktywność CFTR w komórkach HNE jest dobrym modelem predykcyjnym do oceny i dostosowania spersonalizowanych terapii w mukowiscydozie.