Zastosowanie dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym detergentu w celu potwierdzenia niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych

Ogólnym celem tej dwuwymiarowej, częściowo denaturującej elektroforezy w żelu agarozowym jest potwierdzenie niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych, obserwowanej podczas tradycyjnego SDD-AGE. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie amyloidu lub agregacji białek, takie jak to, czy niejednorodność wielkości obserwowana podczas tradycyjnego SDD-AGE jest natywnym stanem włókien in vivo, czy też wynikiem degradacji lub dysocjacji białek podczas elektroforezy żelowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją łatwo wykonać w laboratorium bez specjalistycznego sprzętu.

Nie jest wymagane żadne dodatkowe wyposażenie poza tym, które jest używane w tradycyjnym SDD-AGE. Najpierw umieść wytwarzające amyloid komórki raka jelita grubego HT-29 w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej. Następnie inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, użyj soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, aby umyć komórki. Następnie dodaj trzy mililitry trypsyny do komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Po odłączeniu komórek od naczynia hodowlanego dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej na płytkę.

Następnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej rurki. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 1 000 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej.

Policz komórki za pomocą licznika komórek. Następnie pozostaw na noc dwie płytki hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj odczynniki TSZ do jednej z naczyń hodowlanych jako leczenie.

Po około sześciu godzinach zbierz komórki za pomocą plastikowego skrobaka. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj przy 1000 razy g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dwukrotnie przemyj osad komórkowy 10 mililitrami lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i powtórz proces wirowania.

Następnie odessać roztwór PBS i przenieść osad komórek do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Dodaj 0,3 mililitra buforu do lizy do osadu komórkowego i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Ponownie odwirować przy 20 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Otrzymanym supernatantem jest lizat całego organizmu komórkowego. Do supernatantu dodać 4x bufor SDD-AGE, aby przygotować 20 mikrolitrów po trzy mikrogramy na mikrolitr próbki. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Aby przygotować żel, dodaj dwa gramy proszku agarozy do 200 mililitrów buforu TAE w szklanej zlewce. Następnie podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę. Następnie dodaj jeden mililitr 20%SDS do końcowego stężenia 0,1%Delikatnie zakręć zlewką.

Następnie wlej płynną agarozę na płytę żelową o wymiarach 15 na 14 centymetrów. Aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, użyj pipety o pojemności jednego mililitra. Następnie umieść 20-dołkowy grzebień na żelu.

Następnie dodaj około 60 mikrogramów lizatu pełnokomórkowego w skrajnym prawym pasie żelu. Uruchom żel pod napięciem 60 V przez około cztery godziny, używając buforu TAE zawierającego 0,1% SDS jako bufora bieżącego. Aby uruchomić żel w drugim wymiarze, ostrożnie obróć żel o 90 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.

Następnie uruchom żel pod napięciem 60 woltów przez około cztery godziny. W pojemniku o wymiarach 20 na 20 centymetrów dodaj 500 mililitrów buforu transferowego. Tuż obok pojemnika przygotuj pięciocentymetrowy stos ręczników papierowych.

Następnie namocz dwie bibuły filtracyjne, każda o wymiarach 14 na 15 centymetrów, w buforze transferowym i umieść na stosie ręczników papierowych. Aktywuj membranę PVDF o wymiarach 14 na 15 centymetrów w metanolu na 30 sekund. Po aktywacji umieść membranę na bibule filtracyjnej i użyj wałka, aby usunąć wszystkie pęcherzyki.

Najważniejszą częścią transferu jest upewnienie się, że między żelem a membraną nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Spłucz żel buforem transferowym i ułóż go na wierzchu membrany. Rozwałkuj wszystkie powstałe bąbelki.

Następnie użyj folii plastikowej, aby przykryć krawędź ręczników papierowych znajdujących się najbliżej pojemnika buforowego do przenoszenia. Następnie namocz kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 15 na 35 centymetrów w buforze transferowym. Umieścić bibułę filtracyjną w taki sposób, aby jeden koniec zakrywał górną część żelu, a drugi koniec znajdował się w pojemniku buforowym do przenoszenia.

Przykryj pojemnik folią spożywczą i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia przepłucz membranę 50 mililitrami PBST w pojemniku o wymiarach 20 na 20 centymetrów. Następnie dodaj 20 mililitrów 5% mleka w PBST na membranie.

Następnie pozostaw membranę na bujaku w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby się zablokowała. Odpipetować 10 mikrolitrów króliczego przeciwciała anty-MLKL do 20 mililitrów 5% mleka w PBST. Następnie dodaj mieszaninę przeciwciał na membranę.

Inkubuj membranę na bujaku przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyj membranę 20 mililitrami PBST przez pięć minut. To pranie powtarza się pięć razy.

Następnie odpipetuj cztery mikrolitry przeciwciała anty-króliczego HRP do 20 mililitrów 5% mleka w PBST. Dodaj przeciwciało na membranie. Pozostaw pojemnik z membraną na bujaku w temperaturze pokojowej na dwie godziny.

Po dwóch godzinach umyj membranę pięć razy w 20 mililitrach PBST przez pięć minut każdy. Na koniec dodaj wzmocniony substrat chemiluminescencyjny na membranę. Następnie należy naświetlić membranę folią rentgenowską zgodnie z zaleceniami producenta.

Badanie to ma na celu wykazanie obecności opornych na SDS włókien amyloidopodobnych w lizatach całych komórek uzyskanych z komórek leczonych czynnikiem martwicy nowotworu alfa. Pokazuje to tutaj, że RIPK1 i RIPK3 wykazują podobne, identyczne wzorce podobne do amyloidu. Co ciekawe, włókna MLKL wydają się niejednorodne i mają inny wzorzec migracji niż inne.

Obraz ten pokazuje możliwy wzorzec migracji włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych. W pierwszym wymiarze SDD-AGE włókna amyloidowe lub podobne do amyloidu wykazują charakterystyczny rozmaz. Na tym obrazie włókna migrują identycznie w drugim przebiegu i wykazują ukośny wzór migracji na membranie pod kątem 45 stopni.

Pokazuje to, że włókna nie ulegają degradacji ani dysocjacji podczas procesu pracy żelu. Wręcz przeciwnie, jeśli włókna dysocjują, poniżej linii ukośnej pojawiają się pionowe smugi, co wskazuje na szybszą migrację mniejszych włókien podczas drugiej elektroforezy. Zarówno pierwszy, jak i drugi wymiar SDD-AGE pokazują, że włókna MLKL nie dysocjują podczas procesu SDD-AGE i rzeczywiście różnią się od włókien RIPK1 i RIPK3.

Na tym zdjęciu włókna MLKL wykazują charakterystyczny rozmaz podczas pierwszego wymiaru. Jednak te same włókna wykazują ostrą ukośną linię bez pionowych smug w drugim wymiarze SDD-AGE. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że wszystkie warunki, takie jak napięcie i długość przebiegu, pozostają takie same między pierwszym a drugim wymiarem, aby zapewnić ostrą linię pod kątem 45 stopni.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak usunięcie błony i ponowne sondowanie innymi przeciwciałami, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy błonnik zawiera inne białka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak potwierdzić, że podczas tradycyjnego SDD-AGE nie zachodzi degradacja lub dysocjacja włókien amyloidowych lub podobnych do amyloidu.