Name: Zastosowanie dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym detergentu w celu potwierdzenia niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj dwuwymiarową półdenaturującą elektroforezę w żelu agarozowym detergentu do badania niejednorodności wielkości włókien amyloidowych. Ta metoda potwierdza, czy zmiany wielkości są cechą natywną, czy artefaktem eksperymentalnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez stypendium dla S.H.-A. z NIH/NCATS (TL1TR001104), grant Fundacji Welch (I-1827) i grant R01 od NIGMS (RGM120502A) dla Z.W. Z.W. jest stypendystą Virginia Murchison Linthicum w dziedzinie badań medycznych oraz profilaktyki i badań nad rakiem w Teksasie (R1222).

1. Przygotuj próbki
<ol>
	<li>Hodowla 2 x 106 komórek raka jelita grubego HT-29 wytwarzających amyloid w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej i penicyliny-streptomycyny. Hodować komórki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
	<ol>
		<li>Po tym, jak komórki osiągną 80% zlewności, umyj je 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodać 3 ml roztworu trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.</li>
		<li>Po całkowitym odłączeniu komórek od naczynia dodać 10 ml pożywki hodowlanej i przenieść komórki za pomocą pipety o pojemności 10 ml do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Odessać pożywkę, ponownie zawiesić komórki w 5 ml pożywki hodowlanej i policzyć komórki za pomocą licznika komórek. Talerz 2 x 10 6 komórek w każdej z dwóch 10-centymetrowych naczyń.</li>
		<li>Pozostawić komórki do przylegania i zregenerować się przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Zastosuj leczenie do jednego naczynia, aby indukować tworzenie amyloidów za pomocą 20 ng / ml czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α), 100 nM Smac-mimetic i 20 μM inhibitora pan-kaspazy Z-VAD-FMK11. Kombinacja jest w skrócie TSZ. Drugą potrawę z pojazdem traktuj jako kontrolę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po upływie odpowiedniego czasu, zwykle 6 godzin, należy pobrać lizat komórkowy.
	<ol>
		<li>Zeskrob komórki z płytki za pomocą plastikowego skrobaka i za pomocą pipety o pojemności 10 ml przenieś do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki w temperaturze 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przemyć komórki 2 razy, ponownie zawieszając w 10 ml lodowatego PBS i odwirowując przy 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Odessać roztwór PBS. 
		Uwaga: W tym miejscu proces można wstrzymać, zamrażając osad komórkowy w ciekłym azocie i przechowując go w temperaturze ˗80 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
		<li>Przenieś osad komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i inkubuj w 0,3 ml buforu do lizy przez 30 minut na lodzie. Wirować przy 20 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Supernatantem jest lizat całego komórki. 
		Uwaga: W tym miejscu proces można wstrzymać, przechowując próbkę w temperaturze -20 °C przez okres do kilku miesięcy.</li>
		<li>Zmierz stężenie białka za pomocą testu Bradforda zgodnie z protokołem producenta. Dodać 4x bufor ładujący SDD-AGE, aby przygotować 20 μl próbki 3 μg/μL i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotuj i uruchom żele
<ol>
	<li>Dodaj 2 g agarozy do 200 ml 1x buforu tris-octanowego (TAE) w szklanej zlewce i podgrzej w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę. Dodaj 1 ml 20% SDS, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1% SDS. Ostrożnie zamieszaj, aby wymieszać. Uważaj, aby nie generować bąbelków po dodaniu SDS.</li>
	<li>Wlej roztwór agarozy do płyty żelowej o wymiarach 15 cm x 14 cm. Użyj pipety o pojemności 1 ml, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Umieść jeden 20-dołkowy grzebień na górze.</li>
	<li>Pierwszy wymiar: Odpipetować 60 μg lizatu pełnokomórkowego na skrajnym prawym pasie. Uruchom żel pod napięciem 60 V przez około 4 godziny (do momentu, gdy czoło barwnika przejdzie przez żel w około 3/4), używając TAE zawierającego 0,1% SDS jako buforu bieżącego.</li>
	<li>Drugi wymiar: Ostrożnie obróć żel o 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). Uruchom żel pod napięciem 60 V przez około 4 godziny 
	Uwaga: Ogólne warunki pracy to długość żelu 4 V/cm. Ważne jest, aby warunki pracy były dokładnie takie same dla pierwszego i drugiego wymiaru.</li>
</ol>
3. Transfer
<ol>
	<li>Użyj metody transferu kapilarnego, aby przenieść białka do membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 2B).
	<ol>
		<li>Dodać 500 ml buforu transferowego do pojemnika o wymiarach około 20 cm x 20 cm. Ułóż obok pojemnika stos ręczników papierowych o wysokości 5 cm. Powierzchnia górnej części stosu musi być większa niż wymiary żelu.</li>
		<li>Namocz bibułę filtracyjną o wymiarach 14 cm x 15 cm w buforze transferowym i umieść na stosie ręczników papierowych. Uważaj, aby umieścić na papierze bez zmarszczek i pęcherzyków. Powtórz z kolejnym kawałkiem bibuły filtracyjnej.</li>
		<li>Aktywuj membranę PVDF o wymiarach 14 cm x 15 cm w metanolu przez 30 sekund, a następnie ułóż ją na bibule filtracyjnej, uważając, aby użyć wałka do usunięcia wszystkich pęcherzyków. Spłucz żel buforem transferowym i ułóż go na wierzchu membrany, ponownie rozwałkowując wszelkie pęcherzyki.</li>
		<li>Przykryj krawędź ręczników papierowych najbliżej pojemnika bufora transferowego folią spożywczą. Ważne jest, aby mostek papierowy zbudowany w kolejnym kroku nie stykał się bezpośrednio ze stosem ręczników papierowych.</li>
		<li>Namocz kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 15 cm x 35 cm w buforze transferowym i umieść go tak, aby jeden koniec zakrywał górną część żelu, a drugi koniec znajdował się w pojemniku buforu transferowego. Powtórz z innym mostkiem.</li>
		<li>Przykryj pojemnik folią spożywczą i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Wykrywanie Western Blotting
<ol>
	<li>Przepłukać membranę 50 ml PBS zawierającego 0,05% Tween-20 (PBST) w pojemniku o średnicy 20 cm × 20 cm. Dodaj 20 ml mleka 5% do PBST. Kołysz w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby zablokować.</li>
	<li>Odpipetować 10 μl króliczego przeciwciała anty-MLKL do 20 ml 5% mleka w PBST i dodać do pojemnika. Inkubować na bujaku przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Płukać membranę w 20 ml PBST przez 5 minut. Powtórzyć 5 razy.</li>
	<li>Odpipetować 4 μl anty-króliczej HRP do 20 ml 5% mleka w PBST i dodać do pojemnika. Inkubować na bujaku w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Płukać membranę w 20 ml PBST przez 5 minut. Powtórzyć 5 razy.</li>
	<li>Dodaj ulepszony substrat chemiluminescencyjny (ECL) i wystaw na klisze rentgenowskie zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature medicine. 10, 10-17 (2004).</li>
<li>Hou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAVS+forms+functional+prion-like+aggregates+to+activate+and+propagate+antiviral+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response.</a> Cell. 146, 448-461 (2011).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RIP1%2FRIP3+necrosome+forms+a+functional+amyloid+signaling+complex+required+for+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis.</a> Cell. 150, 339-350 (2012).</li>
<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL+forms+disulfide+bond-dependent+amyloid-like+polymers+to+induce+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).</li>
<li>Uptain, S. M., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions+as+protein-based+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Prions as protein-based genetic elements.</a> Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).</li>
<li>Halfmann, R., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+amyloid+aggregation+by+Semi-Denaturing+Detergent-Agarose+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+2014%3A+Amyloid+fibril+proteins+and+clinical+classification+of+the+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid+%3A+the+international+journal+of+experimental+and+clinical+investigation+%3A+the+official+journal+of+the+International+Society+of+Amyloidosis%22%5BJournal%5D)">Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis.</a> Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).</li>
<li>Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Studies+of+Amyloid+Proteins+at+the+Molecular+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level.</a> Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).</li>
<li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687906120030">Methods in Enzymology</a>. 412, Academic Press. 33-48 (2006).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+lineage+kinase+domain-like+protein+mediates+necrosis+signaling+downstream+of+RIP3+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase.</a> Cell. 148, 213-227 (2012).</li>
<li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+interacting+protein+kinase-3+determines+cellular+necrotic+response+to+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha.</a> Cell. 137, 1100-1111 (2009).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Najbardziej krytycznym aspektem 2D SDD-AGE jest to, że warunki elektroforezy są takie same dla pierwszego i drugiego wymiaru. Zdolność do wykrycia ostrej linii ukośnej pod kątem 45° (wskazującej, że nie nastąpiła dysocjacja lub degradacja) zależy od włókien migrujących w identyczny sposób podczas obu elektroforezy. Stosowanie różnych warunków, na przykład zmiana napięcia lub długości czasu pracy, zaciemni te wyniki. Ponadto, podobnie jak w przypadku tradycyjnego 1D SDD-AGE, należy unikać gotowania próbki, ponieważ spowod...

Od dawna wiadomo, że powstawanie włókien amyloidowych w wyniku nieprawidłowego fałdowania białek odgrywa rolę w stanach patologicznych, takich jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona i choroba Huntingtona1. Ostatnio wykazano, że tworzenie włókien amyloidowych lub podobnych do amyloidu jest częścią szlaków sygnałowych u ludzi, w tym podczas przeciwwirusowej wrodzonej odpowiedzi immunologicznej2 i nekroptozy3,4, oraz w organizmach niższych, takich jak drożdże5,6. Dlatego ważna jest możliwość wykrycia tych włókien w laboratorium. Obecnie istnieją trzy główne sposoby wykrywania włókien amyloidowych i amyloidopodobnych: użycie barwników, EM i SDD-AGE.
Użycie barwników, takich jak czerwień Kongo czy tioflawina T, ma tę zaletę, że jest szybkie i łatwe do wykrycia za pomocą mikroskopii lub spektroskopii7. Jednak detekcja za pomocą mikroskopii, w przypadku czerwieni kongijskiej, nie dostarcza żadnych informacji na temat tego, które białka składają się na włókna, ani jaka jest ich wielkość. Podobnie, zastosowanie spektroskopii do wykrywania wiązania czerwieni Kongo lub tioflawiny T z kompleksami białkowymi daje tylko wynik dodatni lub negatywny.
EM dostarcza rozstrzygających dowodów na obecność włókien, a także ilościowych informacji na temat długości i średnicy włókna8. Jednak ta metoda wymaga bardzo rygorystycznego oczyszczania. Dodatkowo EM jest specjalistyczną techniką, która wykorzystuje drogi sprzęt.
SDD-AGE został użyty do wykrywania odpornych na SDS mega daltonowych kompleksów białkowych, w tym włókien amyloidowych lub amyloidowych. Ma wiele zalet. Po pierwsze, nie wymaga oczyszczania włókien i jest łatwy do uformowania9. Po drugie, dostarcza jakościowych informacji o wielkości włókien, w tym względnej wielkości i ilości niejednorodności włókien. Wreszcie, ponieważ Western blot można przeprowadzić po elektroforezie, łatwo jest wykryć obecność dowolnego białka, dla którego istnieje przeciwciało, chociaż należy zauważyć, że ponieważ SDD-AGE jest częściowo denaturujący, niektóre epitopy mogą pozostać ukryte, co komplikuje wykrywanie przez przeciwciało.
Ostatnio donoszono, że kinazy białkowe 1 (RIPK1) i 3 (RIPK3) oddziałujące z receptorami tworzą włókna amyloidowe, które służą jako platformy sygnalizacyjne podczas nekroptozy, zaprogramowanej formy martwicy3. Podczas badania tych włókien nasze laboratorium wykazało, że inne białko związane z nekroptozą, kinaza mieszana (MLKL), również tworzy włókna podobne do amyloidu4. Jednak po zbadaniu za pomocą SDD-AGE, rozmiar włókien MLKL wydawał się różny od włókien RIPK1 i RIPK3, które wydawały się identyczne ze sobą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Było to nieoczekiwane, ponieważ powszechnie wiadomo, że MLKL wiąże się z RIPK1/RIPK3, tworząc kompleks sygnalizacyjny nekroptozy zwany necrosome10.
Istnieją co najmniej dwa wyjaśnienia. Po pierwsze, podczas nekroptozy mogą powstać dwa całkowicie odrębne włókna podobne do amyloidu, z których jeden zawiera RIPK1/RIPK3, a drugi MLKL. Po drugie, tylko jeden rodzaj włókien podobnych do amyloidu zawierających RIPK1 / RIPK3 / MLKL może powstać podczas nekroptozy, ale asocjacja MLKL z innymi białkami jest na tyle słaba, że dysocjuje podczas SDD-AGE.
Aby rozwiązać ten problem, proponujemy przeprowadzenie dwuwymiarowego (2D) WIEKU SDD. Włókna amyloidowe lub podobne do amyloidu stabilne w SDD-AGE będą miały ten sam wzorzec migracji podczas elektroforezy pierwszego i drugiego wymiaru. Będzie to wykrywalne po przeniesieniu białek do błony i przeprowadzeniu Western blot. Stabilne włókna będą miały ostry ukośny wzór. Jakiekolwiek odchylenie od tego sugerowałoby, że włókna ulegają zmianom w wyniku elektroforezy SDS.

<table><tbody><tr><td>Urządzenie do elektroforezy żelowej</td><td>Fisher</td><td>HE99XPRO</td><td>apratusa do biegania żelowego.</td></tr><tr><td>agroza</td><td>VWR</td><td>97062-250</td><td>Do żelu agarozowego.</td></tr><tr><td>wieża papierowa</td><td>Fisher</td><td>19-120-2484</td><td>do przenoszenia</td></tr><tr><td>bibuły filtracyjnej</td><td>VWR</td><td>21427-386</td><td>do przenoszenia</td></tr><tr><td>membrany PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td>do przenoszenia blokującego</td></tr><tr><td>mleko w proszku</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404XTU</td><td>do blokowania w Western blot</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-MLKL</td><td>Genetex</td><td>GTX107538</td><td>królik</td></tr><tr><td>Przeciwciało RIPK1</td><td>BD Biosciences</td><td>610459</td><td>mysie przeciwciało anty-RIPK1</td></tr><tr><td>Przeciwciało RIPK3</td><td>prezent od dr Xiaodong Wang</td><td></td><td>królik anty-RIPK3. Patrz Ostrzeżenie 11.</td></tr><tr>przeciwciało <td>drugorzędowe</td> <td>anty-Rabbit-HRP</td><td>Sigma</td><td>A6154</td></tr><tr><td>ECL</td><td>Fisher</td><td>WBKLS0500</td><td>Zachodni chemiluminescencyjny substrat HRP</td></tr><tr><td>Film rentgenowski</td><td>Fisher</td><td>F-BX810</td><td>do wyniku Western blot</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>płodowej surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td>do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>penicyna-streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>PBS do hodowli tkankowych</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td>do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>rekombinowany TNF</td><td>wykonany w naszym laboratorium</td><td></td><td>do indukowania nekroptozy. Patrz odniesienie 11.</td></tr><tr><td>smac-mimetyczny</td><td>prezent od dr Xiaodong Wang</td><td></td><td>do wywoływania nekroptozy. Patrz odniesienie 11.</td></tr><tr><td>ZVAD-FMK</td><td>ApexBio</td><td>A1902</td><td>do indukowania nekroptozy. Patrz odniesienie 11.</td></tr><tr><td>Licznik komórek</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>1450102 Model TC20; do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Pierce&trade; Zestaw do oznaczania białek BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>do pomiaru stężenia białka w lizatach komórkowych</td></tr><tr><td>Podnośnik komórek</td><td>Fisher</td><td>07-200-364</td><td>do usuwania komórek z naczynia</td></tr><tr><td>Bufor do lizy (1 l)</td><td></td><td></td><td>20 ml 1 M Tris pH 7,4 10 ml glicerolu 30 ml 5 M NaCl 840 ml ddH2O 10 mL Triton-X100 (inhibitory proteazy i fosforanów według uznania)</td></tr><tr><td>10X TAE (1 L)</td><td></td><td></td><td>48,4 g Tris zasada 11,42 ml lodowaty kwas octowy 20 ml 0,5 M EDTA pH 8 ddH20 do 1 L</td></tr><tr><td>4X SDD-AGE bufor ładujący (50 ml)</td><td></td><td></td><td>5 ml 10X TAE 10 ml glicerolu 4 ml 20% SDS 0,5 ml 10% błękitu bromofenolowego 31 ml ddH2O</td></tr><tr><td>TBS Bufor transferowy (1 l)</td><td></td><td></td><td>20 ml 1 M Tris pH 7,4 30 ml 5 M NaCl 950 ml ddH2O</td></tr><tr><td>Bufor do płukania PBST (1 l)</td><td></td><td></td><td>100 ml 10xPBS 800 ml ddH2O 1 mL Tween20</td></tr><tr><td>10X PBS (10 l)</td><td></td><td></td><td>800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4&middot; 2H2O 24 g KH2PO4 dodać ddH2O do 10 L</td></tr></tbody></table>

zastosowanie dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym detergentu w celu potwierdzenia niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Włókna amyloidowe lub podobne do amyloidu były związane z wieloma ludzkimi chorobami, a teraz odkrywa się, że są ważne dla wielu szlaków sygnałowych. Zdolność do łatwego wykrywania powstawania tych włókien w różnych warunkach eksperymentalnych jest niezbędna do zrozumienia ich potencjalnej funkcji. Do wykrywania włókien zastosowano wiele metod, ale nie obyło się bez pewnych wad. Na przykład mikroskopia elektronowa (EM) lub barwienie czerwienią Kongo lub tioflawiną T często wymaga oczyszczenia włókien. Z drugiej strony, półdenaturująca elektroforeza w żelu agarozowym (SDD-AGE) umożliwia wykrywanie opornych na SDS włókien amyloidowych w ekstraktach komórkowych bez oczyszczania. Ponadto pozwala na porównanie różnicy wielkości włókien. Co ważniejsze, można go wykorzystać do identyfikacji określonych białek we włóknach za pomocą Western blotting. Jest to mniej czasochłonne i łatwiej dostępne dla większej liczby laboratoriów. Wyniki SDD-AGE często wykazują zmienny stopień niejednorodności. Nasuwa się pytanie, czy część niejednorodności wynika z dysocjacji kompleksu białkowego podczas elektroforezy w obecności SDS. Z tego powodu zastosowaliśmy drugi wymiar SDD-AGE, aby określić, czy niejednorodność wielkości obserwowana w SDD-AGE jest naprawdę wynikiem heterogeniczności włókien in vivo, a nie wynikiem degradacji lub dysocjacji niektórych białek podczas elektroforezy. Metoda ta pozwala na szybkie, jakościowe potwierdzenie, że włókna amyloidowe lub podobne do amyloidu nie dysocjują częściowo podczas procesu SDD-AGE.

Po indukcji nekroptozy białka RIPK1 i RIPK3 wykazały niemal identyczne wzory amyloidopodobne (ścieżki 2 i 4, Rycina 1). Jednak włókna MLKL były bardziej heterogeniczne i wydawały się mniejsze od włókien RIPK1/RIPK3 (ścieżka 6, Rycina 1). Skłoniło nas to do opracowania metody 2D SDD-AGE, aby sprawdzić, czy MLKL tworzy włókna niezależne od RIPK1/RIPK3, czy też MLKL po prostu dysocjuje z dużych włókien RIPK1/RIPK3/MLKL podczas SDD-A...

Tutaj używamy dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym, aby potwierdzić obecność włókien podobnych do amyloidu o niejednorodnej wielkości i wykluczyć możliwość, że niejednorodność wielkości jest spowodowana dysocjacją włókien amyloidowych podczas procesu działania żelu.

Zastosowanie dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym detergentu w celu potwierdzenia niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Ogólnym celem tej dwuwymiarowej, częściowo denaturującej elektroforezy w żelu agarozowym jest potwierdzenie niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych, obserwowanej podczas tradycyjnego SDD-AGE. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie amyloidu lub agregacji białek, takie jak to, czy niejednorodność wielkości obserwowana podczas tradycyjnego SDD-AGE jest natywnym stanem włókien in vivo, czy też wynikiem degradacji lub dysocjacji białek podczas elektroforezy żelowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją łatwo wykonać w laboratorium bez specjalistycznego sprzętu.Nie jest wymagane żadne dodatkowe wyposażenie poza tym, które jest używane w tradycyjnym SDD-AGE. Najpierw umieść wytwarzające amyloid komórki raka jelita grubego HT-29 w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej. Następnie inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, użyj soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, aby umyć komórki. Następnie dodaj trzy mililitry trypsyny do komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy minuty. Po odłączeniu komórek od naczynia hodowlanego dodaj 10 mililitrów pożywki hodowlanej na płytkę.Następnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej rurki. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 1 000 g przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach pożywki hodowlanej.Policz komórki za pomocą licznika komórek. Następnie pozostaw na noc dwie płytki hodowlane w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj odczynniki TSZ do jednej z naczyń hodowlanych jako leczenie.Po około sześciu godzinach zbierz komórki za pomocą plastikowego skrobaka. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej stożkowej probówki i odwiruj przy 1000 razy g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie dwukrotnie przemyj osad komórkowy 10 mililitrami lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i powtórz proces wirowania.Następnie odessać roztwór PBS i przenieść osad komórek do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Dodaj 0,3 mililitra buforu do lizy do osadu komórkowego i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Ponownie odwirować przy 20 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Otrzymanym supernatantem jest lizat całego organizmu komórkowego. Do supernatantu dodać 4x bufor SDD-AGE, aby przygotować 20 mikrolitrów po trzy mikrogramy na mikrolitr próbki. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.Aby przygotować żel, dodaj dwa gramy proszku agarozy do 200 mililitrów buforu TAE w szklanej zlewce. Następnie podgrzej zlewkę w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę. Następnie dodaj jeden mililitr 20%SDS do końcowego stężenia 0,1%Delikatnie zakręć zlewką.Następnie wlej płynną agarozę na płytę żelową o wymiarach 15 na 14 centymetrów. Aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, użyj pipety o pojemności jednego mililitra. Następnie umieść 20-dołkowy grzebień na żelu.Następnie dodaj około 60 mikrogramów lizatu pełnokomórkowego w skrajnym prawym pasie żelu. Uruchom żel pod napięciem 60 V przez około cztery godziny, używając buforu TAE zawierającego 0,1% SDS jako bufora bieżącego. Aby uruchomić żel w drugim wymiarze, ostrożnie obróć żel o 90 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.Następnie uruchom żel pod napięciem 60 woltów przez około cztery godziny. W pojemniku o wymiarach 20 na 20 centymetrów dodaj 500 mililitrów buforu transferowego. Tuż obok pojemnika przygotuj pięciocentymetrowy stos ręczników papierowych.Następnie namocz dwie bibuły filtracyjne, każda o wymiarach 14 na 15 centymetrów, w buforze transferowym i umieść na stosie ręczników papierowych. Aktywuj membranę PVDF o wymiarach 14 na 15 centymetrów w metanolu na 30 sekund. Po aktywacji umieść membranę na bibule filtracyjnej i użyj wałka, aby usunąć wszystkie pęcherzyki.Najważniejszą częścią transferu jest upewnienie się, że między żelem a membraną nie tworzą się pęcherzyki powietrza. Spłucz żel buforem transferowym i ułóż go na wierzchu membrany. Rozwałkuj wszystkie powstałe bąbelki.Następnie użyj folii plastikowej, aby przykryć krawędź ręczników papierowych znajdujących się najbliżej pojemnika buforowego do przenoszenia. Następnie namocz kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 15 na 35 centymetrów w buforze transferowym. Umieścić bibułę filtracyjną w taki sposób, aby jeden koniec zakrywał górną część żelu, a drugi koniec znajdował się w pojemniku buforowym do przenoszenia.Przykryj pojemnik folią spożywczą i pozostaw na noc w temperaturze pokojowej. Następnego dnia przepłucz membranę 50 mililitrami PBST w pojemniku o wymiarach 20 na 20 centymetrów. Następnie dodaj 20 mililitrów 5% mleka w PBST na membranie.Następnie pozostaw membranę na bujaku w temperaturze pokojowej na 30 minut, aby się zablokowała. Odpipetować 10 mikrolitrów króliczego przeciwciała anty-MLKL do 20 mililitrów 5% mleka w PBST. Następnie dodaj mieszaninę przeciwciał na membranę.Inkubuj membranę na bujaku przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyj membranę 20 mililitrami PBST przez pięć minut. To pranie powtarza się pięć razy.Następnie odpipetuj cztery mikrolitry przeciwciała anty-króliczego HRP do 20 mililitrów 5% mleka w PBST. Dodaj przeciwciało na membranie. Pozostaw pojemnik z membraną na bujaku w temperaturze pokojowej na dwie godziny.Po dwóch godzinach umyj membranę pięć razy w 20 mililitrach PBST przez pięć minut każdy. Na koniec dodaj wzmocniony substrat chemiluminescencyjny na membranę. Następnie należy naświetlić membranę folią rentgenowską zgodnie z zaleceniami producenta.Badanie to ma na celu wykazanie obecności opornych na SDS włókien amyloidopodobnych w lizatach całych komórek uzyskanych z komórek leczonych czynnikiem martwicy nowotworu alfa. Pokazuje to tutaj, że RIPK1 i RIPK3 wykazują podobne, identyczne wzorce podobne do amyloidu. Co ciekawe, włókna MLKL wydają się niejednorodne i mają inny wzorzec migracji niż inne.Obraz ten pokazuje możliwy wzorzec migracji włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych. W pierwszym wymiarze SDD-AGE włókna amyloidowe lub podobne do amyloidu wykazują charakterystyczny rozmaz. Na tym obrazie włókna migrują identycznie w drugim przebiegu i wykazują ukośny wzór migracji na membranie pod kątem 45 stopni.Pokazuje to, że włókna nie ulegają degradacji ani dysocjacji podczas procesu pracy żelu. Wręcz przeciwnie, jeśli włókna dysocjują, poniżej linii ukośnej pojawiają się pionowe smugi, co wskazuje na szybszą migrację mniejszych włókien podczas drugiej elektroforezy. Zarówno pierwszy, jak i drugi wymiar SDD-AGE pokazują, że włókna MLKL nie dysocjują podczas procesu SDD-AGE i rzeczywiście różnią się od włókien RIPK1 i RIPK3.Na tym zdjęciu włókna MLKL wykazują charakterystyczny rozmaz podczas pierwszego wymiaru. Jednak te same włókna wykazują ostrą ukośną linię bez pionowych smug w drugim wymiarze SDD-AGE. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że wszystkie warunki, takie jak napięcie i długość przebiegu, pozostają takie same między pierwszym a drugim wymiarem, aby zapewnić ostrą linię pod kątem 45 stopni.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak usunięcie błony i ponowne sondowanie innymi przeciwciałami, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy błonnik zawiera inne białka. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak potwierdzić, że podczas tradycyjnego SDD-AGE nie zachodzi degradacja lub dysocjacja włókien amyloidowych lub podobnych do amyloidu.

use-two-dimensional-semi-denaturing-detergent-agarose-gel

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

SDD-AGE jest użyteczną techniką wykrywania i charakteryzacji polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Przedstawiamy tutaj adaptację, która sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań na szeroką skalę.

Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

Ten film demonstruje procedurę separacji siarczanów heparanu wyizolowanych z tkanki płucnej myszy za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika analityczna do wykrywania siarczanów heparanu o różnej długości łańcucha wyizolowanych z tkanki płucnej myszy

Ten film demonstruje technikę denaturacji białek na bazie poliakrylamidu. Technika ta pomaga we wstępnej identyfikacji białek na podstawie ich mas cząsteczkowych.

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu do analizy białek: technika oddzielania i wizualizacji białek na podstawie masy cząsteczkowej

Ten film demonstruje dwuwymiarową, częściowo denaturującą separację włókien amyloidowych za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym detergentu. Technika ta polega na oddzieleniu polimorficznych agregatów amyloidowych na podstawie ich niejednorodnego rozmiaru.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu agarozowym częściowo denaturującym: technika rozdzielania polimorficznych włókien amyloidowych na podstawie niejednorodności wielkości

W tym filmie demonstrujemy dwuwymiarową metodę elektroforezy żelowej, która oddziela pojedyncze białka od złożonej mieszaniny białek uzyskanej z tkanek nowotworowych ludzkiego niefunkcjonalnego gruczolaka przysadki (NFPA). Białka są rozdzielane na podstawie ich ładunku elektrycznego w pierwszym wymiarze i dalej rozdzielane na podstawie mas cząsteczkowych w drugim wymiarze.

Dwuwymiarowa elektroforeza w żelu poliakrylamidowym: technika rozdzielania do analizy białek w złożonej mieszaninie białek na podstawie ładunku i masy cząsteczkowej

Ten raport opisuje techniki izolacji i oczyszczania siarczanowych glikozaminoglikanów (GAG) z próbek biologicznych oraz metodę elektroforezy w żelu poliakrylamidowym w celu przybliżenia ich wielkości. GAG przyczyniają się do budowy tkanek i wpływają na procesy sygnalizacyjne poprzez oddziaływanie elektrostatyczne z białkami. Długość polimeru GAG przyczynia się do ich powinowactwa do pokrewnych ligandów.

Wykrywanie glikozaminoglikanów za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym i barwienia srebrem

Ten protokół demonstruje izolację pojedynczego włókna z liofilizowanych ludzkich mięśni szkieletowych i klasyfikację typów włókien według izoformy ciężkiego łańcucha miozyny (MHC) przy użyciu techniki kropkowania. Zidentyfikowane próbki włókien MHC I i II mogą być następnie dalej analizowane pod kątem specyficznych dla rodzaju błonnika różnic w ekspresji białek przy użyciu western blotting.

Identyfikacja rodzaju włókien ludzkich mięśni szkieletowych

Ten artykuł opisuje prosty i szybki protokół oceny oligomerycznego stanu białka GTPase MxA podobnego do dynaminy z lizatów komórek ludzkich przy użyciu kombinacji niedenaturującego PAGE z analizą western blot.

Charakterystyka wielopodjednostkowych kompleksów białkowych ludzkiego MxA przy użyciu niedenaturującej elektroforezy żelowej poliakryloamidu

A przedstawiono protokół produkcji tRNA(UUU) i analizy tRNA(UUU) w kompleksie z enzymem TcdA za pomocą testów opóźniających działanie żelu agarozowego.

Testy opóźnienia w żelu agarozowym białko-tRNA do analizy funkcji TcdA N 6-treonylokarbamoiloloadenozyny

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Poznaj dwuwymiarową półdenaturującą elektroforezę w żelu agarozowym detergentu do badania niejednorodności wielkości włókien amyloidowych. Ta metoda potwierdza, czy zmiany wielkości są cechą natywną, czy artefaktem eksperymentalnym.

Zastosowanie dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym detergentu w celu potwierdzenia niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym detergentu w celu potwierdzenia niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych

Przeglądaj więcej filmów