Name: System detekcji mutacji Lambda Select cII (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Poznaj metodę Lambda Select cII do oceny mutagenności związków chemicznych i fizycznych w komórkach ssaków. Technika ta wykorzystuje zintegrowany gen reporterowy do wykrywania mutacji sekwencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować za wkład wszystkich kolegów i współpracowników w nasze oryginalne badania, których wyniki zostały przywołane w tym manuskrypcie (w celach ilustracyjnych). Prace autorów są wspierane przez granty z National Institute of Dental and Craniofacial Research of the National Institutes of Health (1R01DE026043) dla AB oraz z University of California Tobacco-Related Disease Research Program dla AB (TRDRP-26IR-0015) i ST (TRDRP-25IP-0001). Sponsorzy badania nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu danych, analizie danych, interpretacji danych, pisaniu raportu ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu go do publikacji.

1. Izolacja genomowego DNA z fibroblastów embrionalnych myszy
UWAGA: Pierwotne mysie fibroblasty embrionalne są izolowane z embrionów pochodzących od transgenicznych myszy BB z genetycznym tłem C57BL/6, zgodnie z opublikowanym protokołem53. Materiał wyjściowy dla tego protokołu składa się z 1 x 106 do 1 x 107 embrionalnych komórek fibroblastów poddanych działaniu badanego związku w porównaniu z kontrolą. Zbieranie i zliczanie tych komórek przy użyciu standardowych metod jest opisane w references10,54,55.
<ol>
	<li>Przygotuj wcześniej bufor A (0,3 M sacharozy, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 mM spermidyny, 0,15 mM sperminy i 2 mM EDTA), bufor B (150 mM NaCl i 5 mM EDTA, pH 7,8) i bufor C (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM NaCl, 20 mM EDTA i 1% SDS), i przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez okres do jednego roku54,55.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 2–4 ml buforu A w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, wielokrotnie pipetując w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o szerokim otworze 1 000 μl.</li>
	<li>Dodać jedną objętość (2–4 ml) buforu A zawierającego 1% oktylofenoksypolietylenu (np. Nonidet P40) za pomocą szklanej pipety serologicznej.</li>
	<li>Inkubować probówkę na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i przemyć osad 10–15 ml buforu A za pomocą szklanej pipety serologicznej.</li>
	<li>Zawiesić osad w 2–4 ml buforu B.</li>
	<li>Dodać jedną objętość (2–4 ml) buforu C zawierającego 600 μg/ml proteinazy K.</li>
	<li>Inkubować probówkę przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać RNazę A do końcowego stężenia 100 μg/ml.</li>
	<li>Inkubować probówkę przez dodatkowy 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać jedną objętość (2–4 ml) fenolu (nasyconego w 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0):chloroform:alkohol izoamylowy (25:24:1 obj./obj.). 
	UWAGA: Fenol może stanowić poważne zagrożenie dla zdrowia i należy obchodzić się z nim z najwyższą ostrożnością. Fenol jest silnie dla skóry i łatwo się przez nią wchłania, a także wykazuje inne działanie. Podczas pracy z fenolem należy zawsze używać podwójnych rękawiczek, nosić okulary ochronne i pracować w osłonie przeciwchemicznej.</li>
	<li>Dobrze wymieszać, obracając probówkę do góry dnem przez 5 minut na rotatorze probówki w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć fazę wodną (górną warstwę) do nowej probówki za pomocą szklanej pipety serologicznej.</li>
	<li>Powtórz ekstrakcję fenolem: chloroformem: alkoholem izoamylowym 1 do 3 razy, aż faza wodna będzie czysta, a granica faz nie będzie już mętna.</li>
	<li>Dodać 1/10 objętości (200–400 μl) 3M octanu sodu o pH 5,2.</li>
	<li>Dodaj 2,5 objętości (5–10 ml) 100% etanolu (schłodzonego) i delikatnie odwróć probówkę ręcznie przez 2–3 minuty.</li>
	<li>Zwiń DNA szklanym haczykiem i przenieś je do nowej probówki zawierającej 1-5 ml 70% etanolu i dokładnie umyj. Alternatywnie, odwirować probówkę z dużą prędkością (3 500 x g) w temperaturze 4 °C w celu osadzenia DNA i dokładnie przepłukać ją 1–5 ml 70% etanolu.</li>
	<li>Odwirować probówkę z dużą prędkością (3 500 x g) w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i wysuszyć DNA na powietrzu przez 10-15 minut.</li>
	<li>Rozpuścić DNA w 10–100 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) i przechowywać w temperaturze 4 °C (w przypadku krótkiego przechowywania do jednego miesiąca) lub w temperaturze -20 °C (w przypadku dłuższego okresu przechowywania). Optymalne stężenie DNA dla testu λ Select cII wynosi 0,5–1,0 μg/μL (w buforze TE)56.</li>
</ol>
2. Reakcja na pakowanie in vitro
<ol>
	<li>Na jedną reakcję pakowania dodać ~5 μg genomowego DNA (końcowa objętość: 8–12 μL, genomowe DNA wyizolowano w sekcji 1 z mysich fibroblastów embrionalnych traktowanych in vitro związkiem testowym lub kontrolą) do probówki mikrowirówkowej zawierającej pierwszą mieszaninę reakcyjną (~10 μL). 
	UWAGA: Przygotowane we własnym zakresie lub dostępne w handlu ekstrakty z opakowań λ są używane w różnych laboratoriach. W zestawie ekstraktów do pakowania używanego tutaj56 (patrz Tabela materiałów), czerwone probówki zawierały pierwszą mieszaninę reakcyjną (~10 μL), a niebieskie probówki zawierały drugą mieszaninę reakcyjną (~70 μL dla co najmniej 5 reakcji).</li>
	<li>Inkubować probówkę przez 90 minut w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Dodać wymaganą objętość (~12 μl) drugiej mieszaniny reakcyjnej do probówki.</li>
	<li>Inkubować probówkę przez dodatkowe 90 minut w temperaturze 30 °C.</li>
	<li>Dodać 1,1 ml buforu SM do probówki. 
	UWAGA: 1 ml tego roztworu (tj. opakowania mieszaniny reakcyjnej) zostanie użyty do badań przesiewowych mutantów λ cII. Pozostała część zostanie wykorzystana do mianowania.
	<ol>
		<li>Przygotować bufor SM, mieszając 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO, 4,7H2O, 50 ml1 M Tris-HCl (pH 7,5) i 5 ml 2% (w/v) żelatyny. Dodać dH2O do końcowej objętości 1 litra, w autoklawie przez 30 min. Przechowywać w temperaturze pokojowej do 1 roku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirować probówkę zawierającą zapakowaną próbkę DNA przez 10 s w temperaturze pokojowej (energiczne wirowanie).</li>
	<li>Pulsacyjnie odwiruj probówkę w mikrowirówce i przechowuj na lodzie, aż będzie gotowa do użycia. Jeżeli próbka nie zostanie wykorzystana w tym samym dniu od zapakowania, dodać 50 μl chloroformu na ml zapakowanej próbki DNA, delikatnie przemieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.</li>
</ol>
3. Przygotowanie kultury bakterii E. coli G1250
<ol>
	<li>Co najmniej dwa dni przed posiewem należy wykonać kilka płytki z smugami bakteryjnymi z Escherichia coli (E. coli) G1250 na płytkach agarowych TB1-kanamycyny.
	<ol>
		<li>Przygotuj płytki agarowe TB1-kanamycyny w następujący sposób. Wymieszaj 5,0 g NaCl, 10,0 g peptonu kazeinowego i 12,0 g agaru. Dodać 800 ml dH2O. Dodać 1 ml 0,1% chlorowodorku tiaminy. Dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH lub HCl. Dodaj dH2O do końcowej objętości 1 litra.</li>
		<li>Dobrze wymieszać i sterylizować w autoklawie przez 30 minut. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury 55 °C. Dodać 50,0 mg kanamycyny i wymieszać. Wlać do sterylnych szalek Petriego o średnicy 100 mm (20–25 ml na szalkę). Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płytki ze smugami bakteryjnymi inkubować w stacjonarnym inkubatorze o temperaturze 30 °C przez co najmniej 24 godziny.</li>
	<li>Na dzień przed posiewem połączyć 10 ml płynnego podłoża TB1 ze 100 μl 20% (w/v) roztworu maltozy-1 M MgSO4 w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
	<ol>
		<li>Przygotować płynne podłoże TB1 w następujący sposób. Wymieszaj 5,0 g NaCl i 10,0 g peptonu kazeinowego, a następnie dodaj 800 ml dH2O, 1 ml 0,1% chlorowodorku tiaminy i dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH lub HCl. Następnie dodać dH2O do końcowej objętości 1 litra, dobrze wymieszać i sterylizować w autoklawie przez 30 minut. Przechowuj pożywkę w temperaturze pokojowej przez okres do trzech miesięcy.</li>
		<li>Przygotować 20% (w/v) Maltozy-1 MMgSO4 w następujący sposób. Wymieszaj 20,0 g maltozy i 24,6 gMgSO4. 7H2O, następnie dodać dH2O do końcowej objętości 100 ml. Filtrować, sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zaszczepić płynną pożywkę kilkoma koloniami z płytki smugowej bakterii za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej56.</li>
	<li>Inkubować płynną kulturę przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C z energicznym wytrząsaniem (250–300 obr./min).</li>
	<li>W dniu posiewu odwirować stożkową probówkę zawierającą płynną kulturę G1250 o stężeniu 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia komórek bakteryjnych.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml 10 mMMgSO4</li>.
	<li>Zmierzyć absorbancję zawiesiny komórek w stosunku 1:10 przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis (np. 100 μl zawiesiny komórek + 900 μL 10 mM MgSO4)56.</li>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę komórek do końcowego OD600 0,5 za pomocą 10 mM MgSO4. Przygotowana zawiesina G1250 E. coli o OD600 = 0,5 jest określana jako "kultura posiewu G1250".</li>
	<li>Przechowuj kulturę galwaniczną G1250 na lodzie i zużyj w ciągu 1-2 godzin.</li>
</ol>
4. Posiewanie zapakowanych próbek DNA
<ol>
	<li>Z jednej zapakowanej próbki DNA przygotuj szesnaście sterylnychprobówek okrągłodennych o wymiarach 14 x 100 mm 2 i szesnaście płytek agarowych TB1. Dziesięć z każdego zestawu zostanie wykorzystanych do badań przesiewowych, a sześć do mianowania (trzy dla miana 20 i trzy dla miana 100).
	<ol>
		<li>Przygotuj płytki agarowe TB1 w następujący sposób. Wymieszaj 5,0 g NaCl, 10,0 g peptonu kazeinowego i 12,0 g agaru, a następnie dodaj 800 ml dH2O i 1 ml 0,1% chlorowodorku tiaminy. Doprowadzić pH do 7,0 za pomocą NaOH lub HCl i dodać dH2O do końcowej objętości 1 l.</li>
		<li>Dobrze wymieszać i sterylizować w autoklawie przez 30 minut. Pozostawić mieszaninę do ostygnięcia do temperatury 55 °C, a następnie przelać ją do sterylnych szalek Petriego o średnicy 100 mm (20–25 ml na szalkę). Płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do dwóch tygodni. 
		UWAGA: Płytki agarowe TB1 należy przygotować co najmniej 24 godziny przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Porcję 200 μl kultury galwacyjnej G1250 do każdej probówki okrągłodennej.</li>
	<li>W celu miareczkowania należy rozcieńczyć zapakowaną próbkę DNA w stosunku 1:100 i dobrze wymieszać przez wirowanie (tj. 10 μl upakowanej próbki DNA + 990 μl buforu SM).</li>
	<li>Dodać 20 μl rozcieńczenia 1:100 do każdej z trzech probówek o mianie 20.</li>
	<li>Dodać 100 μl rozcieńczenia w stosunku 1:100 do każdej z trzech probówek o mianie 100.</li>
	<li>Do badań przesiewowych dodać 100 μl "nierozcieńczonej" próbki DNA do każdej z dziesięciu probówek przesiewowych.</li>
	<li>Przetwarzać wszystkie probówki do miareczkowania i badań przesiewowych (2 x 3 + 10 = 16 probówek) w następujący sposób: dobrze wymieszać przez wirowanie przez około 10 s, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić gospodarzowi E. coli adsorbację fagów.</li>
	<li>Dodać 2,5 ml stopionego górnego agaru TB1 (schłodzonego do 55 °C) w kuchence mikrofalowej do każdego miana lub probówki przesiewającej, natychmiast wymieszać przez wirowanie (delikatnie) i wlać do odpowiedniego miana lub przesiewania płytek agarowych TB1.
	<ol>
		<li>Przygotuj górny agar TB1 w następujący sposób. Wymieszaj 5,0 g NaCl, 10,0 g peptonu kazeinowego i 7,0 g agaru, a następnie dodaj 800 ml dH2O. Dodaj 1 ml 0,1% chlorowodorku tiaminy, a następnie dostosuj pH do 7,0 za pomocą NaOH lub HCl. Na koniec dodaj dH2O do końcowej objętości 1 litra.</li>
		<li>Dobrze wymieszać i sterylizować w autoklawie przez 20–25 minut. Przechowywać w temperaturze pokojowej do trzech miesięcy.</li>
		<li>Przed użyciem rozpuść przygotowany górny agar TB1 w kuchence mikrofalowej, dobrze wymieszaj i pozostaw do ostygnięcia do 55 °C w łaźni wodnej. 
		UWAGA: Stopiony i schłodzony wierzchołek TB1 dodaje się do zawartości każdego miana lub probówki przesiewającej, a po wymieszaniu wlewa się do odpowiedniego miana lub przesiewania TB1 płytek agarowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw talerze na 15–30 minut w temperaturze pokojowej, z uchyloną pokrywką, aby zapobiec kondensacji.</li>
	<li>Odwrócić płytki i umieścić dziesięć płytek przesiewających w stacjonarnym inkubatorze w temperaturze 24 °C i inkubować przez 46–48 godzin (tj. w warunkach selektywnych), a sześć płytek mianowych w stacjonarnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubować przez 24 godziny/noc (tj. w warunkach nieselektywnych). 
	UWAGA: W celu zapewnienia jakości i standaryzacji wyników, dostępne na rynku roztwory kontrolne fagów zawierające mieszaninę typu dzikiego i zmutowanego cII o znanej częstości występowania mutacji są siane wraz z zapakowanymi próbkami DNA i włączane do wszystkich serii testów56.</li>
</ol>
5. Badanie miana i płytek przesiewowych w celu określenia częstości występowania mutacji cII
<ol>
	<li>Po 24 godzinach/noc inkubacji w temperaturze 37 °C należy policzyć liczbę blaszek utworzonych w każdej z trzech płytek miana 20 i płytki miana 100. Aby łatwiej zidentyfikować tabliczki, trzymaj tabliczkę obok białego pudełka z lampą i na ciemnym tle ze zdjętą pokrywką (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Proszę uśrednić (średnią) liczbę tabliczek zliczonych w każdym zestawie tabliczek miana 20 i miana 100 tabliczek (potrójnych, każda).</li>
	<li>Wybierz średnią liczbę z zestawu płytek mianowych, która jest najbliższa zakresowi 50–200 płytek na zestaw płytek.</li>
	<li>Obliczyć całkowitą liczbę blaszek przesiewanych na dziesięciu płytkach przesiewowych w następujący sposób: 
	Całkowita liczba przesiewanych blaszek = (Średnia liczba blaszek w wybranym zestawie płytek miareczkowych ÷ Liczba μl rozcieńczenia użytego na wybraną płytkę mianejącą) x Współczynnik rozcieńczenia x Liczba μL zapakowanej próbki DNA na płytkę przesiewową [100 μL/płytkę] x Liczba płytek przesiewowych [10]. 
	UWAGA: Na przykład, jeśli średnia liczba tabliczek na tabliczkę w zestawie tabliczek miana 20 wynosi 128, a odpowiadająca jej liczba w zestawie tabliczek miana 100 wynosi 478, liczba 128 zostanie użyta do obliczenia całkowitej liczby tabliczek przesiewanych w następujący sposób: 
	(128 ÷ 20) x 100 [współczynnik rozcieńczenia] x 100 [μL/płytkę] x 10 [płytki] = 640 000 
	Jest to równoznaczne z pomnożeniem średniej liczby tabliczek przez 5 000 lub 1 000, jeśli średnia liczba opiera się na zliczeniach odpowiednio z płytek Titer 20 lub Titer 100.</li>
	<li>Po 46–48 godzinach inkubacji w temperaturze 24 °C należy policzyć całkowitą liczbę blaszek utworzonych na dziesięciu płytkach przesiewowych (postępować zgodnie z instrukcjami podanymi w sekcji 5.1). 
	UWAGA: Częstość występowania mutacji cII oblicza się, dzieląc całkowitą liczbę blaszek utworzonych na płytkach przesiewowych przez całkowitą liczbę blaszek przesiewanych. Korzystając z powyższego przykładu, jeśli całkowita liczba blaszek zliczonych na dziesięciu płytkach przesiewowych wynosi 112, częstość mutacji cII dla tej próbki DNA wynosiłaby 112 ÷ 640 000 = 17,5 x 10-5.</li>
</ol>
6. Weryfikacja domniemanych mutantów λ cII, amplifikacja PCR i sekwencjonowanie DNA
<ol>
	<li>Wydrążyć daną płytkę nazębną sterylną końcówką pipety o szerokim otworze i wyrzucić ją (pipetując w górę i w dół) do sterylnej probówki do mikrowirówki zawierającej 500 μl sterylnego buforu SM.</li>
	<li>Inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C przez noc, aby umożliwić wymycie cząstek faga z czopa agarowego.</li>
	<li>W sterylnej probówce okrągłodennej o wymiarach 14 x 100 mm2 wymieszać 200 μl kultury galwacyjnej G1250 z 1 μl rdzeniowego roztworu fagowego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieścić próbkę na płytce przy użyciu 2,5 ml stopionego górnego agaru TB1 o temperaturze 55 °C i inkubować płytkę w temperaturze 24 °C przez 46–48 godzin (warunki selektywne), jak opisano w sekcjach 4.8–4.10.</li>
	<li>Gdy uformują się blaszki wtórne, użyj końcówki pipety, aby ostrożnie wybrać pojedynczą, dobrze odizolowaną, zweryfikowaną płytkę z mutacją λ cII (unikaj dotykania dolnego agaru). 
	UWAGA: Ponowne umieszczenie przypuszczalnych płytek z mutacją cII służy dwóm celom: (i) artefakty poszycia mogą być czasami mylone z blaszkami o małych rozmiarach; oraz (ii) rdzeń agarozy pobrany z płytki przesiewowej może zawierać niezmutowany (fagi) wraz ze zmutowanym fagiem. Wtórne blaszki z powtórnego posiewu o niskiej gęstości zapewnią nieskażoną zmutowaną matrycę do PCR i późniejszej analizy sekwencji DNA.</li>
	<li>Przenieść płytkę nazębną do probówki mikrowirówkowej zawierającej 25 μl podwójnie destylowanej wody, pipetując w górę iw dół.</li>
	<li>Umieść probówkę we wrzącej wodzie na 5 minut.</li>
	<li>Wirować z maksymalną prędkością (18 000 x g) przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Natychmiast przenieść 10 μl supernatantu do nowej probówki mikrowirówki zawierającej 40 μl mastermixu PCR, w którym końcowe stężenia odczynników wynoszą 1 x bufor Taq PCR, 10 pmol każdy ze starterów do przodu i do tyłu, 12,5 nmol do każdego dNTP i 2,5 U polimerazy DNA Taq. 
	UWAGA: Startery do przodu i do tyłu są następujące: odpowiednio 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (pozycje od -68 do -50 względem kodonu start cII) i 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (pozycje od +345 do +365 względem kodonu start cII).</li>
	<li>Wzmocnić matrycę, stosując następujące parametry cykliczne: 3-minutowa denaturacja w temperaturze 95 °C, następnie 30 cykli trwających 30 s w temperaturze 95 °C, 1 minuta w temperaturze 60 °C i 1 minuta w temperaturze 72 °C, z końcowym przedłużeniem o 10 minut w temperaturze 72 °C.</li>
	<li>Produkt PCR 432 pz zawierający gen cII i regiony flankujące należy oczyścić za pomocą dostępnych w handlu zestawów do oczyszczania PCR, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wykonaj sekwencjonowanie DNA przy użyciu odpowiedniej platformy sekwencjonowania i przeanalizuj wynikowe sekwencje DNA w celu wykrycia mutacji w transgenie cII (patrz uwaga poniżej). 
	UWAGA: Najlepiej osiągnąć to poprzez wyrównanie z referencyjną sekwencją cII za pomocą oprogramowania, takiego jak internetowy serwer wyrównywania sekwencji T-Coffee. Aby dowiedzieć się, jak korzystać z programu, odwiedź: <a href="http://tcoffee.crg.cat/">http://tcoffee.crg.cat/</a></li>
</ol>

Wszyscy autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Test λ Select cII służy do wykrywania mutacji w transgenie cII odzyskanym z genomowego DNA komórek pochodzących z narządów/tkanek gryzoni BB3. Genom tych transgenicznych zwierząt zawiera wiele tandemowych kopii chromosomalnie zintegrowanego wektora wahadłowego λLIZ, który przenosi transgeny cII (294 pz) i lacI (1080 pz) jako geny reporterowe mutacji 1,2,25. Test λ Selec...

Szeroka gama transgenicznych modeli zwierzęcych i systemów wykrywania mutacji została opracowana do testowania mutagenności czynników rakotwórczych w komórkach ssaków. Spośród nich, transgeniczne myszy Big Blue (zwane dalej BB) i system wykrywania mutacji λ Select cII zostały wykorzystane do eksperymentów mutagenności przez tę grupę i wiele innych grup badawczych na całym świecie1,2,3,4,5,6,7,8,9. Przez ostatnie 16 lat badaliśmy mutagenne skutki różnych czynników chemicznych i / lub fizycznych przy użyciu tych transgenicznych zwierząt lub odpowiadających im embrionalnych kultur komórek fibroblastów traktowanych związkiem testowym, a następnie analizowaliśmy fenotyp i genotyp transgenu cII za pomocą testu λ Select cII i sekwencjonowania DNA, odpowiednio10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Genom tych transgenicznych zwierząt zawiera bakteriofag λ wektor wahadłowy (λLIZ) zintegrowany z chromosomem 4 jako wielokopiczny konkategomer głowa do ogona1,2,25. Wektor wahadłowy λLIZ zawiera dwa mutacyjne geny reporterowe, a mianowicie transgeny lacI i cII1,2,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47. Test λ Select cII opiera się na odzyskiwaniu wektorów wahadłowych λLIZ z genomowego DNA komórek pochodzących z narządów/tkanek zwierząt transgenicznych1,2,25. Odzyskane wektory wahadłowe λLIZ są następnie pakowane w głowy fagów λ zdolne do infekowania gospodarza wskaźnikowego Escherichia coli. Następnie zakażone bakterie są hodowane w selektywnych warunkach, aby umożliwić ocenę i analizę mutacji w transgenach cII < klasie sup = "xref" >1,< klasie sup = "xref">3.
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół testu λ Select cII, który składa się z izolacji genomowego DNA z komórek/organów zwierząt transgenicznych traktowanych in vitro/in vivo związkiem testowym, pobierania wektorów wahadłowych λLIZ z genomowego DNA, pakowania wektorów do zakaźnych fagów λ, zakażenia gospodarza E. coli bakteriofagami, identyfikacja mutantów cII w warunkach selektywnych w celu określenia częstości występowania mutacji cII oraz analiza sekwencji DNA w celu ustalenia spektrum mutacji cII. Protokół może być stosowany do transgenicznych hodowli komórek myszy/szczurów poddanych działaniu in vitro czynnika chemicznego/fizycznego będącego przedmiotem zainteresowania lub tkanek/narządów odpowiednich zwierząt poddanych działaniu in vivo badanej substancji chemicznej/środka1,2,4,48,49,50,51,52. Schematyczną prezentację testu λ Select cII przedstawiono na rysunku Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>MO Bio Laboratories, Inc.</td><td>12112-05</td><td>Klasa bakteriologiczna</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 Zestaw do sekwencjonowania cyklu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4337455</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Kazeina Pepton</td><td>Alfa Aesar</td><td>H26557</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>J. T. Baker</td><td>2124-01</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol w</td> proszku <td>Fisher Scientific</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>Brak</td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 9724-500</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 Reakcje oczyszczania PCR</td></tr><tr><td>Octan sodu trójwodny Fisher</td><td>Scientific</td><td>M-15756</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Taq5000 Polimeraza DNA&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>201207</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tiaminy</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2722-57</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Ekstrakt z opakowań Transpack</td><td>Stratagene Corp., przejęty przez BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.</td><td>200223</td><td>50 reakcje pakowania</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Biosciences</td><td>RC-110</td><td>Brak</td></tr></tbody></table>

system detekcji mutacji lambda select cii

The Lambda Select cII Mutation Detection System

Opracowano wiele transgenicznych modeli zwierzęcych i systemów wykrywania mutacji do testowania mutagenności czynników rakotwórczych w komórkach ssaków. Spośród nich myszy transgeniczne i system wykrywania mutacji Lambda (λ) Select cII zostały wykorzystane do eksperymentów mutagenności przez wiele grup badawczych na całym świecie. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół testu mutacji Lambda Select cII, który można zastosować do hodowanych komórek transgenicznych myszy / szczurów lub odpowiadających im zwierząt traktowanych środkiem chemicznym / fizycznym będącym przedmiotem zainteresowania. Protokół składa się z następujących etapów: 1) izolacja genomowego DNA z komórek lub narządów/tkanek zwierząt transgenicznych poddanych działaniu odpowiednio in vitro lub in vivo badanego związku; (2) odzyskanie wektora lambda przenoszącego mutację genu reporterowego (tj. transgenu cII) z genomowego DNA; (3) pakowanie uratowanych nosicieli w bakteriofagi zakaźne; (4) zakażenie bakterii gospodarza i hodowla w warunkach selektywnych, aby umożliwić namnażanie się indukowanych mutacji cII; oraz (5) ocena mutantów cII i analiza sekwencji DNA w celu określenia odpowiednio częstości mutacji cII i spektrum mutacji.

W zależności od rozkładu danych, do określenia istotności różnic w zastosowano testy parametryczne lub nieparametryczne cII częstość mutacji pomiędzy grupą badaną a kontrolną (t. j., indukowane versus spontaniczne częstości mutacji). Porównanie indukowanych cII częstotliwości mutacji w różnych grupach badawczych są analizowane za pomocą odpowiednich (parzystych) testów statystycznych. Do porównania całkowitego widma mutacji indukowanych i spontanicznych powszech...

Opisujemy szczegółowy protokół testu mutacji Lambda Select cII w hodowanych komórkach transgenicznych gryzoni lub odpowiadających im zwierząt potraktowanych chemicznie/fizycznym środkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Podejście to jest szeroko stosowane do badania mutagenności czynników rakotwórczych w komórkach ssaków.

System detekcji mutacji Lambda Select cII

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

Ogólnym celem tego protokołu jest wizualizacja etapowych procedur związanych z testem mutacji Lambda Select cII w hodowanych komórkach transgenicznych gryzoni lub odpowiadających im zwierząt traktowanych środkami chemicznymi i fizycznymi będącymi przedmiotem zainteresowania. Ta metoda badawcza może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad mutacjami, takie jak: czy badany związek jest mutagenny? A jeśli tak, to jak silny jest to mutagen?Czy wywołuje mutacje specyficzne dla sekwencji? Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to minimalny lub praktycznie każdy badany związek. Metoda może być stosowana do badania mutagenności w komórkach ssaków przy użyciu chromosomalnie zintegrowanego genu reporterowego.Aby utworzyć pojedynczą reakcję pakowania, należy dodać pięć mikrogramów genomowego DNA do probówki mikrowirówkowej zawierającej pierwszą mieszaninę reakcyjną. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 90 minut. Po inkubacji dodać 12 mikrolitrów drugiej mieszaniny reakcyjnej do probówki i pozostawić na kolejne 90 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Po 90 minutach dodaj 1,1 mililitra buforu SM do probówki. Następnie energicznie wiru

the-lambda-select-cii-mutation-detection-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty protokół tworzenia losowej biblioteki mutantów dla określonej sekwencji docelowej. Pokazujemy, w jaki sposób metoda ta, realizowana in vivo w Escherichia coli, może być łączona z selekcją funkcjonalną w celu wyewoluowania nowych aktywności enzymatycznych.

Protokoły mutagenezy i selekcji funkcjonalnej dla ewolucji sterowanej białek w E. coli

Ten film pokazuje rolę cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej w identyfikacji mutacji indel w próbce DNA. Wysoka precyzja i czułość ddPCR umożliwiają dokładne i spójne wykrywanie rzadkich mutacji obecnych w próbce, nawet przy niskich poziomach. Może identyfikować i określać ilościowo mutacje indel w różnych regionach genomu, dostarczając cennych informacji na temat mechanizmów mutacji i funkcjonalnych konsekwencji tych mutacji.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej do wykrywania mutacji indel w genach docelowych

Tutaj opisujemy test mutagenezy in vivo dla małej liczby oczyszczonych komórek krwiotwórczych przy użyciu transgenicznego modelu myszy LacI. Gen LacI może być wyizolowany w celu określenia częstotliwości, lokalizacji i rodzaju mutantów DNA spontanicznie powstałych lub po ekspozycji na genotoksyny.

Identyfikacja mutacji DNA w oczyszczonych hematopoetycznych komórkach macierzystych/progenitorowych

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Ilościowe półautomatyczne typowanie immunoglobuliny z komórek zabójczych (KIR) (qKAT) to prosta, wysokoprzepustowa i opłacalna metoda kopiowania genów KIR typu liczbowego do ich zastosowania w badaniach populacyjnych i asocjacyjnych chorób.

qKAT: Ilościowe półautomatyczne typowanie genów receptorów podobnych do immunoglobulin komórek zabójczych

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Ten artykuł przedstawia zastosowanie metody wykrywania niskiej częstotliwości opartej na sekwencjonowaniu Sangera w chłoniaku angioimmunoblastycznym. Zapewnij podstawę do zastosowania tej metody do innych chorób.

PCR blokujący typu dzikiego w połączeniu z sekwencjonowaniem Sangera w celu wykrycia mutacji somatycznej o niskiej częstotliwości

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Niniejszy artykuł opisuje kroki niezbędne do izolacji i charakterystyki wariantów polimerazy RNA o różnym stopniu wierności replikacji w przypadku wirusów RNA oraz sposób wykorzystania danych o częstotliwości mutacji do potwierdzenia zmian wierności w hodowlach tkankowych.

Izolacja wariantów wierności replikacji wirusów RNA i charakterystyka częstotliwości mutacji wirusa

Poznaj metodę Lambda Select cII do oceny mutagenności związków chemicznych i fizycznych w komórkach ssaków. Technika ta wykorzystuje zintegrowany gen reporterowy do wykrywania mutacji sekwencji.

System detekcji mutacji Lambda Select cII

Przeglądaj więcej filmów