System detekcji mutacji Lambda Select cII

Ogólnym celem tego protokołu jest wizualizacja etapowych procedur związanych z testem mutacji Lambda Select cII w hodowanych komórkach transgenicznych gryzoni lub odpowiadających im zwierząt traktowanych środkami chemicznymi i fizycznymi będącymi przedmiotem zainteresowania. Ta metoda badawcza może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad mutacjami, takie jak: czy badany związek jest mutagenny? A jeśli tak, to jak silny jest to mutagen?

Czy wywołuje mutacje specyficzne dla sekwencji? Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to minimalny lub praktycznie każdy badany związek. Metoda może być stosowana do badania mutagenności w komórkach ssaków przy użyciu chromosomalnie zintegrowanego genu reporterowego.

Aby utworzyć pojedynczą reakcję pakowania, należy dodać pięć mikrogramów genomowego DNA do probówki mikrowirówkowej zawierającej pierwszą mieszaninę reakcyjną. Następnie inkubuj probówkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 90 minut. Po inkubacji dodać 12 mikrolitrów drugiej mieszaniny reakcyjnej do probówki i pozostawić na kolejne 90 minut w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Po 90 minutach dodaj 1,1 mililitra buforu SM do probówki. Następnie energicznie wiruj probówkę z zapakowanym DNA w temperaturze pokojowej przez około 10 sekund. Szybko wprawij w ruch pulsacyjny mikrowirówkę.

Następnie pozostaw tubkę na lodzie do czasu użycia. Następnie dodaj 50 mikrolitrów chloroformu na każdy mililitr zapakowanego DNA. Jeśli próbka nie zostanie przetworzona tego samego dnia, należy ją delikatnie zwirować i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dwóch tygodni.

Przygotuj 16 sterylnych probówek z okrągłym dnem i 16 płytek agarowych TB1 na pojedynczą zapakowaną próbkę DNA. Użyj dziesięciu probówek do przesiewania i sześciu do miareczkowania. Następnie podatkować 300 mikrolitrów kultury galwacyjnej G1250 w każdej probówce z okrągłym dnem.

Następnie, do mianowania, dodaj 10 mikrolitrów pakowanego DNA do 990 mikrolitrów buforu SM i rozcieńczenia 1:100. Następnie odwiruj próbkę. Dodać 20 lub 100 mikrolitrów roztworu DNA w stosunku 1:100 do każdej z trzech probówek o mianie 20 lub mianie 100

Do celów przesiewowych dodać 100 mikrolitrów nierozcieńczonej zapakowanej próbki DNA do każdej z 10 probówek przesiewowych. Przetwarzaj wszystkie 16 probówek do miareczkowania i badań przesiewowych. Wiruj probówki przez 10 sekund, aby wymieszać składniki.

Następnie inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby gospodarz E. coli wchłonął fagi. Następnie dodaj 2,5 mililitra stopionego górnego agaru TB1. Utrzymuj temperaturę 55 stopni Celsjusza do odpowiednich probówek do miareczkowania i przesiewania.

Po dodaniu natychmiast delikatnie wymieszaj rurki. Teraz wlej agar TB1 do odpowiedniego miana lub przesiewającej płytki agarowej TB1. Pozostaw talerze na 15 do 30 minut w temperaturze pokojowej.

Gdy agar zastygnie, odwróć i pozostaw wszystkie 10 płytek sitowych w stacjonarnym inkubatorze w temperaturze 24 stopni Celsjusza na 46 do 48 godzin. Pozostałe sześć płytek mianowych należy pozostawić w stacjonarnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc lub jeden dzień. Po inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza policz liczbę blaszek utworzonych we wszystkich 3 płytkach o mianie 20 i mianie 100.

Po inkubacji w temperaturze 24 stopni Celsjusza policz liczbę blaszek utworzonych na 10 płytkach przesiewowych. Aby zweryfikować zmutowane blaszki nazębne, należy je wydrążyć sterylną końcówką do pipety o szerokim otworze. Następnie przenieś płytkę nazębną do sterylnej probówki mikrowirówkowej wypełnionej 500 mikrolitrami sterylnego buforu SM.

Następnie inkubować probówkę do mikrowirówki w temperaturze pokojowej przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie wymieszaj jeden mikrolitr rdzeniowego roztworu fagowego z 200 mikrolitrami kultury galwacyjnej G1250 w sterylnej probówce z okrągłym dnem. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Po 30 minutach umieść wydrążony roztwór fagowy w 2,5 mililitra stopionego górnego agaru TB1 i inkubuj w temperaturze 24 stopni Celsjusza przez 46 do 48 godzin. Gdy blaszki wtórne są widoczne, użyj końcówki pipety, aby wybrać pojedynczą, dobrze odizolowaną zmutowaną płytkę Lambda cII. Kilkakrotnie przenieś płytkę nazębną do probówki mikrowirówki wypełnionej 25 mikrolitrami podwójnie destylowanej wody w pipecie.

Pozostaw probówkę na wrzącej wodzie na pięć minut. Następnie odwirować probówkę o stężeniu 18 000 G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Natychmiast po odwirowaniu przenieść 10 mikrolitrów supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki zawierającej 40 mikrolitrów głównej mieszanki PCR.

Po amplifikacji PCR należy oczyścić produkt paraamplifikowany na zasadzie 432 za pomocą genu cII i jego obszarów flankujących włączonych za pomocą zestawu do oczyszczania PCR. Następnie zsekwencjonuj transgen cII za pomocą analizatora DNA w celu wykrycia mutacji. Blaszki uzyskane zarówno na płytkach miana 20, jak i miana 100 są wyraźnie widoczne, jeśli trzyma się je obok białej lampy i na ciemnym tle.

W tym przypadku wykres słupkowy przedstawia mutagenną moc różnych substancji chemicznych w badanych związkach fizycznych. Odbywa się to poprzez analizę stopnia wzrostu względnej częstości mutacji cII wyizolowanej z wybuchów włókien embrionalnych myszy. Wykres słupkowy przedstawia wszystkie te odczynniki testowe wykazujące statystycznie istotny wzrost krotności częstości występowania mutacji cII.

Następnie przedstawiono widma mutacji transgenu cII w mysich wybuchach włókien embrionalnych napromieniowanych promieniowaniem UVB. Wykres kołowy pokazuje znaczny wzrost względnej częstości przejścia pojedynczej lub tandemowej cytydyny do tymidyny w dinukleotydach pirymidynowych w porównaniu z kontrolą. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu ośmiu do dziesięciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo, z wyłączeniem czasu przygotowania płytki z smugami bakteryjnymi w hodowli.

W sekwencjonowaniu DNA, po ocenie mutantów cII. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić analizę mutacji badanego związku w systemie modelowym in vitro.