Name: Wytwarzanie, testowanie i stosowanie mikroelektrod selektywnych jonów potasu w wycinkach tkanek mózgu dorosłego człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania i kalibracji mikroelektrod selektywnych jonów potasu do pomiaru dynamiki jonów K+ w wycinkach hipokampu dorosłych myszy. Technika ta umożliwia badanie homeostazy potasu w układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Laboratorium Khakh było wspierane przez NIH MH104069. Laboratorium Mody było wspierane przez NIH NS030549. J.C.O. dziękuje NIH T32 Neural Microcircuits Training Grant (NS058280).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem Narodowego Instytutu Zdrowia dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez Komitet Badań nad Zwierzętami Kanclerza Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles. Wszystkie myszy trzymano w pomieszczeniach z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum w 12-godzinnym jasnym i ciemnym środowisku. Wszystkie zwierzęta były zdrowe, bez widocznych zmian w zachowaniu, nie brały udziału w wcześniejszych badaniach i zostały złożone w ofierze podczas cyklu świetlnego. Dane do eksperymentów zebrano od dorosłych myszy (w wieku 6-8 tygodni dla wszystkich eksperymentów).
1. Przygotowanie mikroelektrod selektywnych K+
<ol>
	<li>Silanizacja szkła borokrzemianowego
	<ol>
		<li>Wyjmij wystarczającą ilość szklanych kapilar z opakowania i umieść w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Napełnij stożkową rurkę do góry 1 M HCl. Umyj elektrody, delikatnie mieszając w HCl przez noc lub przez minimum 6 godzin.</li>
		<li>Krótko spłukać naczynka 70% etanolem, a następnie całkowicie wysuszyć w temperaturze 100-120 °C przez 6-8 godzin. Umyte naczynka należy przechowywać w pojemnikach z bezwodnym środkiem osuszającym siarczan wapnia do 4 tygodni przed dalszym użyciem.</li>
		<li>Przed silanizacją należy pociągnąć kapilary do cienkiej końcówki za pomocą ściągacza do mikroelektrod. Mikroelektrody, których używamy, mają średnicę około 2-5 mikronów. Z umytymi naczyniami włosowatymi należy zawsze obchodzić się w rękawiczkach, ponieważ oleje ze skóry mogą zakłócać silanizację.</li>
		<li>Umieść mikroelektrody w szklanym pojemniku tak, aby elektrody były podniesione od dołu, aby zapobiec złamaniu końcówki. Przymocuj mikroelektrody do pojemnika za pomocą taśmy autoklawowalnej lub podobnej taśmy klejącej.</li>
		<li>Usunąć około 0,5 ml 5% roztworu silanizacyjnego dichlorodimetylosilanu (DDS) z pojemnika, stosując metodę zastępowania azotu (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2). Napełnij balon azotem gazowym i przymocuj strzykawkę lub rurkę i igłę do balonu. Wprowadzić igłę do pojemnika DDS, jednocześnie pobierając DDS do oddzielnej strzykawki za pomocą dłuższej igły.</li>
		<li>Nanieś roztwór silanizacyjny kroplami na końcówki pipet i natychmiast przykryj. Umieścić pojemnik z mikroelektrodami z roztworem silanizacyjnym we wstępnie podgrzanym (170-180 °C) piecu laboratoryjnym na 10-12 godzin lub w temperaturze 200-220 °C na 30 minut</li>
		<li>Po inkubacji wyłącz piekarnik, a następnie wyjmij talerz z piekarnika. Zachowaj ostrożność podczas wyjmowania płytki z inkubatora, ponieważ jest ona bardzo gorąca. Umieść talerz na ławce w temperaturze pokojowej na 10-15 minut, aby szklane naczynia ostygły.</li>
		<li>Usuń mikroelektrody z płytki (używając żyletki lub skalpela do przecięcia taśmy) i umieść je w hermetycznym pojemniku wypełnionym środkiem osuszającym. Mikroelektrody silanizowane utrzymywane w stanie wolnym od wilgoci mogą być używane do 1 tygodnia po silanizacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gruntowanie elektrod
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór podstawowy koktajlu jonoforowego K+: 5% w/v walinomycyny, 93% v/v 1,2-dimetylo-3-nitrobenzenu, 2% w/v tetrakis(4-chlorofenylo)boran potasu11. Ten roztwór ma słaby żółty kolor. Przechowywać w hermetycznym, nieprzezroczystym pojemniku w temperaturze pokojowej. Przy prawidłowym przechowywaniu roztwór ten może przetrwać wiele miesięcy.</li>
		<li>Przygotować roztwór podstawowy 10 mM HEPES buforowany 300 mM NaCl o pH 7,4. Zamocuj elektrodę w zacisku i wypełnij buforowanym NaCl za pomocą końcówki mikrofilu 28G podłączonej do strzykawki. Zwróć uwagę, że roztwór soli dotarł do końca końcówki mikroelektrody. Upewnij się, że mikroelektroda jest wolna od dużych pęcherzyków, które mogłyby zakłócać przepływ prądu.</li>
		<li>Złamij końcówkę elektrody na szerokość około 10-20 μm, używając strony skalpela lub żyletki.</li>
		<li>Za pomocą mikropipety nanieść małą kropelkę (~0,1 μl) jonoforu K+ w pobliżu końcówki mikroelektrody. Jeśli elektroda została odpowiednio silanizowana, kropla zostanie wchłonięta przez złamaną końcówkę. Napełnij elektrodę jonoforem K+ do 1-2 mm, a nadmiar usuń za pomocą bibuły.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kalibracja mikroelektrod selektywnych K+
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów kalibracyjnych
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory o różnych stężeniach KCl w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym o równej osmolarności (ACSF), zastępując NaCl KCl. Do kalibracji elektrod użyliśmy 0,1, 1, 4,5, 10 i 100 mM K+ ACSF. Przepisy dotyczące tych roztworów kalibracyjnych są wymienione w tabeli 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Chemiczny</td>
			<td>Mw </td>
			<td rowspan="2">końcowy mM</td>
			<td rowspan="2">0.1 mM [K+]</td>
			<td rowspan="2">1 mM [K+]</td>
			<td rowspan="2">4.5 mM [K+]</td>
			<td rowspan="2">10 mM [K+]</td>
			<td rowspan="2">100 mM [K+]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(g / mol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zawartość NaCl</td>
			<td>Klasa 58,44</td> pkt.
			<td>Różni się</td>
			<td>1,51 gr</td>
			<td>1,50 gr</td>
			<td>1,44 grama</td>
			<td>1,4 grama</td>
			<td>0,345 gr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kcl</td>
			<td>1 mln zapasów</td>
			<td>Różni się</td>
			<td>20 μl</td>
			<td>200 μl</td>
			<td>900 μl</td>
			<td>Pojemność 2 ml</td>
			<td>Pojemność 20 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 mln zapasów</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td colspan="5">400 μl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 mln zapasów</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">200 μl </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>119,98</td> pkt.
			<td>Rozdział 1.2</td>
			<td colspan="5">0.29 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>84,01</td> pkt.
			<td>26</td>
			<td colspan="5">0.437 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glukoza</td>
			<td>180,16</td> pkt.
			<td>10</td>
			<td colspan="5">0,360 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda</td>
			<td colspan="7">q.s. 200 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Roztwory kalibracyjne potasu
<ol start="2">
	<li>Kalibracja mikroelektrod
	<ol>
		<li>Pęcherzyk wszystkich roztworów z 95% O2/5% CO2 przez co najmniej 20 minut przed rozpoczęciem eksperymentu. Rozpocznij perfuzję kąpieli za pomocą 4,5 mM [K+] ACSF z szybkością 3 ml na minutę. Umieść elektrodę selektywną K+ w uchwycie elektrody przymocowanym do głowicy elektrody na manipulatorze. Stopień ten jest podłączony do odpowiedniego wzmacniacza. Włóż końcówkę elektrody do perfuzatu kąpieli.</li>
		<li>Upewnij się, że elektroda uziemiająca Ag/AgCl jest zanurzona w tym samym roztworze i że przepływ jest stały. Nakładaj roztwory kalibracyjne w sposób krokowy i zapisuj potencjalne zmiany mV na końcówce elektrody. Poczekaj, aż potencjał na końcówce elektrody osiągnie stabilną wartość, zanim przejdziesz do następnego rozwiązania</li>
		<li>Zmierz zmianę napięcia w stanie ustalonym w odpowiedzi na zastosowanie roztworów kalibracyjnych na końcówkę elektrody. Upewnij się, że nachylenie odpowiedzi elektrody wynosi co najmniej 52 i nie więcej niż 58 mV na zmianę logarytmu w [K+].</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie ostrych wycinków mózgu w hipokampie
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów do krojenia
	<ol>
		<li>Przygotować 500 ml roztworu do cięcia sacharozy składającego się z: 194 mM sacharozy, 30 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 10 mM D-glukozy, 1 mM MgCl2, 1,2 mM NaH2PO4 i 26 mM NaHCO3, 290-300 mOsm, nasyconych 95%O2 i 5% CO2 .</li>
		<li>Przygotować 1-2 litry roztworu rejestrującego (ACSF) składającego się z: 124 mM NaCl, 4,5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM D-glukozy, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4 i 26 mM NaHCO3; pH 7,3 - 7,4 (po bulgotaniu), 290 - 300 mOsm, nasyconych 95% O2 i 5% CO2 . Napełnić zlewkę zawierającą komorę na plasterki mózgu roztworem do nagrywania i utrzymywać ją w temperaturze 32-34 °C. Napełnić komorę wibratomu lodowatą wodą</li> błotną.
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie ostrych plastrów
	<ol>
		<li>Głęboko znieczul mysz, umieszczając ją w słoiku z dzwonem napełnionym 2-3 ml izofluranu. Sprawdź, czy palce u nóg nie mają odruchu szczypania, a jeśli nie reagują, szybko odetnij mu głowę za pomocą ostrych nożyc lub gilotyny, zgodnie z protokołem dla zwierząt.</li>
		<li>Wykonaj 2-3 cm nacięcie za pomocą nożyc z ogonowej części czaszki, aby przeciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej. Ręcznie chowając skórę głowy, wykonaj dwa poziome nacięcia o długości 1 cm od otworu wielkiego wzdłuż boków czaszki. Następnie za pomocą cienkich nożyc wytnij nacięcie wzdłuż długości czaszki, wzdłuż linii środkowej od tyłu czaszki do nosa.</li>
		<li>Za pomocą cienkich kleszczy umieszczonych w pobliżu linii środkowej cofnij naciętą czaszkę na dwie części. Wyjmij mózg myszy z czaszki i użyj ostrza, aby usunąć móżdżek i opuszki węchowe, które znajdują się odpowiednio w ogonowej i rostralnej części mózgu. Można je zidentyfikować po dużych szczelinach, które oddzielają je od kory.</li>
		<li>Zamontuj blok mózgu na tacy z wibratomem za pomocą super kleju. Napełnij tacę wibratomu roztworem do cięcia na zimno.</li>
		<li>Wytnij skrawki tkanki na płaszczyźnie koronalnej o grubości 300 μm. Zwykle można zebrać 6 koronalnych wycinków hipokampa.</li>
		<li>Po odcięciu każdej sekcji należy natychmiast przenieść je do zlewki z ramką podgrzaną do temperatury 32–34°C. Przechowywać skrawki w tej temperaturze przez 20 minut przed wyjęciem zlewki zawierającej kawałki i umieścić ją w temperaturze pokojowej na co najmniej 20–30 minut przed zapisem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Pomiar elektrycznie wywołanej dynamiki K+ 
<ol>
	<li>Ustawianie przygotowania plastrów
	<ol>
		<li>Delikatnie umieść plasterek mózgu w kąpieli za pomocą pipety Pasteura i delikatnie przytrzymaj go na miejscu za pomocą platynowej harfy z nylonowymi strunami.</li>
		<li>Upewnij się, że końcówki bipolarnej elektrody stymulującej są równoległe do siebie i znajdują się na poziomie płaszczyzny plasterka. Powoli, w ciągu 6-7 sekund, włóż elektrody do warstwy promieniowania CA3 o głębokości około 40-50 μm, aby stymulować zabezpieczenia Schaffera. W przekrojach koronalnych CA3 można w przybliżeniu zidentyfikować jako część hipokampa właściwą bocznie do warstwy komórek ziarnistych w obrębie hipokampa, z warstwą promieniową opadającą przyśrodkowo i brzusznie do warstwy komórek piramidowych.</li>
		<li>Ostrożnie włóż elektrodę selektywną K+ do warstwy promieniowania CA1 o głębokości około 50 μm, powoli opuszczając elektrodę przez około 3-4 sekundy. Poczekaj, aż potencjał ustabilizuje się na elektrodzie przed zastosowaniem stymulacji do plasterka: zwykle zajmuje to od 5 do 10 minut. Jeśli plasterek wykazuje spontaniczne zmiany w zewnątrzkomórkowym K+, wyrzuć i powtórz ten proces z nowym plasterkiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz wywołane uwolnienie K+
	<ol>
		<li>Zastosuj ciągi stymulacji elektrycznej (8 impulsów), ręcznie naciskając spust na stymulatorze, jednocześnie cyfrowo rejestrując odpowiedzi. Zastosuj stymulację przy 10 Hz i szerokości impulsu 1 ms, zaczynając od amplitudy bodźca 10 μA.</li>
		<li>Stosuj zwiększające amplitudy stymulacji o współczynnik 2, aż do wykrycia maksymalnej amplitudy odpowiedzi K+. Jeśli nie widzisz żadnej odpowiedzi, przesuwaj położenie elektrody K+ bliżej miejsca stymulacji w krokach co 100 μm</li>
		<li>Określ amplitudę bodźca, która wytwarza połowę maksymalnej odpowiedzi. Z naszego doświadczenia wynika, że jest to od 40 do 160 μA, w zależności od jakości preparatu, wieku zwierzęcia i odległości między elektrodami stymulacyjnymi a elektrodą selektywną K+.</li>
		<li>W tym samym wycinku, stosując amplitudę bodźca o jeden krok niższą niż amplituda, która wytwarza odpowiedź połówkową maksymalną (np. jeśli 80 μA daje odpowiedź połówkową maksymalną, użyj 40 μA), zastosuj ciągi bodźców o rosnącej liczbie impulsów. Początkowo używaliśmy ciągów o 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 i 128 impulsach.</li>
		<li>Aby potwierdzić, że sygnały K+ są pośredniczone przez wyzwalanie potencjału czynnościowego elektrycznie stymulowanej kąpieli pobocznej Schaffera, należy zastosować 0,5 μM TTX w ACSF przez 10 minut i powtórzyć protokół stymulacji. Nie należy zaobserwować żadnych wywołanych reakcji.</li>
		<li>Po zakończeniu eksperymentu z plastrem upewnij się, że elektroda zachowała swoją responsywność, ponownie kalibrując elektrodę w roztworach kalibracyjnych i upewniając się, że odpowiedź nie odbiega o więcej niż 10% od początkowej kalibracji</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>McDonough, A. A., Youn, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+homeostasis%3A+The+knowns%2C+the+unknowns%2C+and+the+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Bethesda+Md%22%5BJournal%5D)">Potassium homeostasis: The knowns, the unknowns, and the health benefits.</a> Physiol Bethesda Md. 32 (2), 100-111 (2017).</li>
<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHille%2C+B+%22Ion+channels+of+excitable+membranes%22">Ion channels of excitable membranes</a>. , Sinauer. Sunderland, MA. 507(2001).</li>
<li>Kofuji, P., Ceelen, P., Zahs, K. R., Surbeck, L. W., Lester, H. A., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+inactivation+of+an+inwardly+rectifying+potassium+channel+%28Kir4.1+subunit%29+in+mice%3A+Phenotypic+impact+in+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic inactivation of an inwardly rectifying potassium channel (Kir4.1 subunit) in mice: Phenotypic impact in retina.</a> J Neurosci. 20 (15), 5733-5740 (2000).</li>
<li>Sibille, J., Dao Duc, K., Holcman, D., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroglial+potassium+cycle+during+neurotransmission%3A+role+of+Kir4.1+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">The neuroglial potassium cycle during neurotransmission: role of Kir4.1 channels.</a> PLoS Comput Biol. 11 (3), e1004137(2015).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Kir4.1+ion+channel+deficits+contribute+to+neuronal+dysfunction+in+Huntington%27s+disease+model+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Kir4.1 ion channel deficits contribute to neuronal dysfunction in Huntington's disease model mice.</a> Nat Neurosci. 17 (5), 694-703 (2014).</li>
<li>Datta, D., Sarkar, K., Mukherjee, S., Meshik, X., Stroscio, M. A., Dutta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide+and+DNA+aptamer+based+sub-nanomolar+potassium+detecting+optical+nanosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide and DNA aptamer based sub-nanomolar potassium detecting optical nanosensor.</a> Nanotechnology. 28 (32), 325502(2017).</li>
<li>Bandara, H. M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-Mediated+Synthesis+of+a+Near-Infrared+Fluorescent+K%2B+Sensor%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Org+Chem%22%5BJournal%5D)">Palladium-Mediated Synthesis of a Near-Infrared Fluorescent K+ Sensor.</a> J Org Chem. 82 (15), 8199-8205 (2017).</li>
<li>Depauw, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+selective+potassium+sensor+for+the+detection+of+potassium+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Weinh+Bergstr+Ger%22%5BJournal%5D)">A highly selective potassium sensor for the detection of potassium in living tissues.</a> Chem Weinh Bergstr Ger. 22 (42), 14902-14911 (2016).</li>
<li>Machado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofouling-Resistant+Impedimetric+Sensor+for+Array+High-Resolution+Extracellular+Potassium+Monitoring+in+the+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Biofouling-Resistant Impedimetric Sensor for Array High-Resolution Extracellular Potassium Monitoring in the Brain.</a> Biosensors. 6 (4), (2016).</li>
<li>Rose, M. C., Henkens, R. W. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0304416574902049">Stability of sodium and potassium complexes of valinomycin.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Gen Subj. 372 (2), 426-435 (1974).</li>
<li>Ammann, D., Chao, P., Simon, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valinomycin-based+K%2B+selective+microelectrodes+with+low+electrical+membrane+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Valinomycin-based K+ selective microelectrodes with low electrical membrane resistance.</a> Neurosci Lett. 74 (2), 221-226 (1987).</li>
<li>Amzica, F., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+and+glial+membrane+potentials+during+sleep+and+paroxysmal+oscillations+in+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal and glial membrane potentials during sleep and paroxysmal oscillations in the neocortex.</a> J Neurosci. 20 (17), 6648-6665 (2000).</li>
<li>Amzica, F., Steriade, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+K-complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep+Med+Rev%22%5BJournal%5D)">The functional significance of K-complexes.</a> Sleep Med Rev. 6 (2), 139-149 (2002).</li>
<li>MacVicar, B. A., Feighan, D., Brown, A., Ransom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+optical+signals+in+the+rat+optic+nerve%3A+role+for+K%28%2B%29+uptake+via+NKCC1+and+swelling+of+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Intrinsic optical signals in the rat optic nerve: role for K(+) uptake via NKCC1 and swelling of astrocytes.</a> Glia. 37 (2), 114-123 (2002).</li>
<li>Chever, O., Djukic, B., McCarthy, K. D., Amzica, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+Kir4.1+channel+in+excess+potassium+clearance%3A+an+in+vivo+study+on+anesthetized+glial-conditional+Kir4.1+knock-out+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Implication of Kir4.1 channel in excess potassium clearance: an in vivo study on anesthetized glial-conditional Kir4.1 knock-out mice.</a> J Neurosci. 30 (47), 15769-15777 (2010).</li>
<li>Hall, D. G. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jp9603039">Ion-selective membrane electrodes: A general limiting treatment of interference effects.</a> J Phys Chem. 100 (17), 7230-7236 (1996).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+Concentric+Microelectrodes+for+Measurement+of+Extracellular+Ion+Signals+in+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue.</a> J Vis Exp. (103), e53058(2015).</li>
<li>Larsen, B. R., MacAulay, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kir4.1-mediated+spatial+buffering+of+K%28%2B%29%3A+Experimental+challenges+in+determination+of+its+temporal+and+quantitative+contribution+to+K%28%2B%29+clearance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+Austin+Tex%22%5BJournal%5D)">Kir4.1-mediated spatial buffering of K(+): Experimental challenges in determination of its temporal and quantitative contribution to K(+) clearance in the brain.</a> Channels Austin Tex. 8 (6), 544-550 (2014).</li>
<li>Mei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+recording+of+circadian+rhythms+in+brains+of+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo recording of circadian rhythms in brains of freely moving mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115, 4276-4281 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metoda, którą tutaj opisujemy, pozwoliła nam ocenić dynamikę K+ w odpowiedzi na elektryczną stymulację zabezpieczeń Schaffera w ostrych wycinkach hipokampa od dorosłych myszy. Nasza metoda przygotowania mikroelektrod jonoselektywnych K+ jest podobna do wcześniej opisanych procedur 12,13,14,15. Jednak ta metoda ma przewagę nad alternatywnymi konfiguracjami elektrod, poniewa...

Stężenia jonów potasu są ściśle regulowane w mózgu, a ich wahania wywierają potężny wpływ na spoczynkowy potencjał błonowy wszystkich komórek. W świetle tych krytycznych wkładów, ważnym celem biologii jest określenie mechanizmów komórkowych i biofizycznych, które są wykorzystywane do ścisłej regulacji stężenia K+ w przestrzeni zewnątrzkomórkowej w różnych narządach ciała1,2. Ważnym wymogiem w tych badaniach jest możliwość dokładnego pomiaru stężeń K+. Chociaż zidentyfikowano wiele składników, które przyczyniają się do homeostazy potasu w mózgu w stanach zdrowych i chorych3,4,5, dalszy postęp został spowolniony ze względu na specjalistyczny charakter przygotowania jonoselektywnych mikroelektrod do pomiaru potasu. Czujniki mikroelektrodowe stanowią złoty standard w pomiarze stężeń K+ in vitro, w wycinkach tkanek i in vivo.
Nowsze podejścia do monitorowania K+ są w trakcie opracowywania przy użyciu czujników optycznych, jednak nie wykrywają one biologicznie istotnego zakresu stężeń K+ lub nie zostały w pełni sprawdzone w systemach biologicznych, chociaż wstępne wyniki wydają się obiecujące6,7,8. W porównaniu z czujnikami optycznymi, mikroelektrody są zasadniczo ograniczone do punktowego pomiaru źródeł jonów, chociaż układy elektrod mogą poprawić rozdzielczość przestrzenną9. W tym artykule skupiono się na jednolufowych czujnikach mikroelektrodowych do monitorowania dynamiki K+.
W tej pracy opisujemy szczegółowe procedury etapowe wytwarzania mikroelektrod selektywnych K+, przy użyciu jonoforu potasu na bazie walinomycyny, który pozwala na wysoce selektywny (104-krotna selektywność K+ do Na+) ruch K+ przez membrany10. Walinomycyna, naturalnie występujący polipeptyd, działa jak przepuszczalny por K+ i ułatwia przepływ K+ w dół gradientu elektrochemicznego. Opisujemy również, jak kalibrować elektrody, jak je przechowywać i używać, a na koniec, jak je wykorzystać do pomiaru dynamiki stężenia K + w ostrych wycinkach mózgu hipokampa u dorosłych myszy. Zastosowanie takich elektrod wraz z genetycznie zmodyfikowanymi myszami, które nie mają specyficznych kanałów jonowych, proponowanymi do regulacji zewnątrzkomórkowej dynamiki K+, powinno ujawnić mechanizmy komórkowe wykorzystywane przez układ nerwowy do kontrolowania stężenia K+ w otoczeniu w środowisku zewnątrzkomórkowym.

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>DSK</td><td>Microslicer Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Mysz: myszy wsobne C57BL/6NTac</td> Mikroskop <td>Taconic</td><td>Stock#B6</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz elektrod</td><td>Olympus</td><td>BX51</td> Sutter P-97 <td></td></tr><tr><td>Ag / AgCl mielony granulat</td><td>WPI</td><td>EP2</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> pCLAMP10.3 Urządzenia molekularne nie dotyczy <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niestandardowa końcówka microfil 28G</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>CMF28G</td><td></td></tr><tr><td>Pręt wolframowy</td><td>AM Systems</td><td>716000</td><td></td></tr><tr><td>Bipolarne elektrody stymulujące</td><td>FHC</td><td>MX21XEW(T01)</td><td></td></tr><tr><td>Izolator bodźców</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>A365</td><td></td></tr><tr><td>Trawa S88 Stymulator</td><td>trawy Firma</td><td>S88</td><td></td></tr><tr><td>Pipety ze szkła borokrzemianowego</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Płyta od A do D</td><td>Digidata 1322A</td><td>Wzmacniacz sygnału Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Multiclamp 700A lub 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>CV-7B Cat 1</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Patch komputer</td><td>Dell</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>walinomycyna</td><td>Sigma</td><td>V0627-10mg</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dimetylo-3-nitrobenzen</td><td>Sigma</td><td>40870-25ml</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis potasu (4-chlorofenylo)boran</td><td>Sigma</td><td>60591-100mg</td><td></td></tr><tr><td>5% dimetylodichlorosilan w heptanie</td><td>Sigma</td><td>85126-5ml</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Cayman Firma chemiczna</td><td>14964</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S9378-5kg</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Mikromanipulator</td><td>Sutter</td><td>MP-285 / ROE-200 / MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka obiektywowa</td><td>Olympus</td><td>PlanAPO 10xW</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie, testowanie i stosowanie mikroelektrod selektywnych jonów potasu w wycinkach tkanek mózgu dorosłego człowieka

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Jony potasu znacząco przyczyniają się do spoczynkowego potencjału błonowego komórek, dlatego też zewnątrzkomórkowe stężenie K+ jest kluczowym regulatorem pobudliwości komórek. Zmienione stężenia zewnątrzkomórkowego K+ wpływają na spoczynkowy potencjał błonowy i pobudliwość komórkową poprzez przesunięcie równowagi między stanami zamkniętymi, otwartymi i nieaktywowanymi dla zależnych od napięcia kanałów jonowych, które leżą u podstaw inicjacji i przewodzenia potencjału czynnościowego. W związku z tym cenny jest bezpośredni pomiar zewnątrzkomórkowej dynamiki K+ w stanach zdrowotnych i chorobowych. Tutaj opisujemy, jak wykonać, skalibrować i używać monopolarnych mikroelektrod selektywnych K+. Umieściliśmy je w wycinkach mózgu dorosłego hipokampa, aby zmierzyć elektrycznie wywołaną dynamikę koncentracji K +. Rozsądne stosowanie takich elektrod jest ważną częścią zestawu narzędzi potrzebnych do oceny mechanizmów komórkowych i biofizycznych, które kontrolują zewnątrzkomórkowe stężenia K+ w układzie nerwowym.

Do selektywnego pomiaru pozakomórkowego K+ przygotowaliśmy mikrolektrody jonoselektywne pokryte warstwą hydrofobową poprzez silanizację czystych pipet z borokrzemianowego szkła (Rycina 1A). Powłoka ta umożliwia zatrzymanie jonoforu K+ zawierającego walinomycynę na końcówce elektrody i pozwala na przepływ jedynie jonów K+ przez wąski otwór na czubku elektrody (Rycina 1B). Po wstępnym przygotowaniu ...

Jony potasu przyczyniają się do spoczynkowego potencjału błonowego komórek, a zewnątrzkomórkowe stężenie K+ jest kluczowym regulatorem pobudliwości komórek. Opisujemy, jak wykonać, skalibrować i stosować monopolarne mikroelektrody selektywne K+. Zastosowanie takich elektrod umożliwia pomiar elektrycznie wywołanej dynamiki stężenia K+ w dorosłych wycinkach hipokampa.

Wytwarzanie, testowanie i stosowanie mikroelektrod selektywnych jonów potasu w wycinkach tkanek mózgu dorosłego człowieka

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Ogólnym celem tej techniki jest wykonanie, kalibracja i użycie monopolarnych mikroelektrod jonoselektywnych jonów potasu. Zastosowanie takich elektrod umożliwia ilościową ocenę dynamiki wywołanego stężenia jonów potasu w wycinkach dorosłego mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu fizjologii, takie jak identyfikacja komórkowych i molekularnych mechanizmów homeostazy jonów potasu w ośrodkowym układzie nerwowym.Główną zaletą tej techniki jest to, że oprócz tego, że jest to łatwa i nieskomplikowana metoda wytwarzania, czujniki mikroelektrodowe stanowią złoty standard w pomiarze stężenia jonów potasu. Aby przygotować kapilary ze szkła borokrzemianowego do silanizacji, umieść je w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Napełnij stożkową rurkę jednomolowym kwasem solnym i inkubuj szklane naczynia włosowate w kwasie solnym z delikatnym mieszaniem przez noc przez co najmniej sześć godzin.Następnie krótko przepłucz naczynia włosowate 70% etanolem, a następnie całkowicie wysusz je w temperaturze od 100 do 120 stopni Celsjusza przez sześć do ośmiu godzin. Umyte kapilary należy przechowywać w pojemnikach z bezwodnym środkiem osuszającym siarczan wapnia do czterech ty

making-testing-using-potassium-ion-selective-microelectrodes-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania i utrzymania preparatu przekroju nowokory w kulturze organotypowej w celu wykonania rejestracji elektrycznej z neuronów piramidowych.

Rejestracja całokomórkowa z organotypowego preparatu skrawka neokory

Wykorzystujemy technikę patch-clamp do pomiaru prądów pojedynczych kanałów aktywowanych przez GABA (kanały GABAA, receptory GABAA) oraz generowanych przez nie prądów synaptycznych i tonicznych w neuronach. Aktywacja kanałów zmniejsza pobudliwość neuronów w stanach zdrowia i choroby 1,2,3,4.

Prądy pojedynczego kanału i prądy toniczne aktywowane przez GABA w skrawkach mózgu szczura

W pierwszej kolejności neurony są charakteryzowane elektrofizjologicznie. Następnie z rejestrowanego neuronu aspiruje się cytoplazmę i poddaje ją analizie RT-PCR w celu wykrycia ekspresji mRNA dla enzymów syntezy neuroprzekaźników, kanałów jonowych oraz receptorów.

Profilowanie ekspresji mRNA napięciowo zależnych kanałów potasowych w neuronach istoty czarnej z wykorzystaniem technik jedno-komórkowego RT-PCR

Film demonstruje wywołaną dynamikę stężenia jonów potasu podczas stymulacji elektrycznej wycinków mózgu myszy koronalnych hipokampów. Bipolarną elektrodę stymulującą umieszcza się w warstwie promieniowej regionu CA3 w hipokampie, a elektrodę selektywną jonów potasu umieszcza się w promieniu promieniowym warstwy CA1. Stymulacja elektryczna powoduje potencjał czynnościowy, w wyniku czego uwalniane są jony potasu. Wreszcie, brak wywołanej odpowiedzi jonów potasu w obecności cząsteczki hamującej...

Pomiar dynamiki wywołanego stężenia jonów potasu w koronalnych wycinkach hipokampa

Ten film pokazuje, jak scharakteryzować przestrzeń zewnątrzkomórkową w wycinku mózgu za pomocą mikroelektrod jonoselektywnych i jonoforetycznych do pomiaru i porównywania sygnałów elektrycznych. Proces ten pomaga określić objętość, frakcję przestrzeni i stopień skręcenia.

Charakterystyka przestrzeni zewnątrzkomórkowej w wycinku mózgu za pomocą mikroelektrod jonoselektywnych i jonoforetycznych

Opracowaliśmy model wycinka mózgu, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z uszkodzeniem mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności. Ta technika generuje żywotną dojrzałą tkankę mózgową i zmniejsza liczbę zwierząt wymaganych do eksperymentów, jednocześnie utrzymując częściowo nienaruszone obwody neuronalne, interakcje komórkowe i przedziały postsynaptyczne.

Ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro

W tym artykule pokazujemy metodę przygotowania ostrych wycinków mózgu w temperaturze fizjologicznej, przy użyciu konwencjonalnego roztworu fizjologicznego bez specjalnych modyfikacji krojenia (takich jak dodanie sacharozy) i bez wewnątrzsercowej perfuzji zwierzęcia przed przygotowaniem plastrów.

Slice It Hot: Ostre cięcie mózgu dorosłego w temperaturze fizjologicznej

Zapisy patch-clamp i jednoczesne wewnątrzkomórkowe wypełnianie biocytyną synaptycznie sprzężonych neuronów w ostrych wycinkach mózgu pozwalają na skorelowaną analizę ich strukturalnych i funkcjonalnych właściwości. Celem niniejszego protokołu jest opisanie podstawowych etapów technicznych zapisu elektrofizjologicznego z mikroukładów neuronalnych i ich późniejszej analizy morfologicznej.

Elektrofizjologiczna i morfologiczna charakterystyka mikroobwodów neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu przy użyciu sparowanych nagrań patch-clamp

Demonstrujemy wykonanie, kalibrację i właściwości dwóch typów mikroelektrod selektywnych jonowo (dwulufowych i koncentrycznych) do pomiaru stężeń jonów w tkance mózgowej. Są one następnie wykorzystywane w przygotowaniu plastra hipokampa myszy, aby pokazać, że aktywność pobudzająca zmienia zarówno zewnątrzkomórkowe stężenie potasu, jak i sodu.

Dwulufowe i koncentryczne mikroelektrody do pomiaru zewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w tkance mózgowej

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Poznaj metodę wytwarzania i kalibracji mikroelektrod selektywnych jonów potasu do pomiaru dynamiki jonów K+ w wycinkach hipokampu dorosłych myszy. Technika ta umożliwia badanie homeostazy potasu w układzie nerwowym.

Wytwarzanie, testowanie i stosowanie mikroelektrod selektywnych jonów potasu w wycinkach tkanek mózgu dorosłego człowieka

Przeglądaj więcej filmów