Wytwarzanie, testowanie i stosowanie mikroelektrod selektywnych jonów potasu w wycinkach tkanek mózgu dorosłego człowieka

Ogólnym celem tej techniki jest wykonanie, kalibracja i użycie monopolarnych mikroelektrod jonoselektywnych jonów potasu. Zastosowanie takich elektrod umożliwia ilościową ocenę dynamiki wywołanego stężenia jonów potasu w wycinkach dorosłego mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu fizjologii, takie jak identyfikacja komórkowych i molekularnych mechanizmów homeostazy jonów potasu w ośrodkowym układzie nerwowym.

Główną zaletą tej techniki jest to, że oprócz tego, że jest to łatwa i nieskomplikowana metoda wytwarzania, czujniki mikroelektrodowe stanowią złoty standard w pomiarze stężenia jonów potasu. Aby przygotować kapilary ze szkła borokrzemianowego do silanizacji, umieść je w 50-mililitrowej stożkowej probówce. Napełnij stożkową rurkę jednomolowym kwasem solnym i inkubuj szklane naczynia włosowate w kwasie solnym z delikatnym mieszaniem przez noc przez co najmniej sześć godzin.

Następnie krótko przepłucz naczynia włosowate 70% etanolem, a następnie całkowicie wysusz je w temperaturze od 100 do 120 stopni Celsjusza przez sześć do ośmiu godzin. Umyte kapilary należy przechowywać w pojemnikach z bezwodnym środkiem osuszającym siarczan wapnia do czterech tygodni przed dalszym użyciem. Przed silanizacją pociągnij kapilary do cienkiej końcówki za pomocą ściągacza do mikroelektrod.

Następnie umieść mikroelektrody w szklanym pojemniku za pomocą taśmy autoklawowalnej, tak aby elektrody były podniesione od dołu, aby zapobiec pęknięciu końcówki. Następnie usuń około 0,5 mililitra 5% roztworu silanizacyjnego DDS z pojemnika metodą azotu. Napełnij balon azotem gazowym i przymocuj strzykawkę lub rurkę i igłę do balonu.

Następnie wprowadzić igłę do pojemnika DDS, jednocześnie pobierając DDS do oddzielnej strzykawki za pomocą dłuższej igły. Następnie nanieść roztwór silanizacyjny kroplami na końcówki pipet i natychmiast przykryć pojemnik. Umieść pojemnik z mikroelektrodami z roztworem silanizacyjnym we wstępnie nagrzanym piecu laboratoryjnym w temperaturze od 170 do 180 stopni Celsjusza na 10 do 12 godzin lub w temperaturze od 200 do 220 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Po inkubacji wyjmij płytkę z piekarnika. Umieść talerz na ławce w temperaturze pokojowej na 10 do 15 minut, aby szklane naczynia ostygły. Wyjmij mikroelektrody z płytki i umieść je w hermetycznym pojemniku wypełnionym środkiem osuszającym.

Mikroelektrody silanizowane utrzymywane w stanie wolnym od wilgoci mogą być używane do tygodnia po silanizacji. Aby zalać elektrody, przygotuj roztwór podstawowy koktajlu jonoforowego potasu i przechowuj go w hermetycznym, nieprzezroczystym pojemniku w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj roztwór podstawowy 10-milimolowego 300-milimolowego chlorku sodu buforowanego przez HEPS o pH 7,4.

Zamocuj elektrodę w zacisku. Następnie, za pomocą narzędzia, nagrab końcówkę elektrody do szerokości około 10 do 20 mikrometrów, a następnie wypełnij elektrodę chlorkiem sodu buforowanym przez HEPES za pomocą końcówki MicroFil o rozmiarze 28 podłączonej do strzykawki. Obserwuj, że roztwór soli dotarł do końca końcówki mikroelektrody i upewnij się, że mikroelektroda jest wolna od dużych pęcherzyków, które mogłyby zakłócać przepływ prądu.

Za pomocą mikropipety nanieś niewielką kroplę jonoforu potasu w pobliżu końcówki mikroelektrody. Jeśli elektroda została odpowiednio silanizowana, kropla zostanie wchłonięta przez złamaną końcówkę. Napełnij elektrodę do około 1 milimetra jonoforem potasu i usuń nadmiar za pomocą bibuły.

Aby skalibrować mikroelektrody, przed rozpoczęciem eksperymentu należy bąbelkować wszystkie roztwory kalibracyjne i plastrować roztwory buforowe z 95% tlenem/5% dwutlenkiem węgla przez co najmniej 20 minut. Rozpocznij perfuzję kąpieli z 4,5-milimolowym ACSF zawierającym jony potasu w tempie trzech mililitrów na minutę. Umieść elektrodę potasowo-jonoselektywną w uchwycie elektrody przymocowanym do głowicy elektrody na manipulatorze.

Następnie włóż końcówkę elektrody do perfuzatu kąpieli. Upewnij się, że elektroda uziemiająca srebro/chlorek srebra jest zanurzona w tym samym roztworze, a przepływ jest stały. Nakładaj roztwory kalibracyjne w sposób krokowy i zapisuj potencjalne zmiany w miliwoltach na końcówce elektrody.

Poczekaj, aż potencjał na końcówce elektrody osiągnie stabilną wartość przed przejściem do następnego roztworu. Następnie zmierz zmianę napięcia w stanie ustalonym w odpowiedzi na zastosowanie roztworów kalibracyjnych na końcówce elektrody. Upewnij się, że nachylenie odpowiedzi napięciowej elektrody wynosi co najmniej 52 i nie więcej niż 59 miliwoltów na dziesięciokrotną zmianę stężenia potasu.

Aby przygotować plastry hipokampa, wykonaj dwu- lub trzycentymetrowe nacięcie od ogonowej części czaszki, aby przeciąć skórę głowy wzdłuż linii środkowej. Ręcznie chowając skórę głowy, wykonaj dwa jednocentymetrowe poziome nacięcia od otworu wielkiego wzdłuż boków czaszki. Następnie za pomocą cienkich nożyc wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej od tyłu czaszki do nosa.

Następnie włóż cienkie kleszcze w pobliżu linii środkowej i cofnij naciętą czaszkę w dwóch częściach. Wyjmij mózg myszy z czaszki i użyj ostrza, aby usunąć móżdżek, korę przedczołową i opuszki węchowe, które znajdują się odpowiednio w ogonowej i rostralnej części mózgu. Następnie zamontuj blok mózgu na tacy wibratomu za pomocą Super Glue.

Napełnij tacę wibratomu lodowatym roztworem do cięcia. Następnie wytnij skrawki tkanki na równinie koronalnej o grubości 300 mikrometrów. Zwykle można zebrać od czterech do sześciu koronalnych wycinków hipokampa.

Po pokrojeniu każdej sekcji należy ją natychmiast przenieść do zlewki do przechowywania plastrów ogrzanej do temperatury od 32 do 34 stopni Celsjusza. Utrzymuj sekcje w tej temperaturze przez 20 minut przed przeniesieniem zlewki z sekcjami do temperatury pokojowej na co najmniej 20 do 30 minut przed zapisem. Aby zmierzyć dynamikę jonów potasu, delikatnie umieść plasterek mózgu w kąpieli za pomocą pipety Pasteura i delikatnie przytrzymaj go na miejscu za pomocą platynowej harfy z nylonowymi strunami.

Upewnij się, że końcówki bipolarnej elektrody stymulującej są w przybliżeniu równoległe do siebie i znajdują się na poziomie płaszczyzny plasterka. W ciągu pięciu do siedmiu sekund powoli wprowadzaj elektrody do warstwy promieniowania CA3 na głębokość około 40 do 50 mikrometrów, aby stymulować zabezpieczenia Schaffera. Następnie ostrożnie włóż elektrodę potasowo-jonoselektywną do warstwy promieniowania CA1 na głębokość około 50 mikrometrów, powoli opuszczając elektrodę przez około trzy do czterech sekund.

Poczekaj, aż potencjał ustabilizuje się w poprzek elektrody przed zastosowaniem stymulacji do plasterka, co zwykle zajmuje od pięciu do 10 minut. Jeśli plasterek wykazuje nadmierne spontaniczne zmiany w zewnątrzkomórkowych stężeniach jonów potasu, wyrzuć i powtórz proces z nowym plasterkiem. Aby zmierzyć wywołane uwalnianie jonów potasu, zastosuj ciągi stymulacji elektrycznej za pomocą izolatora bodźców, jednocześnie cyfrowo rejestrując odpowiedzi.

Zastosuj stymulację z częstotliwością 10 Hz i jedną milisekundę na impuls, zaczynając od amplitudy bodźca 10 mikroamperów. Stosuj dwukrotne zwiększanie amplitudy stymulacji, aż do wykrycia maksymalnej amplitudy odpowiedzi potasu. Jeśli nie zaobserwuje się żadnej odpowiedzi, przesuń położenie elektrody jonoselektywnej potasu bliżej miejsca stymulacji w odstępach co 100 mikrometrów.

Aby potwierdzić, że zmiany stężenia jonów potasu są pośredniczone przez wyzwalanie potencjału czynnościowego aktywowanych elektrycznie zabezpieczeń Shaffera, należy zastosować 0,5 mikromola TTX w ACSF przez 10 minut i powtórzyć protokół stymulacji. Nie należy zaobserwować żadnych wywołanych reakcji. Po zalaniu elektrod wypełnionym roztworem soli fizjologicznej buforowanym przez HEPES i jonoforem potasu, elektrody można przetestować pod kątem ich szybkiej reakcji na skokowe zmiany stężeń jonów potasu w kąpieli oraz pod kątem liniowej odpowiedzi na zmiany jonów potasu w kąpieli w zakresie kalibracji od 0,1 do 100 milimolowych w sposób przewidziany równaniem Nernsta.

Potencjał w stanie ustalonym można wykreślić w stosunku do stężenia jonów potasu w kąpieli w celu określenia nachylenia linii, które powinno wynosić około V 58,2 miliwoltów i nie mniej niż 52 miliwolty na dziesięciokrotną zmianę stężenia jonów potasu. Dalej testowano reakcję elektrod selektywnych potasowo i zaobserwowano reakcję na wzrost potasu o 5,5 milimola przy stałych czasu narastania i zaniku wynoszących około 85 milisekund. Po umieszczeniu elektrod stymulujących i selektywnych jonów potasu w tkance i osiągnięciu stabilnej linii bazowej zapisu, można zastosować impulsy o rosnącej amplitudzie prądu.

Przebieg tej aktywności objawia się szybkim wzrostem potasu z wykładniczą szybkością rozpadu, która jest znoszona przez zastosowanie TTX. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około trzy do czterech godzin, jeśli jest wykonywana z ostrożnością i dokładnością. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby końcówka elektrody była jak najmniejsza, aby umożliwić dokładne nagrania, ale wystarczająco duża, aby umożliwić niski poziom szumów.