Integracja obrazowania, cytometrii przepływowej i profilowania transkryptomicznego w celu oceny zmienionego endocytarnego transportu CD1d

Metody te integrują sekwencjonowanie nowej generacji i analizę obrazowania metodą cytometrii przepływowej. Może pomóc odpowiedzieć na interesujące pytania, takie jak to, czy niektóre zmiany fenotypowe są związane z transkryptomem, a nie z transkryptomem, zwłaszcza w środowisku narażenia na zanieczyszczenia. Główną zaletą tej prostej metody jest dla nas to, że możemy jej użyć do pomiaru kolokalizacji biologicznie ważnego białka, do interpretacji wyników kluczowej różnicowej ekspresji genów na poziomie funkcjonalnym.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy skutków patologicznych i toksykologicznych. Jako normalne podejście do obrazowania, forsee ma zdolność łączenia ekspresji genów z funkcją białka. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu wysokich wymagań technicznych związanych z obrazowaniem i analizą transkryptomiczną.

Aby zsekwencjonować bibliotekę komórek dendrytycznych pochodzących z ludzkich monocytów, najpierw załaduj odczynniki do sekwencjonowania i indeksowania odpowiednio na stojaki na odczynniki do sekwencjonowania biosyntezy i indeksowania, a następnie umieść stojaki w laboratoryjnej łaźni wodnej na jedną godzinę, aż cały lód się stopi, a odczynniki zostaną dokładnie wymieszane. Podczas rozmrażania odczynników włącz sekwencer, podłącz komputer do dysku sieciowego, gdy pojawi się dysk Nie wysuwaj, a następnie uruchom oprogramowanie sterujące sekwencerem. Następnie dodaj około 100 mililitrów roztworu do mycia konserwacyjnego do każdej z butelek w stojaku na odczynniki do biosyntezy sekwencyjnej i nakręć nakrętkę lejka na każdą butelkę.

Dodać około 12 mililitrów roztworu do mycia konserwacyjnego do każdej 15-mililitrowej stożkowej probówki w stojaku na odczynniki indeksujące i wyrzucić nakrętki. Następnie załaduj oba stojaki na sekwencer. Wybierz opcję Mycie konserwacyjne w oprogramowaniu sterującym sekwencerem i postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi czyszczenia układu płynu sekwencera.

Użyj latarki, aby wizualnie sprawdzić komórkę przepływową pod kątem pęcherzyków przechodzących przez pasy, aby upewnić się, że nie ma wycieków. Po zakończeniu sekwencji prania otwórz kartę Sekwencja i rozpocznij nowy przebieg, kierując dane wyjściowe na dysk sieciowy. Prześlij przykładowy arkusz do demultipleksowania i wprowadź odpowiednie informacje o odczynniku.

Użyj używanej komory przepływowej, aby zalać system odczynnikami do sekwencjonowania. Po zakończeniu generowania klastra usuń komórkę przepływową. I lekko spryskaj komórkę wodą.

Wytrzyj komórkę przepływową do sucha papierem do soczewek, a następnie spryskaj ją lekkim roztworem 95% etanolu. Po ponownym wytarciu komory przepływowej do sucha sprawdź jej powierzchnię pod światło, aby upewnić się, że jest czysta, bez zanieczyszczeń i pozostałości soli. Po zakończeniu pierwszego kroku załaduj zgrupowaną komórkę przepływową i rozpocznij sekwencjonowanie.

Oprogramowanie do przeglądania analizy sekwencji zostanie uruchomione automatycznie. Około 26 godzin później monitoruj jakość danych sekwencjonowania za pomocą oprogramowania do kontroli sekwencji o wysokiej wydajności i oprogramowania do analizy sekwencjonowania, aby ocenić jakość danych i rozwiązać wszelkie problemy. Następnie, po zakończeniu sekwencji, wymień uszczelkę komory przepływowej i wykonaj mycie konserwacyjne przed rozpoczęciem następnego uruchomienia.

Po obrazowaniu metodą cytometrii przepływowej komórek dendrytycznych narażonych na zanieczyszczenia, otwórz ImageJ Fiji i połącz 100 zapisanych obrazów komórek dla grup próbek ludzkich komórek dendrytycznych nienaświetlonych i narażonych na zanieczyszczenia w indywidualne pliki zgodnie z grupą badaną. Aby przeanalizować kolokalizację CD1d i Lamp1 w obu populacjach, otwórz obraz 100 scalonych komórek narażonych na zanieczyszczenia i wybierz Kanały, Obraz, Kolor i Podział, aby podzielić obraz na dwa pojedyncze obrazy z pojedynczym fluoroforem na kanał. Aby utworzyć wykres punktowy kolokalizowanych pikseli, wybierz opcje Analizuj, Kolokalizacja i Próg kolokalizacji, a następnie naciśnij przycisk Drukuj zrzut ekranu, aby zapisać wykres punktowy.

Aby obliczyć współczynnik kolokalizacji Mandera dla każdego obrazu jednokomórkowego, użyj narzędzia do zaznaczania owalu, aby wybrać obraz jednokomórkowy w pliku obrazu z podzielonymi kanałami, a następnie ponownie wybierz opcję Analizuj, Kolokalizacja i Próg kolokalizacji. Następnie wybierz Kanał 1 w oknie dialogowym dla obszaru zainteresowania i kliknij przycisk OK. Po obliczeniu współczynnika dla wszystkich 100 obrazów komórek zaimportuj wyniki do odpowiedniego arkusza kalkulacyjnego i powtórz analizę dla kontrolnej próbki komórek nienaświetlonych. Korzystając z sekwencjonowania RNA i analiz danych transkryptomicznych, zidentyfikowano kilka głównych zmienionych klastrów genów, w tym metabolizmu lipidów i funkcji endocytarnych w DC narażonych na zanieczyszczenia.

Na poziomie obrazu pojedynczej komórki, komórki dendrytyczne HLADR dodatnie CD11c mogą być bramkowane, zgodnie z ich koekspresją CD1d i Lamp1. Kontrolne nienarażone komórki dendrytyczne wykazują minimalną kolokalizację białek CD1d i Lamp1, co wskazuje na podstawowy poziom transportu endocytarnego CD1d i wysoki poziom ekspresji powierzchniowej w warunkach fizjologicznych. Natomiast CD1d jest zatrzymywany w późnych przedziałach endocytarnych komórek dendrytycznych narażonych na zanieczyszczenia, co potwierdza zmienione profile genów endocytarnych w tej eksperymentalnej populacji komórek.

Po scaleniu poszczególnych obrazów komórkowych w jeden plik obrazu, poszczególne obrazy można podzielić zgodnie z ich ekspresją fluoroforu, a kolokalizację intensywności pikseli między dwoma kanałami można zwizualizować na wykresie punktowym. Stopień kolokalizacji między białkami CD1d i Lamp1 w dwóch grupach leczenia można następnie określić ilościowo za pomocą współczynników Mandera. Jeśli intensywność białka jest hetergeniczna między obszarami kolokalizowanymi i niekolokalizowanymi, intensywność kolokalizowana nie będzie równoległa do obszarów kolokalizowanych, dlatego ważne jest również dalsze ocenianie kolokalizacji dwóch białek w oparciu o intensywność pikseli.

Po opanowaniu analiza obrazu może zostać zakończona w ciągu dwóch godzin, a konfiguracja sekwencjonowania RNA może zostać zakończona w ciągu trzech godzin, jeśli każda technika zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby upewnić się, że wszystkie odczynniki są prawidłowo załadowane we właściwych pozycjach i że nie ma wycieków w sekwencerze. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak sekwencjonowanie mikro RNA, egzomu lub komórek tucznych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące odpowiednio globalnej ekspresji mikro RNA, mutacji genów lub metylacji DNA.

Po opracowaniu, technika ta pomoże naukowcom zajmującym się analizą obrazowania komórkowego i sekwencjonowaniem nowej generacji w badaniu wpływu zanieczyszczenia środowiska na ekspresję genów i funkcję białek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować sekwencjonowanie nowej generacji oraz analizę kolokalizacji białek za pomocą imagera. Nie zapominaj, że praca z toksycznymi substancjami chemicznymi zanieczyszczającymi w próbkach ludzkiej krwi może być niezwykle niebezpieczna.

Podczas wykonywania tych procedur należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak używanie dygestorii chemicznej i środków ochrony osobistej.