Name: Integracja obrazowania, cytometrii przepływowej i profilowania transkryptomicznego w celu oceny zmienionego endocytarnego transportu CD1d (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj integrację cytometrii przepływowej z obrazowaniem i sekwencjonowaniem RNA w celu analizy endocytozy CD1d w ludzkich komórkach dendrytycznych narażonych na zanieczyszczenia. Ta metoda łączy profilowanie transkryptomiczne z oceną kolokalizacji białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy dziękują Robertowi Giulitto (centrum krwiodawstwa Hoxworth) za próbki ludzkiej krwi i dr Liang Niu za normalizację ekspresji genów czytamy. Dziękujemy również za wsparcie grantowe od Narodowego Instytutu Nauk o Zdrowiu Środowiskowym (ES006096), projektu pilotażowego Centrum Genetyki Środowiskowej (CEG) (S.H.), Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (AI115358) (S.H.), nagrody Rady ds. Badań Naukowych Uniwersytetu w Cincinnati (S.H.) oraz University of Cincinnati College of Medicine Core Enhancement Funding (X. Z.).

Protokoły ludzkie w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board Uniwersytetu w Cincinnati, a wszystkie metody zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami. Próbki krwi od zdrowych dawców pobrano z Hoxworth Blood Center w University of Cincinnati Medical Center.
1. Profilowanie transkryptomiczne narażonych na zanieczyszczenia DC pochodzących z ludzkich monocytów
<ol>
	<li>Całkowita ekstrakcja RNA DC narażonych na BaP
	<ol>
		<li>Różnicuj ludzkie DC za pomocą cytokin GM-CSF i IL-4 i wystawiaj DC na działanie BaP przez 4 dni13.</li>
		<li>Sortuj DC narażone na BaP za pomocą cytometrii przepływowej na podstawie markerów ekspresji powierzchniowej (Lineage-HLA-DR+), z których większość składa się z konwencjonalnych DC (CD11c+CD1c+)13. Zazwyczaj sortuje się 10 000 DC do pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS, odwirowuje DC przy 600 x g i 4 °C przez 6 minut i natychmiast usuwa supernatant przez aspirację za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Po usunięciu supernatantu przez aspirację należy poddać lizie osad komórkowy, dodając 0,4 ml buforu do lizy/wiązania z zestawu do izolacji RNA w celu przechowywania w temperaturze -80 °C przed ekstrakcją RNA.</li>
		<li>Użyj zestawu do izolacji RNA z protokołem ekstrakcji całkowitego RNA, aby wyodrębnić całkowity RNA14. Zmierz integralność RNA za pomocą Bioanalyzer15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza transkryptomiczna posortowanych DC (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)
	<ol>
		<li>Przygotuj bibliotekę do sekwencji RNA za pomocą zestawu do przygotowania biblioteki RNA. Krótko mówiąc, fragmentuj wyizolowany poli-A RNA (~ 200 pz), odwróć transkrypcję fragmentów do 1. nici cDNA, a następnie dokonaj syntezy drugiej nici cDNA znakowanej dUTP.</li>
		<li>Podwiązywać dwuniciowe cDNA do adaptera o strukturze pętli trzpienia po oczyszczeniu kulek, naprawie końcówek i ogonowaniu dA. Wyciąć reszty uracylu w 2. nici cDNA i pętli adaptera za pomocą enzymu USER (odczynnik do wycinania swoistego dla uracilu), aby zachować swoistość nici i otworzyć pętlę adaptera do PCR.
		<ol>
			<li>Wykonaj 13 cykli PCR przy użyciu uniwersalnych i specyficznych dla indeksu starterów, aby wzbogacić zindeksowaną bibliotekę. Oczyść bibliotekę i uruchom na chipie Bioanalyzer DNA High Sensitivity, aby sprawdzić jakość biblioteki i rozkład rozmiaru.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj bibliotecznego zestawu do kwantyfikacji i systemu PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z informacjami o wielkości biblioteki, aby obliczyć stężenie w bibliotece za pomocą metody krzywej standardowej. </li>
		<li>Proporcjonalnie połącz indywidualnie indeksowane kompatybilne biblioteki i dostosuj końcowe całkowite stężenie do 15 pM. Wykonaj generowanie klastra bibliotecznego i sekwencjonuj bibliotekę przy ustawieniu pojedynczego odczytu 1x 50 bp, aby wygenerować ~25 milionów odczytów na próbkę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekwencjonowanie
	<ol>
		<li>Załaduj odczynniki do sekwencjonowania i indeksowania odpowiednio do stojaków na odczynniki SBS i PE. Umieść odczynniki w laboratoryjnej łaźni wodnej na 1 godzinę, aż cały lód się stopi, a odczynniki w każdej butelce/probówce zostaną odpowiednio wymieszane.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę ICB, dodając rozmrożony barwnik i enzym o temperaturze -20 °C do butelki i wymieszać. Przygotować roztwór NaOH zgodnie z instrukcją sekwencjonowania. Umieścić wszystkie odczynniki w temperaturze 4 °C, aż będą gotowe do użycia.</li>
		<li>Podczas 1 godzinnego okresu oczekiwania włącz sekwencer. Poczekaj, aż pojawi się dysk DONOTEJECT i podłącz komputer do dysku sieciowego.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie sterujące sekwencerem.</li>
		<li>Przygotuj 2 l roztworu do mycia konserwacyjnego, który zawiera 0,5% Tween 20 i 0,03% ProClin 300 w wodzie o jakości laboratoryjnej.</li>
		<li>W stojaku na odczynniki SBS dodaj ~100 ml roztworu do mycia konserwacyjnego do każdej z 8 butelek i zakręć nakrętki lejków do butelek. W stojaku na odczynniki PE dodaj ~12 ml roztworu do mycia konserwacyjnego do każdej z dziesięciu stożkowych probówek o pojemności 15 ml i wyrzuć nakrętki.</li>
		<li>Załaduj dwa stojaki z butelkami/probówkami wypełnionymi roztworem do sekwencera.</li>
		<li>W oprogramowaniu sterującym sekwencerem wybierz Mycie konserwacyjne; postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby wyczyścić system płynu sekwencera, aż proces zostanie zakończony.</li>
		<li>Rozpocznij nowy przebieg w zakładce "SEKWENCJA" z oprogramowania; skieruj dane wyjściowe na dysk sieciowy. Wybierz parametry dla pojedynczego odczytu 1x 50 bp z bibliotekami multipleksowanymi o pojedynczym indeksie.</li>
		<li>Opcjonalnie zaloguj się do koncentratora sekwencji BaseSpace, aby stan sekwencjonowania mógł być zdalnie monitorowany za pomocą komputera lub smartfona.</li>
		<li>Prześlij arkusz próbki do demultipleksowania i podaj informacje o odczynniku zgodnie z wymaganiami oprogramowania.</li>
		<li>Załaduj odczynniki SBS i PE do sekwenatora. Zalać system zużytą kuwetą przepływową (~15 min).</li>
		<li>Po zakończeniu generowania klastra (~4,5 h) wyjmij kuwetę przepływową, lekko spryskaj ją wodą i wytrzyj do sucha papierem do soczewek. Lekko spryskaj komorę przepływową 95% etanolem i wytrzyj ją do sucha. Sprawdź pod światło, aby upewnić się, że powierzchnia jest czysta, bez zanieczyszczeń i pozostałości soli.</li>
		<li>Po zakończeniu kroku Prime załaduj klastrowaną komórkę przepływową i rozpocznij sekwencjonowanie. Oprogramowanie Sequence Analysis Viewer zostanie uruchomione automatycznie.</li>
		<li>Monitoruj jakość danych sekwencjonowania za pomocą SAV, w tym gęstość klastra, filtr przebiegu odczytu, filtr przejścia klastra, % ≥Q30, starsza faza/profaza, indeksowanie QC itp. Pomaga to zrozumieć jakość danych i rozwiązywać problemy.</li>
		<li>Wymień uszczelkę komory przepływowej i wykonaj mycie konserwacyjne po zakończeniu sekwencjonowania. Sekwencer jest gotowy do następnego uruchomienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza bioinformatyczna
	<ol>
		<li>Wykonaj bioinformatyczną analizę danych sekwencyjnych RNA13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza ścieżek profili transkryptomicznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Użyj bioprzewodnika edgeR, aby porównać wynikową intensywność ekspresji genów między DC narażonymi na BaP i nienarażonymi od trzech dawców. Następnie zidentyfikuj geny o zróżnicowanej ekspresji między DC narażonymi na BaP i nienarażonymi na BaP na podstawie bezwzględnej zmiany fałdowania (>2 razy) i wartości p skorygowanych o współczynnik fałszywych odkryć (FDR) (<0,05).</li>
	<li>Aby przewidzieć funkcjonalne klastry genów o zróżnicowanej ekspresji, należy użyć pakietu oprogramowania ToppCluster do przeszukania zmienionych genów w kilku bazach danych, w tym KEGG i REACTOME, i wygenerowania danych grupowania. ToppCluster wykorzystuje test hipergeometryczny do uzyskania funkcjonalnego wzbogacenia za pomocą analizy wzbogacenia listy genów16.</li>
	<li>Następnie wprowadź wyniki z tych klastrów funkcji do Cytoscape17,18 Wersja 3.3.0, szeroko stosowana platforma oprogramowania open source do wizualizacji złożonych sieci. W ten sposób geny zaangażowane w różne klastry lub szlaki, w tym klastry endocytarne i metabolizm lipidów, są pokazane w sieci z adnotacją kolorystyczną uśrednionej zmiany krotności ekspresji genów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B)13.</li>
</ol>
3. Obrazowanie cytometrii przepływowej kolokalizacji CD1d i Lamp1
<ol>
	<li>Znakowanie przeciwciałami DC narażonych na BaP
	<ol>
		<li>Wystawić 0,5 x 106 ludzkich DC na działanie 5,94 μM BaP przez 4 dni w temperaturze 37 °C w 2 ml kompletnej zmodyfikowanej pożywki Dulbecco. Zbierać DC przez odwirowanie przy 400 x g przez 10 min. Zablokuj zróżnicowane DC poprzez inkubację komórek z ludzkim blokerem surowicy i przeciwciałami anty-ludzkim receptorem Fc przez 10 minut w lodzie, w tym przeciwciałami anty-ludzkimi CD16, CD32 i CD64.</li>
		<li>Inkubować fiolet brylantowy 421-anty-CD1c (L161), barwnik fikoerytryny/cyjaniny 7 (PE/Cy7)-anty-HLA-DR i PE/Cy5-anty-CD11c z DC przez 20 minut w lodzie. Tabela 1 przedstawia tę listę przeciwciał.</li>
		<li>Napraw DC za pomocą 4% paraformaldehydu w PBS i przepuszczaln je za pomocą Permeabilization Wash Buffer. Wykonaj barwienie wewnątrzkomórkowe za pomocą mieszaniny oczyszczonego anty-ludzkiego CD1d znakowanego PE (51.1) i anty-Lamp1 znakowanego Alexa Fluor 647 (CD107a) (H4A3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowy pomiar cytometrii przepływowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
	<ol>
		<li>Analizuj barwione próbki za pomocą obrazowego cytometru przepływowego w rdzeniu cytometrii przepływowej Szpitala Dziecięcego w Cincinnati przy użyciu obiektywu 40X, aby uzyskać 300 pikseli dla komórki o średnicy około 10 μm. Rozmiar jednego piksela to około 0,5 μm na 0,5 μm obiektu.</li>
		<li>Uzyskaj 10 000 obrazów komórkowych w sposób bezstronny, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analizy obrazowe obrazów cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Analiza kolokalizacji za pomocą oprogramowania IDEAS (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
	<ol>
		<li>Wykonaj kompensację z próbkami barwionymi pojedynczo i niebarwionymi, ustawiając intensywność fluorescencji próbek niebarwionych poniżej progu, w tym niebarwionych DC wystawionych na działanie BaP z autofluorescencją BaP, tak jak w rutynowej analizie danych cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Bramkowanie komórek barwionych w celu uzyskania podzbiorów komórek HLA-DR + CD11c + CD1d + Lamp1 + (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A) i pokazanie obrazów komórkowych w podzbiorach bramkowanych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B).</li>
		<li>Zapisz obrazy komórek w formacie png w oparciu o dwa techniczne kryteria włączenia, wizualną obecność silnych współbarwionych sygnałów i subkomórkową lokalizację białek CD1d i Lamp1, do analiz kolokalizacji przy użyciu ImageJ-Fiji (<silna klasa = "xfig">Figura 2B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj oprogramowania ImageJ-Fiji, aby przeprowadzić analizę kolokalizacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).
	<ol>
		<li>Przygotuj wejściowe pliki obrazów, scalając 100 zapisanych obrazów komórek odpowiednio dla nienaświetlonych i narażonych na BaP ludzkich DC (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3A).</li>
		<li>Przeanalizuj kolokalizację CD1d (czerwony) i Lamp1 (zielony) za pomocą wykresu rozrzutu.
		<ol>
			<li>Uruchom program ImageJ-Fiji. Otwórz plik .png ze 100 obrazami komórek (Rysunek 3B i <silna klasa="xfig">Rysunek 4A): "Plik | Otwórz".</li>
			<li>Podziel obraz ze scalonymi kanałami czerwonym i zielonym na dwa obrazy z kanałem czerwonym lub zielonym: "Obraz | Kolor | Podziel kanały".</li>
			<li>Narysuj wykres rozrzutu za pomocą poleceń "Analizuj | Kolokacja | Próg kolokalizacji". Zapisz wykres rozrzutu za pomocą "PrintScreen".</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Obliczać współczynniki kolokalizacji Mandera dla każdego pojedynczego obrazu komórkowego (n=100) (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B)
		<ol>
			<li>Wybierz obraz z pojedynczą komórką w pliku obrazu z podzielonymi kanałami za pomocą narzędzia do zaznaczania "Owal".</li>
			<li>Użyj poleceń "Analizuj | Kolokacja | Próg kolokalizacji". Wybierz "Kanał 1" w oknie dialogowym regionu zainteresowania (ROI). Zachowaj wszystkie opcje obliczeń, w tym "Progi użycia Mandera" dla każdego obrazu komórki.</li>
			<li>Powtórz to obliczenie dla wszystkich obrazów 100 komórek.</li>
			<li>Zapisz i otwórz wyniki za pomocą arkusza kalkulacyjnego.</li>
			<li>Wykreśl błędy średnie i standardowe dla "progowych współczynników Mandera" (n=100, 0 oznacza brak kolokalizacji, a 1 oznacza doskonałą kolokalizację). Użyj testu t-Studenta, aby obliczyć wartość p dla porównania między grupami narażonymi na BaP i nienarażonymi (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Oblicz procent progowej intensywności pikseli kolokalizowanej między CD1d i Lamp1 dla obrazów z wieloma komórkami (n=100) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4C).
		<ol>
			<li>Użyj tego samego protokołu analizy w 4.2.3 i dodatkowo wybierz opcję wyniku "% intensywności powyżej progu kolokalizowanej".</li>
			<li>Wykonaj tę analizę razem ze współczynnikami kolokalizacji Mandera.</li>
			<li>Podobnie wykreśl błędy średnie i standardowe dla % intensywności kolokalizowanej między CD1d i Lamp1. Użyj testu t-Studenta, aby obliczyć wartość p dla porównania między grupami narażonymi na BaP i nienarażonymi (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Roche, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Processing+and+Presentation+Mechanisms+in+Myeloid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Spectrum%22%5BJournal%5D)">Antigen Processing and Presentation Mechanisms in Myeloid Cells.</a> Microbiology Spectrum. 4 (3), (2016).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MR1+uses+an+endocytic+pathway+to+activate+mucosal-associated+invariant+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">MR1 uses an endocytic pathway to activate mucosal-associated invariant T cells.</a> The Journal of experimental medicine. 205 (5), 1201-1211 (2008).</li>
<li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomes+are+specialized+platforms+for+bacterial+sensing+and+NOD2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endosomes are specialized platforms for bacterial sensing and NOD2 signalling.</a> Nature. 509 (7499), 240-244 (2014).</li>
<li>Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+antigen+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Pathways of antigen processing.</a> Annual review of immunology. 31, 443-473 (2013).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature reviews. Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Zajonc, D. M., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+mediated+T+cell+recognition+of+glycolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">CD1 mediated T cell recognition of glycolipids.</a> Current opinion in structural biology. 17 (5), 521-529 (2007).</li>
<li>Cox, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cellular+lipids+bound+to+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Determination of cellular lipids bound to human CD1d molecules.</a> PloS one. 4 (5), e5325(2009).</li>
<li>Yuan, W., Kang, S. J., Evans, J. E., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+lipid+ligands+associated+with+human+CD1d+targeted+to+different+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Natural lipid ligands associated with human CD1d targeted to different subcellular compartments.</a> Journal of immunology. 182 (8), 4784-4791 (2009).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+deoxyceramides+and+diacylglycerols+as+CD1b+scaffold+lipids+among+diverse+groove-blocking+lipids+of+the+human+CD1+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discovery of deoxyceramides and diacylglycerols as CD1b scaffold lipids among diverse groove-blocking lipids of the human CD1 system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19335-19340 (2011).</li>
<li>de Jong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1a-autoreactive+T+cells+recognize+natural+skin+oils+that+function+as+headless+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CD1a-autoreactive T cells recognize natural skin oils that function as headless antigens.</a> Nature. 15 (2), 177-185 (2014).</li>
<li>Trombetta, E. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+antigen+processing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Cell biology of antigen processing in vitro and in vivo.</a> Annual review of immunology. 23, 975-1028 (2005).</li>
<li>Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardizing+immunophenotyping+for+the+Human+Immunology+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project.</a> Nature reviews. Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).</li>
<li>Sharma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endocytic+lipid+antigen+presentation+by+common+lipophilic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endocytic lipid antigen presentation by common lipophilic environmental pollutants.</a> Science Reports. 7 (1), 2085(2017).</li>
<li>Boom, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> Journal of clinical microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).</li>
<li>Nachamkin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agilent+2100+bioanalyzer+for+restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+the+Campylobacter+jejuni+flagellin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Agilent 2100 bioanalyzer for restriction fragment length polymorphism analysis of the Campylobacter jejuni flagellin gene.</a> Journal of clinical microbiology. 39 (2), 754-757 (2001).</li>
<li>Kaimal, V., Bardes, E. E., Tabar, S. C., Jegga, A. G., Aronow, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ToppCluster%3A+a+multiple+gene+list+feature+analyzer+for+comparative+enrichment+clustering+and+network-based+dissection+of+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">ToppCluster: a multiple gene list feature analyzer for comparative enrichment clustering and network-based dissection of biological systems.</a> Nucleic acids research. 38 (Web Server issue), W96-W102 (2010).</li>
<li>Bauer-Mehren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+genomic+information+with+biological+networks+using+Cytoscape%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Integration of genomic information with biological networks using Cytoscape).</a> Methods in molecular biology. 1021, 37-61 (2013).</li>
<li>Cline, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+biological+networks+and+gene+expression+data+using+Cytoscape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Integration of biological networks and gene expression data using Cytoscape.</a> Nature protocols. 2 (10), 2366-2382 (2007).</li>
<li>Huang, S., Moody, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-unrestricted+T+cells+in+the+human+CD1+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Donor-unrestricted T cells in the human CD1 system.</a> Immunogenetics. 68 (8), 577-596 (2016).</li>
<li>Huang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Innate-Like+T+Cells+in+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Targeting Innate-Like T Cells in Tuberculosis.</a> Frontiers in immunology. 7, 594(2016).</li>
<li>Moody, D. B., Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+pathways+of+CD1+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intracellular pathways of CD1 antigen presentation.</a> Nature reviews. Immunology. 3 (1), 11-22 (2003).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Diard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+cooperative+virulence+by+the+expression+of+an+avirulent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stabilization of cooperative virulence by the expression of an avirulent phenotype.</a> Nature. 494 (7437), 353-356 (2013).</li>
<li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proliferative+and+mature+beta-cells+in+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of proliferative and mature beta-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li>
<li>Eliceiri, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+imaging+software+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biological imaging software tools.</a> Nature. 9 (7), 697-710 (2012).</li>
<li>Costes, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+quantitative+measurement+of+protein-protein+colocalization+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Automatic and quantitative measurement of protein-protein colocalization in live cells.</a> Biophysical journal. 86 (6), 3993-4003 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Funkcjonalne potwierdzenie zmienionego szlaku genowego jest trudne ze względu na duży wpływ ekspresji genów obejmującej wiele szlaków oraz trudności w integracji indywidualnych i populacyjnych aktywności komórkowych. Zastosowaliśmy obrazową cytometrię przepływową, aby przetestować transport CD1d w przedziałach endocytarnych. Obrazowa cytometria przepływowa integruje populacyjny pomiar komórek i indywidualną demonstrację subkomórkowej kolokalizacji wielu białek. Mikroskopia konfokalna wcześniej zapewniała wysoką rozdzielc...

Prezentacja antygenu zazwyczaj wiąże się z wewnątrzkomórkowym transportem białek, co często było badane za pomocą charakterystyki morfologicznej i profilowania fenotypowego komórek prezentujących antygen1,2,3. Aby zintegrować zalety metod obrazowania i fenotypowania, opisujemy platformę analizy obrazowania zarówno na poziomie pojedynczej komórki, jak i populacji, aby wykazać zmienioną kolokalizację białek w ludzkich komórkach dendrytycznych (DC). W prezentacji antygenu peptydowego cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I wiążą krótki peptyd (8-10 reszt) w retikulum endoplazmatycznym, aby aktywować konwencjonalne limfocyty T CD8 +, podczas gdy cząsteczki MHC klasy II wiążą stosunkowo dłuższy peptyd (~ 20 reszt) w przedziałach endocytarnych<, aby aktywować konwencjonalne limfocyty T CD4 + sup class="xref">1,4. W przeciwieństwie do tego, limfocyty T specyficzne dla lipidów są aktywowane przez białka CD1 z antygenami lipidowymi załadowanymi głównie w przedziałach endocytarnych5,6. Prezentacja antygenu lipidowego wymaga dostarczenia metabolitów lipidowych wytwarzanych w metabolizmie lipidów7,8,9,10 oraz załadowania funkcjonalnych metabolitów lipidowych do białek CD1 w przedziałach endocytarnych5,6. W tym kontekście kluczowe znaczenie ma zdefiniowanie różnych czynników komórkowych modulujących prezentację antygenu lipidowego, zwłaszcza w środowisku narażonym na zanieczyszczenia lipofilowe i zaburzenia immunologiczne. W tym badaniu zastosowaliśmy analizę transkryptomiczną, profilowanie obrazu oraz analizę obrazowania komórkowego i populacyjnego DC pochodzących z ludzkich monocytów w celu określenia transportu białek endocytarnych przyczyniających się do prezentacji antygenu lipidowego w ekspozycji na zanieczyszczenia. Z pewnością ta połączona platforma może być zastosowana do badania subkomórkowego transportu białek i kolokalizacji w różnych procesach biologicznych.
Technicznie, lokalizacja białek subkomórkowych była zwykle demonstrowana za pomocą mikroskopii konfokalnej i analizowana statystycznie w ograniczonej liczbie wykrytych komórek1,2,3,11. Co więcej, cytometria przepływowa jest szeroko stosowana do populacji komórek bramkowych z współbarwionymi sygnałami wielu białek na poziomie komórkowym12; Brakuje jednak szczegółowej wizualizacji kolokalizacji białek subkomórkowych. Aby uzyskać kompleksowe i statystyczne analizy procentowej kolokalizacji białek zarówno na poziomie komórkowym, jak i populacyjnym, stosujemy podejścia do profilowania i analizy obrazowania w celu określenia cech kolokalizacji białek o znaczeniu biologicznym. W szczególności używamy obrazowej cytometrii przepływowej do wykrywania kolokalizacji CD1d i białek białka błonowego 1 związanego z lizosomami (Lamp1) w tym badaniu. Analiza ilościowa kolokalizowanych cząsteczek była wcześniej trudna do przeprowadzenia w skali populacji. W tym badaniu dostosowaliśmy program ImageJ-Fiji, aby zbadać procent kolokalizacji białek z dużą liczbą współbarwionych komórek zarówno na poziomie populacyjnym, jak i indywidualnym komórkowym. W szczególności zmierzyliśmy kolokalizowane obszary, intensywność i wielkość populacji, aby potwierdzić wniosek, że białko CD1d było w dużej mierze zatrzymywane w późnych przedziałach endocytarnych ludzkich DC w ekspozycji na lipofilowe zanieczyszczenie benzo[a]pirenem (BaP)13. Ta połączona analiza obrazowania komórkowego i populacyjnego dostarczyła wysoce powtarzalnych, kompleksowych i statystycznie istotnych wyników kolokalizacji CD1d-Lamp1 istotnych dla zahamowanej prezentacji antygenu lipidowego.
Transkryptom ludzkich DC narażonych na BaP zdecydowanie wspierał hipotezę, że metabolizm lipidów endocytarnych i transport endocytarny CD1d były zaburzone w ekspozycji na BaP. Aby przetestować tę hipotezę, zastosowaliśmy obrazową cytometrię przepływową do profilowania obrazów populacji DC, które były współbarwione wieloma białkami, w tym CD1d, markerami endocytarnymi i markerami DC. Na koniec współbarwione komórki poddano analizie statystycznej, aby wykazać procent intensywności i obszarów kolokalizacji CD1d i Lamp1.

<table><tbody><tr><td>Transkryptomika</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500 v4</td><td>System Illumina HiSeq</td></tr><tr><td>ImagingStream X</td><td>Millipore</td><td>100220</td><td>Obrazowanie cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>mirVana Zestaw do izolacji miRNA</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>Ekstrakcja całkowitego RNA</td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Analiza</td> QC <td>Agilent</td><td></td><td>Total RNA</td></tr><tr><td>Veriti 96-dołkowy szybki termocykler</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td>PCR, reakcja enzymatyczna</td></tr><tr><td>NEBNext Moduł izolacji magnetycznej mRNA poli(A)&nbsp;</td><td>Oczyszczanie RNA</td> <td>New England Biolab</td><td></td></tr><tr><td>PolyA Zautomatyzowany system SMARTer Apollo</td><td>Oczyszczanie RNA</td><td>Takara</td><td></td></tr><tr><td>PolyA Zestaw do przygotowania biblioteki NEBNext Ultra RNA do</td><td>przygotowania biblioteki</td>Illumina <td>New England Biolab</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne Agencourt AMPure XP</td> Oczyszczanie DNA <td>Beckman Coulter</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Library QC, analiza rozkładu wielkości</td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td><td>Agilent</td><td></td><td>Library QC, analiza rozkładu wielkości</td></tr><tr><td>QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher)</td><td>Kwantyfikacja biblioteki</td> <td>Thermo Fisher</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ilościowy biblioteki NEBNext</td><td>Kwantyfikacja</td><td></td> biblioteki New England Biolab <td></td></tr><tr><td></td><td>Generacja klastra</td>biblioteki <td>cBot Illumina</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SR Cluster Kit v3 - cBot &ndash; Biblioteka HS</td><td>Illumina</td><td></td><td>Generacja klastrów</td></tr><tr><td>HiSeq 1000</td><td>Sekwencjonowanie</td><td>Illumina</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3 - HS (50 cykli)</td><td>Sekwencjonowanie</td> <td>Illumina</td> Fikoerytryna/Cyjanina 7 (PE/Cy7)Bio Legend L243 Fikoerytryna/Cyjanina 5 (PE/Cy5)Bio Legend 3.9 Fioletowy brylantowy <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 421 Bio <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Legend</td><td>L161</td><td></td></tr><tr><td>PE - anty-myszy IgG2b</td><td>Bio Legend</td><td>51.1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (AF647)</td><td>Bio Legend</td><td>CD107a(H4A3)</td><td></td></tr></tbody></table>

integracja obrazowania, cytometrii przepływowej i profilowania transkryptomicznego w celu oceny zmienionego endocytarnego transportu cd1d

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Analizy populacyjne morfologicznej i funkcjonalnej zmian białek endocytarnych są trudne ze względu na konieczność przechwytywania obrazów na poziomie pojedynczej komórki i statystycznej analizy obrazu na poziomie populacji. Aby przezwyciężyć tę trudność, zastosowaliśmy obrazowaną cytometrię przepływową i profilowanie transkryptomiczne (RNA-seq) w celu określenia zmienionej subkomórkowej lokalizacji klastra białka różnicowania 1d (CD1d) związanego z upośledzoną ekspresją genów endocytarnych w ludzkich komórkach dendrytycznych (DC), które były narażone na powszechny lipofilowy benzo[a]piren zanieczyszczający powietrze. Kolokalizacja białek CD1d i markera endocytarnego Lamp1 z tysięcy obrazów komórkowych zarejestrowanych za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej została przeanalizowana przy użyciu programów IDEAS i ImageJ-Fiji. Liczne obrazy komórkowe z jednocześnie barwionymi białkami CD1d i Lamp1 wizualizowano po bramkowaniu na CD1d+Lamp1+ DC za pomocą IDEAS. Zwiększona kolokalizacja CD1d i Lamp1 po ekspozycji na BaP została następnie zademonstrowana przy użyciu progowych wykresów rozrzutu, przetestowanych ze współczynnikami Mandera dla intensywności kolokalizowanej i wykreślonej na podstawie procentu kolokalizowanych obszarów przy użyciu ImageJ-Fiji. Nasze dane dostarczają korzystnego instrumentalnego i bioinformatycznego podejścia do pomiaru kolokalizacji białek zarówno na poziomie pojedynczym, jak i populacyjnym, wspierając upośledzony funkcjonalny wynik zmiany transkryptomicznej w ludzkich DC narażonych na zanieczyszczenia.

Lipofilny zanieczyszczający związek BaP zmienia klastry genów endocytozy w ludzkich komórkach DC. Ludzkie komórki DC pochodzące z monocytów od każdego dawcy (n=3) inkubowano z BaP, a następnie wyizolowano konwencjonalne komórki DC, które wykorzystano do ekstrakcji RNA i analizy transkrypcyjnej zgodnie z opisem. Po normalizacji ekspresji genów, geny zmienione pomiędzy grupą eksponowaną na BaP a grupą nieeksponowaną zostały pogrupowane w klastry zgodnie z korelacją funkcjonalną genów o różn...

Obrazowanie cytometrii przepływowej stanowi idealne podejście do wykrywania morfologicznych i funkcjonalnych zmian komórek na poziomie indywidualnym i populacyjnym. Zakłóconą funkcję endocytarną w prezentacji antygenu lipidowego w ludzkich komórkach dendrytycznych narażonych na zanieczyszczenia wykazano za pomocą połączonego profilowania transkryptomicznego ekspresji genów i morfologicznej demonstracji transportu białek.

Integracja obrazowania, cytometrii przepływowej i profilowania transkryptomicznego w celu oceny zmienionego endocytarnego transportu CD1d

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...

Metody te integrują sekwencjonowanie nowej generacji i analizę obrazowania metodą cytometrii przepływowej. Może pomóc odpowiedzieć na interesujące pytania, takie jak to, czy niektóre zmiany fenotypowe są związane z transkryptomem, a nie z transkryptomem, zwłaszcza w środowisku narażenia na zanieczyszczenia. Główną zaletą tej prostej metody jest dla nas to, że możemy jej użyć do pomiaru kolokalizacji biologicznie ważnego białka, do interpretacji wyników kluczowej różnicowej ekspresji genów na poziomie funkcjonalnym.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy skutków patologicznych i toksykologicznych. Jako normalne podejście do obrazowania, forsee ma zdolność łączenia ekspresji genów z funkcją białka. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności z powodu wysokich wymagań technicznych związanych z obrazowaniem i analizą transkryptomiczną.Aby zsekwencjonować bibliotekę komórek dendrytycznych pochodzących z ludzkich monocytów, najpierw załaduj odczynniki do sekwencjonowania i indeksowania odpowiednio na stojaki na odczynniki do sekwencjonowania biosyntezy i indeksowania, a następnie umieść stojaki w laboratoryjnej łaźn

integrate-imaging-flow-cytometry-transcriptomic-profiling-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiono metodę IP-FCM, która umożliwia czułą i niezawodną biochemiczną ocenę natywnych oddziaływań białko-białko, bez konieczności stosowania inżynierii genetycznej lub dużych objętości próbek.

IP-FCM: Immunoprecypitacja wykrywana za pomocą cytometrii przepływowej

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Mechanizmy rządzące ruchliwością śródmiąższową komórek T efektorowych CD4 w miejscach zapalenia są stosunkowo nieznane. Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do wizualizacji i manipulacji limfocytami T CD4 przygotowanymi in vitro w zapalnej skórze właściwej ucha, co pozwala na badanie dynamicznego zachowania tych komórek in situ.

Obrazowanie migracji śródmiąższowej komórek T CD4 w stanie zapalnym skóry właściwej

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Opisujemy tutaj metodę izolacji w celu uzyskania ludzkich śródnabłonkowych limfocytów wewnątrzszyjkowych do analizy śródnabłonkowych limfocytów T gamma delta. Protokół ten można rozszerzyć o oczyszczanie komórek T gamma delta szyjki macicy za pomocą kulek magnetycznych lub sortowania komórek.

Izolacja i analiza cytometryczna przepływowa ludzkich komórek T gamma Delta w obrębie szyjki macicy

Tutaj opisujemy kompletny proces analizy jakościowej i ilościowej synaps immunologicznych pomiędzy pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda opiera się na obrazowej cytometrii przepływowej, która pozwala na pozyskanie i ocenę kilku tysięcy obrazów komórek w stosunkowo krótkim czasie.

Analiza jakościowa i ilościowa synapsy immunologicznej w organizmie człowieka z wykorzystaniem obrazowej cytometrii przepływowej

Opisano test wiązania komórkowego oparty na cytometrii przepływowej, który jest używany głównie jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które hamują wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 (CXCL12) z receptorem chemokiny CXC 4 (CXCR4).

Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4

Izolacja komórek z wypreparowanych implantów i ich charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej może znacząco przyczynić się do zrozumienia wzorca odpowiedzi immunologicznej przeciwko implantom. W pracy opisano dokładną metodę izolacji komórek z wypreparowanych implantów i ich barwienia do analizy metodą cytometrii przepływowej.

Wysokowymiarowa cytometria przepływowa do analizy funkcji immunologicznej wypreparowanych tkanek implantów

Ten protokół opisuje opartą na cytometrii przepływowej, wysokoprzepustową metodę przesiewową w celu identyfikacji małocząsteczkowych leków, które hamują aktywację integryny β2 na ludzkich neutrofilach.

Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny

Napływ wapnia, miara sygnalizacji limfocytów T, jest skutecznym sposobem analizy reakcji na stymulację receptorów limfocytów T. Ten protokół multipleksowania Indo-1 z panelami przeciwciał skierowanymi na cząsteczki powierzchniowe komórki wykorzystuje wysoce elastyczne możliwości cytometrii przepływowej w pełnym spektrum.

Analiza indukowanego przez receptor limfocytów T napływu wapnia w pierwotnych mysich limfocytach T za pomocą cytometrii przepływowej pełnego spektrum

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Poznaj integrację cytometrii przepływowej z obrazowaniem i sekwencjonowaniem RNA w celu analizy endocytozy CD1d w ludzkich komórkach dendrytycznych narażonych na zanieczyszczenia. Ta metoda łączy profilowanie transkryptomiczne z oceną kolokalizacji białek.

Integracja obrazowania, cytometrii przepływowej i profilowania transkryptomicznego w celu oceny zmienionego endocytarnego transportu CD1d (Wideo) | JoVE Journal

Integracja obrazowania, cytometrii przepływowej i profilowania transkryptomicznego w celu oceny zmienionego endocytarnego transportu CD1d

Przeglądaj więcej filmów