Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny

Nasze badania koncentrują się na integrynie neutrofilowej. W tym badaniu mamy na celu ustalenie metody znalezienia małocząsteczkowych antagonistów aktywacji integryny beta dw. Wierzymy, że dzięki tej metodzie możemy znaleźć nowych antagonistów, którzy mogą pogłębić naszą wiedzę na temat fizjologii integryny, a także zapewnić wgląd translacyjny w terapię przeciwzapalną opartą na integrynie.

W przyszłości skupimy się na odkrywaniu nowych leków przeciwzapalnych i analizowaniu mechanizmów ich działania. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie ułóż cztery mililitry heparynizowanej krwi ludzkiej na ośmiu mililitrach pożywki o gradiencie gęstości w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Odwirować krew o stężeniu 550 G przez 30 do 50 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Następnie użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby usunąć górną warstwę zawierającą osocze i komórki jednojądrzaste. Zebrać neutrofile z dolnego pasma mętnego i około trzech do czterech mililitrów poniżej klarownej cieczy do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 10 mililitrów PBS. Delikatnie odwróć probówkę dwa do trzech razy, aby wymieszać zawiesinę neutrofili.

Odwirować zawiesinę neutrofili o stężeniu 400 G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie zdekantować supernatant z probówki i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS. Ponownie odwirować zawiesinę o stężeniu 300 G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Po usunięciu supernatantu należy użyć ssania próżniowego, aby usunąć resztki supernatantu na ściance probówki i wokół ujścia probówki. Zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki neutrofilowej. Połącz jeden mililitr 1,2 mikrograma na mililitr roztworu przeciwciała z 0,2 mililitra pożywki neutrofilowej w 1,5 mililitrowej probówce.

Dodaj 25 mikrolitrów roztworu przeciwciała do studzienek kontroli ujemnej w płytce 384-dołkowej. W 15-mililitrowej probówce połącz dziewięć mililitrów roztworu przeciwciała, 21,6 mikrolitrów roztworu FMLP i 1,7784 mililitra pożywki neutrofilowej. Dodać 25 mikrolitrów tej mieszaniny do kontroli pozytywnej i studzienek testowych w płytce 384-dołkowej.

Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś pięć mikrolitrów roztworu związku z płytki biblioteki związków na płytkę 384-dołkową. Odwirować zawiesinę o sile 500 G przez jedną minutę. Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny neutrofili do każdej studzienki za pomocą 16-kanałowej pipety.

Inkubować płytkę na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min przez 10 minut. Następnie, aby utrwalić komórki, dodaj trzy mikrolitry 16% paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubuj na lodzie przez 10 minut. Po włączeniu cytometru przepływowego załadować 384-dołkową płytkę zawierającą zawiesinę neutrofili poddanych działaniu związku na uchwyt próbki.

Otwórz oprogramowanie. Zainicjuj nowy eksperyment. Wybierz dobrze 384 i wybierz żądane fluorofory.

Następnie kliknij ustawienia płyty, przeciągnij, aby zaznaczyć wszystkie dołki i kliknij próbkę. Włącz przełącznik wysokiej przepustowości, a następnie w panelu szybkości wybierz opcję wysoka. W polu woluminu wprowadź wartość 50.

Wybrać próbki w kolumnach o numerach nieparzystych i aktywować przełącznik mieszania. Na koniec nazwij próbki w prawym panelu. Średnie wartości intensywności fluorescencji badanych związków znajdowały się powyżej linii odcięcia, co wskazuje, że żaden ze związków nie został zidentyfikowany jako antagoniści integryny beta dwa.