Name: Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 15 s
Description: Poznaj wysokoprzepustową metodę cytometrii przepływowej do identyfikacji inhibitorów integryny β2 na ludzkich neutrofilach. Technika ta umożliwia odkrywanie nowych antagonistów z potencjałem terapeutycznym w leczeniu zapalnych chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr Evanowi Jellisonowi i pani Li Zhu z centrum cytometrii przepływowej w UConn Health za ich pomoc w cytometrii przepływowej, dr Lynn Puddington z Wydziału Immunologii UConn Health za wsparcie instrumentów, Pani Sławie Gajewskiej i dr Paulowi Appletonowi z centrum badań klinicznych w UConn Health za ich pomoc w uzyskaniu próbek krwi. Dziękujemy dr Christopherowi "Kit" Boninowi i dr Genewie Hargis z UConn School of Medicine za ich pomoc w pisaniu naukowym i redagowaniu tego manuskryptu. Badania te były wspierane przez granty z National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (R01HL145454), National Institute of General Medical Sciences (P20GM121176), USA, Career Development Award od American Heart Association (18CDA34110426) oraz fundusz startowy od UConn Health. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com.

Heparynizowane próbki krwi pełnej zostały pobrane od niezidentyfikowanych zdrowych dawców ludzkich po uzyskaniu świadomej zgody, zatwierdzonej przez Institutional Review Board of UConn Health, zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich dawców. Kryteria włączenia/wykluczenia dla tego badania zostały starannie opracowane, aby zapewnić odpowiednią kwalifikację uczestników i zminimalizować potencjalne ryzyko. Uprawnieni uczestnicy byli w wieku od 18 do 65 lat, niezależnie od pochodzenia etnicznego, biegle posługiwali się językiem angielskim i byli zdolni do wyrażenia świadomej zgody. Wykluczeni uczestnicy obejmowali osoby, które nie były w stanie wyrazić świadomej zgody dla siebie, takie jak osoby wymagające prawnie upoważnionego przedstawiciela, osoby poniżej 18 roku życia lub powyżej 65 lat, osoby osadzone w więzieniach i kobiety w ciąży. Dodatkowo uczestnicy musieli być wolni od stosowania leków przeciwzapalnych i stanów zapalnych. Obecne infekcje lub trwające przewlekłe lub ostre stany zapalne były również kryteriami wykluczenia. Wreszcie, osoby z aktualną lub niedawną historią zakażenia COVID-19 nie kwalifikowały się do badania. Kryteria te zostały opracowane w celu zapewnienia bezpieczeństwa i przydatności uczestników przy jednoczesnej minimalizacji potencjalnych czynników zakłócających, które mogłyby mieć wpływ na wyniki badania.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Pożywka neutrofilowa: Przygotować pożywkę neutrofilową, dodając 2% albuminy surowicy ludzkiej do RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Roztwór fMLP: Przygotować roztwór fMLP, rozcieńczając go 100 razy z 10 mM roztworu do przechowywania dimetylosulfotlenku fMLP (DMSO) (patrz tabela materiałów) RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej, dając roztwór fMLP o stężeniu 100 μM.</li>
	<li>Roztwór przeciwciała: Rozcieńczyć 120 μl przeciwciała monoklonalnego sprzężonego z allofikocyjaniną (APC) mAb24 (mAb24-APC) (patrz tabela materiałów), które informuje o wysokim powinowactwie integryny β2, w 10 ml pożywki neutrofilowej, tworząc roztwór 1,2 μg/ml mAb24-APC.</li>
	<li>Biblioteka związków: Rozcieńczyć początkową bibliotekę związków o stężeniu od 10 mM do 1 mM, dodając 5 μl biblioteki 10 mM (patrz tabela materiałów) do 45 μl DMSO w 384-dołkowych płytkach za pomocą płynu. Następnie przenieś 5 μl na studzienkę z biblioteki związków 1 mM na pustą płytkę 384-dołkową za pomocą manipulatora cieczy.</li>
	<li>Jak pokazano w Rysunek 1, cztery kolumny (1, 2, 23, 24) zawierały tylko DMSO, ale nie zawierały związków, służąc jako kontrole dodatnie i ujemne w badaniu przesiewowym. Następnie rozcieńczyć każdą studzienkę, dodając 45 μl RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej, uzyskując końcowe stężenie 100 μM dla wszystkich związków.</li>
</ol>
2. Izolacja neutrofili z ludzkiej krwi
<ol>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie ułóż 4 ml krwi na 8 ml dostępnego w handlu podłoża o gradiencie gęstości (patrz tabela materiałów) w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Odwirować krew przy stężeniu 550 × g przez 30-50 minut w temperaturze 20 °C. Stopniowo zwalniać wirnik (współczynnik opóźnienia 1). 
	UWAGA: Pomyślne oddzielenie neutrofili (pasmo 2 w <silna klasa="xfig">Ryc. 2B) od czerwonych krwinek może się różnić w zależności od dawcy. W przypadku większości dawców wystarczające jest 30-minutowe wirowanie. Jednak w przypadku niektórych dawców może być wymagane dodatkowe 10-30 minut wirowania, jeśli separacja się nie powiedzie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C).</li>
	<li>Ostrożnie usuń osocze (żółty płyn na wierzchu) i komórki jednojądrzaste (górne mętne pasmo; Pasmo PBMC w klasie <strong="xfig">Rysunek 2B) przy użyciu pipety o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Zebrać neutrofile z dolnego mętnego pasma (pasmo neutrofili w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B) i około 3-4 ml poniżej klarownej cieczy do 15 ml probówki wirówkowej zawierającej 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Delikatnie wymieszaj zawiesinę neutrofili, odwracając ją 2-3 razy.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o stężeniu 400 × g przez 10 minut w temperaturze 20 °C, a następnie ostrożnie usunąć supernatant przez dekantację.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić osad z 5 ml PBS i odwirować go przy 300 × g przez 5 minut w temperaturze 20 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant przez dekantację i ostrożnie usunąć wszelkie pozostałości supernatantu wokół ujścia probówki i na ściance probówki za pomocą odsysania próżniowego. Zawiesić osad w 1 ml pożywki z granulocytami obojętnochłonnymi.</li>
	<li>Policz numery komórek za pomocą hemocytometru. Zazwyczaj od 1 do 4 × 107 neutrofili uzyskiwano z 8 ml ludzkiej krwi. 
	UWAGA: W zawiesinie neutrofili może występować zanieczyszczenie krwinkami czerwonymi. Czerwone krwinki nie wpływają znacząco na większość testów i mogą zapobiegać aktywacji/torowaniu neutrofili27. Czerwone krwinki muszą zostać poddane lizie przed liczeniem, aby uzyskać dokładne stężenie neutrofili. Dodaj 10 μl zawiesiny komórkowej do 891 μl dejonizowanej wody przez 10-30 s, aby lizować czerwone krwinki, a następnie dodaj 99 μl 10× PBS, aby zrównoważyć ciśnienie osmotyczne, zapobiegając lizie neutrofili</li>.
	<li>Dostosuj gęstość komórek do 6,25 × 105 komórek/ml, dodając pożywkę neutrofilową.</li>
</ol>
3. Przygotowanie płytki 384-dołkowej
<ol>
	<li>W probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml połącz 1 ml roztworu przeciwciała (1,2 μg/ml mAb24-APC) z 0,2 ml pożywki neutrofilowej, aby uzyskać roztwór 1 μg/ml mAb24-APC. Następnie dodaj 25 μl tej mieszaniny do studzienek kontroli ujemnej na płytce 384-dołkowej (niebieskie studzienki w <silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml wymieszaj 9 ml roztworu przeciwciała z 21,6 μl roztworu fMLP (100 μM) i 1,7784 ml pożywki neutrofilowej, aby uzyskać roztwór zawierający 1 μg/ml mAb24-APC i 200 nM fMLP. Następnie dodaj 25 μl tej mieszaniny do kontroli pozytywnej i studzienek testowych w płytce 384-dołkowej (czerwone i niebieskie studzienki w <silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Przenieść 5 μl 100 μM roztworów związków z płytki biblioteki związków na płytkę 384-dołkową za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Odwirowywać ciecz przez 1 minutę w temperaturze 500 × g, w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Do wirowania płytek wymagany jest wirnik z odchylanym kubełkiem i wiadra z płytami.</li>
</ol>
4. Leczenie komórek
<ol>
	<li>Dodać 20 μl zawiesiny neutrofili do każdego dołka za pomocą pipety 16-kanałowej (zakres 5-50 μl, dla każdej kolumny płytki 384-dołkowej). Delikatnie wymieszaj 5-10 razy za pomocą pipety, zachowując stały odstęp czasu między każdym pipetowaniem. 
	UWAGA: Końcowe stężenia w studzienkach są następujące: neutrofile 2,5 × 105 komórek/ml (wszystkie studzienki); mAb24-APC 0,5 μg/ml (wszystkie studzienki); fMLP 100 nM (kontrolne i testowe studzienki kontrolne); związki 10 μM (studzienki badawcze).</li>
	<li>Inkubować płytkę na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min, w temperaturze pokojowej (RT), przez 10 minut.</li>
	<li>Utrwal komórki, dodając 3 μl 16% paraformaldehydu (PFA) do każdej studzienki za pomocą 16-kanałowej pipety (końcowe stężenie PFA ~0,91%). Następnie inkubować na lodzie przez 10 min. 
	UWAGA: Zaleca się zachowanie stałego odstępu czasu między różnymi kolumnami podczas dodawania neutrofili i PFA. Gwarantuje to, że neutrofile w każdym dołku mają taki sam czas inkubacji z fMLP i mAb24-APC.</li>
</ol>
5. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Włącz cytometr przepływowy (patrz Tabela materiałów) i upewnij się, że komputer podłączony do przyrządu jest również włączony.</li>
	<li>Upewnij się, że pojemnik na płyn w osłonie jest napełniony, a pojemnik na odpady jest pusty i prawidłowo podłączony do instrumentu.</li>
	<li>Załadować płytkę 384-dołkową na ładowarkę próbki cytometru przepływowego. Upewnij się, że wgłębienie A1 na tabliczce jest wyrównane z oznaczeniem A1 na ładowarce.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie i utwórz nowy eksperyment. Wybierz dobrze 384 i wybierz żądane fluorofory. Następnie kliknij Ustawienia płyty, przeciągnij, aby zaznaczyć wszystkie dołki, a następnie kliknij Próbka. Włącz przełącznik "Wysoka przepustowość" i wybierz opcję Wysoka pod panelem stawek.
	<ol>
		<li>W polu woluminu wprowadź wartość 50. Wybierz próbki w kolumnach nieparzystych, a następnie aktywuj przełącznik "Mieszanie". Na koniec nazwij próbki w prawym panelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij na Działka i brama. Następnie kliknij przycisk Zastosuj (dwie strzałki na zielonym kółku), a następnie kliknij przycisk odtwarzania (kształt trójkąta). Poczekaj kilka sekund, aby obserwować niektóre komórki z pierwszej studni, a następnie kliknij przycisk pauzy.
	<ol>
		<li>Dostosuj napięcia FSC i SSC, aby zapewnić prawidłową wizualizację komórek na wykresie. Kliknij Akwizycja, a następnie kliknij przycisk odtwarzania (kształt trójkąta), aby rozpocząć test.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cytometr przepływowy będzie sekwencyjnie pobierał próbki ~ 50 μL 1000-3000 neutrofili z każdej studzienki. Wykonanie całej płytki 384-dołkowej zajmie około 3 godzin.</li>
	<li>Po wykonaniu wszystkich przykładów wyeksportuj pliki .fcs do następnego kroku.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy danych cytometrii przepływowej (patrz tabela materiałów). Wybierz i przeciągnij folder zawierający wszystkie pliki .fcs do okna oprogramowania, a następnie zwolnij, aby zaimportować dane do oprogramowania.</li>
	<li>Kliknij dwukrotnie na jedną próbkę, bramkują pojedyncze neutrofile w oparciu o FSC i SSC28,29,30 w wyskakującym okienku, jak pokazano w Rysunek 3. Zaznacz wiersze bramkowane i przeciągnij je do folderu, a następnie zwolnij przycisk, aby zastosować bramkowanie do wszystkich próbek w tym folderze.</li>
	<li>Oblicz i wyeksportuj medianę intensywności fluorescencji (MFI) granulocytów obojętnochłonnych APC z każdego dołka, korzystając z funkcji edytora tabel w oprogramowaniu. Kliknij Dodaj kolumnę na karcie Edytuj. Wybierz opcję Mediana na karcie Statystyka, wybierz bramkowaną populację neutrofili i wybierz APC jako parametr. Kliknij przycisk OK.</li>
	<li>Wróć do zakładki "Edytor tabel", wybierz Wszystkie próbki w zakładce "Grupa" i naciśnij przycisk Utwórz tabelę. Pojawi się nowe okno wyświetlające utworzoną tabelę. Zapisz go jako plik tekstowy, CSV lub Excel.</li>
	<li>Otwórz wyeksportowaną tabelę, oblicz średnią wartość i odchylenie standardowe APC MFI dla dodatnich i ujemnych próbek kontrolnych (<silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Oblicz współczynnik Z' (Z') tabliczki za pomocą równania: 
	Z' = 1 - 3(σp + σn)/(μp - μn), 
	gdzie σp i σn są odchyleniami standardowymi odpowiednio kontroli dodatniej i ujemnej, a μp i μn są średnimi odpowiednio kontroli dodatnich i ujemnych<klasa SUP="xref">31. 
	UWAGA: Współczynnik Z' wskazuje rozdzielenie rozkładu kontroli dodatniej i ujemnej. Z' równe 0 oznacza brak separacji, podczas gdy Z' równe 0,5 oznacza równą separację. Jak wspomniano w poprzednim badaniu31, Z' > 0,5 wskazuje na doskonały test do badań przesiewowych związków. Z' w zakresie od 0,5 do 0 jest dopuszczalne, ale może identyfikować tylko silne trafienia w teście, co będzie wymagało dalszej walidacji w testach wtórnych.</li>
	<li>Związki należy traktować jako "trafienia" do badań przesiewowych, gdy wartość APC MFI neutrofili poddanych działaniu związków jest mniejsza niż trzykrotność odchylenia standardowego MFI kontroli dodatniej odjętej od MFI kontroli dodatniej (P = 0,0013, reprezentowana przez przerywaną linię w <silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
</ol>

Screening of β2 Integrin Activation Inhibitors in Human Neutrophils

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Inicjacja i zakończenie stymulacji i barwienia neutrofili jest determinowane przez dodanie neutrofili i utrwalacza PFA. Dlatego tak ważne jest zapewnienie takiego samego odstępu czasu między pipetowaniem neutrofili lub PFA do każdej kolumny. Gwarantuje to, że czas stymulacji i barwienia neutrofili z każdej studzienki pozostaje stały. Ze względu na krótką żywotność neutrofili cały eksperyment, od pobrania krwi od dawców do zakończenia cytometrii przepływowej, musi zostać przeprowadzony tego samego dnia. Neutrofile są bardzo wrażliwe na zmiany temperatury i mogą ulec aktywacji pod wpływem gwałtownych wzrostów temperatury, takich jak przejście z 4 °C do temperatury pokojowej lub z temperatury pokojowej do 37 °C. Dodatkowo, w oparciu o nasze wcześniejsze doświadczenia, indukowana przez fMLP aktywacja integryny neutrofili β2 nie zachodzi, gdy komórki są przechowywane na lodzie lub w temperaturze 4 °C (dane nie pokazane). Dlatego przed utrwaleniem krew pełną i neutrofile należy przechowywać w temperaturze pokojowej lub 20 °C (podczas etapu wirowania izolacyjnego). Nie umieszczaj krwi pełnej i neutrofili na lodzie.
Barwienie mAb24 w kontrolach ujemnych powinno dać bardzo niskie wyniki. Jeśli w eksperymencie zaobserwuje się wysoki poziom barwienia mAb24, należy sprawdzić, co następuje: (1) czy podczas eksperymentu przed utrwaleniem nastąpiła znacząca zmiana temperatury; (2) czy w pożywce neutrofilowej doszło do zanieczyszczenia fMLP lub endotoksynami; (3) czy obchodzenie się z próbką było zbyt agresywne, np. wytwarzanie pęcherzyków podczas pipetowania i mieszania.
Obecny protokół wykorzystuje mAb24 do zgłaszania otwarcia głowicy integryny β2. Teoretycznie KIM127, przeciwciało monoklonalne informujące o rozszerzeniu integryn β234,35, może być stosowane w połączeniu z mAb24 do kompleksowej oceny konformacji integryny β2. Jednak stosunek sygnału do szumu barwienia KIM127 (1,5 do 2 razy) nie jest tak korzystny jak w przypadku mAb24 (od 5 do 10 razy), co zwykle nie zapewnia zadowalającego współczynnika Z' w teście płytkowym 384-dołkowym. W teście na 96-dołkowej płytce próbki można umyć przed wykonaniem cytometrii przepływowej, redukując rozpuszczalne sygnały tła pochodzące od przeciwciał. Dlatego test oparty na KIM127 można przeprowadzić w teście na płytce 96-dołkowej, która ma niższą przepustowość w porównaniu z testem na płytce 384-dołkowej.
Ponieważ metoda ta wykorzystuje intensywność fluorescencji jako odczyt do oceny hamującego działanie leków na integryny, niektóre leki fluorescencyjne mogą zakłócać wyniki. Dodatkowo, toksyczne leki, które indukują śmierć neutrofili w ciągu 10-minutowego okresu stymulacji, również wydają się zgłaszać hamowanie integryny. Leki, które hamują degranulację neutrofili, hamują ogólną ekspresję integryny β2. Te inhibitory degranulacji zostaną również zidentyfikowane w naszych badaniach przesiewowych. W związku z tym konieczne jest wtórne badanie przesiewowe z innymi kontrolami, aby potwierdzić hamujące działanie trafień. Ekrany wtórne są przywoływane jako środek zarówno do walidacji, jak i określenia mechanizmu działania trafień. Oprócz powtórzenia testów mAb24, całkowita ekspresja CD18 na powierzchni komórki zostanie oceniona przy użyciu przeciwciała anty-ludzkiego CD18. Poziom aktywowanej integryny β2, mierzony za pomocą mAb24, zostanie znormalizowany przez całkowitą ekspresję CD18. Umożliwi nam to ustalenie, czy mechanizm działania czynnika polega na antagonizowaniu aktywacji integryny i/lub hamowaniu ekspresji CD18 na powierzchni komórki. Należy również przeprowadzić test żywotności na wtórnym sicie, aby wykluczyć wszelkie toksyczne skutki trafień.
Ten protokół ma ograniczenia. Po pierwsze, mAb24 jest w stanie wykryć domenę podobną do β2 I tylko w przypadkach, gdy integryna jest w stanie wysokiego powinowactwa. W związku z tym nie może zidentyfikować α/β podobnych do I-podobnych antagonistów allosterycznych, takich jak lifitegrast, poprzez zmniejszenie wiązania mAb24. Lifitegrast indukuje więcej wiązania mAb2432 i wykazuje nienormalnie zwiększoną wartość MFI z mAb24 (ryc. 4). W przypadku takich nieprawidłowych wartości mogą być potrzebne inne testy, aby sprawdzić, czy te trafienia są α/β podobnymi do I-podobnych antagonistów allosterycznych, takich jak lifitegrast. Po drugie, współczynnik Z' dla tego testu jest nieoptymalny i potencjalnie można go poprawić dzięki zastosowaniu automatycznego pipetowania i mieszania. Niestety, nasze laboratorium nie dysponuje niezbędną aparaturą do przetestowania tej hipotezy. Powielanie lub trzykrotne testowanie będzie pomocne w identyfikacji wyników fałszywie dodatnich i ujemnych w przypadku, gdy czynnika Z' nie można dalej poprawić za pomocą powyższych metod. Ponadto korzystne może być wydłużenie czasu inkubacji w celu zidentyfikowania większej liczby trafień, jak zaobserwowano w przypadku znanego inhibitora aktywacji integryny β2 Nexinhib20, który wymaga godziny inkubacji, aby wywołać efekty hamujące. Badanie to koncentrowało się na identyfikacji szybko działających środków. Naukowcy powinni pamiętać, że mogą modyfikować czas inkubacji, aby dostosować go do swoich konkretnych potrzeb.
Według naszej wiedzy jest to pierwsza wysokoprzepustowa metoda przesiewowa w kierunku antagonistów integryny β2. Podejście to może być wykorzystane do identyfikacji związków małocząsteczkowych, które bezpośrednio wiążą się z integrynami β2 i zapobiegają zmianom konformacyjnym prowadzącym do stanów integryny o pośrednim/wysokim powinowactwie, podobnie jak antagoniści bez właściwości "agonistycznych" opisanych niedawno dla integryn αIIbβ3 i α4β126. Neutrofile mają kluczowe znaczenie w wielu chorobach zapalnych, takich jak uszkodzenie niedokrwienno-reperfuzyjne mięśnia sercowego36, posocznica37 i choroby autoimmunologiczne38,39. Leki małocząsteczkowe mogą oferować większą elastyczność w leczeniu tych chorób w porównaniu z lekami opartymi na przeciwciałach. Trafienia z naszego ekranu mogą dostarczyć potencjalnych metod leczenia chorób zapalnych.
Obecna metoda to wysokoprzepustowe badanie przesiewowe oparte na przeciwciałach fluorescencyjnych. Ponieważ przeciwciała reporterowe aktywacji są również dostępne dla β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 i integryn αL 47,48,49,50, metodę tę można rozszerzyć o identyfikację antagonistów dla innych integryn. Konformacyjnie wrażliwe przeciwciało, takie jak HUTS-21, które wiąże się z domeną hybrydową β1 51,52,53, zostało użyte w wysokoprzepustowym badaniu przesiewowym w celu identyfikacji bardzo późnych antagonistów allosterycznych antygenu-4 (VLA-4, integryna α4β1) 54. Obecna metoda badań przesiewowych może być również modyfikowana i rozszerzana w celu znalezienia leków, które hamują lub promują ekspresję innych receptorów powierzchniowych, takich jak związki zwiększające ekspresję powierzchniową transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) na komórkach mukowiscydozy (CF). W mukowiscydozie wielokrotne mutacje prowadzą do nieprawidłowego fałdowania CFTR, co skutkuje brakiem ekspresji CFTR na błonie komórkowej55. Wykazano, że leki małocząsteczkowe przywracają ekspresję CFTR56. W celu modyfikacji protokołu konieczne jest wydłużenie czasu inkubacji leków do kilku godzin, aby umożliwić zajście zmian w ekspresji białek.

Wiele chorób zapalnych charakteryzuje się infiltracją neutrofili w miejscu obrzęku lub urazu1. Aby przeniknąć do tych tkanek, neutrofile muszą przejść przez kaskadę rekrutacji neutrofili, która obejmuje zatrzymanie do śródbłonka, wynaczynienie przez ścianę naczynia i rekrutację do tkanki2. Krążące neutrofile potrzebują aktywacji integryny β2, aby zakończyć tę kaskadę, szczególnie w fazie zatrzymania. Tak więc leki hamujące integryny, które zmniejszają adhezję neutrofili, wynaczynienie i rekrutację, mogą skutecznie leczyć choroby zapalne3,4.
β2 integryny były już wcześniej celem chorób zapalnych. Efalizumab, przeciwciało monoklonalne skierowane bezpośrednio przeciwko integrynie αLβ2, zostało opracowane w leczeniu łuszczycy5. Jednak efalizumab został wycofany ze względu na jego śmiertelny skutek uboczny - postępującą wieloogniskową leukoencefalopatię wynikającą z reaktywacji wirusa JC6,7. Nowe terapie przeciwzapalne oparte na integrynach powinny uwzględniać utrzymanie funkcji przeciwinfekcyjnych leukocytów w celu zminimalizowania skutków ubocznych. Skutki uboczne efalizumabu mogą wynikać z przedłużonego krążenia przeciwciał monoklonalnych w krwiobiegu, które mogą hamować funkcje immunologiczne w dłuższej perspektywie8. Niedawne badanie pokazuje, że efalizumab pośredniczy w sieciowaniu αLβ2 i niepożądanej internalizacji integryn α4, zapewniając alternatywne wyjaśnienie skutków ubocznych9. Tak więc krótkowieczni, małocząsteczkowi antagoniści mogą uniknąć tego problemu.
Przedstawiono tutaj wysokoprzepustową metodę badania małocząsteczkowych antagonistów integryny β2 przy użyciu ludzkich neutrofili. Aktywacja integryny β2 wymaga zmian konformacyjnych ektodomeny integryny, aby uzyskać dostęp do liganda i zwiększyć jego powinowactwo wiązania. W kanonicznym modelu switchblade, ektodomena wygiętej integryny najpierw rozciąga się do konformacji rozszerzonej-zamkniętej, a następnie otwiera swoją głowicę do w pełni aktywowanej konformacji rozszerzonej-otwartej10,11,12,13. Istnieje również alternatywna ścieżka, która zaczyna się od zagiętego zamkniętego do wygiętego-otwartego i rozszerzonego-otwartego, ostatecznie14,15,16,17,18,19. Przeciwciało specyficzne dla konformacji mAb24 wiąże się z epitopem w ludzkiej domenie podobnej do β2-I, gdy głowica ektodomeny jest otwarta20,21,22,23.
Tutaj mAb24-APC służy do określenia, czy integryny β2 są aktywowane. Aby aktywować neutrofile i integrynę, N-formylometylo-leucylo-fenyloalanina (fMLP), krótki peptyd chemotaktyczny pochodzenia bakteryjnego, który może aktywować integryny β2 neutrofili24, jest używany jako bodziec w tym protokole. Kiedy fMLP wiąże się z Fpr1 na neutrofilach, aktywowane są kaskady sygnałowe obejmujące białka G, fosfolipazę Cβ i γ kinazy fosfoinozytolu. Te zdarzenia sygnalizacyjne ostatecznie skutkują aktywacją integryny poprzez szlak sygnalizacyjny inside-out18,25. Oprócz małocząsteczkowych antagonistów, którzy bezpośrednio wiążą się z integrynami β2 i zapobiegają zmianom konformacyjnym aktywacji integryny26, za pomocą tej metody wykryte zostaną również związki, które mogą hamować składniki szlaku sygnalizacji aktywacji integryny β2 inside-out. Zautomatyzowane cytometry przepływowe umożliwiają wysokoprzepustowe badania przesiewowe. Identyfikacja nowych antagonistów może nie tylko pogłębić naszą wiedzę na temat fizjologii integryny, ale także zapewnić wgląd w translacyjny wgląd w terapię przeciwzapalną opartą na integrynie.

<table><tbody><tr><td>Pipety 16-kanałowe</td><td>Thermo</td><td>4661090N</td><td></td></tr><tr><td>Instrument 384-dołkowa płytka</td><td>Greiner</td><td>784201</td><td>Materiały</td></tr><tr><td>APC anty-ludzkie CD11a/CD18 (LFA-1) Klon przeciwciała: m24</td><td>BioLegend</td><td>363410</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Bravo&nbsp; Zautomatyzowana platforma do obsługi cieczy&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>384 wielokanałowa wirówka do obsługi cieczy</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td>Przepływ przyrządu</td></tr><tr><td>Jo</td><td>Becton, Dickinson & Firma</td><td>NA</td><td>Software</td></tr><tr><td>Roztwór albuminy ludzkiej surowicy (25%)</td><td>Odczynniki GeminiBio</td><td>800-120</td><td></td></tr><tr><td>Lifitegrast</td><td>Thermofisher</td><td>&nbsp; 50-208-2121</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Nexinhib20</td><td>Tocris</td><td>6089</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)</td><td>Sigma</td><td>F3506</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16% roztwór</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td>Odczynniki</td></tr><tr><td>Wiadra płytkowe</td><td>Eppendorf</td><td>UL155</td><td>Akcesorium</td></tr><tr><td>Wytrząsarka do płytek&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>88-861-023</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>PolymorphPrep</td><td>PROGEN</td><td>1895 (poprzedni 1114683)</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki Biblioteka chemiczna Prestwick Płytki złożone (10 mM)</td><td>Biblioteki chemiczne Prestwick</td><td>Ver19_384</td><td>1520 małych cząsteczek, 98% zatwierdzonych do obrotu leków (zatwierdzone przez FDA, EMA, JAN i inne agencje)</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, bez czerwieni fenolowej</td><td>Odczynniki Gibco</td><td>11-835-030</td><td></td></tr><tr><td>Wirnik czerpako-huśtawkowy&nbsp;</td><td>Analizator komórek Eppendorf</td><td>A-4-62</td><td>Rotor</td></tr><tr><td>ZE5</td><td>Instrument Bio-Rad Laboratories</td><td>Model ZE5</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny

A Flow Cytometry-Based High-Throughput Technique for Screening Integrin-Inhibitory Drugs

Ten protokół ma na celu ustanowienie metody identyfikacji małych molekularnych antagonistów aktywacji integryny β2, wykorzystując przeciwciała zgłaszające zmiany konformacyjne i wysokoprzepustową cytometrię przepływową. Metoda ta może również służyć jako przewodnik dla innych wysokoprzepustowych metod badań przesiewowych opartych na przeciwciałach. Integryny β2 to cząsteczki adhezyjne specyficzne dla leukocytów, które mają kluczowe znaczenie w odpowiedziach immunologicznych. Neutrofile polegają na aktywacji integryny, aby opuścić krwioobieg, nie tylko w celu zwalczania infekcji, ale także w celu wzięcia udziału w wielu chorobach zapalnych. Kontrolowanie aktywacji integryny β2 stanowi realne podejście do leczenia chorób zapalnych związanych z neutrofilami. W tym protokole przeciwciało monoklonalne, mAb24, które specyficznie wiąże się z głowicą o wysokim powinowactwie integryn β2, jest wykorzystywane do ilościowego oznaczania aktywacji integryny β2 na izolowanych pierwotnych ludzkich neutrofilach. N-formylometylo-leucylo-fenyloalanina (fMLP) jest stosowana jako bodziec do aktywacji integryn β2 neutrofili. W badaniu wykorzystano wysokoprzepustowy cytometr przepływowy, zdolny do automatycznego uruchamiania próbek z płytek 384-dołkowych. Wpływ 320 substancji chemicznych na hamowanie integryny β2 ocenia się w ciągu 3 godzin. Dzięki temu podejściu można zidentyfikować cząsteczki, które są bezpośrednio ukierunkowane na integryny β2 lub cząsteczki docelowe w inicjowanym przez receptor białkowym białku G szlaku sygnalizacji aktywacji integryny od wewnątrz na zewnątrz.

Dane z reprezentatywnego przesiewu na płytce 384-dołkowej (Rycina 4) wykazały, że kontrole negatywne miały MFI dla mAb24-APC wynoszące 3236 ± 110, podczas gdy kontrole pozytywne miały MFI dla mAb24-APC wynoszące 7588 ± 858. Współczynnik Z' dla tej płytki wynosi około 0,33, co mieści się w dopuszczalnym zakresie31. Niemniej jednak, Z' wymaga dalszej walidacji w testach wtórnych.
W celu normalizacji danych wszystkie wartości zostały przeskalowane tak, aby przypisać wartość maksymalną 1 do średniej dodatniej i wartość minimalną 0 do średniej ujemnej. Współczynnik Z' zostanie poddany bardziej rygorystycznej walidacji w testach wtórnych. Próg odcięcia dla tej płytki ustalono na poziomie 0,41, co oznacza, że próbki z relatywnym MFI niższym niż 0,41 zostaną uznane za trafienia hamujące indukowaną fMLP aktywację integryny β2 w ludzkich neutrofilach. Na tej płytce nie zidentyfikowano żadnych trafień.
Aby potwierdzić skuteczność protokołu, zastosowano Nexinhib20, który hamuje aktywację β2 integryny poprzez antagonizowanie funkcji Rac-1, oraz lifitegrast, który bezpośrednio antagonizuje integrynę αLβ232,33. Czas inkubacji dostosowano jednak do jednej godziny dla Nexinhib20 i pół godziny dla lifitegrastu. Uzyskane dane z tych eksperymentów znormalizowano przy użyciu tej samej metody skalowania opisanej powyżej. Następnie punkty danych te połączono z wynikami z płytek i przeanalizowano zbiorczo (Rysunek 4).
<img alt="Schemat płytki 96-dołkowej, wyniki testu, kontrole pozytywne/negatywne, analiza rozkładu związków." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64401/64401fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Układ płytki do przesiewania związków. Schemat ilustrujący rozmieszczenie badanych związków i kontroli w płytce 384-dołkowej. Dołki kontroli negatywnej zaznaczono na niebiesko (kolumny 1 i 23), a dołki kontroli pozytywnej na czerwono (kolumny 2 i 24). Dołki testowe przedstawiono w kolorze beżowym (kolumny od 3 do 22). Strzałki wskazują kolejność odczytu płytki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64401/64401fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces frakcjonowania krwi; przygotowanie probówki do izolacji PBMC metodą gradientu gęstości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64401/64401fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Separacja neutrofili z wykorzystaniem medium gradientu gęstości. Reprezentatywne zdjęcia demonstrujące prawidłową i nieprawidłową separację neutrofili z wykorzystaniem medium gradientu gęstości. (A) Początkowo 4 mL krwi nakłada się warstwowo na 8 mL medium gradientu gęstości. (B) Po wirowaniu powinny być widoczne dwa mętne pasma: górne pasmo zawierające głównie mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs) oraz dolne pasmo zawierające głównie neutrofile wraz z pewną ilością erytrocytów (RBCs). Większość erytrocytów osadza się na dnie. (C) Nieprawidłowa separacja, w której erytrocyty nie zostały osadzone, a pasmo neutrofili nie jest widoczne. Do wydzielenia pasma neutrofili wymagane byłoby dodatkowe wirowanie (10-30 min). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64401/64401fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej, analiza populacji komórek, neutrofile, procent pojedynczych komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64401/64401fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Gating neutrofili z wykorzystaniem wykresów FSC/SSC. Reprezentatywne wykresy rozproszenia światła w przód (FSC) oraz rozproszenia bocznego (SSC) ilustrujące strategię gatingu w celu identyfikacji neutrofili. (A) Neutrofile są wyznaczane (gating) na podstawie pola rozproszenia w przód (FSC-A) i rozproszenia bocznego (SSC-A) zarejestrowanego przez cytometr przepływowy. (B) Pojedyncze komórki są następnie wyznaczane na podstawie szerokości (FSC-W) i wysokości (FSC-H) rozproszenia w przód, a (C) szerokości (SSC-W) i wysokości (SSC-H) rozproszenia bocznego. Skala kolorystyczna reprezentuje gęstość komórek, przechodząc z koloru czerwonego przez żółty i zielony do niebieskiego wraz ze spadkiem gęstości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64401/64401fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres punktowy porównujący znormalizowane MFI dla mAb24 w zależności od związków; legenda wskazuje kontrole pozytywne/negatywne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64401/64401fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wyniki przesiewania na reprezentatywnej płytce 384-dołkowej. Wyniki przesiewania z reprezentatywnej płytki 384-dołkowej, wykazujące współczynnik Z' wynoszący 0,3. Kontrole negatywne i pozytywne są oznaczone odpowiednio niebieskimi i czerwonymi kropkami. Próbki testowe traktowane różnymi związkami są przedstawione jako beżowe kropki. Linia przerywana reprezentuje wartość odcięcia średniej intensywności fluorescencji (MFI) służącą do identyfikacji hitów. Żaden z testowanych związków nie został zidentyfikowany jako antagonista integryny β2, ponieważ wszystkie przetestowane związki wykazały wartości MFI powyżej linii odcięcia. Wyniki z niezależnych eksperymentów testujących znane antagonisty integryny β2 przy różnych czasach inkubacji (Nexinhib20 przez 1 h, lifitegrast przez pół godziny) zostały połączone w celu prezentacji na tym rysunku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64401/64401fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Ten protokół opisuje opartą na cytometrii przepływowej, wysokoprzepustową metodę przesiewową w celu identyfikacji małocząsteczkowych leków, które hamują aktywację integryny β2 na ludzkich neutrofilach.

Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny

This protocol aims to establish a method for identifying small molecular antagonists of &#946;2 integrin activation, utilizing ...

Nasze badania koncentrują się na integrynie neutrofilowej. W tym badaniu mamy na celu ustalenie metody znalezienia małocząsteczkowych antagonistów aktywacji integryny beta dw. Wierzymy, że dzięki tej metodzie możemy znaleźć nowych antagonistów, którzy mogą pogłębić naszą wiedzę na temat fizjologii integryny, a także zapewnić wgląd translacyjny w terapię przeciwzapalną opartą na integrynie.W przyszłości skupimy się na odkrywaniu nowych leków przeciwzapalnych i analizowaniu mechanizmów ich działania. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie ułóż cztery mililitry heparynizowanej krwi ludzkiej na ośmiu mililitrach pożywki o gradiencie gęstości w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Odwirować krew o stężeniu 550 G przez 30 do 50 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Następnie użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby usunąć górną warstwę zawierającą osocze i komórki jednojądrzaste. Zebrać neutrofile z dolnego pasma mętnego i około trzech do czterech mililitrów poniżej klarownej cieczy do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 10 mililitrów PBS. Delikatnie odwróć probówkę dwa do trzech razy, aby wymieszać zawiesinę neutrofili.Odwirować zawiesinę neutrofili o stężeniu 400 G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie zdekantować supernatant z probówki i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS. Ponownie odwirować zawiesinę o stężeniu 300 G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Po usunięciu supernatantu należy użyć ssania próżniowego, aby usunąć resztki supernatantu na ściance probówki i wokół ujścia probówki. Zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki neutrofilowej. Połącz jeden mililitr 1,2 mikrograma na mililitr roztworu przeciwciała z 0,2 mililitra pożywki neutrofilowej w 1,5 mililitrowej probówce.Dodaj 25 mikrolitrów roztworu przeciwciała do studzienek kontroli ujemnej w płytce 384-dołkowej. W 15-mililitrowej probówce połącz dziewięć mililitrów roztworu przeciwciała, 21,6 mikrolitrów roztworu FMLP i 1,7784 mililitra pożywki neutrofilowej. Dodać 25 mikrolitrów tej mieszaniny do kontroli pozytywnej i studzienek testowych w płytce 384-dołkowej.Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś pięć mikrolitrów roztworu związku z płytki biblioteki związków na płytkę 384-dołkową. Odwirować zawiesinę o sile 500 G przez jedną minutę. Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny neutrofili do każdej studzienki za pomocą 16-kanałowej pipety.Inkubować płytkę na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min przez 10 minut. Następnie, aby utrwalić komórki, dodaj trzy mikrolitry 16% paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubuj na lodzie przez 10 minut. Po włączeniu cytometru przepływowego załadować 384-dołkową płytkę zawierającą zawiesinę neutrofili poddanych działaniu związku na uchwyt próbki.Otwórz oprogramowanie. Zainicjuj nowy eksperyment. Wybierz dobrze 384 i wybierz żądane fluorofory.Następnie kliknij ustawienia płyty, przeciągnij, aby zaznaczyć wszystkie dołki i kliknij próbkę. Włącz przełącznik wysokiej przepustowości, a następnie w panelu szybkości wybierz opcję wysoka. W polu woluminu wprowadź wartość 50.Wybrać próbki w kolumnach o numerach nieparzystych i aktywować przełącznik mieszania. Na koniec nazwij próbki w prawym panelu. Średnie wartości intensywności fluorescencji badanych związków znajdowały się powyżej linii odcięcia, co wskazuje, że żaden ze związków nie został zidentyfikowany jako antagoniści integryny beta dwa.

a-flow-cytometry-based-high-throughput-technique-for-screening

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje badanie przesiewowe związków immunomodulujących za pomocą testu fluorescencyjnego. Transgeniczne limfocyty T pochodzące od myszy z kasetami ekspresji białek zielonej fluorescencji są traktowane tymi związkami. Wzmocnione i zredukowane sygnały GFP umożliwiają identyfikację odpowiednio stymulującego i hamującego działania związków.

Test oparty na fluorescencji z wykorzystaniem zmodyfikowanych limfocytów do badań przesiewowych związków immunomodulujących

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Statyczny test adhezji to potężne narzędzie, które może być użyte do modelowania interakcji między limfocytami T a innymi typami komórek. Interakcje są generowane przez wstrzykiwanie znakowanych limfocytów T do studzienek pokrytych cząsteczkami adhezyjnymi, podczas gdy czytnik płytek służy do ilościowego określania liczby przylegających komórek po seryjnym płukaniu.

Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T

Dziedziczne zaburzenia rytmu serca są często spowodowane mutacjami, które zmieniają powierzchniowe dostarczanie jednego lub więcej kanałów jonowych. Tutaj dostosowujemy testy cytometrii przepływowej, aby zapewnić ilościowe określenie względnej całkowitej i powierzchniowej ekspresji białek w rekombinowanych kanałach jonowych ulegających ekspresji w komórkach tsA-201.

Wyznaczanie względnej powierzchni komórki i całkowitej ekspresji rekombinowanych kanałów jonowych za pomocą cytometrii przepływowej

Prezentujemy w obecnym badaniu nowatorski test oparty na fluorescencji, wykorzystujący limfocyty pochodzące od transgenicznej myszy. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS) małych cząsteczek obdarzonych zdolnością hamowania lub promowania aktywacji limfocytów.

Test limfocytów oparty na fluorescencji, odpowiedni do wysokoprzepustowych badań przesiewowych małych cząsteczek

Przedstawiono skuteczny protokół badań przesiewowych do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka (GSC). Test opiera się na reporterze różnicowania komórek macierzystych, w którym ekspresja wzmocnionego GFP (eGFP) jest napędzana przez ludzki promotor GFAP.

System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka

Opisano test wiązania komórkowego oparty na cytometrii przepływowej, który jest używany głównie jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które hamują wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 (CXCL12) z receptorem chemokiny CXC 4 (CXCR4).

Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Ten artykuł wykorzystuje test oparty na cytometrii przepływowej do badania bibliotek chemicznych inhibitorów w celu identyfikacji inhibitorów i ich celów, które wpływają na sygnalizację receptora limfocytów T. Opisane tutaj metody można również rozszerzyć o badania przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Identyfikacja mediatorów sygnalizacji receptora limfocytów T poprzez badania przesiewowe bibliotek inhibitorów chemicznych

Celem tego protokołu jest stworzenie modelu 3D in vitro do badania różnicowania fibroblastów związanych z rakiem (CAF) w środowisku podobnym do masy guza, które mogą być adresowane w różnych systemach analizy, takich jak immunofluorescencja, analiza transkrypcyjna i obrazowanie żywych komórek.

Model sferoidalny 3D jako bardziej fizjologiczny system do różnicowania i inwazji fibroblastów związanych z rakiem w badaniach in vitro

Koniecznym krokiem w rozwoju aptameru przeciwnowotworowego jest przetestowanie jego wiązania z celem. Demonstrujemy test oparty na cytometrii przepływowej w celu zbadania tego wiązania, podkreślając znaczenie włączenia aptameru kontroli ujemnej i komórek rakowych, które są dodatnie lub ujemne dla tego konkretnego białka.

Test wiązania białek powierzchniowych komórek oparty na cytometrii przepływowej do oceny selektywności i swoistości aptameru przeciwnowotworowego

Poznaj wysokoprzepustową metodę cytometrii przepływowej do identyfikacji inhibitorów integryny β2 na ludzkich neutrofilach. Technika ta umożliwia odkrywanie nowych antagonistów z potencjałem terapeutycznym w leczeniu zapalnych chorób.

Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny

Przeglądaj więcej filmów