Wysokoprzepustowa technika oparta na cytometrii przepływowej do badań przesiewowych leków hamujących integryny
2 lutego 2024
Ten protokół opisuje opartą na cytometrii przepływowej, wysokoprzepustową metodę przesiewową w celu identyfikacji małocząsteczkowych leków, które hamują aktywację integryny β2 na ludzkich neutrofilach.
Nasze badania koncentrują się na integrynie neutrofilowej. W tym badaniu mamy na celu ustalenie metody znalezienia małocząsteczkowych antagonistów aktywacji integryny beta dw. Wierzymy, że dzięki tej metodzie możemy znaleźć nowych antagonistów, którzy mogą pogłębić naszą wiedzę na temat fizjologii integryny, a także zapewnić wgląd translacyjny w terapię przeciwzapalną opartą na integrynie.
W przyszłości skupimy się na odkrywaniu nowych leków przeciwzapalnych i analizowaniu mechanizmów ich działania. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie ułóż cztery mililitry heparynizowanej krwi ludzkiej na ośmiu mililitrach pożywki o gradiencie gęstości w 15-mililitrowej probówce wirówkowej. Odwirować krew o stężeniu 550 G przez 30 do 50 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.
Następnie użyj pipety o pojemności jednego mililitra, aby usunąć górną warstwę zawierającą osocze i komórki jednojądrzaste. Zebrać neutrofile z dolnego pasma mętnego i około trzech do czterech mililitrów poniżej klarownej cieczy do 15-mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej 10 mililitrów PBS. Delikatnie odwróć probówkę dwa do trzech razy, aby wymieszać zawiesinę neutrofili.
Odwirować zawiesinę neutrofili o stężeniu 400 G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie ostrożnie zdekantować supernatant z probówki i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach PBS. Ponownie odwirować zawiesinę o stężeniu 300 G przez 10 minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza.
Po usunięciu supernatantu należy użyć ssania próżniowego, aby usunąć resztki supernatantu na ściance probówki i wokół ujścia probówki. Zawiesić osad w jednym mililitrze pożywki neutrofilowej. Połącz jeden mililitr 1,2 mikrograma na mililitr roztworu przeciwciała z 0,2 mililitra pożywki neutrofilowej w 1,5 mililitrowej probówce.
Dodaj 25 mikrolitrów roztworu przeciwciała do studzienek kontroli ujemnej w płytce 384-dołkowej. W 15-mililitrowej probówce połącz dziewięć mililitrów roztworu przeciwciała, 21,6 mikrolitrów roztworu FMLP i 1,7784 mililitra pożywki neutrofilowej. Dodać 25 mikrolitrów tej mieszaniny do kontroli pozytywnej i studzienek testowych w płytce 384-dołkowej.
Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś pięć mikrolitrów roztworu związku z płytki biblioteki związków na płytkę 384-dołkową. Odwirować zawiesinę o sile 500 G przez jedną minutę. Dodaj 20 mikrolitrów zawiesiny neutrofili do każdej studzienki za pomocą 16-kanałowej pipety.
Inkubować płytkę na wytrząsarce z prędkością 300 obr./min przez 10 minut. Następnie, aby utrwalić komórki, dodaj trzy mikrolitry 16% paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubuj na lodzie przez 10 minut. Po włączeniu cytometru przepływowego załadować 384-dołkową płytkę zawierającą zawiesinę neutrofili poddanych działaniu związku na uchwyt próbki.
Otwórz oprogramowanie. Zainicjuj nowy eksperyment. Wybierz dobrze 384 i wybierz żądane fluorofory.
Następnie kliknij ustawienia płyty, przeciągnij, aby zaznaczyć wszystkie dołki i kliknij próbkę. Włącz przełącznik wysokiej przepustowości, a następnie w panelu szybkości wybierz opcję wysoka. W polu woluminu wprowadź wartość 50.
Wybrać próbki w kolumnach o numerach nieparzystych i aktywować przełącznik mieszania. Na koniec nazwij próbki w prawym panelu. Średnie wartości intensywności fluorescencji badanych związków znajdowały się powyżej linii odcięcia, co wskazuje, że żaden ze związków nie został zidentyfikowany jako antagoniści integryny beta dwa.
Przegląd
To badanie opracowuje metodę wysokowydajnego przesiewania opartą na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji leków małocząsteczkowych, które hamują aktywację 尾2 integrinu na ludzkich neutrofilach. Metoda ta ma na celu odkrycie nowych antagonistów, które mogą zwiększyć zrozumienie fizjologii integrinu i dostarczyć informacji na temat terapii przeciwzapalnych opartych na integrinach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Immunologia
- Farmakologia
Tło
- Neutrofile odgrywają kluczowa rolę w odpowiedzi immunologicznej.
- 尾2 integrin jest niezbędny do aktywacji i funkcji neutrofili.
- Identyfikowanie antagonistów może prowadzić do nowych strategii terapeutycznych.
- Obecne metody przesiewania małocząsteczkowych związków są ograniczone.
Cel badania
- Opracowanie metody wysokowydajnego przesiewania antagonistów 尾2 integrinu.
- Zwiększenie zrozumienia fizjologii integrinu.
- Dostarczenie informacji na temat rozwoju leków przeciwzapalnych.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa do przesiewania wysokowydajnego.
- Izolacja ludzkich neutrofili z krwi z heparyną.
- Centryfugacja do oddzielania składników krwi.
- Ocena poziomów aktywacji 尾2 integrinu.
Główne wyniki
- Udana identyfikacja małocząsteczkowych inhibitorów.
- Wykazano skuteczność metody przesiewania.
- Dostarczono nowych informacji na temat mechanizmów aktywacji integrinu.
- Możliwość przyszłego rozwoju leków w terapiach przeciwzapalnych.
Wnioski
- Opracowany metoda jest skuteczna w przesiewaniu antagonistów 尾2 integrinu.
- Wyniki mogą prowadzić do postępu w leczeniu przeciwzapalnym.
- Wymagane są dalsze badania, aby zbadać mechanizmy działania.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-throughput flow cytometry screening of integrin-inhibitory compounds enables rapid identification of small molecules that modulate neutrophil activation, a key inflection point in inflammatory disease research. This approach supports predictive confidence in target validation and accelerates early-stage portfolio triage for anti-inflammatory drug discovery. Integrating conformational-change-reporting antibodies with automated cytometry platforms enhances translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of integrin activation mechanisms in primary human neutrophils.
- Supports functional target validation using conformational-specific antibody readouts.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing compounds acting on integrins versus upstream signaling.
- Improves predictive confidence for advancing anti-inflammatory candidates.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, quantitative outputs suitable for high-throughput compound evaluation.
- Prepares validated biological systems for scalable screening workflows.
- Enables reproducible assessment of compound libraries in 384-well plate format.
- Supports platform reuse for other antibody-based high-throughput screens.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant neutrophil biology implicated in inflammatory pathologies.
- Provides continuity from early discovery through preclinical mechanism-of-action studies.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative inhibition profiles.
- Supports translational biomarker development for integrin-targeted therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This high-throughput screening method bridges early discovery and lead identification, providing a robust workflow for evaluating integrin-targeted compounds in primary immune cells.
- Discovery Biology: Quantifies integrin activation state to clarify pathway engagement and biological relevance.
- Screening: Offers reproducible, scalable assay outputs for compound triage and hit validation.
- Analytics: Generates mean fluorescence intensity data for statistical comparison of compound effects.
- Translational Research: Connects in vitro inhibition data to disease-relevant neutrophil function.
- Enterprise Reuse: Provides a template for adapting antibody-based high-throughput screens to other targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target engagement and functional inhibition.
- Operational Value: Streamlines assay standardization, reproducibility, and high-throughput scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of anti-inflammatory drug candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry and antibody-based detection.
- Needs access to high-throughput cytometry platforms and automated liquid handling.
- Demands rigorous cross-team assay standardization for reproducibility.
- May require adaptation for different integrin subtypes or cell models.
- Dependent on availability of conformational-specific antibodies and validated controls.
