Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas
21 czerwca 2018
Identyfikacja wariantów genetycznych przyczyniających się do złożonych chorób ludzkich pozwala nam zidentyfikować nowe mechanizmy. W tym miejscu demonstrujemy podejście do genotypowania multipleksowego genów kandydujących lub analizy szlaków genowych, które maksymalizuje pokrycie przy niskich kosztach i jest podatne na badania kohortowe.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki klinicznej i genetyki, takie jak wykrywanie markerów genetycznych związanych z wynikami choroby, w tym wirusa brodawczaka ludzkiego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to opłacalna, ukierunkowana i oszczędzająca czas metoda diagnostyczna. Aby rozpocząć tę procedurę, rozpuść wszelkie uporządkowane liofilizowane startery w wodzie molekularnej.
Przeciągnij startery do przodu i do tyłu dla każdego testu multipleksowanego do podstawowej mieszanki starterów, tak aby zawierała każdą starter w stężeniu zerowym pięciu milimolów. Następnie przygotuj mieszankę wzorcową do PCR, jak opisano w protokole tekstowym. Dodaj cztery mikrolitry tej mieszanki do każdego dołka 384-dołkowej płytki PCR, wraz z jednym mikrolitrem genomowego DNA w stężeniu od pięciu do 10 nanogramów na mikrolitr.
Przykryj płytkę pokrywą płytki i odwiruj przez 200 razy G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie uruchom PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Załaduj jeden mikrolitr produktu PCR z trzema mikrolitrami buforu ładującego na 2% żelu agarozowym.
Uruchom pod napięciem 100 woltów przez 45 minut, aby upewnić się, że amplifikacja DNA zakończyła się sukcesem. Następnie należy przygotować główny miks SAP zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj dwa mikrolitry świeżo przygotowanej mieszanki głównej SAP do każdego dołka poprzednio uruchomionej płytki PCR.
Wirować krótko przy 1 000 razy G przez jedną minutę. A następnie włóż płytkę z powrotem do termocyklera. Uruchom termocykler w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 40 minut.
A następnie w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby dezaktywować enzym. Po obliczeniu współczynnika rozcieńczenia dla każdego startera, połącz określone objętości każdego z nich, aby utworzyć pulę starterów. W razie potrzeby dodaj wodę, aby rozcieńczyć ten basen.
Złóż główną mieszankę rozszerzenia dla testu wysokiej lub niskiej pleksji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj dwa mikrolitry mieszanki głównej przedłużającej do każdego dołka płytki, zwiększając całkowitą objętość w każdym dołku do dziewięciu mikrolitrów. Odwirować krótko przy 1 000 razy G przez jedną minutę, a następnie włożyć płytkę z powrotem do termocyklera.
Następnie dodaj 16 mikrolitrów wody dejonizowanej do każdej studzienki, zwiększając całkowitą objętość do 25 mikrolitrów na studzienkę. Nałóż sześć miligramów żywicy równomiernie na całą płytkę z wgłębieniami żywicy. Pozostaw żywicę do wyschnięcia na 20 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie nałóż żywicę na płytkę reakcyjną. Za pomocą mieszalnika do zawiesiny obracaj płytkę z małą prędkością przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwiruj płytkę przy 3 200 razy G przez pięć minut, aby uniknąć nakładania żywicy na chip widma masy.
Prześlij przykładowy układ płyty do interfejsu oprogramowania systemu. Za pomocą systemu dozującego nanieść mieszaninę analitu genotypowania z płytki na chip do genotypowania. Załaduj chip do systemu MALDI-TOF, aby wygenerować widma masowe z mieszaniny analitów i zinterpretować je za pomocą interfejsu oprogramowania platformy.
W tym badaniu genotypowanie multipleksowe odbywa się za pomocą spektrometrii mas. Reprezentatywne dane SNP są generowane i analizowane dla genu kandydującego IL13 w odkrywczej kohorcie klinicznej fenotypowanej pod kątem alergii pokarmowej. Jeden z wariantów, rs1295686, jest związany z alergią pokarmową o udowodnionym prowokacyjnym działaniu.
Jest to związek potwierdzony w kohorcie replikacyjnej przy użyciu podejścia genotypowania multipleksowego wykazanego w tym protokole. Metaanaliza wyników z dwóch kohort dostarcza mocnych dowodów na związek między IL13 a FA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie zanieczyścić żadnych próbek ani odczynników. Ważne jest również, aby przygotować dodatkową 10% mieszankę wzorcową dla każdego PCR, aby uwzględnić wszelkie błędy pipetowania.
Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak PCR w czasie rzeczywistym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy ekspresja genów koreluje ze zidentyfikowanymi markerami genetycznymi związanymi z chorobą. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się diagnostyką kliniczną i genetyką do badania powiązań chorobowych w kohortach pacjentów. Nie zapominaj, że podczas pracy z odczynnikami do genotypowania i systemem MALDI-TOF może być niebezpieczne, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę multipleksowego genotypowania służącą do analizy genów kandydackich powiązanych ze złożonymi chorobami ludzi. Metoda ta jest kosztowo efektywna i odpowiednia do badań kohortowych, co usprawnia wykrywanie markerów genetycznych związanych z przebiegiem chorób.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Diagnostyka kliniczna
- Wykrywanie patogenów
Wstęp
- Identyfikacja wariantów genetycznych pomaga w zrozumieniu mechanizmów chorobowych.
- Kosztowo efektywne metody są kluczowe dla badań na dużą skalę.
- Multiplexowe genotypowanie może zwiększyć efektywność diagnostyczną.
- Wirus brodawczaka ludzkiego jest przykładem celu detekcji markerów genetycznych.
Cel badania
- Opracowanie metody genotypowania multipleksowego do analizy genów kandydackich.
- Maksymalizacja zakresu pokrycia przy jednoczesnym minimalizowaniu kosztów.
- Ułatwienie prowadzenia badań genetycznych opartych na kohortach.
Zastosowane metody
- Rekonstytucja liofilizowanych starterów wodą klasy molekularnej.
- Przygotowanie roztworu zapasowego mieszaniny starterów o stężeniu 0.5 millimolar.
- Przygotowanie master mixu do PCR zgodnie z opisanym protokołem.
- Zastosowanie płyty PCR 384-dołkowej do analizy genomicznego DNA.
Główne wyniki
- Metoda wykazała skuteczność w wykrywaniu markerów genetycznych.
- Opłacalność została potwierdzona w zastosowaniu praktycznym.
- Zauważono efektywność czasową w procesie diagnostycznym.
- Skuteczne zastosowanie w wykrywaniu wirusa HPV.
Wnioski
- Metoda multipleksowego genotypowania jest cennym narzędziem w genetyce.
- Stanowi ona podstawę dla przyszłych badań nad złożonymi chorobami.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zakres jej zastosowań w diagnostyce klinicznej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Multiplexowe genotypowanie z wykorzystaniem spektrometrii mas umożliwia kosztowo efektywną, wysokoprzepustową analizę wariantów genetycznych w kohortach klinicznych, wspierając walidację celów w badaniach nad złożonymi chorobami. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną poprzez powiązanie locus kandydackich, takich jak IL13, z efektami fenotypowymi, np. alergią pokarmową, za pomocą statystycznie wiarygodnych badań asocjacyjnych. Umożliwia to wykorzystanie przesiewu genetycznego jako skalowalnego narzędzia odkrywczego do minimalizacji ryzyka hipotez terapeutycznych we wczesnych etapach procesów badawczo-rozwojowych (R&D).
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez badanie powiązań między wariantami genetycznymi a fenotypami chorób w kohortach o znaczeniu klinicznym.
- Wartość operacyjna: Umożliwia jednoczesną analizę do 40 SNP w jednym badaniu, co zwiększa wydajność walidacji celów na poziomie szlaków sygnałowych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka w przypadku IL13 jako celu terapeutycznego poprzez replikację i metaanalizę asocjacji genotyp-fenotyp.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Wykorzystanie nierównowagi sprzężeń w celu maksymalizacji pokrycia genomowego przy minimalnym wyborze SNP, co zwiększa efektywność projektowania testów.
- Wartość operacyjna: Odczyt metodą MALDI-TOF dostarcza ilościowych danych genotypowania o wysokiej rozdzielczości, odpowiednich dla zautomatyzowanych potoków analizy.
- Skalowalność: Format PCR w płytkach 384-dołkowych umożliwia wysoką przepustowość próbek w kampaniach przesiewowych opartych na kohortach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia genetyczne w kohortach ludzkich ze ścieżkami walidacji funkcjonalnej, wspierając dobór celów terapeutycznych zgodnych z biomarkerami.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Replikacja w niezależnych kohortach zwiększa pewność przejścia z etapu odkryć do inwestycji przedklinicznych.
- Wgląd w mechanizmy: Umożliwia prowadzenie badań uzupełniających (np. korelację ekspresji genów) w celu wyjaśnienia mechanizmów biologicznych leżących u podstaw powiązań genetycznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów odkrywczych, od przesiewania genetycznego po identyfikację związków wiodących, zapewniając genetycznie stratyfikowane kohorty do późniejszej walidacji celów terapeutycznych oraz przesiewania związków.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez genetycznych w fenotypowanych kohortach klinicznych w celu wyjaśnienia szlaków związanych z chorobą i priorytetyzacji celów.
- Screening: Generowanie zestandaryzowanych, reprodukowalnych danych genotypowych, umożliwiających wiarygodną stratyfikację próbek do analiz funkcjonalnych.
- Analityka: Dostarczanie wysokoniezawodnych wyników genotypowania z progami kontroli jakości, co wspiera statystyczne porównania między różnymi warunkami i kohortami.
- Badania translacyjne: Łączenie wyników genetycznych u ludzi z walidacją przedkliniczną poprzez identyfikację wariantów o silnej asocjacji fenotypowej.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Projekt testów multipleksowych jest adaptowalny dla różnych genów i chorób, co wspiera inwestycje na poziomie platformy w infrastrukturę genotypowania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczo
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez statystycznie potwierdzone powiązania genetyczne w populacjach istotnych klinicznie.
- Wartość operacyjna: Obniża koszt pojedynczej próbki dzięki multipleksowaniu i usprawnia przepływ pracy dzięki zintegrowanemu PCR, elongacji oraz detekcji MALDI-TOF.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go, dostarczając ludzkich dowodów genetycznych, które minimalizują ryzyko wyboru celu na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o replikację i wielkość efektu w badaniach kohortowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu testów genetycznych, optymalizacji PCR oraz interpretacji danych MALDI-TOF.
- Zależne od dostępu do systemów spektrometrii mas z możliwością multipleksowania oraz zwalidowanego oprogramowania do genotypowania.
- Konieczne jest zastosowanie zestandaryzowanych procedur przygotowania próbek i protokołów kontroli jakości (QC) w celu zapewnienia powtarzalności pomiędzy ośrodkami lub partiami.
- Adaptacja do nowych celów wymaga selekcji SNP w oparciu o nierównowagę sprzężeń (LD) oraz testowania kompatybilności starterów w reakcjach multipleksowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na jakość DNA w próbce oraz konieczność ostrożnego obchodzenia się z odczynnikami, aby uniknąć kontaminacji.
