Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki klinicznej i genetyki, takie jak wykrywanie markerów genetycznych związanych z wynikami choroby, w tym wirusa brodawczaka ludzkiego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to opłacalna, ukierunkowana i oszczędzająca czas metoda diagnostyczna. Aby rozpocząć tę procedurę, rozpuść wszelkie uporządkowane liofilizowane startery w wodzie molekularnej.

Przeciągnij startery do przodu i do tyłu dla każdego testu multipleksowanego do podstawowej mieszanki starterów, tak aby zawierała każdą starter w stężeniu zerowym pięciu milimolów. Następnie przygotuj mieszankę wzorcową do PCR, jak opisano w protokole tekstowym. Dodaj cztery mikrolitry tej mieszanki do każdego dołka 384-dołkowej płytki PCR, wraz z jednym mikrolitrem genomowego DNA w stężeniu od pięciu do 10 nanogramów na mikrolitr.

Przykryj płytkę pokrywą płytki i odwiruj przez 200 razy G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie uruchom PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Załaduj jeden mikrolitr produktu PCR z trzema mikrolitrami buforu ładującego na 2% żelu agarozowym.

Uruchom pod napięciem 100 woltów przez 45 minut, aby upewnić się, że amplifikacja DNA zakończyła się sukcesem. Następnie należy przygotować główny miks SAP zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj dwa mikrolitry świeżo przygotowanej mieszanki głównej SAP do każdego dołka poprzednio uruchomionej płytki PCR.

Wirować krótko przy 1 000 razy G przez jedną minutę. A następnie włóż płytkę z powrotem do termocyklera. Uruchom termocykler w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 40 minut.

A następnie w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby dezaktywować enzym. Po obliczeniu współczynnika rozcieńczenia dla każdego startera, połącz określone objętości każdego z nich, aby utworzyć pulę starterów. W razie potrzeby dodaj wodę, aby rozcieńczyć ten basen.

Złóż główną mieszankę rozszerzenia dla testu wysokiej lub niskiej pleksji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj dwa mikrolitry mieszanki głównej przedłużającej do każdego dołka płytki, zwiększając całkowitą objętość w każdym dołku do dziewięciu mikrolitrów. Odwirować krótko przy 1 000 razy G przez jedną minutę, a następnie włożyć płytkę z powrotem do termocyklera.

Następnie dodaj 16 mikrolitrów wody dejonizowanej do każdej studzienki, zwiększając całkowitą objętość do 25 mikrolitrów na studzienkę. Nałóż sześć miligramów żywicy równomiernie na całą płytkę z wgłębieniami żywicy. Pozostaw żywicę do wyschnięcia na 20 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie nałóż żywicę na płytkę reakcyjną. Za pomocą mieszalnika do zawiesiny obracaj płytkę z małą prędkością przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwiruj płytkę przy 3 200 razy G przez pięć minut, aby uniknąć nakładania żywicy na chip widma masy.

Prześlij przykładowy układ płyty do interfejsu oprogramowania systemu. Za pomocą systemu dozującego nanieść mieszaninę analitu genotypowania z płytki na chip do genotypowania. Załaduj chip do systemu MALDI-TOF, aby wygenerować widma masowe z mieszaniny analitów i zinterpretować je za pomocą interfejsu oprogramowania platformy.

W tym badaniu genotypowanie multipleksowe odbywa się za pomocą spektrometrii mas. Reprezentatywne dane SNP są generowane i analizowane dla genu kandydującego IL13 w odkrywczej kohorcie klinicznej fenotypowanej pod kątem alergii pokarmowej. Jeden z wariantów, rs1295686, jest związany z alergią pokarmową o udowodnionym prowokacyjnym działaniu.

Jest to związek potwierdzony w kohorcie replikacyjnej przy użyciu podejścia genotypowania multipleksowego wykazanego w tym protokole. Metaanaliza wyników z dwóch kohort dostarcza mocnych dowodów na związek między IL13 a FA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie zanieczyścić żadnych próbek ani odczynników. Ważne jest również, aby przygotować dodatkową 10% mieszankę wzorcową dla każdego PCR, aby uwzględnić wszelkie błędy pipetowania.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak PCR w czasie rzeczywistym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy ekspresja genów koreluje ze zidentyfikowanymi markerami genetycznymi związanymi z chorobą. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się diagnostyką kliniczną i genetyką do badania powiązań chorobowych w kohortach pacjentów. Nie zapominaj, że podczas pracy z odczynnikami do genotypowania i systemem MALDI-TOF może być niebezpieczne, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.