Name: Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Poznaj metodę multipleksowego genotypowania do analizy genów kandydujących w badaniach kohortowych. Technika ta jest opłacalna i czasowo efektywna, umożliwiając wykrywanie markerów genetycznych związanych z chorobami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

<ol><li>Aronson, S. J., Rehm, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+foundation+for+genomics+in+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Building the foundation for genomics in precision medicine.</a> Nature. 526 (7573), 336-342 (2015).</li>
<li>Ball, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+a+GWAS%3A+power%2C+sample+size%2C+and+data+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genome-Wide+Association+Studies+and+Genomic+Prediction%22%5BJournal%5D)">Designing a GWAS: power, sample size, and data structure.</a> Genome-Wide Association Studies and Genomic Prediction. , 37-98 (2013).</li>
<li>Kwon, J. M., Goate, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+candidate+gene+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+research+and+health%22%5BJournal%5D)">The candidate gene approach.</a> Alcohol research and health. 24 (3), 164-168 (2000).</li>
<li>Oeth, P., Mistro, G. D., Marnellos, G., Shi, T., van den Boom, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+genotyping+using+single+base+primer+extension+coupled+with+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry+%28MassARRAY%29%5BTitle%5D)+AND+%22Single+Nucleotide+Polymorphisms%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative genotyping using single base primer extension coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MassARRAY).</a> Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols. , 307-343 (2009).</li>
<li>Pusch, W., Kostrzewa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+screening+and+diagnostic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+pharmaceutical+design%22%5BJournal%5D)">Application of MALDI-TOF mass spectrometry in screening and diagnostic research.</a> Current pharmaceutical design. 11 (20), 2577-2591 (2005).</li>
<li>Su, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+T790M+mutation+predicts+shorter+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+response+duration+in+patients+with+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Pretreatment epidermal growth factor receptor (EGFR) T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer.</a> Journal of clinical oncology. 30 (4), 433-440 (2012).</li>
<li>Singhal, N., Kumar, M., Kanaujia, P. K., Virdi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MALDI-TOF+mass+spectrometry%3A+an+emerging+technology+for+microbial+identification+and+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">MALDI-TOF mass spectrometry: an emerging technology for microbial identification and diagnosis.</a> Frontiers in microbiology. 6, 791(2015).</li>
<li>Cricca, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+genotyping+of+high-risk+Human+Papillomavirus+by+MALDI-TOF+Mass+Spectrometry-based+method%5BTitle%5D)+AND+%22New+Microbiologica%22%5BJournal%5D)">High-throughput genotyping of high-risk Human Papillomavirus by MALDI-TOF Mass Spectrometry-based method.</a> New Microbiologica. 38 (2), 211-223 (2015).</li>
<li>Ashley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Variation+at+the+Th2+Immune+Gene+IL13+is+Associated+with+IgE-mediated+Paediatric+Food+Allergy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Allergy%22%5BJournal%5D)">Genetic Variation at the Th2 Immune Gene IL13 is Associated with IgE-mediated Paediatric Food Allergy.</a> Clinical & Experimental Allergy. 47 (8), 1032-1037 (2017).</li>
<li>Bousman, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+NRG1+and+DAOA+genetic+variation+on+transition+to+psychosis+in+individuals+at+ultra-high+risk+for+psychosis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+psychiatry%22%5BJournal%5D)">Effects of NRG1 and DAOA genetic variation on transition to psychosis in individuals at ultra-high risk for psychosis.</a> Translational psychiatry. 3 (4), e251(2013).</li>
<li>Moffatt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale%2C+consortium-based+genomewide+association+study+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.</a> New England Journal of Medicine. 363 (13), 1211-1221 (2010).</li>
<li>Granada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+association+study+of+plasma+total+IgE+concentrations+in+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">A genome-wide association study of plasma total IgE concentrations in the Framingham Heart Study.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 129 (3), 840-845 (2012).</li>
<li>Oeth, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/290120569_iPLEX_Assay_Increased_Plexing_Efficiency_and_Flexibility_for_MassARRAY_System_Through_Single_Base_Primer_Extension_with_Mass-Modified_Terminators">iPLEX assay: Increased plexing efficiency and flexibility for MassARRAY system through single base primer extension with mass-modified terminators.</a> Sequenom application note. 27, (2005).</li>
<li>Ellis, J. A., Ong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MassARRAY+System+for+Targeted+SNP+Genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Genotyping%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">The MassARRAY System for Targeted SNP Genotyping.</a> Genotyping: Methods and Protocols. , 77-94 (2017).</li>
<li>Johnson, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAP%3A+A+web-based+tool+for+identification+and+annotation+of+proxy+SNPs+using+HapMap%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SNAP: A web-based tool for identification and annotation of proxy SNPs using HapMap.</a> Bioinformatics. 24 (24), 2938-2939 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu demonstrujemy metodę genotypowania multipleksowanego z wykorzystaniem spektrometrii mas. Reprezentatywne wyniki uzyskano przy użyciu PCR w połączeniu ze spektrometrią mas MALDI-TOF4 z chemią testową wymienioną w tabeli materiałów13. Dzięki tej platformie w ciągu 40 godzin w laboratorium wygenerowaliśmy łącznie 11 295 genotypów u 1 255 osób dla 9 SNP.
Ilustrujemy przydatność tej techniki w odpowiadaniu na hipotezy ge...

W złożonych chorobach ludzkich, warianty genetyczne przyczyniają się do podatności na choroby, a ilościowe określenie tych wariantów może być przydatne do zrozumienia patogenezy, identyfikacji grup pacjentów wysokiego ryzyka i odpowiedzi na leczenie. Rzeczywiście, obietnica medycyny precyzyjnej zależy od wykorzystania informacji genomicznych do identyfikacji podgrup pacjentów1. Niestety, w złożonej przestrzeni biologii chorób, w której fenotypy chorób opierają się na znacznej heterogeniczności genetycznej, niskiej penetracji i zmiennej ekspresji, wymagania dotyczące wielkości kohorty dla podejść obejmujących cały genom w celu identyfikacji nowych kandydatów są często zbyt duże2. Alternatywnie, podejście oparte na genach docelowych zaczyna się od hipotezy a priori dotyczącej określonych genów/szlaków w etiologii choroby3. Narzędzia do analizy ścieżek są powszechnie stosowane do badania patofizjologii zidentyfikowanych loci docelowych, generując liczne potencjalne szlaki do zbadania. Demonstrujemy tutaj podejście do genotypowania multipleksowego, które pozwala na badanie dziesiątek do setek SNP za pomocą jednego testu, odpowiedniego dla badań kohortowych na ludziach4. Podejście to charakteryzuje się stosunkowo wysoką przepustowością, co pozwala na genotypowanie setek do tysięcy próbek DNA w celu przeprowadzenia nowatorskich badań odkrywczych i zbadania określonych szlaków. Przedstawione tutaj metody są przydatne do identyfikacji alleli ryzyka i ich powiązań z cechami klinicznymi w stosunkowo szybki i niedrogi sposób. Platforma ta okazała się bardzo korzystna do celów badań przesiewowych i diagnostycznych5,6, a ostatnio także do infekcji mikrobiologicznych7 i wirusa brodawczaka ludzkiego8.
Ten protokół zaczyna się od selekcji zestawu genów do badania, tj. regionów docelowych, zazwyczaj określanych przez przeszukiwanie literatury, lub hipotez a priori dotyczących udziału w procesie chorobowym; lub być może wybranych do replikacji jako wiodące asocjacje w badaniu odkrycia całego genomu (GWA). Z zestawu genów badacz wybierze doprecyzowaną listę SNP znaczników. Oznacza to, że nierównowaga sprzężeń (LD) lub korelacja między wariantami w regionie jest wykorzystywana do identyfikacji reprezentatywnego "znacznika SNP" dla grupy SNP o wysokim LD, znanego jako haplotyp. Wysoki LD regionu oznacza, że SNP są często dziedziczone razem, tak że genotypowanie jednego SNP jest wystarczające do przedstawienia zmienności we wszystkich SNP w haplotypie. Alternatywnie, w przypadku śledzenia ostatecznej listy SNP z wielu regionów, np. replikacji na potrzeby badania GWA, proces ten może być niepotrzebny. W przypadku genotypowania multipleksowego należy następnie zaprojektować test wokół tych celów w taki sposób, aby startery amplifikacyjne miały różną masę niż startery i produkty rozszerzające w celu uzyskania interpretowalnych widm masowych. Parametry te można łatwo zaimplementować za pomocą narzędzia do projektowania multipleksowanego testu genotypowania. Startery do przodu i do tyłu z tego projektu zostaną wykorzystane do celowania w markery zainteresowania i wzmacniania sekwencji zawierającej SNP. Startery rozszerzające przyłączają się bezpośrednio proksymalnie do SNP i dodawana jest pojedyncza, masowo modyfikowana baza "terminatorowa", która jest komplementarna do SNP. Baza terminatora zapobiega dalszemu rozszerzaniu DNA. Modyfikacja masy zasady umożliwia wykrywanie fragmentów różniących się pojedynczą zasadą za pomocą spektrometrii mas. Płytka zawierająca chemię genotypowania jest następnie nakładana na chip w celu pomiaru na platformie spektrometrii mas. Po zastosowaniu odpowiednich kontroli jakości w odniesieniu do wykrytych przez system wywołań nieprzetworzonego genotypowania, dane mogą zostać wyeksportowane i wykorzystane do analizy statystycznej w celu zbadania związku z fenotypami choroby.

<table><tbody><tr><td>Genomowe DNA&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>1 &mu; L w stężeniu 5-10 ng/&mu; L</td></tr><tr><td>Startery: wzmocnienie i wydłużenie do przodu i do tyłu</td><td>IDT</td> <td>-</td> <td>patrz sekcja 1.2.1 manuskryptu na temat projektowania starterów</td></tr><tr><td>Woda dejonizowana&nbsp;</td><td>Np. woda Milli-Q&nbsp;</td><td>-</td><td>dejonizowany 18,2 M&Omega;. cm rezystywność</td></tr><tr><td>Zestaw odczynników do genotypowania. Zestaw odczynników iPLEX Gold Chemistry&nbsp;</td><td>Agena Bioscience</td><td>#10148-2</td><td>zawiera wszystkie odczynniki do reakcji w 2.2.1, 2.3.1 i 2.4.2 , chipowe i żywiczne</td></tr><tr><td>płytki PCR (384-dołkowe)</td><td>Abgene</td><td>#ABGAB-1384</td><td>Do płytek systemu MassARRAY firmy Abgene są kompatybilne</td></tr><tr><td>Wirówka mikropipet</td><td></td><td></td><td>jedno i 8-kanałowa</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>kompatybilny z płytkami 384-dołkowymi</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td></td><td></td><td>kompatybilny z programami PCR zgodnie z opisem w 2.2.4, 2.3.2 i 2.4.3</td></tr><tr><td>Płytka z żywicy Dimple&nbsp;</td><td>Agena Bioscience</td><td></td><td>6mg, 384-dołkowy</td></tr><tr><td>rotator płytkowy&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassARRAY Analyzer 4 System</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td>Spektrometr masowy MALDI-TOF (matrycowo wspomagana desorpcja/jonizacja laserowa &ndash; czas przelotu).</td></tr><tr><td>RS1000 Nanodispenser</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Assay Design Suite</td><td>Agena Biosciences</td><td></td><td>Narzędzie służące do projektowania multipleksowych testów genotypowania</td></tr><tr><td>Hot Start Taq</td><td></td><td></td><td>DNA polimerazy enzymu&nbsp;</td></tr><tr><td>Żywica&nbsp;</td><td>Agena Biosciences Dostarczany</td><td></td><td>z zestawem iPLEX</td></tr></tbody></table>

testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Złożone choroby często opierają się na wielu powszechnych wariantach genetycznych, które przyczyniają się do podatności na choroby. W tym miejscu opisujemy opłacalne podejście do polimorfizmu pojedynczego nukleotydu znacznikowego (SNP) przy użyciu multipleksowanego testu genotypowania ze spektrometrią mas, w celu zbadania asocjacji szlaków genowych w kohortach klinicznych. Jako przykład badamy locus kandydata na alergię pokarmową Interleukinę13 (IL13). Ta metoda skutecznie maksymalizuje zasięg, wykorzystując nierównowagę wspólnych powiązań (LD) w regionie. Wybrane SNP LD są następnie projektowane w teście multipleksowanym, co umożliwia jednoczesną analizę do 40 różnych SNP, co zwiększa opłacalność. Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest stosowana do amplifikacji docelowych loci, a następnie do wydłużania pojedynczego nukleotydu, a amplikony są następnie mierzone za pomocą spektrometrii mas wspomaganej matrycą laserowej desorpcji/jonizacji czasu lotu (MALDI-TOF). Surowe dane wyjściowe są analizowane za pomocą oprogramowania do wywoływania genotypów, przy użyciu rygorystycznych definicji i punktów odcięcia kontroli jakości, a genotypy o wysokim prawdopodobieństwie są określane i wyprowadzane do analizy danych.

Stosując opisany powyżej protokół, przeprowadziliśmy genotypowanie SNP tagujących w obrębie genu odpowiedzi immunologicznej Th2 IL13 w kohorcie osób z alergią pokarmową oraz grupy kontrolnej9. Zastosowaliśmy analizę regresji logistycznej, skorygowaną o pochodzenie etniczne oraz inne potencjalne współzmienne, aby sprawdzić, czy warianty genetyczne w badanym regionie zwiększają ryzyko wystąpienia alergii pokarmowej. Tabela 10<sup class="xref...

Identyfikacja wariantów genetycznych przyczyniających się do złożonych chorób ludzkich pozwala nam zidentyfikować nowe mechanizmy. W tym miejscu demonstrujemy podejście do genotypowania multipleksowego genów kandydujących lub analizy szlaków genowych, które maksymalizuje pokrycie przy niskich kosztach i jest podatne na badania kohortowe.

Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie diagnostyki klinicznej i genetyki, takie jak wykrywanie markerów genetycznych związanych z wynikami choroby, w tym wirusa brodawczaka ludzkiego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to opłacalna, ukierunkowana i oszczędzająca czas metoda diagnostyczna. Aby rozpocząć tę procedurę, rozpuść wszelkie uporządkowane liofilizowane startery w wodzie molekularnej.Przeciągnij startery do przodu i do tyłu dla każdego testu multipleksowanego do podstawowej mieszanki starterów, tak aby zawierała każdą starter w stężeniu zerowym pięciu milimolów. Następnie przygotuj mieszankę wzorcową do PCR, jak opisano w protokole tekstowym. Dodaj cztery mikrolitry tej mieszanki do każdego dołka 384-dołkowej płytki PCR, wraz z jednym mikrolitrem genomowego DNA w stężeniu od pięciu do 10 nanogramów na mikrolitr.Przykryj płytkę pokrywą płytki i odwiruj przez 200 razy G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Następnie uruchom PCR zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Załaduj jeden mikrolitr produktu PCR z trzema mikrolitrami buforu ładującego na 2% żelu agarozowym.Uruchom pod napięciem 100 woltów przez 45 minut, aby upewnić się, że amplifikacja DNA zakończyła się sukcesem. Następnie należy przygotować główny miks SAP zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj dwa mikrolitry świeżo przygotowanej mieszanki głównej SAP do każdego dołka poprzednio uruchomionej płytki PCR.Wirować krótko przy 1 000 razy G przez jedną minutę. A następnie włóż płytkę z powrotem do termocyklera. Uruchom termocykler w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 40 minut.A następnie w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby dezaktywować enzym. Po obliczeniu współczynnika rozcieńczenia dla każdego startera, połącz określone objętości każdego z nich, aby utworzyć pulę starterów. W razie potrzeby dodaj wodę, aby rozcieńczyć ten basen.Złóż główną mieszankę rozszerzenia dla testu wysokiej lub niskiej pleksji, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodaj dwa mikrolitry mieszanki głównej przedłużającej do każdego dołka płytki, zwiększając całkowitą objętość w każdym dołku do dziewięciu mikrolitrów. Odwirować krótko przy 1 000 razy G przez jedną minutę, a następnie włożyć płytkę z powrotem do termocyklera.Następnie dodaj 16 mikrolitrów wody dejonizowanej do każdej studzienki, zwiększając całkowitą objętość do 25 mikrolitrów na studzienkę. Nałóż sześć miligramów żywicy równomiernie na całą płytkę z wgłębieniami żywicy. Pozostaw żywicę do wyschnięcia na 20 minut w temperaturze pokojowej.Następnie nałóż żywicę na płytkę reakcyjną. Za pomocą mieszalnika do zawiesiny obracaj płytkę z małą prędkością przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie odwiruj płytkę przy 3 200 razy G przez pięć minut, aby uniknąć nakładania żywicy na chip widma masy.Prześlij przykładowy układ płyty do interfejsu oprogramowania systemu. Za pomocą systemu dozującego nanieść mieszaninę analitu genotypowania z płytki na chip do genotypowania. Załaduj chip do systemu MALDI-TOF, aby wygenerować widma masowe z mieszaniny analitów i zinterpretować je za pomocą interfejsu oprogramowania platformy.W tym badaniu genotypowanie multipleksowe odbywa się za pomocą spektrometrii mas. Reprezentatywne dane SNP są generowane i analizowane dla genu kandydującego IL13 w odkrywczej kohorcie klinicznej fenotypowanej pod kątem alergii pokarmowej. Jeden z wariantów, rs1295686, jest związany z alergią pokarmową o udowodnionym prowokacyjnym działaniu.Jest to związek potwierdzony w kohorcie replikacyjnej przy użyciu podejścia genotypowania multipleksowego wykazanego w tym protokole. Metaanaliza wyników z dwóch kohort dostarcza mocnych dowodów na związek między IL13 a FA. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie zanieczyścić żadnych próbek ani odczynników. Ważne jest również, aby przygotować dodatkową 10% mieszankę wzorcową dla każdego PCR, aby uwzględnić wszelkie błędy pipetowania.Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak PCR w czasie rzeczywistym, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy ekspresja genów koreluje ze zidentyfikowanymi markerami genetycznymi związanymi z chorobą. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się diagnostyką kliniczną i genetyką do badania powiązań chorobowych w kohortach pacjentów. Nie zapominaj, że podczas pracy z odczynnikami do genotypowania i systemem MALDI-TOF może być niebezpieczne, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego.

candidate-gene-testing-clinical-cohort-studies-with-multiplexed

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Powiązania genetyczne często pozostają niewyjaśnione na poziomie funkcjonalnym. Niniejsza metoda ma na celu ocenę wpływu markerów genetycznych powiązanych z fenotypem na ekspresję genów poprzez analizę komórek heterozygotycznych w obrębie transkrybowanych SNP. Technologia ta umożliwia precyzyjny pomiar za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF w celu ilościowego oznaczenia produktów specyficznego dla alleli przedłużania starterów.

Analiza allelo-specyficznej ekspresji genów w celu zbadania funkcjonalnych podstaw powiązań genetycznych

Opisano protokół, który wykorzystuje testy Infinium firmy Illumina do przeprowadzania genotypowania na dużą skalę. Testy te mogą niezawodnie genotypować miliony SNP w setkach pojedynczych próbek DNA w ciągu trzech dni. Po wygenerowaniu genotypy te można wykorzystać do sprawdzenia powiązań z wieloma różnymi chorobami lub fenotypami.

Test Infinium do zastosowań genotypowania SNP na dużą skalę

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Opisany jest zintegrowany system do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji próbek onkologicznych. Ten wieloplatformowy system jest zoptymalizowany pod kątem biopsji guza o niskiej jakości i małej ilości, obsługuje niskie dane wejściowe DNA, zawiera dobrze scharakteryzowane wielowariantowe kontrole i zawiera nowatorski wariant wywołujący, który jest informowany o ilościowych przedanalitycznych środkach kontroli jakości.

Integracja procesów na mokrym i suchym stanowisku laboratoryjnym optymalizuje ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji biopsji nowotworów o niskiej jakości i małej ilości

Przedstawiamy strategiczny plan i protokół identyfikacji niekodujących wariantów genetycznych wpływających na wiązanie DNA czynnika transkrypcyjnego (TF). Przedstawiono szczegółowy protokół eksperymentalny dla testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu powinowactwa DNA (DAPA) analizy wiązania TF DNA zależnego od genotypu.

Badania przesiewowe w kierunku funkcjonalnych niekodujących wariantów genetycznych przy użyciu testu przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) i testu precypitacji powinowactwa DNA (DAPA)

Analiza sygnału do szumu na poziomie aminokwasów określa rozpowszechnienie zmienności genetycznej na danej pozycji aminokwasu, znormalizowanej do zmienności genetycznej tła danej populacji. Pozwala to na identyfikację wariantowych "gorących punktów" w sekwencji białka (sygnału), która wzrasta powyżej częstości występowania rzadkich wariantów występujących w populacji (szum).

Określanie prawdopodobieństwa patogenności wariantów za pomocą analizy zmienności genetycznej na poziomie aminokwasów

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Ten artykuł szczegółowo opisuje użycie zestawu do przygotowania biblioteki opartej na reakcji łańcuchowej polimerazy zakotwiczonej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji, do oceny fuzji genów onkogennych w klinicznych próbkach guzów litych. Opisano zarówno etapy mokrej ławki, jak i analizy danych.

Wykrywanie fuzji genów onkogennych za pomocą zakotwiczonej reakcji łańcuchowej polimerazy multipleksowej, a następnie sekwencjonowania nowej generacji

Protokół przedstawia ogólne procedury laboratoryjne wymagane w preimplantacyjnych testach genetycznych na aneuploidię na platformie sekwencjonowania nowej generacji opartej na półprzewodnikach. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe etapy amplifikacji całego genomu, selekcji fragmentów DNA, budowy biblioteki, przygotowania szablonów i przepływu roboczego sekwencjonowania z reprezentatywnymi wynikami.

Preimplantacyjne badania genetyczne w kierunku aneuploidii na półprzewodnikowej platformie sekwencjonowania nowej generacji

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Poznaj metodę multipleksowego genotypowania do analizy genów kandydujących w badaniach kohortowych. Technika ta jest opłacalna i czasowo efektywna, umożliwiając wykrywanie markerów genetycznych związanych z chorobami.

Testowanie genów kandydujących w klinicznych badaniach kohortowych z genotypowaniem multipleksowym i spektrometrią mas

Przeglądaj więcej filmów