Mikroskopia sił trakcyjnych do badania aktywacji limfocytów B

Metoda ta umożliwia pomiar przestrzennego rozkładu czasowego sił wywieranych przez limfocyty B w synapsie immunologicznej i skorelowanie ich z rekrutacją określonych białek. Mikroskopia sił trakcyjnych z użyciem żeli poliakrylamidowych jest łatwa do wdrożenia. Protokół ten może być wykorzystany do szybkiego skonfigurowania pomiaru możliwości mechanicznych wielu komórek B.

Ta metoda jest elastyczna i może być dostosowana do tworzenia wykresów innych ligandów, takich jak integryny, lub do badania innych rodzajów synaps immunologicznych, takich jak limfocyty T lub sfrustrowana fagocytoza. Ze względu na właściwości fizyczne i chemiczne żeli wymagane w tym eksperymencie, adaptacja klasycznych metod mikroskopii sił trakcyjnych do komórek B może być trudna. Zacznij od zasolenia żelowego wsparcia.

Aktywuj szkiełko nakrywkowe lub szalkę Petriego ze szklanym dnem lampą UV na dwie minuty, a następnie zasalizuj je 200 mikrolitrami APTMS przez pięć minut. To przygotuje podparcie dla kowalencyjnego wiązania żelu. Dokładnie umyj szkiełko nakrywkowe lub naczynie ze szklanym dnem ultra czystą wodą i wysusz je za pomocą aspiracji próżniowej.

Aby przygotować szkiełka nakrywkowe do spłaszczania żelu, włóż je do ceramicznego uchwytu na szkiełka nakrywkowe, umieść uchwyt w małej zlewce i wlej odczynnik silikonowy na szkiełka nakrywkowe, upewniając się, że są całkowicie pokryte. Przykryj zlewkę folią aluminiową i pozostaw w temperaturze pokojowej na trzy minuty. W międzyczasie napełnij dużą zlewkę ultra czystą wodą.

Po trzech minutach inkubacji w odczynniku silikonowym przenieść uchwyt szkiełka nakrywkowego wraz z szkiełkami nakrywkowymi do zlewki z wodą. Dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe ultra czystą wodą. Dobrze je wysusz i umieść na papierowych chusteczkach.

Aby uzyskać najlepsze wyniki, natychmiast przystąp do polimeryzacji żelu. Przygotuj wstępną mieszankę żelową o pojemności 500 Pascali zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie połącz 167 mikrolitrów mieszanki wstępnej z 1,67 mikrolitra kulek. Wirować i sonikować mieszaninę w soniku do kąpieli przez pięć minut.

Chroń mieszankę przed światłem folią aluminiową. Aby skapitalizować polimeryzację, dodaj 1,67 mikrolitra 10% nadsiarczanu amonu do mieszanki żelowej, a następnie rozpocznij polimeryzację, dodając 0,2 mikrolitra TEMED i mieszając żel za pomocą pipety. Aby odlać żel, odpipetuj dziewięć mikrolitrów żelu na każde zasolone szkiełko nakrywkowe lub naczynie ze szklanym dnem.

Natychmiast spłaszcz żel z silikonowanym szkiełkiem nakrywkowym, dociskając go kleszkami, aby upewnić się, że żel rozprowadzi się na całej powierzchni szkiełka nakrywkowego i że część z niego wycieknie. Odwróć szkiełko nakrywkowe lub naczynie ze szklanym dnem do dużej szalki Petriego i postukaj nim o ławkę, aby docisnąć kulki do powierzchni żelu. Umieść nawilżoną chusteczkę na naczyniu, aby stworzyć mokrą komorę.

Przykryj folią aluminiową i inkubuj przez godzinę. Po inkubacji należy ułatwić uwalnianie szkiełka nakrywkowego poprzez dodanie PBS do próbki. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą igły, lekko przechylając naczynie, ale upewniając się, że żel jest zanurzony w PBS.

Środek silikonowy, akrylamid, akryloamid zasadowy i TEMED mogą być toksyczne przez drogi oddechowe. Nosić standardowe środki ochrony osobistej i manipulować tymi produktami pod maską chemiczną. Odessać PBS z żeli i dodać 150 mikrolitrów Sulfo-SANPAH w temperaturze pokojowej.

Wystaw żel na działanie promieniowania UV przez dwie minuty, a następnie zmyj żel trzykrotnie PBS. Powtórzyć zabieg z Sulfo-SANPAH i popłuczynami PBS, następnie dodać 250 mikrolitrów lizozymu jaj kurzych lub HEL do żelu i inkubować przez noc w komorze wilgotnościowej o temperaturze czterech stopni Celsjusza pokrytej folią aluminiową. Po inkubacji należy usunąć antygen HEL i trzykrotnie przemyć żel PBS.

Na koniec przykryj żel 500 mikrolitrami pożywki do hodowli komórek B i pozostaw w temperaturze pokojowej. Do obrazowania należy używać mikroskopu konfokalnego z kontrolą termiczną i dwutlenkiem węgla. Odessać pożywkę z żelu, pozostawiając około 200 mikrolitrów.

Umieść żel na mikroskopie. Dwie główne warstwy koralików pojawią się na dole i na górze żelu. Ustaw ostrość na płaszczyźnie żelu i znajdź równy obszar do zobrazowania.

Ostrożnie wybierz obszar obrazowania i upewnij się, że pozostałeś ostry. Odpowiednia gęstość ściegu i równa powierzchnia są kluczem do uzyskania solidnych i wiarygodnych pomiarów siły. Dodaj 80 mikrolitrów pierwotnych limfocytów B od myszy MD4 do żelu, unikając dotykania żelu, aby utrzymać koncentrację.

Upewnij się, że ostrość jest nadal prawidłowa i że komórki są widoczne opadając w obszarze. Uruchom akwizycję, zanim komórki dotrą do żelu. Otwórz film jako stos obrazów w programie ImageJ, a następnie uruchom makro cropandsave.ijm.

Wybierz katalog wyjściowy i skonfiguruj ustawienia kanału atrybutów. Wybierz obszary zainteresowania za pomocą narzędzia prostokąta i dodaj je do listy ROI za pomocą T. Po zakończeniu kliknij przycisk OK. Gdy makro zaproponuje maskę komórki, kliknij przycisk OK, jeśli jest ona zadowalająca.

Jeśli to nie jest zadowalające, kliknij przycisk nie OK, a następnie ręcznie wybierz zamknięty obszar za pomocą dowolnego narzędzia do zaznaczania, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj. Otwórz program MATLAB i uruchom polecenie tfmv1.m. Wprowadź wymagane parametry.

W szczególności sprawdź właściwości obrazu, takie jak rozmiar piksela i interwał akwizycji oraz właściwości żelu, takie jak moduł Younga E i współczynnik Poissona. Po zakończeniu zlokalizuj dane wyjściowe oprogramowania w tym samym katalogu, co oryginalny plik. Poprawne obrazy koralików wyglądają jak równomierny i losowy rozkład jasnych plam podobny do gwiaździstego nieba.

Dane i analizy nie są wiarygodne, gdy liczba koralików jest zbyt mała lub obraz jest nieostry. Możliwe jest obserwowanie ruchu koralików na oko za pomocą układu odniesienia, który poprzedzał pierwszy kontakt komórki z podłożem. Przybliżone wyniki można uzyskać ze śledzenia pojedynczych cząstek.

Analiza zapewnia segmentację koralików na obrazie referencyjnym jako kontrolkę. Za pomocą oprogramowania możliwe jest również uzyskanie pola przemieszczeń i naprężeń, które jest wektorem lokalnego naprężenia w każdym pikselu i każdym punkcie czasowym. Iloczyn skalarny pól przemieszczenia i sił zintegrowanych na powierzchni komórki zapewnia całkowitą pracę wywieraną przez komórkę na podłoże.

Porównując dwa warunki biologiczne, można obliczyć krzywą średnią lub średnią wartość z ostatnich punktów czasowych, w których energia osiąga plateau. Gdy istotne są informacje przestrzenne o siłach, możliwe jest również porównanie pojedynczych punktów czasowych każdego warunku. Przykład ekstrakcji antygenu fluorescencyjnego w trybie poklatkowym pokazano tutaj.

Postępujące pojawianie się sygnałów fluorescencyjnych w synapsie wskazuje na oderwanie antygenu od żelu. Dane fluorescencyjne można wykorzystać do skonstruowania średniej krzywej ekstrakcji. Najdelikatniejszym krokiem w protokole jest polimeryzacja żelu pod szkiełkiem nakrywkowym.

Ten krok należy wykonać stosunkowo szybko i ostrożnie, upewniając się, że żel jest równomiernie wyciśnięty pod szkiełkiem nakrywkowym. Po tej procedurze można wykorzystać limfocyty B z ekspresją białka fluorescencyjnego do jednoczesnej oceny lokalizacji struktur wewnątrzkomórkowych i wzorca sił. Technikę tę można połączyć z zaburzeniami genetycznymi lub chemicznymi w celu oceny roli określonych białek w kurczliwości komórek i wychwytywaniu antygenu.