Name: Mikroskopia sił trakcyjnych do badania aktywacji limfocytów B (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj mikroskopię sił trakcyjnych do badania aktywacji limfocytów B przy użyciu żeli poliakrylamidowych. Ta metoda umożliwia pomiar sił mechanicznych komórek immunologicznych i korelację z rekrutacją białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują M. Bolger-Munro za krytyczną lekturę i dziękują Nikon Imaging Center@CNRS-InstitutCurie i PICT-IBiSA, Institut Curie, Paryż, członkowi krajowej infrastruktury badawczej France-BioImaging, za wsparcie w pozyskiwaniu obrazów oraz Curie Animal Facility. PP był wspierany przez CNRS. AK i JP były wspierane przez stypendium doktoranckie Kartezjusza w Paryżu oraz Ecole Doctorale FIRE – Programme Bettencourt. Projekt ten został sfinansowany z grantów dla PP (ANR-10-JCJC-1504-Immuphy) i AMLD (ANR-PoLyBex-12-BSV3-0014-001, ERC-Strapacemi-GA 243103).

1. Przygotowanie żelu
<ol>
	<li>Silanizacja podłoża żelowego
	<ol>
		<li>Aktywuj szkiełko podstawowe lub szalkę Petriego z przeszklonym dnem (które posłuży jako podłoże żelu) za pomocą lampy UV przez 2 min (odczekaj 30 s przed naświetlaniem lampą UV, aby uniknąć kontaktu z pozostałościami ozonu).</li>
		<li>Przeprowadź silanizację szkiełka/szalki z przeszklonym dnem, stosując 200 µL aminopropyltrimetoksysilanu (APTMS) przez 5 min. Przygotuje to podłoże do kowalencyjnego wiązania żelu.</li>
		<li>Dokładnie przemyj szkiełko/szalkę z przeszklonym dnem wodą ultra-czystą.</li>
		<li>Osusz szkiełko/szalkę z przeszklonym dnem za pomocą aspiracji próżniowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 18mm szkiełka podstawowego do spłaszczania żelu
	<ol>
		<li>Aby przygotować szkiełka, umieść je najpierw w ceramicznym uchwycie do szkiełek. Następnie włóż uchwyt do małego zlewki (50 mL) i wlej odczyn silikonizujący (przechowywany w 4 °C, wielorazowego użytku) na szkiełka, upewniając się, że są one całkowicie przykryte.</li>
		<li>Przykryj zlewkę folią aluminiową i inkubuj przez 3 min w temperaturze pokojowej. W czasie oczekiwania napełnij dużą zlewkę (500 mL) wodą ultra-czystą. Po 3 min inkubacji w odczynie silikonizującym przenieś uchwyt ze szkiełkami do zlewki z wodą.</li>
		<li>Dokładnie wypłucz szkiełka wodą ultra-czystą, dobrze je osusz i pozostaw na ręcznikach papierowych. Dla uzyskania najlepszych rezultatów niezwłocznie przejdź do następnej sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polimeryzacja żelu
	<ol>
		<li>Dla żeli o sztywności 0.5 kPa zmieszaj 75 µL 40% akryloamidu z 30 µL 2% bisakryloamidu (sieciowacza) oraz 895 µL soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS). Tę przedmieszankę można przechowywać do jednego miesiąca w 4 °C.</li>
		<li>Do 167 µL przedmieszanki żelu 0.5 kPa dodaj 1% (1.67 µL) kulek, wymieszaj w wstrząsarku typu vortex i sonikuj przez 5 min w kąpieli ultradźwiękowej (standardowa myjka ultradźwiękowa z mocą 50–100 W i częstotliwością 40 kHz). Przechowuj mieszaninę w ciemności, zabezpieczając ją folią aluminiową. 
		UWAGA: Przedmieszanka nie polimeryzuje do momentu dodania inicjatora (TEMED).</li>
		<li>Aby skatalizować polimeryzację, dodaj 1% (1.67 µL) 10% w/v nadsiarczanu amonu (APS).</li>
		<li>Aby zainicjować polimeryzację, dodaj 0.1% (0.2 µL) N,N,N′,N′-tetrametyloetylenodiaminy (TEMED). Wymieszaj pipetą. Po dodaniu APS i TEMED żel polimeryzuje szybko, dlatego należy niezwłocznie przystąpić do odlewania żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odlewanie żelu
	<ol>
		<li>Nanieś pipetą 9 µL mieszaniny żelowej na każde szkiełko/szalkę z przeszklonym dnem (kropla na środku, Rysunek 1A)</li>
		<li>Nałóż silanizowane/hydrofobowe szkiełko i spłaszcz żel (Rysunek 1B). Używając pęsety, dociśnij szkiełko, aby zapewnić rozprzestrzenienie się żelu na całej powierzchni szkiełka (Rysunek 1C), aż zacznie wypływać poza krawędź.</li>
		<li>Odwróć szkiełko/szalkę z przeszklonym dnem do dużej szalki Petriego i opukaj o blat, aby wymusić przemieszczanie się kulek w stronę powierzchni żelu (Rysunek 1D).</li>
		<li>Przykryj folią aluminiową i pozostaw na 1 h do polimeryzacji w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnej (np. kładąc mokrą chusteczkę nad szalką, aby zapobiec odparowaniu).</li>
		<li>Po 1 h dodaj PBS do próbki, aby ułatwić oddzielenie szkiełka. Ostrożnie usuń szkiełko za pomocą igły (powłoka z różnych silanów powinna umożliwić łatwe oddzielenie szkiełka od żelu, Rysunek 1E).</li>
		<li>Pozostaw żel w PBS. 
		UWAGA: Żele mogą być teraz przechowywane w PBS w 4 °C przez 5–7 dni, jednak zaleca się ich użycie w ciągu 48 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Funkcjonalizacja żelu
<ol>
	<li>Przygotować roztwór sulfosuccynimidylo-6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino)heksanianu (Sulfo SANPAH) o stężeniu 0,5 mg/mL w buforze HEPES 10 mM. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C, osłonięty folią aluminiową, przez maksymalnie jeden tydzień.</li>
	<li>Odssać PBS z żeli.</li>
	<li>Dodać 150 µL Sulfo SANPAH do żelu w temperaturze pokojowej (Rysunek 1F).</li>
	<li>Poddać żel działaniu promieniowania UV przez 2 min, aby fotoaktywować miejsca wiązania Sulfo SANPAH i spowodować jego przyleganie do powierzchni żelu.</li>
	<li>Przemyć PBS trzykrotnie (Rysunek 1G).</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.2–2.5.</li>
	<li>Dodać 250 µL HEL (100 µg/mL) do każdego żelu i inkubować przez noc w komorze wilgotnościowej w temperaturze 4 °C, utrzymując osłonę z folii aluminiowej (Rysunek 1H).</li>
	<li>Usunąć antygen HEL i przemyć PBS trzykrotnie. 
	UWAGA: HEL pełni funkcję zarówno antygenu, jak i cząsteczki adhezyjnej. Można go zastąpić innymi cząsteczkami wiążącymi się z receptorem (np. przeciwciałem przeciwko mysiej IgM, albuminą surowicy bydlęcej, owalbuminą) lub zmieszać z ligandami integryn (np. ICAM1 wiążącym się z LFA1). W razie potrzeby ekstrakcję antygenu można obserwować za pomocą fluorescencyjnej wersji HEL (uzyskanej poprzez znakowanie cząsteczki zestawem do znakowania białek, patrz krok 4). Należy pamiętać, że dane stężenie w objętości może nie zapewnić takiego samego stężenia powierzchniowego na żelu, jak na szkle: w przypadku konieczności bezpośredniego porównania wymaga to ilościowego oznaczenia za pomocą barwienia wtórnego.</li>
</ol>
3. Obciążanie komórek i obrazowanie
<ol>
	<li>Przed obrazowaniem usunąć PBS z żeli i dodać 500 µL pożywki dla limfocytów B (RPMI 1640, 10% surowicy z płodu bydlęcego pozbawionej dopełniacza, 1% penicyliny-streptomycyny, 2% pirogronianu sodu, 50uM mercaptoetanolu i 1X niezbędnych aminokwasów) i pozostawić je do wyrównania temperatury do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przygotowanie komórek
	<ol>
		<li>Oczyszczone pierwotne limfocy B z śledziony zgodnie z protokołem selekcji negatywnej (patrz Tabela materiałów). Typowa końcowa wydajność limfocytów B wynosi około 1 x 107 komórki. Skoncentruj je do stężenia 3 x 106 komórek/ml w pożywce dla limfocytów B (RPMI-1640 uzupełnionej o 10% płodowej łydki serum, 1% penicyliny i streptomycyny, 0,1% merkaptoetanolu oraz 2% pirogronianu sodu).</li>
		<li>Przechowywać komórki w razie potrzeby przez maksymalnie 6 h w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C przez 30 min przed akwizycją obrazu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie
	<ol>
		<li>Użyj mikroskopu konfokalnego z systemem kontroli temperatury i (opcjonalnie) CO22 kontrola 
		UWAGA: Niezależnie od tego, czy używany jest mikroskop konfokalny, czy dyskowy (spinning-disk), ważne jest zastosowanie obiektywu/przysłony dziurkowej (pinhole), które pozwalają na uzyskanie rozmiaru piksela &lt;200 nm, aby swobodnie śledzić kuleczki w fazie analizy (np. 60x, NA 1,3). Można również zastosować mikroskopię epifluorescencyjną, jednak zapewnia ona niższy stosunek sygnału do szumu, co może utrudnić śledzenie poszczególnych kuleczek.</li>
		<li>Na dnie i na górze żelu pojawią się dwie główne warstwy kulek. Skup się na płaszczyźnie żelu. 
		UWAGA: Prawidłowo przygotowany żel będzie przypominał gwieździste niebo, z kuleczkami rozmieszczonymi mniej więcej równomiernie w jednej płaszczyźnie.</li>
		<li>Zaprogramuj akwizycję na 30 min z częstotliwością klatek wynoszącą 5 s (parametr ten można dostosować do potrzeb eksperymentu, np. poprzez akwizycję innych kolorów, wykonanie stosu z, itp.).</li>
		<li>Odssać medium z żelu, pozostawiając około 200 µL podłoża na żelu. Umieść żel na mikroskopie, odnajdź powierzchniową warstwę kulek oraz jednorodny obszar na żelu.</li>
		<li>Dodaj 80 µL komórek (należy unikać dotykania żelu, aby zachować ostrość obrazu).</li>
		<li>Upewnij się, że ostrość jest nadal odpowiednio ustawiona i że w obszarze widoczne są opadające komórki (w świetle przechodzącym). Uruchom akwizycję przed dotarciem komórek do żelu.</li>
		<li>W przypadku przypadkowego kontaktu z żelem, wystąpienia wibracji lub dryfu ostrości, należy skorygować ustawienie ostrości. 
		UWAGA: Kluczowe jest zarejestrowanie obrazu żelu w stanie rozluźnionym; może to być dowolny obraz wykonany przed dotarciem komórek na żel.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Eksperyment ekstrakcji fluorescencyjnego HEL
<ol>
	<li>Przygotuj fluorescencyjną HEL poprzez wiązanie barwnika fluorescencyjnego (o kolorze innym niż kolor kulek, np. Alexa 555), patrz na Tabela materiałów.</li>
	<li>W kroku 2.7 należy zastąpić konwencjonalne HEL fluorescencyjnym HEL.</li>
	<li>Należy pozyskiwać obrazy przy niskich ustawieniach oświetlenia lub niskiej częstotliwości klatek (np. 2 klatki na minutę), aby uniknąć fotobielenia.</li>
	<li>Aby określić ilość wyekstrahowanego białka HEL, należy obliczyć intensywność zintegrowaną po obszarze komórki dla każdej klatki obrazu. I(t) skorygowane i znormalizowane względem natężenia I(0) klatki 0 zgodnie z wzorem: 
	<img alt="Równanie znormalizowanej zmiany natężenia, wzór Q(t)=(I(t)-I(0))/I(0)." src="/files/ftp_upload/60947/60947eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	UWAGA: Antygen sprzężony z fluoroforem nie jest widoczny (prawdopodobnie z powodu gaszenia fluoroforu na powierzchni żelu), jednak jego obecność na żelu można zweryfikować za pomocą przeciwciał anty-HEL oraz fluorescencyjnego przeciwciała wtórnego. Można potwierdzić, że fluorofor zachowuje właściwości fluorescencyjne po oddzieleniu go od żelu poprzez usunięcie go za pomocą szkiełka podstawowego pokrytego przeciwciałami anty-HEL i ujawnienie go za pomocą wtórnego przeciwciała fluorescencyjnego (na szkiełku podstawowym).6Sygnał wyekstrahowanego antygenu jest bardzo słaby i bywa czasami maskowany przez wyciek kulek. W przypadku, gdy celem jest wyłącznie ekstrakcja antygenu, zaleca się przygotowanie żelu bez kulek (pominięcie kroków 1.3.2 i 1.4.3).</li>
</ol>
5. Obrazowanie fluorescencyjne
<ol>
	<li>Uzyskaj fluorescencyjne limfocyty B, oczyszczając komórki B ze śledzion ścieleń genetycznie zmodyfikowanych myszy w sposób analogiczny do typu dzikiego (np. z myszy Lifeact-GFP lub Myosin II GFP).</li>
	<li>Do obrazowania fluorescencyjnych komórek użyj (jeśli to możliwe) mikroskopu z dyskiem wirującym z obiektywem o dużym dystansie roboczym 40x–100x z imersją wodną.</li>
	<li>Utrzymuj krótki czas ekspozycji i niską częstotliwość klatek, aby uniknąć fotoblaknięcia. 
	UWAGA: Funkcja rozproszenia punktowego (PSF) w osi Z jest silnie pogarszana przez obecność żelu, dlatego sugerujemy użycie obiektywu z imersją wodną. Mikroskopia żywych komórek w układzie pionowym z obiektywami zanurzanymi w wodzie cierpi z powodu silnych aberracji sferycznych wywołanych przez obecność (sferycznej) komórki (i jądra komórkowego) na drodze emisji.</li>
</ol>
6. Analiza
UWAGA: Analiza danych jest zazwyczaj przeprowadzana poprzez wstępną korekcję całego stosu obrazów pod kątem dryfu, odnalezienie kulek w każdej klatce, śledzenie ich ruchów w odniesieniu do klatki referencyjnej (wykonanej w nieobecności komórek), interpolację pola przemieszczeń i odwrócenie problemu w celu wyznaczenia naprężeń przy użyciu transformaty Fouriera29. W tym celu sugerujemy zastosowanie kombinacji makra ImageJ oraz programów MATLAB, które można pobrać z repozytorium internetowego30.
<ol>
	<li>Otwórz film w programie ImageJ jako stos obrazów (stack of images)</li>
	<li>Uruchom makro „Crop_and_save.ijm”
	<ol>
		<li>Zaznacz obszary zainteresowania (ROI) za pomocą narzędzia „Rectangle” i dodaj je do listy ROI, używając klawisza „t”.</li>
		<li>Podczas wycinania komórki upewnij się, że uwzględniono obszar co najmniej 5–10 pikseli z nieruchomymi kuleczkami. Z analizy należy wykluczyć komórki znajdujące się zbyt blisko krawędzi lub innych komórek. Po zakończeniu kliknij „OK”.</li>
		<li>Makro proponuje maskę komórki: jeśli jest ona satysfakcjonująca, kliknij „OK”. Jeśli nie, kliknij „Not ok”, a następnie ręcznie zaznacz zamknięty obszar dowolnym narzędziem zaznaczania (np. „Freehand” lub „Oval”) i kliknij „Continue”.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz program MATLAB i uruchom skrypt „TFM_v1.m”.
	<ol>
		<li>Wprowadź wymagane parametry: w szczególności sprawdź właściwości obrazu (rozmiar piksela, odstęp czasu między akwizycjami) oraz właściwości żelu (moduł Younga E, współczynnik Poissona).</li>
		<li>Obraz odniesienia jest domyślnie ustawiony na pierwszy. W razie potrzeby ustaw inną klatkę lub wprowadź wartość „0”, aby wczytać plik zewnętrzny.</li>
		<li>Pliki wyjściowe programu zostaną zapisane w tym samym katalogu co plik oryginalny (opis znajduje się w pliku User_notice.pdf). Obejmują one wstępny ślad kuleczek („FILENAME.fig”), wykres energii skurczowej w czasie („FILENAME_energy.fig”), tabelę kilku wartości zintegrowanych dla komórki (energia, pole powierzchni, momenty itp.) „FILENAME_finaltable.mat”, strukturę zawierającą pole przemieszczeń i sił oraz filmy przedstawiające kuleczki, pole przemieszczeń, naprężenia i energię (które można otworzyć dowolnym odtwarzaczem plików avi). 
		UWAGA: W parametrach wejściowych „Window size” oznacza okno, w którym interpolowane jest przemieszczenie, co determinuje końcową rozdzielczość pola naprężeń i przemieszczeń. Jest ono ustawione na kilka (domyślnie cztery) pikseli. Nie zaleca się zmniejszania tej wartości, ponieważ sztucznie zwiększyłoby to rozdzielczość poprzez interpolację obszarów, w których nie ma kuleczek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yuseff, M. -I., Pierobon, P., Reversat, A., Lennon-Duménil, A. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+B+cells+capture%2C+process+and+present+antigens%3A+a+crucial+role+for+cell+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">How B cells capture, process and present antigens: a crucial role for cell polarity.</a> Nature Reviews. Immunology. 13 (7), 475-486 (2013).</li>
<li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+antigen+extraction+is+regulated+by+physical+properties+of+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).</li>
<li>Shaheen, S., Wan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+stiffness+governs+the+initiation+of+B+cell+activation+by+the+concerted+signaling+of+PKC%CE%B2+and+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Substrate stiffness governs the initiation of B cell activation by the concerted signaling of PKCβ and focal adhesion kinase.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Natkanski, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+use+mechanical+energy+to+discriminate+antigen+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities.</a> Science. 340 (6140), 1587-1590 (2013).</li>
<li>Wan, Z., Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activation+of+IgM-+or+isotype-switched+IgG-+and+IgE-BCR+exhibits+distinct+mechanical+force+sensitivity+and+threshold%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The activation of IgM- or isotype-switched IgG- and IgE-BCR exhibits distinct mechanical force sensitivity and threshold.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Kumari, A., Pineau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin-driven+force+patterning+controls+endocytosis+at+the+immune+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actomyosin-driven force patterning controls endocytosis at the immune synapse.</a> Nature Communications. 10 (1), 2870(2019).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).</li>
<li>Sabass, B., Gardel, M. L., Waterman, C. M., Schwarz, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+traction+force+microscopy+based+on+experimental+and+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">High resolution traction force microscopy based on experimental and computational advances.</a> Biophysical Journal. 94 (1), 207-220 (2008).</li>
<li>Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+on+soft+elastic+substrates%3A+A+guide+to+recent+computational+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (11), Pt B 3095-3104 (2015).</li>
<li>Colin-York, H., Shrestha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolved+Traction+Force+Microscopy+%28STFM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-Resolved Traction Force Microscopy (STFM).</a> Nano Letters. 16 (4), 2633-2638 (2016).</li>
<li>Stubb, A., Laine, R. F., Guzmán, C., Henriques, R., Jacquemet, G., Ivaska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuation-Based+Super-Resolution+Traction+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Fluctuation-Based Super-Resolution Traction Force Microscopy.</a> BioRxiv. , (2019).</li>
<li>Gutierrez, E., Tkachenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+refractive+index+silicone+gels+for+simultaneous+total+internal+reflection+fluorescence+and+traction+force+microscopy+of+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">High refractive index silicone gels for simultaneous total internal reflection fluorescence and traction force microscopy of adherent cells.</a> Plos One. 6 (9), 23807(2011).</li>
<li>Bergert, M., Lendenmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+reference+free+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Confocal reference free traction force microscopy.</a> Nature Communications. 7, 12814(2016).</li>
<li>Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+cellular+traction+forces+by+micropillar+arrays%3A+contribution+of+substrate+warping+to+pillar+deflection%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Probing cellular traction forces by micropillar arrays: contribution of substrate warping to pillar deflection.</a> Nano Letters. 10 (5), 1823-1830 (2010).</li>
<li>Colin-York, H., Fritzsche, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The future of traction force microscopy.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 1-5 (2018).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+drives+acuity+of+%CE%B1%CE%B2+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (39), 8204-8213 (2017).</li>
<li>Spillane, K. M., Tolar, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-Based+Probes+for+Measuring+Mechanical+Forces+in+Cell-Cell+Contacts%3A+Application+to+B+Cell+Antigen+Extraction+from+Immune+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA-Based Probes for Measuring Mechanical Forces in Cell-Cell Contacts: Application to B Cell Antigen Extraction from Immune Synapses.</a> Methods in Molecular Biology. 1707, 69-80 (2018).</li>
<li>Stabley, D. R., Jurchenko, C., Marshall, S. S., Salaita, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+mechanical+tension+across+membrane+receptors+with+a+fluorescent+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing mechanical tension across membrane receptors with a fluorescent sensor.</a> Nature Methods. 9 (1), 64-67 (2011).</li>
<li>Merkel, R., Nassoy, P., Leung, A., Ritchie, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscapes+of+receptor-ligand+bonds+explored+with+dynamic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Energy landscapes of receptor-ligand bonds explored with dynamic force spectroscopy.</a> Nature. 397 (6714), 50-53 (1999).</li>
<li>Hinterdorfer, P., Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+localization+of+single+molecular+recognition+events+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 3 (5), 347-355 (2006).</li>
<li>Sawicka, A., Babataheri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropipette+force+probe+to+quantify+single-cell+force+generation%3A+application+to+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Micropipette force probe to quantify single-cell force generation: application to T-cell activation.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3229-3239 (2017).</li>
<li>Desprat, N., Guiroy, A., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplates-based+rheometer+for+a+single+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Microplates-based rheometer for a single living cell.</a> Review of Scientific Instruments. 77 (5), 055111(2006).</li>
<li>Labernadie, A., Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protrusion+force+microscopy+reveals+oscillatory+force+generation+and+mechanosensing+activity+of+human+macrophage+podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protrusion force microscopy reveals oscillatory force generation and mechanosensing activity of human macrophage podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343(2014).</li>
<li>Bouissou, A., Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protrusion+force+microscopy%3A+A+method+to+quantify+forces+developed+by+cell+protrusions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Protrusion force microscopy: A method to quantify forces developed by cell protrusions.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), 57636(2018).</li>
<li>Kronenberg, N. M., Liehm, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+imaging+of+cellular+forces+with+high+precision+by+elastic+resonator+interference+stress+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term imaging of cellular forces with high precision by elastic resonator interference stress microscopy.</a> Nature Cell Biology. 19 (7), 864-872 (2017).</li>
<li>Basu, R., Whitlock, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+cells+use+mechanical+force+to+potentiate+target+cell+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing.</a> Cell. 165 (1), 100-110 (2016).</li>
<li>Bufi, N., Saitakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Primary+Immune+Cells+Exhibit+Distinct+Mechanical+Properties+that+Are+Modified+by+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Human Primary Immune Cells Exhibit Distinct Mechanical Properties that Are Modified by Inflammation.</a> Biophysical Journal. 108 (9), 2181-2190 (2015).</li>
<li>Goodnow, C. C., Crosbie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+immunoglobulin+expression+and+functional+silencing+of+self-reactive+B+lymphocytes+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice.</a> Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).</li>
<li>Butler, J. P., Tolić-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+fields%2C+moments%2C+and+strain+energy+that+cells+exert+on+their+surroundings%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).</li>
<li>MBPPlab/TFM_v1: Software for Time dependent Traction Force Microscopy. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/MBPPlab/TFM_v1">https://github.com/MBPPlab/TFM_v1</a> (2019).</li>
<li>Tseng, Q., Duchemin-Pelletier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+organization+of+the+extracellular+matrix+regulates+cell-cell+junction+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).</li>
<li>ImageJ plugins by Qingzong TSENG. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sites.google.com/site/qingzongtseng/">https://sites.google.com/site/qingzongtseng/</a> (2019).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Sabass, B., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+traction+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution traction force microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 123, 367-394 (2014).</li>
<li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Wang, J., Lin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+origin%2C+dynamics%2C+and+function+of+traction+force+in+B+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Profiling the origin, dynamics, and function of traction force in B cell activation.</a> Science Signaling. 11 (542), (2018).</li>
<li>Hui, K. L., Balagopalan, L., Samelson, L. E., Upadhyaya, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+forces+during+signaling+activation+in+Jurkat+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal forces during signaling activation in Jurkat T-cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (4), 685-695 (2015).</li>
<li>Bashour, K. T., Gondarenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2241-2246 (2014).</li>
<li>Gardel, M. L., Sabass, B., Ji, L., Danuser, G., Schwarz, U. S., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+stress+in+focal+adhesions+correlates+biphasically+with+actin+retrograde+flow+speed%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Traction stress in focal adhesions correlates biphasically with actin retrograde flow speed.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (6), 999-1005 (2008).</li>
<li>Stricker, J., Sabass, B., Schwarz, U. S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+traction+force+microscopy+for+micron-sized+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics.+Condensed+Matter%22%5BJournal%5D)">Optimization of traction force microscopy for micron-sized focal adhesions.</a> Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194104(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisana tu metoda TFM pozwala na systematyczne badanie aktywnych zdolności mechanicznych limfocytów B. W kontekście limfocytów B jest to związane ze zdolnością do ekstrakcji i internalizacji antygenu. W porównaniu z innymi metodami TFM, przedstawiony tutaj protokół jest prosty i raczej powtarzalny: sztywność, mierzona przez wgłębienie szklanej mikrosfery i przy użyciu modelu Hertza, wynosi od 400 do 600 Pa. Podobne protokoły zostały z powodzeniem zastosowane nie tylko dla limfocytów B35 , ale także dla limfocytów T36. W porównaniu z nanofilarami (stosowanymi również w limfocytach T37) zapewnia płaską, jednorodną powierzchnię, stąd wyniki są łatwiejsze do interpretacji, ponieważ oddziaływanie żelu jest głównie ograniczone do stycznej do powierzchni.
Opisany przez nas protokół daje dostęp do czasoprzestrzennej dynamiki sił wywieranych przez limfocyty B na substraty prezentujące antygen. Na poziomie przestrzennym dostarcza to informacji o lokalizacji sił, a w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną umożliwia eksperymentatorowi skorelowanie sił lokalnych z obecnością określonych cząsteczek (tj. składników cytoszkieletu lub kaskady sygnalizacyjnej BCR). Na poziomie czasowym możliwe jest zintegrowanie wielkości (takich jak energia całkowita lub naprężenie całkowite) w celu uzyskania jednej wartości na punkt czasowy i zmniejszenia szumu. Pozwala to na obserwację ewolucji siły trakcyjnej w czasie (wzrost i plateau) oraz obecność wzorców pulsacyjnych.
Krytyczne aspekty eksperymentalne dla analizy są opisane w następujący sposób. (i) Gęstość komórek: w celu przeprowadzenia prawidłowej analizy, komórki powinny być wystarczająco oddzielone. Uważamy, że komórka jest możliwa do analizy, jeśli ma wokół siebie pusty obszar o własnym rozmiarze. (ii) Obraz transmisyjny: zaleca się zebranie podczas eksperymentu co najmniej obrazu transmisyjnego komórek, który ma być wykorzystany jako maska w analizie. (iii) Liczba koralików na obrazie: sugerujemy analizowanie tylko obrazów, w których liczba koralików w synapsie wynosi od 30 do 200 (tj. 1–8 koralików/μm²). Mniejsze zagęszczenia nie pozwalają na odpowiednią rekonstrukcję przemieszczeń mapy. Duża gęstość ściegu sprawia, że śledzenie pojedynczych cząstek jest niewiarygodne. (iv) Liczba koralików powinna być stała podczas eksperymentu; Mogą jednak wystąpić wahania spowodowane niewielką zmiennością warunków obrazowania (zwłaszcza w przypadku kulek, które są zbyt blisko siebie). Przesunięcie ostrości, jeśli występuje, musi zostać skorygowane, a problematyczne klatki należy odrzucić. (v) Jakość żelu: żele ze zbyt dużą liczbą pęknięć, zmiennością w rozkładzie kulek lub żele, które są zbyt gęste, należy wyrzucić. (vi) W zależności od typu komórki, po wielokrotnej ekspozycji, komórki w późnych punktach czasowych (>300 klatek) mogą odczuwać efekty fototoksyczne. Wskazane jest uruchomienie programu na masce pozbawionej komórek jako "linii bazowej" do porównania z danymi. Określa to wielkość poziomu hałasu wynikającą wyłącznie z warunków doświadczalnych.
Żele stosowane do pomiaru siły uciągu w adhezji klasycznej pozwalają na badanie procesów zachodzących w adhezji ogniskowej (przepływy aktyny i rekrutacja cząsteczek sygnałowych) - punktach, w których przykładane są siły38,39. Jednak siły w synapsie nie są przykładane przez zrosty ogniskowe. Czasoprzestrzenny wzorzec generowania siły w synapsie immunologicznej limfocytów B nie był do niedawna badany ilościowo przy użyciu tej metody. Korzystając z TFM, po raz pierwszy zaobserwowaliśmy wzorzec siły w synapsie immunologicznej komórek B, jak przedstawiono w naszym ostatnim badaniu6, otwierając zachęcające perspektywy w badaniu limfocytów.
Warto zauważyć, że metoda ta wykorzystuje obraz wykonany przed przybyciem komórek do żelu jako obraz referencyjny do obliczenia siły. Zwykłe protokoły TFM sugerują wykonanie obrazu referencyjnego pod koniec eksperymentu, po odłączeniu komórek trypsyną; Dzięki temu eksperymentator może poszukać regionu bogatego w komórki. Chociaż jest to możliwe również w tym przypadku, trypsyna jest raczej mało skuteczna w odrywaniu limfocytów B od żelu pokrytego antygenem, trzeba długo czekać na oderwanie, a ryzyko modyfikacji i ruchów żelu (które uniemożliwiają wykorzystanie całego zestawu danych) jest większe.
Przedstawiona tutaj metoda jest elastyczna i może być stosowana do badania wpływu innych sygnałów na synapsę immunologiczną, ponieważ pozwala na przeszczepianie innych białek na powierzchnię żelu (np. badano ligandy integrynowe i immunoglobuliny), a nawet antygenu fluorescencyjnego (patrz punkt 4). Co więcej, komórki pozostają dostępne dla eksperymentatora w celu leczenia farmakologicznego i miejscowych perturbacji. Wreszcie, metoda jest również kompatybilna z obrazowaniem komórek stałych. Do tych obserwacji zaleca się wykonanie żelu na szkiełku nakrywkowym, wybarwienie komórek, przyklejenie szkiełka nakrywkowego do szkiełka podstawowego i dopiero wtedy dodanie podłoża montażowego i kolejnego szkiełka nakrywkowego. Obserwacja zostanie następnie przeprowadzona z żelem na wierzchu, aby uniknąć degradacji obrazu przez żel.
Możliwe pułapki to zmienność żelu w polimeryzacji i powlekaniu. Problemy z polimeryzacją wynikają głównie z jakości inicjatora/katalizatora. Ponadto żel może się napompować, zwłaszcza jeśli nie jest używany zaraz po montażu. Wydaje się, że ten problem nie wpływa dramatycznie na właściwości mechaniczne żelu, ale może sprawić, że warstwa perełek będzie nieosiągalna dla celu, skutecznie czyniąc żel bezużytecznym. Zalecamy przygotowanie dodatkowych żeli dla każdego schorzenia, gdy pojawi się ten problem. Może również występować pewna zmienność w powłoce i bardzo ważne jest, aby mieć świeżo rozcieńczony Sulfo SANPAH.
Podsumowując, opisaliśmy prostą, tanią i powtarzalną metodę pomiaru sił wywieranych przez limfocyty B w synapsie immunologicznej po aktywacji przez ligand BCR. Może być przystosowany do badania reakcji na inne ligandy i inne rodzaje limfocytów (limfocyty B pamięci, limfocyty T itp.) z wykorzystaniem odpowiedniego liganda receptorowego.

B Limfocyty są komórkami układu odpornościowego wytwarzającymi przeciwciała. Aby aktywować adaptacyjną odpowiedź immunologiczną, najpierw pozyskują antygen w formie natywnej (tj. nieprzetworzonej) przez specyficzny receptor zwany receptorem komórek B (BCR)1. Proces ten zachodzi w strefie komórek węzła chłonnego B. Nawet jeśli niektóre antygeny mogą dotrzeć do komórki B przez płyny limfatyczne, większość antygenów, zwłaszcza o dużej masie cząsteczkowej (>70 kDa, co jest rozmiarem granicznym dla przewodów limfatycznych) jest rzeczywiście prezentowana w swojej natywnej postaci na powierzchni komórki prezentującej antygen (APC), zwykle makrofaga zatokowego podtorebkowego lub pęcherzykowej komórki dendrytycznej, poprzez lektynę lub receptory Fc (niespecyficzne). Kontakt z tą komórką prowadzi do powstania synapsy immunologicznej, w której BCR wywiera siłę na antygeny związane z APC. Wiązanie antygenu z BCR inicjuje sygnalizację BCR, która może aktywować mechanizmy generujące siłę. Siły te mogą być ważne dla wzmocnienia sygnalizacji BCR, ale są również niezbędne dla komórek B do ekstrakcji, a następnie internalizacji antygenu.
Ostatnie badania wykazały, że BCR jest rzeczywiście mechanowrażliwy2. Na przykład sztywniejsze podłoża wywołują wzmocnioną sygnalizację BCR3. Co więcej, siła generowana w synapsie immunologicznej przyciąga pojedyncze BCR, aby zbadać jej powinowactwo do antygenu, a tym samym zapewnić dyskryminację powinowactwa4. W związku z tym interesujące jest zbadanie mechanicznej odpowiedzi limfocytów B na prezentację antygenu i przeanalizowanie tej odpowiedzi pod kątem typu zaangażowanych receptorów (IgG/IgM)5, cząsteczek adhezyjnych (ligandy integrynowe) lub w komórkach modyfikowanych farmakologicznie i genetycznie (tj. wyciszenie białka poniżej sygnalizacji BCR lub dynamiki cytoszkieletu)6.
Prostą metodą obserwacji reakcji komórki na substrat o sztywności fizjologicznej i jednocześnie badania sił wywieranych na podłoże jest Mikroskopia Sił Trakcyjnych (TFM). TFM polega na obserwacji pola przemieszczenia wytwarzanego przez komórkę ciągnącą po elastycznym podłożu. Pierwotnie deformacja żelu była obserwowana poprzez zmarszczki samego elastomeru za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym7, ale wprowadzenie mikrokulek fluorescencyjnych jako markerów odniesienia pozwoliło na lepszą rozdzielczość i od tego czasu stało się standardem8. Metoda ta została wykorzystana do zbadania siły trakcyjnej wywieranej przez przylegające komórki, tkanki, a nawet organoidy osadzone w żelach. Opracowano kilka wariantów TFM9, w tym połączenie z mikroskopią superrozdzielczą (tj. STED10 lub SRRF11), modyfikacja współczynnika załamania światła żelu, aby umożliwić mikroskopię TIRF12, zastępując koraliki nanodrukowanymi wzorami13 oraz używając nanofilarów zamiast płaskiej powierzchni14. Aby uzyskać pełny przegląd tych odmian, zobacz Colin-York et al.15.
Przedstawiony tutaj protokół opisuje procedurę pomiaru sił wywieranych przez limfocyty B na podłoże pokryte antygenem. Siły te są przykładane do ligandów (antygenu) w celu ich zgrupowania, a następnie wyekstrahowania z substratu prezentującego antygen. Dostosowaliśmy standardowy protokół TFM, aby naśladować sztywność fizjologicznych substratów prezentujących antygen, rozmiar i odpowiednią powłokę dla komórek B. Protokół ten pozwala na badanie kilku komórek jednocześnie i może być stosowany w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej i zabiegami chemicznymi. Nie ma jednak na celu sondowania pomiarów siły pojedynczej cząsteczki, dla których bardziej odpowiednimi technikami są pęsety optyczne16, sondy napięcia molekularnego17,18, sondy siły biomembranowej19 i mikroskopia sił atomowych20 są bardziej odpowiednimi technikami. W porównaniu z innymi metodami pomiaru siły pojedynczej komórki (np. mikropipetami21 lub microplates22) TFM pozwala na rekonstrukcję pełnej mapy sił wywieranych na synapsę z rozdzielczością ~300 nm. Jest to przydatne do identyfikacji wzorców czasoprzestrzennych w siłach wywieranych na powierzchnię, a ponieważ żel jest kompatybilny z obrazowaniem konfokalnym, do korelowania ich z rekrutacją określonych białek (na przykład cytoszkieletu i białek sygnałowych).
Chociaż 3D TFM jest możliwe, nie jest kompatybilne ze sztywnością i konfiguracją, której używaliśmy. Deformacje w 3D można osiągnąć za pomocą innych, bardziej złożonych konfiguracji, takich jak mikroskopia sił wypukłości (AFM skanuje odkształcalną membranę, na której komórki są platerowane)23,24 i mikroskopia naprężeń interferencyjnych rezonatora sprężystego (ERISM, żel działający jak wnęka rezonansowa dla światła i podkreślający deformacje podłoża z dokładnością do kilku nanometrów)25. Chociaż techniki te są bardzo obiecujące, nie zostały jeszcze zastosowane w komórkach B. Inne typy TFM, takie jak nanopillars14, mogą być używane do uzyskania bardziej powtarzalnych substratów. Jednak ta geometria nie jest dostosowana do komórek miękkich, ponieważ komórka przenika się z filarami, co komplikuje analizę. To podejście zostało rzeczywiście wykorzystane w komórkach T do obserwacji zdolności komórki do budowania struktur wokół filarów26.
Pomimo swojej prostoty, TFM wykorzystujący żele poliakrylamidowe pozwala na jednoczesną obserwację wielu komórek i może być łatwo i tanio wdrożone w każdym laboratorium wyposażonym w stół i mikroskop epifluorescencyjny (chociaż zalecamy dysk konfokalny/wirujący).
Aby naśladować fizjologiczną sztywność APC, użyliśmy żeli poliakrylamidowych o sztywności ~500 Pa27 i funkcjonalizowaliśmy żel antygenami aktywującymi. W tym protokole funkcjonalizowaliśmy powierzchnię żelu poliakrylowoamidowego lizozymem jaj kurzych (HEL). Pozwala to na pomiar sił generowanych przez stymulację BCR poprzez zaangażowanie miejsca wiązania antygenu. Zastosowanie tego antygenu i specyficznych dla hel limfocytów B myszy MD4 zapewnia stosunkowo równomierne generowanie siły w odpowiedzi na ligację antygenu28. Jednak inne cząsteczki (takie jak anty-IgM dla myszy B6) mogą być szczepione w żelu, ale siły generowane w tych przypadkach mogą być bardziej niejednorodne i mniej intensywne. Ponieważ komórki B są małymi komórkami (średnica ~6 μm), liczba kulek została zoptymalizowana tak, aby była maksymalna, ale nadal możliwa do śledzenia. W przypadku dużych komórek, które wywierają siły ~kPa na swoje podłoża, można osiągnąć zadowalające wyniki przy użyciu stosunkowo rzadkich kulek lub wykonując prostą prędkość obrazu cząstek (PIV) w celu zrekonstruowania pola deformacji. Jednak w przypadku małych komórek, takich jak limfocyty B, które wywierają naprężenia o natężeniu tak małym jak ~50 Pa, wymagane jest zastosowanie śledzenia pojedynczych cząstek (prędkość śledzenia cząstek, PTV), aby osiągnąć pożądaną dokładność podczas rekonstrukcji pola deformacji. Aby niezawodnie śledzić koraliki indywidualnie, powiększenie soczewki obiektywu musi wynosić co najmniej 60x, a jej apertura numeryczna około 1,3. W związku z tym żele muszą być stosunkowo cienkie (<50 μm), w przeciwnym razie kulki nie są widoczne, ponieważ znajdują się powyżej odległości roboczej obiektywu.
Główny protokół składa się z trzech sekcji: przygotowania żelu, funkcjonalizacji żelu i obrazowania; dwie kolejne sekcje są opcjonalne i są poświęcone ekstrakcji antygenu, kwantyfikacji i obrazowaniu komórek fluorescencyjnych.

<table><tbody><tr><td>3-aminopropylotrimetoksysilan (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>Przechowywać w podzielonym na porcje, chronić przed wilgocią</td></tr><tr><td>40% roztwór akryloamidu Zestaw</td><td></td><td></td> do znakowania białek w mikroskali Biorad 1610140 <td></td></tr><tr><td>Alexa555</td><td>Sondy molekularne</td><td>A30007</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek B, mysz</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-862</td><td></td></tr><tr><td>B-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>2% roztwór Bis Biorad</td><td></td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Euromedex</td><td>04-100-812-C</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe 18mm</td><td>VWR</td><td>631-1580</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Dekomplementowana (40min @56&deg; C)</td></tr> <tr><td>Fluorodzy FD35</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>FD35100</td><td></td></tr><tr><td>Fluosfera: modyfikowana karboksylanem, 0,2um, ciemnoczerwona</td><td>Sondy molekularne</td><td>F8807</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym jaj kurzych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Dostępny w podaniu 100 mg / ml</td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów endogennych MEM (100X)</td> <td>Thermofisher/Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametylotilendiammina(TEMED)</td><td>Euromedex</td><td>50406-B</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforu fosforowego)</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140-010</td><td></td></tr><tr><td>RMPI 1640 &ndash; Glutamax I</td><td>Thermofisher</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino)heksanian sulfosukcynimidylu (Sulfo-SANPAH)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia sił trakcyjnych do badania aktywacji limfocytów b

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

Mikroskopia siły trakcyjnej (TFM) umożliwia pomiar sił wytwarzanych przez komórkę na podłożu. Technika ta wyprowadza pomiary siły pociągowej na podstawie eksperymentalnie zaobserwowanego pola przemieszczenia wytwarzanego przez komórkę ciągnącą na elastycznym podłożu. Tutaj dostosowaliśmy TFM do zbadania przestrzennej i czasowej struktury pola siłowego wywieranego przez komórki B, gdy jest aktywowane przez zaangażowanie antygenu w receptor komórek B. Sztywność żelu, gęstość kulek i funkcjonalizacja białek muszą być zoptymalizowane pod kątem badania stosunkowo małych komórek (~ 6 μm), które oddziałują z ligandami receptorów na powierzchni komórki i reagują na nie specyficznie.

Biorąc pod uwagę rozmiar komórek, algorytmy wyodrębniające mapę przemieszczeń kulek za pomocą technik korelacyjnych (takich jak particle image velocimetry) są zazwyczaj mało precyzyjne. Jednak w zależności od wymaganej rozdzielczości można łatwo uzyskać wyniki jakościowe, korzystając z bezpłatnej wtyczki do programu Fiji/ImageJ31,32. Choć podejście to jest wystarczające do porównania warunków stymulujących i niestymulujących, w celu przeprowadzenia dokładnej analizy zalecamy korzystanie z naszego oprogramowania dostępnego do pobrania z repozytorium online30, które śledzi poszczególne kulki i dostarcza mapę pola przemieszczeń w danym punkcie czasowym jako interpolację przemieszczeń poszczególnych kulek33. Na tym etapie możliwe jest przeprowadzenie kilku rodzajów ilościowych analiz. Na przykład (przy założeniu, że przemieszczenie jest spowodowane wyłącznie naprężeniem stycznym do powierzchni żelu) oprogramowanie określa również naprężenie w każdym punkcie powodujące konkretną mapę przemieszczeń. Jest to rodzaj „problemu odwrotnego”: przemieszczenie w określonym punkcie zależy od sumy wszystkich sił przyłożonych we wszystkich pozostałych punktach. „Algorytm odwracania” uwzględnia parametry fizyczne podłoża: jego sztywność (moduł Younga) oraz współczynnik Poissona. Algorytmy bezpośrednie są zazwyczaj bardzo dokładne, ale kosztowne obliczeniowo. Algorytmy oparte na transformacie Fouriera, takie jak nasz, wykonują w istocie dekonwolucję w przestrzeni Fouriera i są bardziej wydajne, lecz podatne na pewne błędy (głównie ze względu na etap interpolacji). Algorytmy te zazwyczaj wymagają dostrojenia parametru, który zapobiega nadmiernemu wpływowi małych lokalnych (i potencjalnie artefaktowych) przemieszczeń na obliczenia pola naprężeń (parametr regularyzacji Tichonowa8,29; zmienna „Regularization” w oknie dialogowym; tutaj zazwyczaj ustawiamy wartość 5 x 10-19). W przypadku bardziej zaawansowanej interpretacji i analizy, takiej jak korelacje czasowo-przestrzenne, ruchy lokalne czy korelacje z kanałami fluorescencyjnymi, zalecamy współpracę z ekspertami w tej dziedzinie. Przegląd metod obliczeniowych znajduje się w pracy Schwarz et al.9.
Jak wspomniano powyżej, prawidłowe obrazy kulek przypominają „gwieździste niebo”, czyli jednorodny i losowy rozkład jasnych punktów (Rycina 2A). Dane i analiza nie są wiarygodne, gdy liczba kulek jest zbyt mała (Rycina 2B) lub gdy obraz jest poza zakresem ostrości (Rycina 2C). Po osiadaniu limfocytów B na powierzchni żelu, kulki znajdujące się pod komórkami zaczynają się przemieszczać pod wpływem siły trakcyjnej wywieranej przez komórkę na żel. Klatki, w których kulki nie poddają się śledzeniu, należy odrzucić.
W celu weryfikacji możliwe jest wizualne zaobserwowanie ruchu kulek poprzez porównanie z „klatką referencyjną”, zazwyczaj taką, która poprzedza pierwszy kontakt komórki z podłożem. Przybliżone wyniki można uzyskać za pomocą śledzenia pojedynczych cząstek (np. Trackmate, Fiji 34), jak pokazano na Rysunku 3A. Analiza ta dostarcza segmentacji kulek na obrazie referencyjnym („FILENAME.fig”) jako kontroli.
Za pomocą proponowanego przez nas oprogramowania można uzyskać przemieszczenie (Rysunek 3B) oraz pole naprężeń (wektor lokalnego naprężenia w każdym pikselu i w każdym punkcie czasowym, uzyskany poprzez inwersję pola przemieszczeń, Rysunek 3C). Iloczyn skalarny pól przemieszczeń i sił zintegrowany po powierzchni komórki pozwala wyznaczyć całkowitą pracę wykonaną przez komórkę przeciwko podłożu (Rysunek 4A). Obliczenie to wymaga zastosowania maski komórki wprowadzonej w kroku 6.2 protokołu.
Aby porównać dwa stany biologiczne (takie jak aktywujący HEL w porównaniu z nieaktywującym substratem BSA lub typ dziki w porównaniu z nokautem), użyteczne jest obliczenie krzywej średniej (Rycina 4B>) lub, w sposób jeszcze bardziej syntetyczny, wartości średniej z ostatnich punktów czasowych (20 min), w których energia osiąga plateau (Rycina 4C>). Gdy istotne są informacje przestrzenne dotyczące sił, możliwe jest porównanie pojedynczych punktów czasowych dla każdego stanu (Rycina 4D>). Szczegółową analizę przeprowadzono w pracy Kumari i wsp.6.
Przykład filmu poklatkowego z ekstrakcji antygenu fluorescencyjnego przedstawiono na Rysunku 5A: stopniowe pojawianie się sygnałów fluorescencji w synapsie wskazywało na odrywanie się antygenu od żelu. Średnią krzywą ekstrakcji wraz z przedziałem ufności (błędem standardowym średniej) dla 15 komórek przedstawiono na Rysunku 5B.
<img alt="Metoda powlekania hydrożelem; schemat warstwowania żelu i dodawania antygenu; etap aktywacji UV; konfiguracja laboratoryjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przedstawiający przygotowanie żelu i jego funkcjonalizację. Kroki zostały opisane w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Prawidłowe ogniskowanie kulek, niewystarczająca liczba kulek oraz błąd ogniskowania w obrazowaniu mikroskopowym; schemat porównawczy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Trzy przykłady obrazów kulek o różnej jakości. (A) Przykład obrazu kulek z prawidłowym stosunkiem sygnału do szumu i prawidłową gęstością. (B) Przykłady obrazów ze zbyt małą liczbą kulek i (C) obrazów poza płaszczyzną ogniskowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Metoda śledzenia kulek, diagramy pola przemieszczeń i naprężeń, badanie wizualizacji nanometrycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przetwarzanie obrazów w celu wyznaczenia pola sił. (A) Przykład obrazu kulek (obrys komórki zaznaczony na biało, wyodrębniony z obrazu transmisyjnego), śledzenie kulek w czasie t = 5 min (nałożone czerwone punkty) oraz przemieszczenie (strzałki) względem czasu t = 0 min (pasek skali 5 µm). (B) Interpolowane pole przemieszczeń (przedstawione jako wykres wektorowy i mapa wartości, strzałki są proporcjonalne do przemieszczenia [nm]; patrz pasek kolorów po prawej stronie); na dole: wygładzony obraz wartości (uzyskany poprzez interpolację funkcją bikubiczną). (C) Pole naprężeń wyznaczone z pola przemieszczeń z panelu B (przedstawione jako wykres wektorowy i mapa wartości; strzałki są proporcjonalne do naprężenia ścinającego [Pa]; patrz pasek kolorów po prawej stronie); na dole: wygładzony obraz wartości (uzyskany poprzez interpolację funkcją bikubiczną). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy energii odkształcenia, analiza naprężeń dla limfocytów B. Obrazy time-lapse efektów powlekania BSA i HEL." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Przykład informacji, jakie można wyodrębnić z pól sił i przemieszczeń. (A) Przykład ewolucji energii w czasie dla pojedynczej komórki: faza plateau (zaznaczona na szaro) pojawia się po około 10 min. (B) Porównanie średnich krzywych energii oraz (C) względnych poziomów plateau dla 65 komórek wysianych na żelu powlekanym HEL (aktywującym) i 35 komórek na żelu powlekanym BSA (nieaktywującym) (przedstawiono medianę ± rozstęp międzykwartylowy, do oceny istotności statystycznej zastosowano test Mann-Whitneya). (D) Kolorowe mapy naprężeń w czasie (time-lapse) dla warunku HEL oraz kontrolnego BSA; przedstawiono zarówno wykresy wartości, jak i wykresy wektorowe (quiver plots). Obrazy zostały zaadaptowane z pracy Kumari et al.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Ekstrakcja fluorescencyjnego HEL w czasie; wykres przedstawia przyrost względny; mikroskopia, analiza time-lapse." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Przykład eksperymentów z fluorescencyjnym antygenem. (A) Analiza time-lapse ekstrakcji fluorescencyjnego HEL (poniżej: procent maksimum, pasek skali = 3µm). (B) Gromadzenie antygenu w czasie (średnia ± SEM, n = 15). Obrazy te zostały zaadaptowane z pracy Kumari et al.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół używany do przeprowadzania eksperymentów z mikroskopią siły trakcyjnej na komórkach B. Opisujemy przygotowanie miękkich żeli poliakrylamidowych i ich funkcjonalizację, a także pozyskiwanie danych pod mikroskopem i podsumowanie analizy danych.

Mikroskopia sił trakcyjnych do badania aktywacji limfocytów B

Traction force microscopy (TFM) enables the measurement of forces produced by a cell on a substrate. This technique infers traction force measurements ...

Metoda ta umożliwia pomiar przestrzennego rozkładu czasowego sił wywieranych przez limfocyty B w synapsie immunologicznej i skorelowanie ich z rekrutacją określonych białek. Mikroskopia sił trakcyjnych z użyciem żeli poliakrylamidowych jest łatwa do wdrożenia. Protokół ten może być wykorzystany do szybkiego skonfigurowania pomiaru możliwości mechanicznych wielu komórek B.Ta metoda jest elastyczna i może być dostosowana do tworzenia wykresów innych ligandów, takich jak integryny, lub do badania innych rodzajów synaps immunologicznych, takich jak limfocyty T lub sfrustrowana fagocytoza. Ze względu na właściwości fizyczne i chemiczne żeli wymagane w tym eksperymencie, adaptacja klasycznych metod mikroskopii sił trakcyjnych do komórek B może być trudna. Zacznij od zasolenia żelowego wsparcia.Aktywuj szkiełko nakrywkowe lub szalkę Petriego ze szklanym dnem lampą UV na dwie minuty, a następnie zasalizuj je 200 mikrolitrami APTMS przez pięć minut. To przygotuje podparcie dla kowalencyjnego wiązania żelu. Dokładnie umyj szkiełko nakrywkowe lub naczynie ze szklanym dnem ultra czystą wodą i wysusz je za pomocą aspiracji próżniowej.Aby przygotować szkiełka nakrywkowe do spłaszczania żelu, włóż je do ceramicznego uchwytu na szkiełka nakrywkowe, umieść uchwyt w małej zlewce i wlej odczynnik silikonowy na szkiełka nakrywkowe, upewniając się, że są całkowicie pokryte. Przykryj zlewkę folią aluminiową i pozostaw w temperaturze pokojowej na trzy minuty. W międzyczasie napełnij dużą zlewkę ultra czystą wodą.Po trzech minutach inkubacji w odczynniku silikonowym przenieść uchwyt szkiełka nakrywkowego wraz z szkiełkami nakrywkowymi do zlewki z wodą. Dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe ultra czystą wodą. Dobrze je wysusz i umieść na papierowych chusteczkach.Aby uzyskać najlepsze wyniki, natychmiast przystąp do polimeryzacji żelu. Przygotuj wstępną mieszankę żelową o pojemności 500 Pascali zgodnie ze wskazówkami manuskryptu, a następnie połącz 167 mikrolitrów mieszanki wstępnej z 1,67 mikrolitra kulek. Wirować i sonikować mieszaninę w soniku do kąpieli przez pięć minut.Chroń mieszankę przed światłem folią aluminiową. Aby skapitalizować polimeryzację, dodaj 1,67 mikrolitra 10% nadsiarczanu amonu do mieszanki żelowej, a następnie rozpocznij polimeryzację, dodając 0,2 mikrolitra TEMED i mieszając żel za pomocą pipety. Aby odlać żel, odpipetuj dziewięć mikrolitrów żelu na każde zasolone szkiełko nakrywkowe lub naczynie ze szklanym dnem.Natychmiast spłaszcz żel z silikonowanym szkiełkiem nakrywkowym, dociskając go kleszkami, aby upewnić się, że żel rozprowadzi się na całej powierzchni szkiełka nakrywkowego i że część z niego wycieknie. Odwróć szkiełko nakrywkowe lub naczynie ze szklanym dnem do dużej szalki Petriego i postukaj nim o ławkę, aby docisnąć kulki do powierzchni żelu. Umieść nawilżoną chusteczkę na naczyniu, aby stworzyć mokrą komorę.Przykryj folią aluminiową i inkubuj przez godzinę. Po inkubacji należy ułatwić uwalnianie szkiełka nakrywkowego poprzez dodanie PBS do próbki. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą igły, lekko przechylając naczynie, ale upewniając się, że żel jest zanurzony w PBS.Środek silikonowy, akrylamid, akryloamid zasadowy i TEMED mogą być toksyczne przez drogi oddechowe. Nosić standardowe środki ochrony osobistej i manipulować tymi produktami pod maską chemiczną. Odessać PBS z żeli i dodać 150 mikrolitrów Sulfo-SANPAH w temperaturze pokojowej.Wystaw żel na działanie promieniowania UV przez dwie minuty, a następnie zmyj żel trzykrotnie PBS. Powtórzyć zabieg z Sulfo-SANPAH i popłuczynami PBS, następnie dodać 250 mikrolitrów lizozymu jaj kurzych lub HEL do żelu i inkubować przez noc w komorze wilgotnościowej o temperaturze czterech stopni Celsjusza pokrytej folią aluminiową. Po inkubacji należy usunąć antygen HEL i trzykrotnie przemyć żel PBS.Na koniec przykryj żel 500 mikrolitrami pożywki do hodowli komórek B i pozostaw w temperaturze pokojowej. Do obrazowania należy używać mikroskopu konfokalnego z kontrolą termiczną i dwutlenkiem węgla. Odessać pożywkę z żelu, pozostawiając około 200 mikrolitrów.Umieść żel na mikroskopie. Dwie główne warstwy koralików pojawią się na dole i na górze żelu. Ustaw ostrość na płaszczyźnie żelu i znajdź równy obszar do zobrazowania.Ostrożnie wybierz obszar obrazowania i upewnij się, że pozostałeś ostry. Odpowiednia gęstość ściegu i równa powierzchnia są kluczem do uzyskania solidnych i wiarygodnych pomiarów siły. Dodaj 80 mikrolitrów pierwotnych limfocytów B od myszy MD4 do żelu, unikając dotykania żelu, aby utrzymać koncentrację.Upewnij się, że ostrość jest nadal prawidłowa i że komórki są widoczne opadając w obszarze. Uruchom akwizycję, zanim komórki dotrą do żelu. Otwórz film jako stos obrazów w programie ImageJ, a następnie uruchom makro cropandsave.ijm.Wybierz katalog wyjściowy i skonfiguruj ustawienia kanału atrybutów. Wybierz obszary zainteresowania za pomocą narzędzia prostokąta i dodaj je do listy ROI za pomocą T. Po zakończeniu kliknij przycisk OK. Gdy makro zaproponuje maskę komórki, kliknij przycisk OK, jeśli jest ona zadowalająca.Jeśli to nie jest zadowalające, kliknij przycisk nie OK, a następnie ręcznie wybierz zamknięty obszar za pomocą dowolnego narzędzia do zaznaczania, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj. Otwórz program MATLAB i uruchom polecenie tfmv1.m. Wprowadź wymagane parametry.W szczególności sprawdź właściwości obrazu, takie jak rozmiar piksela i interwał akwizycji oraz właściwości żelu, takie jak moduł Younga E i współczynnik Poissona. Po zakończeniu zlokalizuj dane wyjściowe oprogramowania w tym samym katalogu, co oryginalny plik. Poprawne obrazy koralików wyglądają jak równomierny i losowy rozkład jasnych plam podobny do gwiaździstego nieba.Dane i analizy nie są wiarygodne, gdy liczba koralików jest zbyt mała lub obraz jest nieostry. Możliwe jest obserwowanie ruchu koralików na oko za pomocą układu odniesienia, który poprzedzał pierwszy kontakt komórki z podłożem. Przybliżone wyniki można uzyskać ze śledzenia pojedynczych cząstek.Analiza zapewnia segmentację koralików na obrazie referencyjnym jako kontrolkę. Za pomocą oprogramowania możliwe jest również uzyskanie pola przemieszczeń i naprężeń, które jest wektorem lokalnego naprężenia w każdym pikselu i każdym punkcie czasowym. Iloczyn skalarny pól przemieszczenia i sił zintegrowanych na powierzchni komórki zapewnia całkowitą pracę wywieraną przez komórkę na podłoże.Porównując dwa warunki biologiczne, można obliczyć krzywą średnią lub średnią wartość z ostatnich punktów czasowych, w których energia osiąga plateau. Gdy istotne są informacje przestrzenne o siłach, możliwe jest również porównanie pojedynczych punktów czasowych każdego warunku. Przykład ekstrakcji antygenu fluorescencyjnego w trybie poklatkowym pokazano tutaj.Postępujące pojawianie się sygnałów fluorescencyjnych w synapsie wskazuje na oderwanie antygenu od żelu. Dane fluorescencyjne można wykorzystać do skonstruowania średniej krzywej ekstrakcji. Najdelikatniejszym krokiem w protokole jest polimeryzacja żelu pod szkiełkiem nakrywkowym.Ten krok należy wykonać stosunkowo szybko i ostrożnie, upewniając się, że żel jest równomiernie wyciśnięty pod szkiełkiem nakrywkowym. Po tej procedurze można wykorzystać limfocyty B z ekspresją białka fluorescencyjnego do jednoczesnej oceny lokalizacji struktur wewnątrzkomórkowych i wzorca sił. Technikę tę można połączyć z zaburzeniami genetycznymi lub chemicznymi w celu oceny roli określonych białek w kurczliwości komórek i wychwytywaniu antygenu.

traction-force-microscopy-to-study-b-lymphocyte-activation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W tym filmie opisujemy metodę badania dynamiki organelli w limfocytach B po ich aktywacji za pomocą mikrogranulek pokrytych antygenem.

Dynamika organelli w limfocytach B po aktywacji kulkami pokrytymi antygenem

Ten film pokazuje aktywację limfocytów B in vitro. Proces ten obejmuje interakcję antygenu z receptorami komórek B, prowadzącą do przebudowy cytoszkieletu, tworzenia synaps immunologicznych, ruchu lizosomów, internalizacji antygenu, przetwarzania, a następnie prezentacji na cząsteczkach MHC w celu aktywacji komórek B.

Aktywacja limfocytów B na szkiełku nakrywkowym pokrytym antygenem

Ten film prezentuje ocenę aktywacji limfocytów B poprzez wykorzystanie antygenowych liposomów. Limfocyty B potraktowane wrażliwym na wapń barwnikiem Indo-1 rozróżnia się za pomocą cytometrii przepływowej i analizuje się ich stosunek fluorescencji fioletowej do niebieskiej. Gdy komórki napotykają liposomy antygenowe, wyzwala to aktywację limfocytów B poprzez napływ wapnia, stopniowo zwiększając z czasem stosunek sygnału fluorescencji fioletowej do niebieskiej.

Monitorowanie aktywacji limfocytów B za pomocą liposomów antygenowych przy użyciu testu strumienia wapnia

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

Limfocyty są głównymi graczami w adaptacyjnych odpowiedziach immunologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół oczyszczania limfocytów w celu określenia funkcji fizjologicznych pożądanych cząsteczek w aktywacji limfocytów in vitro i in vivo. Opisane procedury doświadczalne są odpowiednie do porównania zdolności funkcjonalnych między limfocytami kontrolnymi a genetycznie zmodyfikowanymi.

Izolacja i aktywacja mysich limfocytów

Przedstawiamy protokół użycia mikroskopii STED do jednoczesnego obrazowania struktur aktynowych, mikrotubul i białek wiążących mikrotubule plus end w komórkach B, które rozprzestrzeniły się na szkiełkach nakrywkowych pokrytych przeciwciałami przeciwko receptorowi komórek B, modelowi początkowej fazy tworzenia synaps immunologicznych.

Wizualizacja cytoszkieletów aktyny i mikrotubul w synapsie immunologicznej komórek B przy użyciu mikroskopii wyczerpywania się emisji stymulowanej (STED)

Przedstawiamy protokół funkcjonalizacji wsporników mikroskopu sił atomowych (AFM) z pojedynczym limfocytem T i cząstką kulki do badań immunologicznych. Przedstawiono procedury badania wiązania jednoparowych komórek T z komórkami dendrytycznymi przez AFM oraz monitorowania odpowiedzi komórkowej makrofagów w czasie rzeczywistym na pojedynczą cząstkę stałą za pomocą AFM z obrazowaniem fluorescencyjnym.

Funkcjonalizacja wsporników mikroskopu sił atomowych z pojedynczymi limfocytami T lub pojedynczą cząstką do immunologicznej spektroskopii sił pojedynczych komórek

Poniżej opisano dwa podejścia do charakteryzacji zdarzeń polaryzacji komórkowej w limfocytach B podczas formowania IS. Pierwsze obejmuje ilościową analizę rekrutacji organelli i reorganizacji cytoszkieletu w błonie synaptycznej. Drugie to podejście biochemiczne, którego celem jest charakterystyka zmian w składzie centrosomy, która ulega polaryzacji w synapsie immunologicznej.

Badanie dynamiki organelli w komórkach B podczas formowania się synapsy immunologicznej

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Tutaj prezentujemy protokół stopniowej rekonstytucji syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich użycie do badania wyjścia synaptycznego z aktywowanych limfocytów T.

Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki w celu zbadania emisji cząstek stałych przez synapsy odpornościowe limfocytów T

Poznaj mikroskopię sił trakcyjnych do badania aktywacji limfocytów B przy użyciu żeli poliakrylamidowych. Ta metoda umożliwia pomiar sił mechanicznych komórek immunologicznych i korelację z rekrutacją białek.

Mikroskopia sił trakcyjnych do badania aktywacji limfocytów B

Przeglądaj więcej filmów